Журнал «Вокруг Света» №09 за 2007 год

Самонаводящаяся таблетка

Для пациентов механизм действия лекарств прост и понятен: принял таблетку — и голова болеть перестала. А для фармакологов судьба препаратов в организме — непрекращающаяся головная боль. Около ста лет назад великий химик и микробиолог Пауль Эрлих назвал «волшебной пулей» лекарства, которые когда-нибудь смогут без побочных эффектов уничтожать только патогенные бактерии или больные клетки. Этот идеал до сих пор остается мечтой, но мечта все же становится более реалистичной.

Желатиновые капсулы или оболочки таблеток могут защитить лекарственные вещества от соляной кислоты в желудке, пищеварительных ферментов и других химически активных веществ. Но в клетки кишечника препарат всасывается в виде беззащитных перед очередными ферментами молекул. В крови (в том числе при внутривенном введении) на него могут наброситься антитела и другие белки. Потом лекарство попадает в печень, главная задача которой — разрушать все чужеродные вещества, и в почки, которые выводят их из организма. В результате не только меняется концентрация препарата в расчете на килограмм веса пациента, но и само действующее вещество после множества химических реакций может превратиться в нечто бесполезное и даже вредное.

Когда то, что осталось от 0,5 г или 0,001 мг препарата, входившего в состав таблетки, наконец добирается до внутренних органов, возникает новая проблема. Лекарство поступает во все клетки организма, а не только в больные, и таблетка, например, «от головы» действует также на сердце, печень, легкие — и далее по анатомическому атласу. И чем более сильнодействующим является препарат, тем больше для него справедлива пословица «одно лечим, другое калечим». Особенно остро эта проблема стоит в онкологии: там применяют настолько токсичные вещества, что врачам приходится балансировать на лезвии бритвы, чтобы уничтожить опухоль и при этом не убить пациента.

Липосома в процессе слияния с клеточной мембраной (компьютерная модель)

Оболочка и система наведения

Первым шагом в деле доставки лекарств точно «по адресу», в больной орган, стало открытие в 1960-х годах липосом. Липосомы состоят из жироподобных веществ — фосфолипидов или других молекул, имеющих гидрофильную «головку» и гидрофобный «хвост». В водном растворе эти молекулы сами собой собираются в двухслойные шарики, как будто занимают круговую оборону. А внутренность шарика заполняет растворенное в воде лекарственное вещество. Для защиты липосом от преждевременного разрушения используют своего рода стелс-технологии: шарики покрывают слоем полиэтиленгликоля — инертного вещества, которое делает микрочастицы невидимыми для иммунной системы. Такие микросферы защищают препарат от ферментов на пути к клетке и не позволяют ему раствориться в крови или межтканевой жидкости. Это особенно важно для токсичных веществ — их общее негативное действие на организм заметно снижается. При контакте с мембраной клетки липосома сливается с ней, высвобождая действующее вещество. Вот только отличить больную клетку от здоровой липосома сама по себе не может.

Чтобы навести микроскопическую бомбу на цель, к ее поверхности прикрепляют специальные белки, называемые антителами, которые система иммунитета использует для опознавания «чужаков». Наткнувшись на молекулу антигена (например, белок оболочки вируса), антитело меняет свою форму — для клеток иммунной системы это означает «вызываю огонь на себя». По специфическим, не характерным для здоровых клеток белкам антитела распознают и «свои» клетки, ставшие опасными для организма, — зараженные вирусами, мутировавшие или злокачественные. Их в организме, по разным оценкам, ежедневно образуется от нескольких десятков тысяч до миллионов, а в опухоль они развиваются тогда, когда иммунная система не справляется с их уничтожением.

К сожалению, единого лекарства «от рака» нет и, скорее всего, не будет: рак — это сотни разных болезней, при которых начинают бесконтрольно делиться клетки десятков разных тканей из-за нарушений в сотнях уже известных и тысячах пока неизвестных генов. Однако найдены уже десятки белков-маркеров, характерных для определенных видов опухолей. Антитела к ним — даже без дополнительного вооружения — могут сработать как микроскопические волшебные пули. Облепив со всех сторон бактерию, вирус или больную клетку, антитела начинают мешать последним. Но еще важнее, что к антителам прикрепляются проплывающие мимо цитотоксические (ядовитые для клеток) Т-лимфоциты, а также Т-лимфоциты-киллеры и фагоциты, они же макрофаги — клетки-«пожиратели», которые захватывают и переваривают возбудителей инфекционных заболеваний и крупные чужеродные молекулы.

Моноклональные антитела прикрепляются строго только к своим мишенямэпитопам и могут доставлять к ним определенные молекулы. На снимке: участок ткани, в котором разные типы клеток окрашены четырьмя видами моноклональных антител, несущих флуоресцентные маркеры разных цветов

Однако по-настоящему серьезным прорывом в медицине и биологии стала технология получения моноклональных антител, которую разработали Георг Кёлер и Сезсар Мильштейн в 1975 году. (За это открытие в 1984 году им была присуждена Нобелевская премия.) Моноклональные антитела подходят только к одному, строго определенному эпитопу конкретного антигена. Например, пометив их флуоресцентными молекулами, можно следить за перемещениями в живом организме клеток определенного типа. Таким образом, они стали незаменимым инструментом для исследователей. Но до наступления эпохи генной инженерии их применение в медицине было экзотикой. Дело в том, что получали моноклональные антитела буквально по микрограмму при помощи специальных химерных клеток гибридом — образованных слиянием клеток опухоли-миеломы, способной к неограниченному росту в питательной среде, и В-лимфоцитов, продуцирующих антитела. Для получения моноклональных антител из культуры гибридом вылавливают отдельные клетки и каждую помещают для размножения в отдельный плоский флакон с питательной средой. Выращенные в результате клоны синтезируют именно такие антитела, которые нужны в каждом конкретном случае.

В современной фармакологии гибридомы применяют только на стадии разработки препарата. А когда один из десятков, а то и сотен вариантов наработанных дедовским способом антител окажется достаточно безопасным и эффективным, их начинают производить клетки обычной опухоли-миеломы. В геном последних встроены выделенные из гибридом гены, необходимые для синтеза нацеленных на врага антител. А в скором будущем этим займутся трансгенные растения и животные. Последние — совсем скоро: американская компания GTC Biotherapeutics заканчивает формальности, необходимые для выхода на рынок человеческого белка антитромбина из молока трансгенных коз.

Первый противораковый препарат на основе моноклональных антител — ритуксимаб — был разрешен в 1997 году для лечения одной из форм рака крови — CD20-положительных В-клеточных лимфом. (CD20 — белок, характерный для злокачественных В-лимфоцитов.) Через год сенсацией для онкологов стали результаты применения трастузумаба у больных раком молочной железы. Сейчас разрешено к применению около 20 препаратов, в название которых входят буквы «маб» — от MAb, monoclonal antibody. И не только в онкологии, но и для предотвращения отторжения трансплантатов, сохранения бета-клеток поджелудочной железы при сахарном диабете I типа, лечения ревматоидного артрита и других воспалительных и аутоиммунных заболеваний. На разных стадиях испытаний на животных и людях сейчас находятся сотни антител.

Во многих препаратах к антителам «подвешивают» ингибиторы, замедляющие рост кровеносных сосудов (без питания опухоль легче добить обычными химиопрепаратами), или атомы радиоактивных изотопов, токсинов, иммуномодуляторов — это на порядки усиливает их смертоносное влияние на раковые клетки. Правда, после операции и последующих химио- или радиотерапии в организме все равно остается какое-то количество недобитых злокачественных клеток. Если повезет, с ними справится иммунная система — особенно если ей помочь.

Лекарства и косметика

Во многих современных таблетках и биологически активных добавках действующие вещества упакованы в липосомы, но пациенты обычно не обращают внимания на такие тонкости: помогает — и слава Богу. А вот о кремах и лосьонах с липосомами слышали, наверное, даже те, кто из всего косметического изобилия пользуется только мылом да одеколоном: от рекламы не спрячешься. Но настоящие, а не телевизионные косметологи очень сомневаются в большей эффективности липосомальной косметики по сравнению с обычной. Ни теоретических обоснований этому нет, ни серьезных экспериментов никто не ставил — тем более что получить разрешение на производство косметики намного легче, чем внедрить новое лекарство. Каким образом липосомы проникают через верхний слой кожи или в волосы от корней до самого кончика, никому не известно. Зато в сознание потребителя они проскальзывают с необычайной легкостью. А за удовольствие оттого, что крем в очередной яркой баночке — не простой, а изготовленный с помощью высоких технологий, доплатить не жалко.

Хорошо обученные клетки

Одной из причин образования опухоли является то, что сложная система иммунитета дает сбой и не реагирует на злокачественные клетки. По той же причине даже немногочисленные такие клетки, выжившие после лечения, могут вызвать рецидив болезни. Но иммунную систему можно обучать — например, так, как это делают ученые из медицинского центра Cedars-Sinai (Лос-Анджелес, Калифорния). Методы воздействия они отрабатывают на мышах, больных глиомой — одной из наиболее распространенных опухолей мозга, очень агрессивной, плохо поддающейся лечению и часто дающей рецидивы. Первый из предложенных ими вариантов иммунотерапии: выделить из крови особые дендритные клетки (в системе иммунитета они играют роль инструкторов: разбирают антигены на части и отдают их на распознавание исполнителям — Ти В-лимфоцитам), выдержать их в питательной среде с белками, полученными из удаленной опухоли, а потом вернуть «обработанные» дендритные клетки в кровоток пациента. Другой способ — с помощью генетически модифицированного вируса ввести в хромосомы все тех же дендритных клеток ген интерлейкина-23, одного из примерно полутора сотен цитокинов — белковых молекул, с помощью которых клетки иммунной системы переговариваются друг с другом. После этого дендритные клетки вводят непосредственно в опухоль, и увеличенная продукция интерлейкина-23 усиливает реакцию иммунной системы на раковые клетки. Такая целевая и долгоиграющая доставка намного эффективнее современных методов иммунотерапии с помощью введения в кровь или опухоль интерлейкинов и других иммуномодуляторов: как любые инородные белки, в организме они очень быстро разлагаются, а обученные или генетически модифицированные клетки синтезируют цитокины всю свою недолгую клеточную жизнь — недели или месяцы, и за это время успевают натренировать новые поколения «инструкторов» и «рейнджеров».

Не простые, а моноклональные

кратчайший словарь биологических терминов Антиген — чужеродное для организма вещество, вызывающее иммунный ответ — в частности, выработку антител.

Антитело (иммуноглобулин) — белок, синтезируемый иммунной системой в ответ на введение в организм антигена и связывающийся с одним из его эпитопов.

Эпитоп — группа из примерно десяти аминокислот в составе белкового антигена (или участок полисахаридной цепи, характерный для оболочек бактерий), к которому, как ключ к замку, подходит активный центр соответствующего антитела. Моноклональные антитела подходят только к одному, строго определенному эпитопу конкретного антигена.

Клон (в данном случае) — все потомки одного-единственного лимфоцита, вырабатывающие антитела только к определенному эпитопу, с которым когда-то «познакомился» их прародитель.

Пули размером с молекулу

По сравнению с липосомами наночастицы — как истребитель рядом с дирижаблем. И дело не только в размерах (десятки—сотни нанометров вместо десятков—сотен микрон у липосом), но и в возможностях. На одну молекулу антитела, избирательно связывающегося с белком-маркером часто встречающейся опухоли кожи — меланомы, — исследователи из Университета Райса (штат Техас) навешивают до сорока углеродных наносфер, нагруженных противоопухолевым препаратом. Вдобавок наноконтейнеры легче и глубже проникают в ткани и клетки. Грузоподъемность, маневренность и в конечном итоге эффективность эскадрильи таких наноистребителей существенно выше, чем у липосомы такого же веса.

Дендример — искусственно созданный ветвящийся полимер. Такие «ветвящиеся шарики» можно приспособить для адресной доставки лекарственных молекул (компьютерная графика)

Наносферы и нанотрубки можно делать из инертных веществ, на которые не реагирует иммунная система (самое распространенное из них — чистый углерод), а также из нуклеиновых кислот или биоразрушаемых полимеров. Наносферы — причем заданного размера, от 1 до 10 нм — можно плести из открытых совсем недавно древообразных полимеров — дендримеров. При самосборке их молекулы образуют шарики, состоящие из «веток», к которым очень удобно крепить самые разные молекулы. Один из способов применения дендримеров в онкологии разработали исследователи из Мичиганского университета. Они научились с помощью небольшого отрезка ДНК соединять два таких наноконтейнера. Первый из них наполняют антителами к рецептору фолиевой кислоты — витамина В9, в котором опухолевые клетки нуждаются намного сильнее, чем здоровые, и поэтому выставляют на поверхность соответствующие рецепторы. Второй контейнер содержит флуоресцентное вещество. Такая система хорошо подходит для диагностики рака: маркерным концом наночастицы прикрепляются к больным клеткам, а обнаружить их можно по свечению второго контейнера в ответ на короткие импульсы поляризованного света. Сейчас исследователи работают над следующим этапом — «бомбовый отсек» можно заполнить лекарственным веществом, а «радар» нацелить на любой белок, характерный только для определенного типа клеток.

Впрочем, с помощью наночастиц можно выжечь опухоль вообще без лекарств. Один из таких методов разработали отец и сын Эль-Сайед, Мустафа и Айвэн (Mustafa & Ivan El-Sayed) из Университета Калифорнии в Сан-Франциско. Золотые наночастицы они покрывали антителами к белку с длинным названием «рецептор эпидермального фактора роста», который встречается на поверхности многих типов раковых клеток, а для здоровых нехарактерен. Опыты ставили на двух культурах клеток: здорового человеческого эпителия и клеток сквамозной карциномы полости рта. Под действием луча лазера закрепившиеся на поверхности злокачественных клеток золотые наночастицы разогревались и уничтожали раковые клетки, а здоровые при той же интенсивности излучения оставались живыми и по-прежнему здоровыми.

Дрессированные вирусы

Полный геном человека состоит примерно из шести миллиардов пар нуклеотидных оснований (в двух наборах хромосом). Изменение отдельной «буквы» в геноме может пройти незамеченным, или оказаться смертельным, или вызвать болезнь, причем как прямо, так и косвенно. Не меньше половины наших болезней тем или иным образом зависят от генов. Известно уже около тысячи только моногенных наследственных болезней, то есть связанных с нарушением работы всего одного из примерно 30 000 пар генов.

На разных стадиях клинических испытаний сейчас находятся сотни методов генотерапии. Разрабатываются и испытываются на животных — тысячи. В большинстве случаев для доставки генов в клетки используют вирусы: именно этим они занимаются в природе уже миллиарды лет (к счастью, с переменным успехом). Но даже самые страшные вирусы можно использовать в мирных целях.

Муковисцидоз (кистозный фиброз) — тяжелое и часто встречающееся наследственное заболевание. В Северной и Центральной Европе он обнаруживается у одного новорожденного из 2 000. Название болезни образовано из латинских слов mucus — «слизь» и viscidus — «липкий», поскольку проявляется она обычно повышенной вязкостью слизистых оболочек, хотя нарушения в работе организма носят комплексный характер. Больные обычно умирают, не дотянув до 20 лет из-за различных заболеваний легких или просто от удушья. Причиной же заболевания является дефект гена, кодирующего белок, который обеспечивает и регулирует транспорт ионов хлора через клеточную мембрану. Существующие методы лечения муковисцидоза неэффективны, и надеяться можно только на то, что в клетки больного удастся ввести нормальный ген трансмембранного регуляторного белка CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductase regulator).

Ученые Пенсильванского университета создали для лечения больных муковисцидозом гибрид двух смертельно опасных вирусов. Вирус иммунодефицита человека хорошо умеет добавлять гены в хромосомы, но не способен проникать в клетки эпителия легких. Поэтому его «переодели» в белковую оболочку вируса геморрагической лихорадки Эбола — редкого, но очень опасного заболевания. Разумеется, ВИЧ при этом надежно обезвредили, а на место удаленных генов вставили ген CFTR. Белковая оболочка Эболы сама по себе, без вирусных генов, тоже не опасна, но зато хорошо умеет соединяться с нужными клетками.

В опытах на мышах и обезьянах после вдыхания аэрозоля из лечебных вирусов более 20% клеток легочного эпителия получили нужный ген. Правда, через несколько месяцев лечение приходится повторять из-за естественного отмирания зараженных (вернее, исцеленных) клеток. Ввести лечебный ген навсегда и во все клетки организма — задача более сложная.

До больных этот метод, если все пойдет гладко, доберется лет через десять, после окончания клинических испытаний, как и сотни других препаратов для генотерапии самых разных заболеваний, причем не только классических наследственных, таких как муковисцидоз. Деятельностью любой клетки управляют гены, и изменение их активности из-за врожденных нарушений, приобретенных мутаций, временного усиления или ослабления синтеза закодированных в них белков является или причиной, или следствием любой болезни. Множество болезней можно вылечить или предупредить, доставив в клетки здоровый ген или заблокировав работу «неправильного», например, с помощью открытых недавно коротких интерферирующих РНК — двойных цепочек из двух десятков нуклеотидов каждая, которые нарушают процесс синтеза определенного белка. Это один из последних и наиболее перспективных методов генотерапии. Статью о нем в журнале Nature Эндрю Файр (Andrew Fire) и Крейг Мелло (Craig Mello) опубликовали в 1998 году, а в 2006 году они получили за свое открытие Нобелевскую премию. Кто знает, может быть, лет через сто даже от насморка будут прописывать не «химию», а капли с лечебными генами?

В медицине уже давно не случалось настоящих революций: все, что происходило после открытия антибиотиков, было неторопливым и равномерным прогрессом. Но возможно, именно методы адресной доставки лекарств (вместе с геномикой, протеомикой и другими новейшими достижениями биологии) через 10—20 лет приведут к радикальным изменениям в лечении болезней.

Интернет-ресурсы

www.cbio.ru — интернет-журнал «Коммерческая биотехнология». Единственный русскоязычный сайт, посвященный биотехнологии в целом

www.molbiol.ru — активный форум и справочный ресурс по молекулярной биологии

www.nature.com/nbt (англ.) — лучший в мире журнал по биотехнологии, публикующий также много сообщений, доступных неспециалистам Александр Чубенко