Биологические основы старения и долголетия

Глава IV Молекуляpнo-клеточные системы поддержания жизнеспособности

Биохимики и молекулярные биологи, изучающие структуры клетки или процессы, происходящие в ней, нередко сравнивают клетку с биохимической фабрикой. Однако фабрика эта очень необычна. Действительно сопоставим, например, генетическую информацию ДНК с программой технологических процессов, заложенной в системе управления фабрикой (будем считать, что это программа вычислительного комплекса). Но мы теперь знаем, что в ДНК спонтанно с большой частотой возникают различные повреждения, причем многие из них вызываются продуктами нормального метаболизма — веществами, необходимыми для жизнедеятельности клетки.

Таким образом, если продолжать аналогию клетки с биохимической фабрикой, то нельзя не увидеть одну существенную отличительную особенность: программа работы этой фабрики постоянно разрушается продуктами ее собственного производства. И нормально функционировать такая фабрика (например, в течение сроков, сопоставимых со временем, затрачиваемым на ее создание) может лишь в том случае, если в ней имеются "сверхпрограмма" и средства восстановления всех программ работы фабрики.

В клетке действительно имеются механизмы и даже системы механизмов для ремонта поврежденных генетических структур. Схема работы наиболее изученного — эксцизионного механизма репарации представлена на рис. 6. Один из интереснейших механизмов репарации ДНК, открытых в последние годы, — устранение из ДНК гуанинов, алкилированных по 6-му кислородному атому. Особенность этой системы репарации ДНК состоит в ее адаптивности, т. е. ее активность во многих клетках увеличивается в условиях, когда возрастает число повреждений, устраняемых ею. Поскольку такие повреждения с относительно большой частотой приводят к мутации и трансформации клеток, то рассматриваемую систему репарации ДНК считают антимутагенной и антиканцерогенной. В процессе такой репарации "лишняя" метильная группа гуанина двойной спирали ДНК переносится на цистеиновый остаток фермента — акцепторного белка. Происходит полное восстановление исходной структуры остатка гуанина в ДНК, но сам фермент инактивируется (см. также с. 203).

В начале 80-х годов автор этих строк теоретически предсказал, что образование О⁶-метилгуанина в ДНК может происходить вследствие реакции ДНК с нормальным метаболитом, необходимым всем клеткам для осуществления различных физиологических функций — S-аденозилметионином. Иными словами, определенное количество повреждений ДНК рассматриваемого типа неизбежно образуется и при физиологических условиях. С этим обстоятельством, вероятно, и связана способность клеток развивать реакцию, так сказать, самоадаптации (т. е. реакцию защиты ДНК от спонтанного физиологического повреждения ДНК "своими" необходимыми клетке метаболитами).

О роли функции рассматриваемого фермента в жизнестойкости и долголетии млекопитающих свидетельствует, например, следующее. Исходный уровень его активности сначала был изучен в печени крыс А. Е. Пегом из отдела физиологии и исследований рака Пенсильванского университета (США). А пять лет спустя советскими онкологами (А. Я. Лихачевым и другими из НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова Минздрава СССР) были опубликованы данные об активности этого фермента в печени человека. Сопоставление данных этих различных работ показывает, что способность устранить премутагенные и преканцерогенные повреждения ДНК, индуцируемые алкилирующими нитрозаминами, в клетках человека примерно в 10 раз больше соответствующей способности клеток печени крыс.

Рассмотренными процессами репарации ДНК и катализируемыми ими ферментами не исчерпывается регуляция на самом Деле гораздо более сложных механизмов залечивания генетических ферментов. В частности, в таких механизмах принимают участие и ферменты, изменяющие структуру ДНК на уровнях ее организации, более высоких, чем первичная. Один из этих ферментов — топоизомераза, название которого подчеркивает и его предназначение — менять топологические свойства ДНК.

Топоизомераза — очень важный фермент, нужный клетке не только для репарации ДНК, но и для регуляции других функций генетического вещества, включая редупликацию генов и их транскрипцию. (Роль такого рода ферментов в репарации ДНК и изменение их активности в процессе канцерогенеза были предсказаны в СССР еще в начале 70-х годов). Но особенно интересны данные, полученные в экспериментах с культивируемыми клетками человека.

Так вот, когда сравнили топоизомеразы в клетках здоровых доноров и больных анемией Фанкони (у последних увеличена нестабильность хромосом, снижена продолжительность жизни и имеются некоторые симптомы преждевременного старения, включая такой грозный, как увеличенная предрасположенность к опухолевым заболеваниям), то оказалось: при этой болезни резко изменено внутриклеточное распределение рассматриваемого фермента. В клетках здоровых людей фермент сосредоточен в основном в их ядрах, а в клетках больных людей активность топоизомеразы в ядрах мала, но она велика в цитоплазме. Возможно, это связано с тем, что вследствие мутации того или иного гена (в частности, гена, кодирующего самую топоизомеразу), фермент, будучи синтезированным в цитоплазме, затем не может быть доставлен в ядро. Так полагают авторы, обнаружившие различия в распределении топоизомеразы между клетками здоровых и больных анемией Фанкони людей.

Но более вероятным кажется другое объяснение этого различия. В клетках больных анемией Фанкони увеличена выработка супероксидного радикала и(или) генерируемого с его участием Н₂О₂, а это и приводит к увеличенной нестабильности хромосом. Об этом свидетельствует, в частности, тот факт, что при добавлении в среду роста клеток этих больных супероксиддисмутазы или каталазы частота спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций "нормализуется". В связи с такими изменениями метаболизма, очевидно, и нарушается распределение топоизомераз. Но этот фермент, как считают исследователи, причастен к точности репарации ДНК и к подготовке ДНК к редупликации, и снижение его активности, вероятно, приводит к нарушению обоих процессов.

Действительно уже относительно давно было установлено, что процесс репликации ДНК в клетках больных с нестабильностью хромосом изменен. А в последние годы обнаружена и еще одна особенность этого процесса в таких клетках: радиочувствительность синтеза ДНК в них значительно снижена. Так, если уже при относительно небольших дозах облучения (меньших, чем летальные) в нормальных клетках синтез ДНК резко тормозится, то в клетках больных с синдромом нестабильности ДНК этого не наблюдается. Но ведь облучение индуцирует в ДНК различные повреждения, которые в норме должны быть залечены, причем точность (завершенность) этого процесса проверяется с помощью топоизомераз. Лишь после этого, наверное, начинается синтез ДНК. С такими процессами, вероятно, и связана задержка синтеза ДНК в облученных клетках.

Но при снижении активности топоизомераз и наличии каких-то других дефектов в механизмах репарации и репликации ДНК клетками "тратится" меньше времени на контролирующие целостность ДНК процессы.

Таким образом, исходя из предположения об участии топоизомеразы в проверке точности (или правильнее — полноты) репарации спонтанных и радиационных повреждений ДНК можно объяснить различные молекулярно-генетические особенности клеток больных с нестабильностью хромосом.

Теперь вопрос можно поставить шире: не является ли нарушение структуры, синтеза или распределения топоизомеразы одним из молекулярных механизмов преждевременного старения? И не являются ли возрастные изменения репликации ДНК средством такого нарушения? Дефект репликации ДНК наблюдали в фибробластах людей, страдающих синдромом Вернера или прогерией взрослых (одно из генетически детерминированных заболеваний, обозначаемых и как синдром преждевременного старения). Этот факт свидетельствует о том, что ответ на оба вопроса, наверное, должен быть положительным.

Но как же изменяется способность клеток к репарации ДНК в процессе нормального, физиологического старения? В обширной литературе на рассматриваемую нами тему очень мало работ, освещающих исследования, в которых проблему возрастных изменений репарации ДНК изучали бы на клетках человека, стареющих не in vitro, a in vivo. Хотя "модель" можно исследовать подробнее и с меньшими усилиями, чем само явление, но все же интересно знать, как происходит старение клеток в естественных условиях.

Прежде всего приведу доказательство уменьшения способности к репарации однонитевых разрывов ДНК у фибробластов взрослых людей по сравнению с эмбриональными фибр об ластами. Способность к репарации ДНК эмбриональных диплоидных фибробластов медицинских абортусов и фибробластов, полученных из кожных биопсий здоровых доноров в возрасте от 25 лет до 91 года, А. Н. Хохлов и автор этих строк (работа выполнялась при поддержке Г. Д. Бердышева из КГУ и К. Н. Гринберга из Института медицинской генетики АМН СССР) определяли методом седиментации в градиенте щелочной сахарозы, о котором я уже рассказывал. Результаты, полученные при использовании этой методики, интерпретируются достаточно определенно: повреждение ДНК (радиацией или химическими мутагенами), приводящее к замедлению скорости седиментации ДНК, означает накопление в ней разрывов или других модификаций (щелочно-лабильных связей), которые в щелочной сахарозе трансформируются в разрывы ДНК. Ускорение седиментации ДНК поврежденных клеток в процессе их инкубации при 37 °C интерпретируется как показатель способности клеток устранять повреждения ДНК: в основном однонитевые разрывы и щелочно-лабильные связи.

При отработке условий эксперимента (количество наносимых на градиент клеток, продолжительность их лизиса, скорость центрифугирования) были исключены все возможные артефакты метода. Это позволило максимально увеличить воспроизводимость результатов и установить, что хотя сразу после облучения седиментаграммы ДНК эмбриональных и "взрослых" фибробластов практически одинаковы, в процессе инкубации скорость седиментации ДНК в эмбриональных клетках возрастает несколько быстрее.

Анализ данных многих серий опытов по сравнительному исследованию ДНК эмбриональных и "взрослых" фибробластов при 37 °C показывает, что и за 30 минут, и за 1 час инкубации облученных "взрослых" клеток в их ДНК устраняется; меньше повреждений, чем за тот же промежуток времени в ДНК эмбриональных клеток,

Ранее другими авторами был проведен целый ряд исследований, посвященных изучению изменений способности к репарации различных повреждений ДНК при "старении" in vitro культивируемых диплоидных фибробластов. Эти данные показывают, что репарация индуцированных радиацией однонитевых разрывов и щелочно-лабильных связей нарушается лишь в клетках последних пассажей, когда их жизнеспособность значительно снижена и большая часть клеток в популяции теряет способность к делению.

Другой подход, использованный нами для изучения возрастных изменений репарации ДНК, состоял в сравнении интенсивностей репаративного синтеза ДНК в клетках животных (крыс) различного возраста и в фибробластах человека, культивируемых в течение длительного времени. О результатах, полученных при исследовании спонтанного репаративного синтеза ДНК в клетках головного мозга, было рассказано в предыдущей главе. То были результаты исследования интактных животных.

Но кроме того, в клетках головного мозга взрослых крыс была обнаружена способность к внеплановому синтезу ДНК, индуцированному (вероятно, репаративному) гамма-излучением. Однако когда такие же опыты были поставлены нами на 23-26-месячных крысах, то у них индуцированного излучением внепланового синтеза ДНК обнаружить не удалось. Таким образом, пока мы имеем доказательство способности к обоим репаративным синтезам ДНК — спонтанному и индуцированному — только в нервных клетках головного мозга молодых животных.

Кстати, наличие такой способности заставляет с осторожностью относиться к широко разрекламированным, сенсационным результатам исследований Д. Пейтона и Ф. Нотебома из Рокфеллеровского университета, наблюдавших обмен ДНК в нервных клетках головного мозга взрослых животных (они исследовали канареек) и на основании такого обмена заключивших, что нервные клетки могут разрушаться и замещаться в процессе деления оставшихся. Возможно, однако, что обмен ДНК, исследованный американскими авторами, был обусловлен репаративным синтезом ДНК.

Чтобы выяснить, изменяется ли в процессе старения клеток человека их способность к репарации повреждений ДНК, диплоидные клетки, совершившие различное число делений in vitro, облучали УФ-светом и определяли интенсивность протекающего у них синтеза ДНК, связанного с репарацией повреждений ДНК. Доказательством включения тимидина как следствия внепланового (репаративного) синтеза ДНК являлся, в частности, тот факт, что его интенсивность определялась величиной дозы УФ-облучения. При облучении клеток в относительно небольшой дозе — 25 эрг/мм² интенсивность репаративного синтеза ДНК в "старых" клетках (40-го пассажа) была статистически достоверно меньше интенсивности репаративного синтеза ДНК в "молодых" клетках (26-го пассажа).

Но конечно, данные, полученные в опытах с клетками, стареющими in vitro, надо осторожно экстраполировать на ситуацию в организме. Поэтому больший интерес представляет вопрос о том, как изменяется репаративный синтез при старении клеток организма. Поскольку, как будет объяснено ниже, это важный для понимания механизмов старения и долголетия вопрос, то основные из имеющихся на этот счет фактов, опубликованных в последние годы (1984–1985), мы теперь рассмотрим.

Е. Ковакс с соавторами из лаборатории генетики человека в Базеле изучили спонтанный и индуцированный УФ-излучением репаративный синтез в лимфоцитах 38 мужчин и 17 женщин, которые были разделены на две группы: 17–39 лет и 44–74 года. Они установили, что интенсивность спонтанного репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах людей 1-й группы была меньше, чем в лимфоцитах 2-й. Однако значительных различий в интенсивности индуцированного репаративного синтеза ДНК они не обнаружили, хотя и отметили, что клетки молодых людей менее гетерогенны по этому показателю.

А группа исследователей из Колумбийского университета в Нью-Йорке исследовала интенсивность репаративного синтеза ДНК клеток эпидермиса, полученных от людей различного возраста. Эту интенсивность оценивали методом радиоавтографии в клетках, облученных УФ-лучами. Было обнаружено, что активность процесса репарации ДНК по мере увеличения возраста доноров уменьшается на 50 %, причем с возрастом увеличивается доля клеток с низкой интенсивностью репаративного синтеза.

Наблюдаемые изменения нельзя объяснить ни нарушением проницаемости клеток для предшественников ДНК, ни изменением размера ядра. Приведенные данные однозначно свидетельствуют о нарушении с возрастом функции самих систем репарации ДНК.

Ряд исследований был выполнен с клетками, полученными от грызунов. В частности, ученые из медицинского колледжа Питтсбургского университета (США) установили: процесс репаративного синтеза ДНК после облучения УФ-светом клеток печени (гепатоцитов) 2-3-месячных крыс протекает активнее, чем в тех же клетках старых (16–20 месяцев) крыс.

По данным Ганса Ниедермуля с соавторами, способность к эксцизионной репарации клеток крыс в процессе их старения уменьшается. Она была снижена в клетках почти всех исследованных органов 28-месячных крыс по сравнению с клетками 9- и 18-месячных независимо от того, чем вызывали повреждения ДНК: 4-нитрозметилмочевиной, метил-метансульфонатом, 4-нитрохинолин-1-оксидом или гамма-излучением.

Я перечислил все исследованные факторы, не только чтобы подчеркнуть общие закономерности, но и отметить, что все эти факторы являются канцерогенными или потенциально канцерогенными. Это обстоятельство мы учтем ниже при рассмотрении вопроса о причинах резкого учащения в процессе старения животных и человека случаев развития у них злокачественных новообразований.

Характер изменения репаративного синтеза ДНК при старении соответствует характеру изменения активности генов в синтезе РНК, т. е. нарушение репарации ДНК и вследствие этого — накопление повреждений ДНК в определенных генах приводят к нарушению функции этих генов. Однако возможно, что обе функции ДНК — синтез РНК и способность к репарации ДНК — нарушаются по одной или нескольким общим причинам, например вследствие компактизации ДНК или хроматина в процессе старения. То, что в результате этого репарируемость (или, если воспользоваться термином из теории надежности технических систем, — ремонтопригодность) генов будет уменьшаться, не подлежит сомнению. Ведь в результате компактизации ДНК доступность поврежденного участка ДНК к препарирующим ферментам должна уменьшаться. Но в то же время целый ряд наблюдений свидетельствует: в процессе старения клеток в них возрастает количество "плотно упакованной" ДНК. У такой ДНК, кроме "ремонтопригодности", может снижаться способность к редупликации и к синтезу РНК. Таковы звенья цепи молекулярных изменений, определяющих скорость старения. Однако на самом деле процесс "старения" генетического вещества еще сложнее.

Выше расчетным путем была оценена скорость спонтанного непрограммированного метилирования ДНК. Была рассмотрена скорость лишь неэнзиматического метилирования, и она оказалась очень большой. Но если это так, то и система спонтанной репарации ДНК в неповрежденной клетке должна работать с такой скоростью, чтобы из ДНК в течение часа выщеплялись многие десятки метильных групп (иначе их содержание в ДНК быстро достигло бы уровня, не совместимого с жизнью клетки). Процесс репарации ДНК такой интенсивности можно зарегистрировать либо физико-химическими, либо более чувствительными иммунологическими методами анализа. Но к сожалению, пока он полностью не исследован.

Далее теоретический биофизический анализ ДНК показывает: в клетках с относительно большой частотой (по сравнению с частотами спонтанных мутаций) протекает процесс спонтанного дезаминирования цитозина. Если бы не было систем репарации этого типа спонтанных повреждений ДНК, то количество предмутационных изменений, ведущих к транзициям ЦГ → АТ, составило бы в расчете на клеточный цикл (его минимальная продолжительность у клеток млекопитающих составляет примерно сутки) порядка 10^-5-10^-4 в расчете на 1 сайт, тогда как экспериментально определяемые частоты порядка 10^-8 и менее. Следовательно, мы должны заключить, что в клетках постоянно протекают не только процессы спонтанного дезаминирования цитозина, но и репарации возникающих в результате этого изменений структуры ДНК.

При действии на различные клетки относительно небольших концентраций некоторых химических мутагенов в них можно определить возрастание устойчивости к этим мутагенам, связанное с активацией (индукцией, синтезом) ферментов с защитными (репарирующими) свойствами. Мы получили доказательство, что небольшие дозы УФ-излучения или даже тепловое воздействие определенной интенсивности и длительности могут активировать системы репарации ДНК в некоторых клетках. Другие авторы также получали факты, свидетельствующие об активной защите клетки, об их "приспособляемости" к окружающей среде и на уровне репарации ДНК.

Существуют и другие, кроме репарации ДНК, способы защиты генома, и о них еще будет рассказано. Сейчас же отмечу, что даже в устройстве генома клеток человека можно усмотреть "стремление" природы в процессе эволюции увеличить стабильность.

Основываясь на биологическом значении нестабильности ДНК, роли ДНКазы в механизмах этой нестабильности, анализе закономерностей взаимодействия Т-лимфоцитов-киллеров ("убийц") с клетками-мишенями, автор этой книги обосновал предположение, что Т-лимфоциты убивают свою жертву путем инъекции в нее ДНКаз. Это предположение было опубликовано в начале 1985 года в отечественном журнале "Успехи современной биологии". А в середине того же года группа американских авторов (В. Е. Мунгер с соавторами) сообщила, что им удалось очистить гранулы, которые вводят цитотоксические Т-лимфоциты в клетку-мишень. Такие гранулы содержат цитолизины, с помощью которых в мембране клеток-мишеней образуется "дырка", и в нее поступает ДНКаза, содержащаяся в большом количестве в этих гранулах. В Т-лимфоцитах, не обладающих цитотоксической активностью, содержание ДНКаз значительно меньше.

Теперь вспомним, что макрофаги убивают бактерии посредством действия на них активных форм кислорода: супероксидного радикала и образуемых при его участии радикала ОН· и Н₂О₂ (также содержащих кислород в полувосстановленной форме). Этот класс веществ, конечно, резко отличается от ДНКаз. Но у них есть и общее свойство — все они являются эндогенными генотоксическими факторами, используемыми одними клетками для разрушения других.

У строгого читателя может возникнуть вопрос: а какое отношение рассказ о механизмах разрушения одних клеток другими имеет к старению? Прежде чем ответить, напомню, что способность определенных клеток пожирать и убивать другие клетки была открыта И. И. Мечниковым — великим русским биологом, первым из отечественных ученых получившим Нобелевскую премию по биологии и медицине. Так вот, И. И. Мечников этим своим открытием не только заложил основы учения о клеточном иммунитете (важнейшей области современной биологии и медицины), но и сформулировал фактически первую гипотезу о механизмах старения человека. И. И. Мечников предположил, что макрофаги могут "пожирать" также клетки собственных органов, например (и это он считал особенно существенным в механизмах старения человека) незаменимые (неделящиеся) клетки в процессе старения органов. Гипотеза И. И. Мечникова, конечно, теперь имеет прежде всего исторический интерес. Однако она же может стать основой для более совершенных гипотез, учитывающих роль иммунологических механизмов (или в более широком смысле — межклеточных взаимодействий) в старении организма.

Ведь получается, что защитные устройства сами участвуют в механизмах старения. Более того, если принять во внимание, что активные формы кислорода и ДНКазы не только "орудия агрессии" клеток, но и мощные эндогенные генотоксические факторы, т. е. что они механизмы "спонтанного" повреждения ДНК, определяющего старение, то станет очевидной взаимосвязь механизмов защиты организма (или агрессии, если рассматривать межклеточные отношения) и старения. Судя по всему, системы транспорта электронов в древних клетках и весь их метаболизм формировались и с учетом их защиты от других клеток или (что примерно то же самое для клеток) с учетом необходимости их агрессивного поведения.

На более поздних этапах эволюции, когда сформировались высшие организмы, эта функция перестала быть столь существенной, и теперь молекулярные средства защиты и нападения стали и механизмами старения и клеток, и всего организма. Более того, именно эти механизмы могут быть основной причиной гибели клеток и организма при действии на него экстремальных факторов.

Действительно анализ многочисленных фактов показывает, что под влиянием различных физических и химических факторов и даже вирусов в клетках происходит возрастание активных форм кислорода (иногда говорят об окислительном стрессе) и(или) ДНКаз. Особенно подробно изучена роль последних в механизмах гибели лимфоцитов после облучения организма ионизирующими излучениями. И здесь надо отметить выдающийся вклад радиобиологов, особенно отечественных (Н. В. Ермолаева, А. М. Кузин, В. К. Мазурик, Н. И. Рябченко, С. Р. Уманский, Г. Е. Фрадкин, К. П. Хансон, И. В. Филиппович) и чехословацких (М. Скалка с соавторами). Именно благодаря их работам концепция программированной гибели клеток и кардинальной роли ДНКаз(ы) в этой гибели получила начиная с середины 70-х годов мощное развитие. Полагают, что в радиочувствительных клетках (лимфоцитах) в результате облучения ДНКазы (во всяком случае, одна из них, стимулируемая Са²⁺) активируются и вызывают разрушение ДНК этих клеток.

Еще одна и, возможно, самая яркая грань взаимосвязи механизмов повреждения и защиты на одном и том же уровне — ДНК обнаруживается, если принять во внимание, что ДНКазы участвуют и в индукции, и в репарации повреждений ДНК.

Двойные разрывы ДНК могут возникнуть по крайней мере двумя путями: через одновременное образование двух однонитевых разрывов, каждый из которых локализован в одной из комплементарных цепей в пределах участка ДНК длиной около 10 нуклеотидов, или через последовательное образование сначала одного разрыва, а затем, если первый не успел репарироваться, — другого.

Исходя из оценок частот образования однонитевых разрывов, сделанных в предыдущей главе, можно заключить, что без участия ферментов оба пути спонтанного образования двунитевых разрывов реализуются исключительно редко. Очень вероятно, что механизм образования двунитевых разрывов в ДНК включает действие ДНКазы на интактную ДНК в участках (в пределах 10 нуклеотидов), расположенных напротив участка комплементарной цепи, содержащей однонитевый разрыв (и следовательно, в локально денатурированном участке двойной спирали ДНК). Действительно в различных клетках животных и человека найдены эндонуклеазы, которые специфичны по отношению к однонитчатой ДНК, т. е. "узнающие" места расплетения ДНК, которые могут образоваться в месте образовавши в ДНК однонитевого разрыва или локального расплетения нативной ДНК вследствие флуктуации в распределении тепловой энергии.

Обычно полагают, что нахождение эндонуклеазами мест частичной денатурации ДНК — это и есть механизм узнавания различных повреждений ДНК этими ферментами, катализирующими первый этап репарации ДНК — инцизию. Следовательно, эти же ферменты могут расщеплять ДНК и в участках локального расплетения двойной спирали — вследствие флуктуации в распределении тепловой энергии. Но кроме того, если эти ферменты ошибутся и индуцируют разрыв в противоположной цепи, содержащей частично расплетенный участок после образования однонитевого разрыва, то это приведет и к образованию двунитевого разрыва.

Таким образом, два противоположных процесса (развитие первичных спонтанных повреждений ДНК и начальные этапы их репарации) катализируются одним и тем же классом ферментов — ДНКазами. И только специфические эндонуклеазы могут сделать выбор между двумя этими процессами (и то не всегда точно).

Что касается экзонуклеаз, то, вероятно, одни и те же ферменты могут катализировать и репарацию ДНК, и ее деградацию. И следовательно, только изучая последующие молекулярные события, можно решить, каково биологическое значение энзиматической деградации ДНК. Более того, биологическое значение деградации даже целых генов может быть двояким: или их повреждение, или освобождение генома от ненужных "использованных" генов.

Возвращаясь к проблеме изменения процессов репарации при старении, мы теперь видим, что пока изучены лишь немногие из ее аспектов. Я подчеркиваю это, потому что обилие фактов по этой проблеме создало иллюзию ее полной изученности даже у специалистов. Так, на симпозиуме по генетике старения, состоявшемся в ноябре 1984 года, один из очень известных наших биогеронтологов заключил свой доклад предположением, что, наверное, теперь мы уже почти все знаем о механизмах репарации и об их изменении при старении. Однако на самом деле ситуацию можно охарактеризовать следующим образом: многие звенья механизмов регуляции репарации ДНК и причины их изменения при старении достаточно детально не исследованы, а о некоторых свойствах репарации ДНК мы можем только догадываться. Но одно заключение все же можно сделать: способность клеток к репарации повреждений ДНК, вызванных облучением, особенно облучением УФ-лучами, в процессе старения, как правило, снижается.

В защите генетического вещества как от эндогенных генотоксических факторов, так и от внешних факторов, способных разрушать его, существенное значение имеют антиоксиданты или, точнее, система антиоксидантов, состоящих из органических веществ различных классов, а также нескольких ферментов. Начнем, пожалуй, с самого интересного и важного из них.

а) Ферментативная система защиты

Ранее была разъяснена роль супероксидного радикала () и образуемых в реакциях с его участием Н₂О₂ и гидроксильного радикала (ОН·) в повреждении и ДНК, и мембран. В настоящее время многие ученые подчеркивают опасность, которую для жизненно важных структур клетки представляют эти вещества, постоянно образуемые в процессе нормального метаболизма и инициируемые ими реакции. Но такое представление возникло еще в конце 60-х годов. Тогда автор этой книги пришел к заключению о возникновении кислородных радикалов in vivo и о роли последних в старении (книга "Молекулярные механизмы старения", М., Наука, 1970). Я вспоминаю об этом сейчас, чтобы лишний раз отметить: исходя из анализа механизмов старения можно делать предсказания общебиологического характера.

Это направление исследований стало бурно развиваться в 70-х годах, после открытия ферментов супероксиддисмутаз (СОД), защищающих клетки от . Сначала такие белки рассматривали предназначенными для запасания меди. Отсюда и их старое название: эритрокупреины, цереброкупреины и т. д. Но затем было установлено, что медьсодержащие белки катализируют реакцию:

Теперь стало ясно, что такие ферменты присутствуют в клетках высших организмов, будучи связанными не только с атомами меди, но и атомами других металлов — цинка или марганца (он содержится в митохондриальной СОД).

При сравнении активностей СОД в печени молодых (2,5-месячных) и старых (22-месячных) крыс В. К. Кольтовер, Р. А. Гуськова и автор этих строк обнаружили, что у последних она снижена более чем в 1,5 раза (при расчете на 1 мг белка клеток печени). Другими авторами общая активность СОД исследована также в скелетных и сердечной мышцах самцов крыс в возрасте от 3 до 23 месяцев. Эта активность у животных старше 19 месяцев с возрастом значительно уменьшалась.

Р. С. Сохал и другие ученые из отдела биологии Далласского университета обнаружили резкое уменьшение активности СОД при старении самцов домашней мухи. О значимости таких изменений свидетельствует обнаруженное этой же группой исследователей увеличение у "старых" мух концентрации неорганических перекисей окисленного глутатиона (хотя скорость поглощения кислорода была уменьшена, вероятно, из-за нарушений функций митохондрий, вызванных перечисленными биохимическими изменениями).

Правда, может возникнуть вопрос: не путаем ли мы причину и следствие? Ведь уменьшение активности защитных систем может быть следствием нарушения функции и белоксинтезирующего аппарата клетки и митохондрий (включая их собственный белоксинтезирующий аппарат), так как активность ферментных (белковых) систем защиты, конечно же, зависит от скорости синтеза белка.

Хотя второе заключение верно, но оно не противоречит первому. Скорее всего, здесь имеет место порочный круг: причиной снижения защитной системы при старении являются отмеченные нарушения, но эти же нарушения усугубляются таким снижением, и в результате защитные функции снижаются еще более и т. д.

Промежуточным звеном в этом круге, очевидно, являются перекиси липидов, которые, во-первых, образуются в реакциях, инициируемых , H₂О₂, ОН·, а во-вторых, могут повреждать ДНК, различные ферменты и, конечно же, мембраны, в липидном бислое которых эти реакции развиваются.

Все это наводит на мысль: не является ли СОД одной из биологических основ долгожительства? Следующий факт показывает, что ответ на этот вопрос может быть положительным. Японские исследователи Тетсуйта Оно и Щигефуми Окада исследовали активность этого и еще целого ряда ферментов в головном мозге половозрелых животных 11 видов с различной продолжительностью жизни; но лишь активность СОД положительно коррелирована с величиной максимальной продолжительности жизни исследованных животных. В связи с такого рода данными особое значение приобретают и другие вопросы: о причинах снижения активности СОД при старении и о возможности коррекции этого возрастного дефекта.

Оба вопроса, к сожалению, пока специально не исследованы, но очевидно, что пути изучения второго из них в сильной степени зависят от понимания первого. В частности, в состав СОД входит атом цинка, а при исследовании мышей в возрасте от 7 до 87 недель было обнаружено снижение в процессе старения содержания цинка в сыворотке. Не связано ли с этим снижение активности ООД? Цинк необходим для целого ряда биохимических процессов, а его недостаток может приводить к нарушению иммунных реакций, что наблюдается при старении. Но нужно ли увеличить его потребление пожилым людям? Ответа мы, конечно, сейчас не можем дать. Пока лишь обоснована актуальность вопроса об изменении с возрастом потребности людей в цинке, возможно, о недостаточном его содержании в пище пожилых людей. По крайней мере очень вероятные ответы на эти вопросы при соответствующей организации исследований получить можно относительно быстро и без больших материальных затрат, поскольку определение содержания цинка в сыворотке крови — простая процедура.

Кроме количества рассматриваемых защитных ферментов, в процессе старения могут изменяться и сами эти молекулы. Так, в цитоплазме фибробластов человека, исчерпавших свой митотический потенциал (а именно прошедших 52 пассажа), обнаруживается форма супероксиддисмутазы, очень чувствительная к нагреванию. Образование такой термолабильной формы фермента связано с изменением его конформации. И что интересно (не только теоретически, но, может быть, и практически): этот процесс перехода фермента из термостабильной в термолабильную конформацию является обратимым. Иными словами, рассматриваемый очень важный защитный фермент можно "омолодить" с помощью определенных метаболитов.

Аэробные организмы защищаются от окислительной деструкции мембран и других структур клетки также с помощью других, кроме супероксиддисмутазы, специальных ферментов, к числу которых относят селенсодержащую глутатионпероксидазу. Подробно роль изменений этой защитной системы при старении не исследована. Но вероятно, и ее функция нарушается, в частности, в связи с изменением синтеза белка или изменением соотношения в клетках различных форм глутатиона: общего, восстановленного и окисленного (Р. С. Сохал с соавторами из Далласского Университета).

Закономерен вопрос: а возможно ли усиление этой важной молекулярной защитной системы? В принципе, очевидно, да; однако здесь крайне важна одна особенность, с которой мы будем встречаться при анализе и других защитных систем. Дело в том, что задача коррекции защитных систем чрезвычайно сложна, поэтому требует исключительной осторожности.

В реакции обезвреживания кислородных радикалов образуется кислород в синглетном состоянии. Катализируемый глутатионпероксидазой процесс диспропорционирования гидроперекисей хотя и устраняет эти активные метаболиты, но также приводит к образованию синглетного молекулярного кислорода, являющегося сильным окислителем. Активность глутатионпероксидазы в печени, почках и сердце 36-месячных мышей уменьшена на 27–53 % по сравнению с активностями этих ферментов в тех же тканях 10-месячных мышей. Такое снижение является причиной нарушения при старении детоксикации перекисей и, кроме того, повышения чувствительности к эндогенным перекисям. Это означает, что, например, потребление избыточного количества растительного масла, содержащего относительно большой процент ненасыщенных жирных кислот, при метаболизме которых неизбежно должны образовываться перекиси, может вызвать развитие в клетках пожилого и старого человека различные деструктивные процессы.

б) Природные органические вещества, защищающие клетку от свободных радикалов и окислительного стресса

Биологической роли антиоксидантов уже давно уделяется очень большое внимание в биологии и медицине. И большое значение в разработке этой важной общебиологической и общемедицинской проблемы имело исследование антиоксидантов в качестве средств защиты от радиационного поражения и от разрушительного влияния времени (старения) академиком Н. М. Эмануэлем и его сотрудниками. В частности, Е. Б. Бурлакова обнаружила, что уменьшение с возрастом актиокислительной активности липидов играет существенную роль в процессе старения мышей различных линий. А Л. К. Обуховой, В. Н. Мамаевым, И. П. Пальминой, А. П. Акифьевым и другими сотрудниками был проведен целый комплекс фундаментальных исследований влияния антиоксидантов на продолжительность жизни различных животных, а также роли в механизмах продления жизни увеличения антиокислительной активности липидов.

Данные, полученные упомянутыми авторами и их сотрудниками, подтверждают предположение о том, что увеличение антиокислительной активности, по крайней мере некоторых органов, способствует долголетию. Из этих органов подробно изучена печень, изменение функций которой при старении обычно не лимитирует продолжительность жизни исследованных животных. Поэтому еще более интересных результатов можно ожидать от изучения влияния антиоксидантов на продолжительность жизни, скорость старения, частоту дегенеративных заболеваний, а также на антиокислительную активность органов, особенно важных для жизнедеятельности организма или наиболее уязвимых к болезням, связанным со старением.

Приходится, однако, снова напомнить, что усиление защитных систем — дело, чреватое самыми серьезными последствиями. Так, в процессе выполнения защитных функций — реакции с радикалами молекулы системы защиты сами становятся "опасными", если переходят в свободнорадикальное состояние. Эта опасность особенно существенна, если в результате таких реакций образуются перекисные радикалы. Вот пример. Некоторые американские геронтологи (и среди них такой выдающийся, как Р. Катлер) считают мочевую кислоту очень важным природным антиоксидантом, с помощью которого может быть увеличена продолжительность жизни. Однако при проведении радиационных исследований с ферментом алкогольдегидрогеназой оказалось, что в случае добавления урата натрия к раствору такого фермента его лучевая инактивация только усиливается. Это, как предполагается, связано с образованием в облученном растворе радикалов мочевой кислоты или связанных с ними перекисных радикалов. Значение, вероятно, имеет и образование супероксидного радикала в рассматриваемом процессе. Но независимо от этого приведенные данные показывают, что при определенных условиях "хороший природный антиоксидант" может не защищать, а, наоборот, усиливать окислительную деструкцию макромолекул. Из приведенного примера следует, кроме того, что для оценки свойств антиоксидантов может быть весьма полезным исследование эффектов облучения макромолекул ионизирующей радиацией.

Некоторые из новых молекулярных механизмов защиты уже открыты в середине 80-х годов, другие пока предполагаются — их возможная роль в старении и долголетии активно исследуется.

К числу вероятных защитных факторов прежде всего нужно отнести каротиноиды — вещества с относительно небольшой молекулярной массой (о них речь будет идти в главах VI и VII этой книги), а также белки, синтезируемые под влиянием кратковременного прогревания ("термошока") и(или) в условиях, когда в клетке усиливается выработка кислородсодержащих радикалов.

Функциональная значимость рассмотренных молекулярных механизмов защиты и репарации определяется их способностью защищать внутриклеточные структуры от эндогенных и экзогенных повреждающих воздействий. Другой класс защитных механизмов предназначен для защиты не только (и может быть, не столько) клеток и тканей, где они локализованы и функционируют, но и всего организма в целом. Такие механизмы изучают уже давно, и некоторые из них широко известны. Поэтому здесь будет рассказано о них кратко, и в основном о тех их свойствах, которые необходимы для понимания биологических основ жизнестойкости организма. Особое внимание будет обращено на взаимосвязь в работе различных защитных систем.

а) Защитные функции центральной нервной системы и гистогематических барьеров

Целый ряд систем организма осуществляет защитные функции. О такой функции (например, нервной системы) И. М. Сеченов еще в прошлом веке писал: "Действие регуляторов (имеются в виду элементы нервной системы. — М. В.) должно быть согласовано с интересами организма в смысле обеспечения анатомической и физиологической сохранности тела".

В отдельный класс физиологических механизмов защиты можно выделить барьерные механизмы, регулирующие переход различных веществ из крови во внутреннюю среду клеток и тканей. Эти барьерные механизмы, открытые советским физиологом академиком Л. С. Штерн, были названы ею гистогематическими. (Их называют также сосудисто-тканевыми.)

Среди них для организма особое значение имеет кровемозговой, или гематоэнцефалический, барьер, который не только регулирует динамическое постоянство состава внутренней среды мозга, но и защищает его от ненужных физиологически активных или тем более токсических веществ, вирусов, микробов. После гематоэнцефалического наиболее надежным считается гематотестикулярный барьер. Как видно из названия, это система защиты мужских половых клеток, содержащихся в семенниках (тестикулах). И в то же время этот механизм защиты (стенки сосудов, собственно оболочка семенных канальцев и т. д.) выполняет регуляторные функции. Интересно, что капилляры семенников и по ультраструктуре близки к капиллярам мозга.

Между кровью матери и плодом также существует барьер — плацентарный, который и регулирует переход веществ, необходимых плоду, и обладает защитной фракцией.

Защитные физиологические механизмы нарушаются в процессе старения, и эти нарушения имеют существенное значение. Еще несколько десятилетий назад студентам медвузов в качестве одного из основных фактов в пользу нервизма (учения об определяющей роли центральной нервной системы в регуляции всех функций организма) приводили следующие результаты, полученные И. П. Павловым и его учениками. Если центральная нервная система собак перевозбуждалась и развивалось состояние, во многом моделирующее состояние невроза у человека, то у животных разбивались признаки преждевременного старения. Этот факт означает, что нарушение тормозных процессов в головном мозге может иметь существенное значение в старении.

Примеров, подтверждающих это, можно было бы привести еще целый ряд. Но мы не будем подробно рассматривать изменения при старении защитной функции нервной системы и барьерных физиологических механизмов, так как это уже область скорее не биологических, а физиологических основ старения. Тем не менее отметим, что, как неоднократно подчеркивали отечественные физиологи (например, И. А. Аршавский, Н. Г. Кассиль, В. В. Фролькис), изменение в процессе старения регуляторных и защитных физиологических систем — очень важная и не во всем еще изученная проблема. А физиолог Л. А. Росин в своей книге "Регуляция функций" (М., Наука, 1984) подчеркнул, что проблема регуляторных и защитных механизмов (о тесной связи двух функций говорилось выше) в возрастном аспекте еще ждет систематического исследования.

б) Иммунологическая система защиты

Переходя к клеточным механизмам защиты, прежде всего назовем наиболее известную защитную систему — иммунологическую.

Иммунологическая защита осуществляется различными классами лимфоцитов, из которых Т-лимфоциты в основном ответственны за клеточный иммунитет — "узнавание" мутантных клеток или клеток, пораженных вирусами, а В-лимфоциты участвуют в синтезе антител. Отдельные классы лимфоцитов составляют моноциты, дифференцирующиеся в макрофаги. Кроме того, в каждом классе лимфоцитов различают несколько форм. Например, среди Т-лимфоцитов имеется по крайней мере три подкласса, о функции которых свидетельствует и их название. Это Т-киллеры ("убийцы"), разрушающие измененные клетки в результате прямого контакта с ними; Т-хелперы ("помощники"), помогающие другим лимфоцитам осуществлять их функции, и Т-супрессоры тормозящие активность других лимфоцитов и тем самым участвующие в регуляции иммунологических реакций. Описаны и такие формы Т-лимфоцитов, которые тормозят активность Т-лимфоцитов-супрессоров. Но у последних существуют свои "анти"-контр-анти-Т-супрессоры. Сеть межклеточных (непосредственных и дистантных) взаимодействий, составляющих иммунологические реакции, очень сложна (их анализу посвящены фундаментальная монография Б. Д. Брондза (Москва, 1987), ранее изданная книга академика Р. В. Петрова "Иммунология" (М., 1982). Многочисленны и механизмы нарушения иммунитета при старении. Выше мы рассматривали роль в старении нарушения межклеточных взаимодействий. Так вот, изменение межклеточных взаимодействий, как было выяснено в последние годы, очень существенно в механизмах нарушения иммунитета. Центральным звеном в механизмах этих взаимодействий является активация деления одних лимфоцитов под влиянием химических факторов, синтезируемых другими клетками. Уже давно было установлено, что один из характерных признаков Т-лимфоцитов, выделенных из крови старых людей, — снижение их способности реагировать на активаторы их клеточного деления (митогены) в культуре клеток. Правда, сначала снижение способности Т-лимфоцитов и активация под влиянием митогенов были открыты при исследовании веществ растительного происхождения, но теперь внимание иммунологов и биогеронтологов сосредоточено на изучении лимфокинов — факторов роста, выделяемых лимфоцитами.

Так, обнаружено снижение с возрастом интенсивности синтеза лимфокина интерлейкина-2. Этот факт позволяет понять по крайней мере одну из причин установленного ранее снижения при старении количества Т-клеток и их активности. Ведь под влиянием интерлейкина-2 происходит активация Т-клеток.

Исходя из того что ряд иммунологических изменений при старении обусловлен нарушением способности лимфоцитов синтезировать лимфокины, группа американских иммунологов (М. Л. Томан и Вильям О. Вейгл, 1985) попыталась даже восстановить некоторые нарушенные при старении иммунологические функции с помощью интерлейкина-2. Согласно их данным, клетки старых мышей образуют это вещество в количестве в 5-10 раз меньшем, чем клетки молодых взрослых мышей. В этих опытах в качестве индукторов интерлейкина-2 использовали митогены или аллоантиген; было показано, что описанный дефект связан вероятно, с нарушением функции Т-лимфоцитов — продуцентов его, а также с ранее установленными явлениями уменьшения при старении реактивности клеток к митогенам и реакции гуморального и клеточного иммунитета. Простое добавление в среду интерлейкина-2 восстанавливало ряд иммунологических реакций лимфоцитов.

В развитии патологических изменений в глубокой старости могут иметь значение молекулярно-клеточные изменения, аналогичные тем, которые обнаружены у старых мышей различных линий в течение нескольких дней, предшествующих их "спонтанной" гибели. В частности, в этот промежуток времени значительно повышается аутореактивность лимфоцитов к сингенным фибробластам и регистрируется повышенная цитотоксичность их естественных киллеров. Это сочетается с увеличением гибели и самих лимфоцитов. Таким образом, обнаруживается прямая корреляция между активацией программы спонтанной гибели лимфоцитов и программой саморазрушения организма посредством инактивации клеток цитотоксическими лимфоцитами. Результаты анализа 25-летнего лонгитудиального (т. е. в течение жизни обследуемых) исследования возрастных изменений в организме взрослых людей, проведенного Национальным институтом старения США, показывают: к числу наиболее существенных из этих изменений нужно отнести нарушения функций Т-лимфоцитов-хелперов.

Однако при старении наблюдается и увеличение количества лимфоцитов определенных категорий. Так, с помощью моноклональных антител и автоматического разделителя ("сортировщика") лимфоцитов периферической крови обнаружено возрастание величины одной из субпопуляций Т-лимфоцитов у пожилых людей по сравнению с молодыми. Эти изменения, вероятно, имеют значение в снижении жизнеспособности организма при старении, поскольку такие же изменения состава лимфоцитов наблюдаются и у молодых людей, страдающих болезнью Дауна, относимой к синдромам ускоренного старения.

Имеются и другие данные, свидетельствующие о существовании компенсаторных изменений в защитных механизмах и на клеточном уровне. Так, были исследованы различные подклассы лимфоцитов из периферической крови двух групп людей в возрасте 22–36 и 76–96 лет. У людей преклонного возраста было обнаружено почти двукратное увеличение естественных киллеров, селективно убивающих опухолевые клетки. В цитотоксическом тесте активность лимфоцитов против опухолевых клеток пожилых людей также была больше активности лимфоцитов молодых людей. Активность же лимфоцитов, относимых к Т-классу, при старении в согласии с данными других работ была сниженной.

Следовательно, увеличение числа естественных киллеров при старении может быть процессом, компенсирующим возрастное снижение функций иммунной системы, которую обеспечивают Т-лимфоциты. Выяснить правильность этого предположения можно, определив, не предшествует ли такое снижение возрастанию числа естественных киллеров.

Изменение функций Т-лимфоцитов при старении служит причиной нарушения не только тех иммунологических реакций, которые определяются самими Т-клетками. Согласно сообщению Перраса Хаузмана с сотрудниками из лаборатории геронтологии отдела медицины Корнеллского университета, наблюдаемое при старении значительное увеличение аутоантител, уменьшение синтеза антител лимфоцитами в культуре клеток или в организме связаны и с нарушением баланса регуляторных Т-клеток. Молекулярной основой таких нарушений может быть изменение рецепторов различных классов и субпопуляций лимфоцитов.

Важное уточнение относительно возрастных изменений функций лимфоцитов: например, по данным только что упомянутой группы авторов, такие нарушения в процессе старения наблюдали обычно при исследовании только лимфоцитов периферической крови, но не лимфоцитов, полученных из костного мозга или лимфоузлов. Такая закономерность может быть сопоставлена с ролью нейрогуморальных механизмов защиты в нарушении иммунологической защиты при старении. Все эти данные — неоспоримое свидетельство взаимосвязи между изменениями иммунологической системы защиты и теми системами, которые были рассмотрены ранее.

Читателю, которого больше интересуют практически аспекты рассматриваемых проблем, поясню: сказанное здесь означает, что частые и длительные стрессы (психологические) могут нарушить иммунологическую защиту или ускорить снижение этой защиты с возрастом.

Количество данных о том, что между функциями центральной нервной системы и иммунологической существует сложное взаимодействие, в последние годы нарастает, можно сказать, лавинообразно. В этом взаимодействии участвует и эндокринная система. Исследование роли таких взаимодействий в возрастном нарушении функции той или иной из систем несомненно — один из важнейших подходов для понимания механизмов старения каждой из этих систем и всего организма в целом.

Однако одновременно это, по-моему, и один из плодотворных подходов для понимания механизмов регуляции функций организма, особенно его иммунологической защиты. Дело в том, что связь между защитными и регуляторными функциями обнаруживается при рассмотрении не только центральной нервной системы или гематоэнцефалического или плацентарного барьера, но и при анализе иммунологической системы. Кстати, роль нарушения "тройного взаимодействия" (функций головного мозга, гематоэнцефалического барьера и иммунологической системы) в старении может состоять, например, в следующем. У молодых организмов головной мозг защищен гематоэнцефалическим барьером таким образом, что в нем "не разыгрываются" иммунологические процессы. Но если при старении функции такого барьера нарушаются, это приводит к синтезу аутоантител против нервных клеток, а следовательно, и к нарушению функций головного мозга.

Другое свойство защитных систем — постоянное функционирование. Это касается не только иммунологической системы. Другие защитные механизмы также работают постоянно, а не только "в особых условиях". Правда, в специальной физиологической литературе высказывалось мнение, что защитная функция в здоровом организме практически не проявляется — она "включается" только в экстремальных условиях. Факты, приведенные ранее, а также те, что будут описаны в следующем разделе, показывают, что это не так.

Постоянно функционируют и биохимические системы защиты организма. Например, в крови имеются в небольших количествах различные физиологические активные вещества (желчные кислоты и т. д.), проникновению которых в мозг препятствует гематоэнцефалический барьер. Если желчные пигменты все же проникают в мозг (это бывает, например, при желтухе новорожденных), они оказывают на него токсическое действие.

В экстремальных условиях функции "физиологических мер защиты" (И. П. Павлов) проявляются более отчетливо. Но наряду с этим те же функции могут стать препятствием для лечения патологического процесса, изолируя орган от медикаментозных средств, например, мешая проникновению в инфицированный орган антибиотиков или других антибактериальных или противовирусных препаратов.

И при анализе биохимических систем внутренней защиты можно увидеть закономерность, которую мы видели раньше, говоря о проблеме физиологических систем защиты. Тогда была подчеркнута тесная связь регуляторных и защитных функций этих систем. Например, одним из важнейших нейромедиаторов является ацетилхолин — медиатор парасимпатического отдела вегетативной нервной системы. После выполнения своей функции (передачи нервного импульса) часть молекул ацетилхолина должна быть разрушена, иначе его постоянное образование с участием синтезирующего фермента — холинацетилтрансферазы приведет к накоплению его в больших количествах в нервных окончаниях и к поступлению его в нефизиологических количествах в кровь. Это нарушит нейрогуморальную регуляцию в организме. Защиту от такого нарушения осуществляет фермент холинэстераза, разрушающая ацетилхолин.

Но часть ацетилхолина все же попадает в кровь, и хотя небольшое его количество необходимо для гуморальной регуляции функции, накопление его в крови очень опасно.

Но организм обезопасил себя, вероятно, еще одной линией защиты от избытка ацетилхолина в крови. По данным Г. Н. Кассиля с сотрудниками, такую защиту осуществляют эритроциты, связывающие и тем самым обезвреживающие ацетилхолин. В уже цитированной книге этого автора проводится интересный анализ, свидетельствующий о существовании целого ряда уровней защиты организма от гистамина — физиологически очень активного вещества, постоянно вырабатываемого в организме и участвующего в регуляции деятельности некоторых органов. Однако если гистамин в крови человека начинает накапливаться, это вызывает нарушение различных функций. Избыточное образование в организме гистамина (или недостаточная защита от него!) может иметь значение в патогенезе таких широко распространенных заболеваний, как язвенная болезнь желудка или аллергия.

Приведенные примеры можно было бы продолжить, но и сказанного достаточно для того, чтобы представление И. П. Павлова о "физиологических мерах защиты" распространить на область биохимии.

Существует и специальная биохимическая система защиты от чужеродных веществ (ксенобиотиков), обладающих токсическими, мутагенными или канцерогенными свойствами. Эта барьерно-химическая защита особенно сильна в печени: с помощью ее обезвреживается большая часть поступающих в организм ксенобиотиков.

Важным элементом этой защиты являются гемсодержащие белки цитохром Р-450. Эта группа белков названа так вследствие того, что в восстановленной форме она в комплексе с окисью углерода имеет спектр поглощения с максимумом при 450 нм или вблизи этой полосы. Цитохром Р-450 — это общее название серии гемпротеидов, относимых к классу гидроксилаз, т. е. белков, участвующих в гидроксилировании поступающих в клетку веществ (или образуемых в ней или в других клетках стероидов и некоторых других метаболитов). При функционировании этих гидроксилаз (их называют еще монооксигеназами, так как они осуществляют включение только одного атома кислорода) происходит транспорт электронов по сложной цепи переносчиков, в результате чего восстанавливаются ионы железа, входящие в комплекс субстрата с цитохромом Р-450. В результате Fe³⁺ восстанавливается в Fe²⁺, а затем к последнему присоединяется О₂. Тогда из внутриклеточной цепи переноса электронов "прибывает" еще один электрон, после чего координационно связанный кислород или О₂^2- атакует субстрат, а цитохром Р-450 освобождается в состоянии, содержащем Fe³⁺.

Все исследованные до сих пор формы цитохрома Р-450 печени млекопитающих прочно связаны с мембранами эндоплазматического ретикулума (микросомами). Под влиянием различных ксенобиотиков концентрация этих белков резко возрастает. Такой процесс индукции происходит и под влиянием синтетических лекарств, также являющихся, как правило (к сожалению), чужеродными для организма. Например, после введения фенобарбитала гидроксилазная активность в печени возрастает примерно в 20 раз. Из важнейших свойств рассматриваемой биохимической системы отметим еще одно, касающееся механизмов ее действия, а именно превращение ксенобиотика из трудно в легко экскретируемую форму.

Как мы уже видели, такая работа сопровождается образованием , являющегося, как мы теперь знаем, индуктором переокисления липидов и генотоксическим агентом.

Рассматривая биологическую роль активных форм кислорода, мы подчеркнули и его участие в разрушении макрофагами бактерий. Таким образом, прослеживается практически одинаковая зависимость функционирования систем защиты от, казалось бы, столь разных факторов: химических чужеродных веществ или чужеродных бактерий.

Мы обсудили защитную функцию Р-450. Но драматический парадокс состоит в том, что Р-450 может не только обезвреживать потенциально канцерогенные вещества, но и катализировать их превращение в активные канцерогены. Например, 3-метилхолантрен, который содержится в выхлопных газах транспортных средств, индуцирует такую форму цитохрома Р-450, которая путем гидроксилирования этого полициклического углеводорода превращает его в сильный канцероген. Таким образом, мы опять приходим к парадоксальному заключению: защитная система оказывается и потенциально опасной, причем опасность эта скрытая.

Но все же регуляция ее возможна. Так, известно, что цитохром Р-450, индуцируемый барбитуратами, отличается от соответствующего белка, индуцируемого 3-метилхолентреном.

Теперь, имея представление о важнейших свойствах биохимической системы защиты, рассмотрим вкратце, как она изменяется при старении организма. Общее количество микросом (1 мг белка в расчете на 1 г массы ткани) в процессе старения крыс уменьшается. Изменение функциональной способности оксидазной системы микросом печени может быть обусловлено также уменьшением текучести липидного бислоя мембран микросом. О том, что физико-химическое изменение мембран происходит, свидетельствует изменение спектров электронного парамагнитного резонанса спиновой метки, растворимой в липидной фазе.

Дуглас Шмуклер и Роза Уонг из отдела биологии старения клетки медицинского центра и центра анатомии печени Калифорнийского университета исследовали активность системы НАДРН-цитохрома с — Р-450 — редуктазы микросом печени крыс 3, 9 и 27 месяцев. Оказалось, что удельная активность последнего фермента, как связанного, так и не связанного с мембранами микросом, наибольшая у 3- и 9-месячных крыс.

Поскольку содержание цитохрома Р-450 может возрастать при воздействии на организм токсических веществ большое значение имеет не только исходный уровень его активности, но и способность клеток к индуцированному синтезу такого белка. Добавки в пищу определенных сорбентов приводили к увеличению продолжительности жизни крыс на 30–40 %. Хотя содержание цитохрома Р-450 в их печени уменьшалось, потенциальная активность ферментных систем, обезвреживающих токсические вещества, существенно возрастала.

На основе этих данных можно полагать, что цитохром Р-450 участвует в обезвреживании не только токсических веществ, которые поступают извне, но и эндогенных токсических факторов. Иными словами, исходя из анализа биологических основ старения, мы можем предположительно находить новые грани работы биохимических систем. Что же касается самой идеи значения эндогенных токсических факторов в старении, то ее можно рассматривать как естественное продолжение представления И. И. Мечникова о роли токсинов. Правда, он имел в виду "токсины", синтезируемые не клетками организма, а живущими в его кишечнике микроорганизмами. Но ведь микроорганизмы, рассматривавшиеся И. И. Мечниковым, были не патогенными, а постоянно находящимися в организме. Во всяком случае, становится ясным, что в пожилом и старческом возрасте из-за снижения защитных возможностей даже эндогенная интоксикация организма может нарушать те или иные его функции путем усиления молекулярных механизмов деструкции: генома, полирибосом, мембран или "энергетических станций" клетки.

Тот же факт, что при старении уменьшается способность к индуцируемому синтезу микросомальных защитных ферментов, подтверждает общие закономерности, которые мы выявили ранее (см. главу II) при анализе других биологических основ старения: во-первых, то, что один из характерных признаков старения — снижение не только (и даже не столько) уровня функциональной активности клетки, органа или организма, сколько функциональной способности их, и, во-вторых, что в процессе, старения уменьшается способность клеток к индуцируемому синтезу по крайней мере некоторых белков. — Однако данные, полученные при экспериментальном исследовании печени грызунов, следует с осторожностью переносить на людей. Ведь такие данные позволяют делать лишь предположительные заключения об изменении защитной функции печени при старении всех млекопитающих. Так, один из основных результатов исследований рассматриваемой защитной системы состоит в том, что активность большинства ферментов микросом печени, участвующих в метаболизме чужеродных веществ, в частности лекарств, уменьшается с возрастом. Но значительны такие изменения лишь в печени самцов крыс, а не самок. В изолированных гепатоцитах печени самцов крыс обнаружено значительное снижение активности монооксигеназной системы, участвующей в метаболизме ксенобиотиков. Даже у мышей закономерности возрастных и половых различий ферментов, участвующих в таком метаболизме, отличаются от закономерностей, наблюдаемых у крыс. Правда, как правило, при старении всех исследованных грызунов наблюдается снижение с возрастом способности организма экскретировать с желчью неметаболизируемые печенью ксенобиотики и содержания в микросомах печени цитохрома Р-450.

Следовательно, можно предположить, что окислительный метаболизм ксенобиотиков, в частности лекарств, при старении млекопитающих, как правило, уменьшается. Если такая закономерность верна и для человека, то нужно предвидеть, что печень и организм в целом пожилого и тем более старого человека более чувствительны к токсическому действию факторов, загрязняющих окружающую среду, а также к побочному (токсическому) действию лекарств.

Неожиданными являются данные о половых различиях изменений у крыс активности ферментов микросом при старении. То, что такие изменения наблюдаются преимущественно у самцов, "соблазнительно" связать с известной закономерностью: ведь у млекопитающих вообще (включая человека) продолжительность жизни самцов обычно меньше, чем самок. Однако вопрос о том, какой "вклад" в это различие вносят половые особенности старения ферментов монооксигеназной системы клеток печени и всей печени в целом, пока может быть только поставлен.

Мы видим, что система защитных механизмов сложна и разнообразна, однако в организации и работе этой системы прослеживается систематичность. Прежде всего это касается взаимосвязи механизмов защиты на различных уровнях организации. Так, рассматривая физиологические механизмы защиты, мы пришли к заключению, что они взаимосвязаны с молекулярными (внутриклеточными) механизмами самозащиты, а последние представляют лишь часть глубинных ее эшелонов. Можно даже отметить однонаправленность физиологических и молекулярных механизмов защиты. Например, мы теперь понимаем, что в крови содержатся эндогенные, генотоксические вещества, от которых так же, как и от содержащихся в окружающей среде генотоксических факторов, нервные клетки головного мозга должны быть надежно защищены.

Сегодня мы можем расшифровать уже цитированное нами предвидение Стефана Цвейга: "Наш мозг… так хрупок, так сложен, что достаточно задетого сосудика… малейшего изменения какой-нибудь молекулы, чтобы нарушить высшую всеобъемлющую гармонию человеческого ума". Такая молекула теперь известна. Это ДНК, "малейшее изменение" которой может нарушить структуру жизненно важного белка и, следовательно, функцию нервной клетки.

Но если функции гематоэнцефалического барьера будут нарушены, то снизить уязвимость ДНК могут еще молекулярные системы обороны, включая механизмы репарации ДНК. Защиту же ДНК половых клеток осуществляют наряду с последними и гистогематические барьеры, а мужских половых клеток — гематотестикулярный.

Существуют и другие различные биологические барьеры для мутагенных и канцерогенных веществ. Например, чужеродные вещества, содержащиеся в окружающей среде и обладающие мутагенными свойствами, могут нейтрализоваться факторами, содержащимися в слюне. Известно также, что активность такого сильного мутагена, как N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидана при попадании в кровь млекопитающих резко снижается. Ну а роль кожных покровов в предохранении организма от факторов, загрязняющих окружающую среду, известна каждому.

При сравнении молекулярных механизмов (биохимических) и клеточных защитных систем обнаруживается столь сильное сходство, что это не может не привести к мысли об общности их происхождения. Например, выше мы пришли к заключению, что в работе микросомальных гидроксилаз, защищающих организм от токсических и канцерогенных чужеродных веществ, и в функции макрофагов, защищающих организм от микробов, значение имеет образование супероксидного радикала.

Мы ограничили наш анализ защитных механизмов лишь животными организмами. Но ведь и растения имеют защитные механизмы, в частности, определяющие их устойчивость к патогенным для растений вирусам и грибкам. Есть основания полагать, что одно из звеньев этой системы обороны — выработка активных форм кислорода клетками растений с целью поражения этим химическим оружием патогенных для них биологических систем. Но клетки и животных, и растений, вырабатывая активные формы кислорода, неизбежно повреждают собственные структуры, включая генетические (о чем подробно было рассказано ранее), а также структуры других клеток. ДНКазы, участвуя в репарации ДНК, также неизбежно повреждают и здоровые участки генома и т. д.

Таким образом, работа защитных механизмов, направленная против вредных для клеток и организма воздействий, сама, оказывается, имеет "вредный" компонент. Становится ясным, что длительность существования клеток и организмов должна зависеть от соотношения благотворной функции и вредных последствий работы этих механизмов. Несовершенство систем защиты генетических и других структур клетки от радикалов ОН·, , от Н₂О₂, перекисей липидов и других эндогенно-образуемых потенциально вредных факторов служит одной из основных причин накопления с возрастом повреждений в ДНК, липофусцина — в цитоплазме, межмолекулярных сшивок — в межклеточном веществе.

Несовершенство систем репарации ДНК состоит не только в том, что часть повреждений "ускользает" от ре-парирующих ферментов, но и в том, что эти же ферменты могут функционировать с ошибками, тем самым усиливая повреждения и становясь механизмом не защиты, а развития болезни.

Лишь имея это в виду, можно понять и следующую, казалось бы, парадоксальную закономерность в организации различных млекопитающих. Активность ферментов цитохрома Р-450 тем больше, чем меньше их видовая продолжительность жизни. Эти ферменты участвуют в метаболизме не только чужеродных веществ (о чем было рассказано ранее), но и стероидных гормонов, причем и в процессе таких биохимических превращений могут образовываться свободные радикалы. Эти вещества, содержащие неспаренные электроны и потому обладающие высокой реакционной способностью, также могут повреждать и ДНК, и другие структуры клетки и разрушать межклеточное вещество. Таким образом, защитные биохимические системы участвует и в нормальном метаболизме; причем в результате этого могут происходить "побочные" биохимические процессы, отдаленным последствием которых может быть снижение жизнеспособности организма и увеличение его предрасположенности к болезням.

Следовательно, при обобщении основного из сказанного до сих пор о механизмах старения логичен вывод: снижение функциональной способности с возрастом можно связать с отмеченным несовершенством функции защитных систем и тем, что это несовершенство в процессе старения усиливается, т. е. эффективность работы защитных систем ухудшается.

Кроме того, со снижением эффективности работы защитных систем связан, вероятно, и другой класс свойств организма, неизбежно сопровождающий старение, — увеличение предрасположенности к болезням.