Журнал «Вокруг Света» №8 за 2003 год

Медпрактикум: Ребро Адама

Все мы знаем о том, что и огромный кит, и маленькая мышка в начале свой жизни состояли всего из одной-единственной клетки. Делясь, эта клеточка постепенно превращалась в большой и сложный организм, состоящий из самых разнообразных органов. Люди давно мечтают вырастить гомункула в пробирке и, похоже, уже вплотную подошли к решению этой задачи. Сегодня биологи, взяв совсем немного настоящих живых клеточек человека, могут построить не только полнофункциональный кожный покров, но и воссоздать кусочек печени или сердца.

Принято считать, что работы в области тканевой инженерии ведут свой отсчет от пионерских исследований профессора Ховарда Грина (Harvard Medical School), который в 1975 году предложил оригинальный способ культивирования и размножения клеток кожи человека в пробирке, или, как принято говорить, in vitro. Грин сумел получить многослойные пласты клеток, которые по своему строению были близки к нормальной человеческой коже, точнее, к ее верхнему слою, эпидермису.

В ходе первых экспериментов ученым удавалось получать из 1 клетки-прародительницы всего 10 дочерних, но уже через несколько лет это число возросло до 10 тысяч. Иначе говоря, из 1 см2 донорской кожи можно было получить 1м2 кожного покрова.

В 1981 году появилось описание двух успешных экспериментов по применению клеточных пластов, которые были получены в лабораторных условиях для восстановления кожи после обширных поверхностных ожогов (40—60% от общей поверхности кожи). В качестве исходного клеточного материала использовались клетки кожи самих пациентов, то есть аутологичные клетки. В настоящее время проводятся и работы в области тканевой инженерии на аллогенных, то есть донорских, клетках.

В 2000 году авторитетный американский журнал «Тайм» опубликовал список наиболее перспективных профессий наступающего десятилетия. Верхнюю строку в этом рейтинге заняла тканевая инженерия. Во многих университетах США и Западной Европы один за другим открываются центры тканевой инженерии. Обычно студенты, получая степень бакалавра на «традиционных» факультетах, завершают образование степенью магистра или доктора, специализируясь в области тканевой инженерии. Сходная система обучения работает и в нашей стране, в Пущинском государственном университете. Там ведется подготовка магистров в области тканевой инженерии, а принимают на обучение бакалавров, имеющих специальность биофизика.

Клеточные пласты (как монослойные, так и многослойные) характерны для тканей, называемых эпителиальными. Другой важный тип тканей – мезенхимальный – специфичен тем, что клетки в нем распределены в трехмерном внеклеточном матриксе. Одна из основных функций таких тканей – соединительная, связующая части организма между собой. Кожа человека состоит из верхнего защитного слоя – эпидермиса и слоя соединительной ткани – дермы. Для реконструкции соединительной ткани недостаточно только наличия необходимого количества определенного типа клеток – в этом случае нужно воссоздать внеклеточный матрикс.

Первым эту задачу решил профессор биологии Массачусетского технологического института Юджин Белл. Он приготовил раствор основного белка внеклеточного матрикса – коллагена, а затем внес в этот раствор суспензию клеток – фибробластов. И за те несколько минут, пока раствор превращался в гель, внутри него сформировались волокна, вдоль которых и распластались клетки. Самым же удивительным оказалось то, что клетки внутри этого геля могли жить более месяца, при этом кардинально реорганизуя внутреннюю структуру биоматериала. Гель уменьшился в размере в несколько раз и стал более плотным и прочным, причем структура получившегося трехмерного коллагенового геля вполне соответствовала прототипу, поэтому он мог служить аналогом соединительной ткани.

К 1980 году были независимо реконструированы основные компоненты кожи – эпидермис и дерма. А спустя недолгое время нанесением эпидермального пласта на коллагеновый гель с фибробластами in vitro был получен первый полнослойный аналог кожи.

В принципе для каждой ткани характерен совершенно уникальный набор биологических молекул, а также пространственная архитектура, которую образует внеклеточный матрикс. Теоретически можно было предположить, что если воспроизвести основные компоненты и структуру матрикса, то задача регенерации будет решена. На практике же все оказалось гораздо сложнее. Дело в том, что аналог ткани должен быть привнесен на место утраченного органа или ткани, то есть на раневую поверхность. В случае применения коллагенового геля искусственная ткань за несколько часов просто распадается под действием агрессивной раневой среды. И для того чтобы избежать этого процесса, приходится различными методами «усиливать» конструкцию материала, например, сшивать его различными агентами или добавлять синтетические полимеры. В результате получается сложный и многофункциональный материал, свойства которого не остаются неизменными, а видоизменяются по ходу процесса заживления.

В России работы по реконструкции тканей и органов при помощи клеточных культур ведутся с начала 1980-х годов. Первые успешные пересадки клеток кожи были проведены в Ожоговом центре Института хирургии им. Вишневского под руководством академика АМН М.И. Кузина с привлечением сотрудников Московского института медико-биологических проблем и Института биологической физики Академии наук СССР. В дальнейшем в орбиту работ по тканевой инженерии кожи были вовлечены практически все ведущие ожоговые центры России, среди них Военно-медицинская академия (Санкт-Петербург) и Институт им. Склифосовского. Наряду с исследованиями в области клеточных культур велись разработки полимерных материалов – носителей клеток, коллагеновых пленок и гелей. В настоящее время развитие тканевой инженерии в России происходит в рамках программы по стволовым клеткам, в которой участвуют ведущие научные коллективы страны.

Даже если в распоряжении «медицинского инженера» находятся все необходимые компоненты, получение аналога ткани это не гарантирует. Если оперировать строительными терминами, для этого необходимы сначала проект, а потом непосредственно строители. «Строителями» в нашем случае являются сами клетки. Именно они, взаимодействуя между собой и перестраивая внеклеточное вещество, создают ткань. Причем создают, согласно своим клеточным программам. В большинстве случаев «проектировщик» лишь задает начальные и граничные условия формирования ткани, запуская процесс самоорганизации. Например, для того чтобы методами тканевой инженерии создать стенку кровеносного сосуда, приходится имитировать условия, характерные для кровеносного русла, – организовывать проток питательной среды, вызывать циклические механические возмущения (пульсовую волну) и тому подобное. Только в этих условиях клетки сосудов, размножаясь, могут сформировать необходимые аналоги. Анализ процессов реконструкции кожи позволил сформулировать основные законы тканевой инженерии и перейти к регенерации других органов in vitro. Одним из главных условий получения аналога ткани является наличие подходящего клеточного материала. Причем клетка должна обладать совершенно определенными функциональными характеристиками. Например, клетки верхнего слоя кожи для выполнения защитной функции должны синтезировать большое количество белка – кератина, а клетки сердечной мышцы – обладать способностью к сокращению.

Источниками стволовых клеток являются не только эмбриональные ткани, но и постоянно регенерирующиеся ткани взрослого человека. Например, мезенхимальные стволовые клетки выделяют из костного мозга, а стволовые клетки эпидермиса кожи берут из волосяных фолликул – специализированных структур, ответственных за рост волос.

Выделение стволовых клеток из «взрослых» тканей связано с проблемой их идентификации, а значит, с поиском молекулярных маркеров (специфических белков на клеточной мембране), которые помогают распознать и отделить ее от общей клеточной массы.

Тем не менее ряд таких маркеров идентифицирован и есть возможность получать клеточные культуры из стволовых клеток взрослых тканей. Замечательным свойством «взрослых» клеток является способность к трансдифференцировке, иначе говоря, к перемене специализации. О том, что во взрослом организме существуют клетки, способные превращаться в любые другие, биологи узнали почти что случайно. После одной из пересадок женского костного мозга мужчине при последующих биохимических анализах оказалось, что в клетках печени и других органов мужчины успешно функционируют соответствующие специализированные клетки, имеющие женский набор хромосом. Так был открыт механизм уникальной способности живых организмов восстанавливать то, что «сломалось» или погибло в процессе жизнедеятельности. Так, стволовые клетки мозга способны превращаться в клетки крови, а стволовые клетки кроветворной системы могут дифференцироваться, в зависимости от молекулярных сигналов, в клетки сердечной мышцы или печени. Однако проблема эффективного распознавания и выделения стволовых клеток из общей клеточной массы, а также управление процессами дифференцировки стволовых клеток еще далеки от своего разрешения.

На начальных этапах реконструкции ткани клетки интенсивно размножаются, а на заключительных – приобретают специфические функции, то есть дифференцируются. В ходе культивирования происходит как бы переключение программы клетки с пролиферации (деления) на дифференцировку (специализацию). Всего в человеческом организме существует около 220 типов клеток, и для многих из них механизмы такого переключения пока неизвестны. Исключительно перспективным в тканевой инженерии считается применение эмбриональных стволовых клеток, из которых формируются различные ткани и органы в процессе внутриутробного развития. Эти клетки обладают высокой пролиферативной активностью и способны к самой разнообразной дифференцировке. Эмбриональные стволовые клетки человека выделяют на стадии развития эмбриона, которую именуют бластоцистой, что соответствует пятому дню от момента оплодотворения яйцеклетки. На этой стадии сферическая бластоциста состоит из 150 клеток, из которых 30 – стволовые. Используя это совсем небольшое количество клеток, в дальнейшем нарабатывается необходимая клеточная масса для реконструкции ткани. Обычно в работах по тканевой инженерии экспериментатору приходится оперировать с клеточными культурами, содержащими от десятков тысяч до сотен миллионов клеток, а это означает, что клетки в культуре прошли несколько десятков циклов деления. Однако лишь в 1998 году удалось получить устойчивую культуру стволовых клеток человека, делившуюся более 6 месяцев (аналогичная линия мышиных стволовых клеток была получена еще в 1981 году).

После того как стали понятны общие закономерности получения тканей и органов при помощи клеточных культур, работы по тканевой инженерии встали на поток. Уже в 1980-х годах была реконструирована хрящевая ткань, немногим позже – костная и мышечная, кровеносные сосуды и, частично, – проводящая система сердца. Получены также фрагменты печени и почек. При помощи клеточных культур репарируются дефекты нервных волокон. Не будет преувеличением сказать, что на сегодня в лабораторных условиях получены аналоги практически всех тканей и органов.

Первые же успехи тканевой инженерии привлекли к себе внимание американских производителей, работающих в области высоких технологий. Еще в 80-е годы в Калифорнии и Массачусетсе на базе университетов было создано несколько компаний, специализирующихся на тканевой инженерии. Однако путь к коммерческим продуктам оказался тернистым и долгим из-за большого количества чисто технологических проблем. В частности, пришлось разработать методы криоконсервации искусственных тканей и создать низкотемпературные хранилища тканевых эквивалентов. И только после этого удалось перейти к «поточному производству».

Кардинально преобразило тканевую инженерию наличие банков искусственных тканей. Если на первых этапах развития каждый кусочек кожи был уникален и «подгонялся» к конкретному пациенту, то сейчас ситуация больше напоминает процедуру по переливанию крови. Усовершенствовалась и транспортировка эквивалентов, которая в отдельных случаях напоминает отрывки из фильмов с погонями. Судите сами: тканевый элемент в специальном контейнере доставляется курьером-мотоциклистом из лаборатории к трапу самолета, в аэропорту прибытия эстафету принимает другой мотокурьер, доставляющий ожидаемое изделие непосредственно в операционную, где в режиме ожидания уже находится бригада врачей.

Существенно снизить цену на тканевые эквиваленты позволило наличие специальных хранилищ. Если стоимость первых успешных пересадок оценивалась в десятки тысяч долларов, то сейчас расценки выглядят более умеренно. Так, стоимость аналога дермального слоя кожи составляет 500 долларов за 1дм2 . А вот полнослойный эквивалент кожи – уже дороже, около 1 500 долларов.

Как нередко бывает в области высоких технологий, цены здесь слабо коррелируют с себестоимостью производства. Прежде всего они адекватны американской медицинской системе и текущей рыночной ситуации. Например, популярное в США перевязочное покрытие «Biobrane», которое выпускается уже более двух десятилетий и активно используется при лечении ожогов, стоит несколько десятков долларов за 1 дм2 . В то же время основными компонентами этого материала являются синтетические полимеры на основе нейлона и силикона, а также желатин, понятно, что цена в данном случае во много раз превышает себестоимость.

Впрочем, роль хай-тек-компаний не свелась только к тиражированию продуктов и продвижению их на рынок. Именно биотехнологические фирмы провели весь цикл доклинических и клинических испытаний. Их результаты дали ответы на ряд принципиальных вопросов, без которых невозможно было бы широкое внедрение тканевой инженерии.

Дело в том, что клетки при культивировании могут изменять свои свойства и превращаться из нормальных в трансформированные, близкие по характеристикам к опухолевым. Причины таких изменений могут быть самыми разнообразными, и молекулярные механизмы этого процесса неясны и по сей день. Вероятность перерождения возрастает при стимулировании размножения клеток. Разумеется, риски подобного рода должны быть минимизированы. На практике это означает более строгий контроль за клетками в культуре, включая анализ их генетического аппарата. При любой трансплантации существует проблема иммунного ответа организма на донорские аллоклетки. Эта реакция связана с наличием на клеточной мембране пересаживаемых клеток особых сигнальных молекул, которые и распознаются иммунной системой реципиента по принципу «свой—чужой».

В ходе экспериментов на клеточных культурах выяснилось, что в процессе культивирования клетки перестают вырабатывать иммуногенные молекулы, а значит, теряют иммунологическую реактивность. Это счастливое обстоятельство, механизм которого до конца не изучен, позволяет осуществлять пересадки выращенных органов без применения иммунодепрессантов, которые приводят к многочисленным осложнениям при обычной пересадке, в том числе чужого сердца или почек.

Разумеется, любой донорский материал должен быть протестирован на наличие вирусов и микроорганизмов. Однако сам процесс культивирования содержит в себе реальную возможность заражения клеток. Источником могут являться питательные среды, сыворотки или нарушение регламента работ. Контроль стерильности, строжайшее выполнение лабораторных протоколов – необходимейшее условие тканевой инженерии, поскольку инфицирование клеточной культуры не оставляет никаких шансов на успешную реконструкцию ткани.

Масштаб проблем, с которыми столкнулись биотехнологические компании, специализирующиеся в области тканевой инженерии, наглядно иллюстрирует статистика результатов испытаний новых продуктов. В настоящее время в США (именно там находятся основные фирмы-производители) лишь 4 коммерческих продукта получили разрешение на применение в клинической практике (все они предназначены для реконструкции кожи), 9 продуктов проходят клинические испытания, 7 эти испытания не прошли.

Однако, несмотря на определенные технологические, политические, морально-этические и финансовые трудности, аналитики рынка перспективных капиталовложений твердо уверены, что следующий высокотехнологический инвестиционный бум будет связан именно с практическим применением биотехнологий, и в том числе тканевой инженерии.

Прямая речь

Заведующая лабораторией биотехнологий стволовых клеток НИИ трансплантологии и искусственных органов Нина Андреевна Онищенко.

Почти все дифференцированные клетки в организме имеют ограниченный срок жизни. В любом органе, будь то печень или сердце, клетки «болеют» и погибают из-за токсических влияний, загрязнения окружающей среды, неправильного питания, далеко не идеального образа жизни и многих других вредных факторов. Тогда почему мы так долго живем? Дело в том, что в организме происходит постоянная регенерация погибших клеток и замена их новыми, здоровыми, которые образуются либо вследствие деления с образованием идентичного генотипа, либо в процессе замещения дифференцированных клеток стволовыми. Оптимальным источником получения мезенхимальных стволовых клеток для регенерации является костный мозг, клетки которого имеют неоспоримые преимущества перед эмбриональными стволовыми клетками. Они хранят в себе информацию о строении всех тканей и органов, являясь своеобразным универсальным «банком» памяти. В нужный момент, когда от больного органа поступает сигнал SOS, стволовые клетки костного мозга тут же начинают делиться и превращаться в клетки требуемого для замены типа. Например, если разрушена печень, то стволовые клетки выходят из костного мозга и через кровь попадают в печень, становясь клетками печени. Однако с возрастом естественная миграция стволовых клеток снижается. Так, при рождении на 1 мезенхимальную стволовую клетку приходятся 10 тысяч стволовых кроветворных клеток, а вот к 70-летнему возрасту это соотношение выглядит как одна к миллиону. По мере взросления и старения человека они заменяются жировой тканью, красный костный мозг сокращается, а желтый, наоборот, разрастается. Тогда-то и возникает потребность в искусственной доставке стволовых клеток в поврежденный орган. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга обладают выраженной способностью к размножению, легко доступны, что позволяет многократно получать стволовые клетки. Немаловажно и то, что их получение не осложняется этическими проблемами, неизбежно возникающими при использовании эмбрионального материала. Отпадает также необходимость в подавлении иммунной системы, так как пересаживаются собственные клетки организма. Если же их брать у донора, то может возникнуть несовместимость и они будут отторгаться. Поэтому использовать их стараются только в крайних случаях, когда немедленная пересадка требуется по жизненным показателям. Выращивание же собственных клеток требует определенного времени, ведь из десяти клеток нужно создать миллионы и миллиарды.

Сотрудники нашей лаборатории занимаются всесторонним изучением возможностей стволовых клеток костного мозга, и можно сказать, на сегодняшний момент подошли к решению вопроса об их внедрении в клиническую практику уже очень близко. Благотворное действие регенерационной терапии с помощью мезенхимальных стволовых клеток (МСК) исследовалось на различных видах животных – крысах, кошках, морских свинках – при моделировании инфарктов миокарда, атеросклероза, жировой дистрофии печени, ожогов кожи и костных переломов. Для повышения эффективности в лаборатории биотехнологий стволовых клеток дополнительно проводилось «омоложение» клеток. Для этого их помещали на специальные среды с добавлением различных химических и биологических веществ, ускоряющих скорость деления и размножения клеток. А затем из этих «одифференцированных» клеток получали требуемые ткани. Например, необходимо воссоздать сердечную мышцу. В ее составе имеется так называемый тропониновый комплекс, которого нет в других органах. При наличии тропонина, под действием солей кальция, клетка меняет свой угол, что приводит к сокращению тканей. Кардиомиоцито подобные клетки «вытягивали» для придания им гибкости и эластичности. Введение в поврежденную сердечную мышцу МСК не только восстанавливает, но и улучшает ее работу. Практика проведенных экспериментов убедительно показала большие возможности применения стволовых клеток при лечении различных заболеваний, исключая, к сожалению, генетическую патологию. Достигнутые в этой области медицины результаты российских ученых получили высокую оценку на недавно проведенном международном симпозиуме, посвященном этой проблеме. И это обстоятельство дает основание надеяться на достаточно широкое использование стволовых клеток во многих направлениях клинической медицины уже в ближайшее время. А именно: в неврологии – для лечения последствий травм головного и спинного мозга, инсульта, коматозных состояний, нейродегенеративных заболеваний, в кардиологии – атеросклероза, ишемической болезни сердца и последствий инфаркта миокарда, в эндокринологии – инсулинозависимого диабета, болезни опорно-двигательного аппарата, в костной пластике – последствий травм, рубцово-спаечных процессов, а также в таких областях, как гепатология, гематология, косметология и геронтология.

Георгий Ижемский, кандидат физико-математических наук