Химический язык насекомых

Следствие ведут знатоки

В течение 20 веков под страхом пыток и смерти охраняли китайцы секреты производства шелка. И только в IV в., если верить преданию, китайская принцесса подарила своему мужу — бухарскому эмиру — яйца тутового шелкопряда. Этот бесценный дар, вывезенный из Китая в прическе женщины, положил начало развитию шелководства во многих странах Азии и Европы.

В XX в. тутовый шелкопряд опять заставил заговорить о себе. В 30-х годах, в одной из лабораторий Геттингенского университета А. Бутенандт, ученик известного А. Виндауса, был поглощен изучением половых гормонов, которые осуществляют важную регуляторную функцию в человеческом организме. Для выделения 15 мг одного из этих «регуляторов» — андростерона ученый переработал более 15 тыс. литров мочи, а для получения 20 мг чистого прогестерона потребовалось «сырье» от 50 тыс. свиней. Благодаря специальным методам анализа удалось установить строение этих веществ и синтезировать искусственные гормоны. За эти открытия немецкому химику А. Бутенандту была присуждена Нобелевская премия.

Казалось бы, какая может быть связь между историей с яйцами тутового шелкопряда и химией XX в.? Однако обстоятельства сложились так, что именно этому насекомому и работам профессора А. Бутенандта были посвящены первые страницы научных публикаций о проникновении человека в тайны химического языка мира шестиногих. Конечно, не искусство насекомых-ткачей, а возможность вырастить необходимое количество особей данного вида и неукротимая страсть к исследованиям позволили ученому испытать радость еще одного открытия.

Часто довольно странная судьба ожидает научные достижения в различных областях знаний. Успех немецкого химика — лишнее доказательство, что потребности практической жизни людей определяют бурное развитие той или иной науки. Когда пытливый человеческий ум в поисках нового оружия борьбы с насекомыми-вредителями обратил внимание на их химический язык, многие химики стали профессорами энтомологии.

Давайте совершим небольшое путешествие в «мастерскую» исследователей мира молекул и познакомимся с историей расшифровки химических «иероглифов».

«О, доктор Бутенандт, зачем вы тратите столько времени на возню с бабочками?» — раздался чей-то голос из аудитории после того, как ученый сообщил об установлении структуры и проведении синтеза полового феромона тутового шелкопряда. В течение 20 лет шаг за шагом приближался химик к познанию этой тайны. В 1939 году исследователь сделал первую попытку получить таинственное вещество. И если для производства шелковых нитей необходимы самцы шелкопряда, то для извлечения «пахучих» молекул ученому понадобились самки — более 300 тыс. особей. К этому надо добавить миллион коконов, давших жизнь подопытным насекомым, и тогда можно будет представить, сколь сложный материал был в руках исследователя. И все это ради получения нескольких миллиграммов чистого вещества.

Феромон тутового шелкопряда, 12 мг которого ученому удалось получить из тысячи насекомых, был назван бомбиколом. Вещество это представляет собой непредельный спирт, формула которого C₁₆H₃₂O₂.

По мнению популярного героя рассказов Конан Дойла, хороший детектив должен распознавать не менее 75 различных запахов. Очень часто приходилось знаменитому Шерлоку Холмсу прибегать к помощи химии. Не одно запутанное преступление раскрыл он, используя не только силу своего аналитического ума, но и знание некоторых методов химического анализа. Химики-аналитики при расшифровке тайн молекул очень часто напоминают детективов с той лишь разницей, что место действия всегда одно — лаборатория. Какими же методами пользуются ученые, проникая в секреты языка шестиногих?

Для ответа на призыв самки и преодоления огромных расстояний самцу насекомых часто достаточно всего одной «молекулы любви». Для химических исследований такого микроскопического количества недостаточно, поэтому возникает вопрос: как накопить исследуемое вещество?

Хорошо известно, что химические соединения легко сорбируются (от латинского sorbeo — поглощаю, втягиваю) пористыми материалами. Это явление можно часто наблюдать в быту. Вспомните, как после долгого хранения зимние вещи пахнут нафталином, а посидев у костра, люди долго ощущают запах дыма, которым пропиталась одежда.

Забавная история произошла однажды с научным сотрудником лаборатории, в которой проводили исследования феромонов. В один из жарких летних дней он, житель южного города, решил отправиться на побережье. Предвкушая все соблазны солнца и моря, исследователь быстро собрал курортный багаж и влился в ряды «паломников». Изрядно намучившийся и разомлевший наш знакомый наконец добрался до конечной цели своего путешествия и, не долго думая, бросился в объятия ласкового моря. Вдоволь насладившись морской прохладой и отвоевав себе участок суши, он скромно устроился на пятачке под солнцем. Зажмурив глаза и предоставив свое тело «жесткому ультрафиолету», ученый попытался забыть все свои проблемы, погружаясь в сладкую дремоту. Но вскоре странные события нарушили его сон. Сначала до сознания исследователя стали долетать неясные возгласы людей, затем голоса стали громче, и наш герой попытался приоткрыть глаза. То, что он увидел, настолько удивило и смутило его, что в первый момент он принял все это за сон. На фоне голубого неба над ним порхало огромное количество бабочек непарного шелкопряда, а вокруг, привлеченные таким «цирковым номером», столпились ошеломленные отдыхающие. Как потом выяснилось, виновником конфуза был портфель, в котором химик часто перевозил различные химические соединения. Перед отпуском хозяин портфеля как раз и занимался изучением феромонов непарного шелкопряда. Таким образом, привлекающие молекулы сначала адсорбировались на стенках портфеля, а затем вызвали появление бабочек.

Для того чтобы поймать молекулы-невидимки, химики применяют различные ловушки — от обыкновенной фильтровальной бумаги до синтетической смолы «паропак». Можно поместить насекомых непосредственно на поглощающую поверхность или продувать током воздуха сосуд с шестиногими пленниками, собирая ловушкой-поглотителем находящиеся в воздушной смеси молекулы-мишени. Такими способами были выделены привлекающие вещества американского таракана, златогузки, мучного хруща и хлопкового долгоносика.

Другой распространенный метод охоты за летучими молекулами — экстракция различными растворителями. В быту мы постоянно имеем дело с экстрактами. Большинство настоев, применяемых в медицине, овощные супы и фруктовые компоты — не что иное, как продукты экстракции биологически активных веществ, используемые для лечения или питания человека. Люди пользуются экстракцией, приготавливая ароматный чай или кофе, удаляя жирное пятно с одежды. Помогает им целый набор химических веществ. Для извлечения пахучих молекул из разных органов и тканей насекомых чаще всего применяют хлористый метилен, гексан или этиловый эфир. Эти растворители довольно летучи и после выполнения своей роли легко удаляются при нагревании. Таким способом ловят «молекулы любви» у большинства изученных представителей мира насекомых. Скорость расшифровки неизвестного вещества во многом зависит от искусства и опыта химика-аналитика, выбора им растворителя и условий экстракции.

Теперь рассмотрим следующий важный момент поиска таинственных молекул. На лабораторном столе «охотника за молекулами» появилась стеклянная колбочка с экстрактом, в котором, по предположению исследователя, содержится искомое вещество. Как же отыскать в этом «химическом коктейле» нужное соединение, спрятавшееся там, как невидимка в толпе?

Ведь, например, в состав пахучего секрета бабочки репейницы входит большое количество метиловых эфиров алифатических кислот, а также некоторые другие соединения.

Хотя герой фантастического романа Герберта Уэллса человек-невидимка и был уверен в своей неуязвимости, ему все-таки пришлось спасаться от внезапно появившегося врага. Неожиданно из конторы фармацевтического общества выбежала маленькая собачонка, которая, принюхиваясь к земле, начала лаять и преследовать невидимку. Все предвидел герой Уэллса, но того, что нос собаки сможет обнаружить его присутствие, не ожидал. Человек-невидимка очень расстроился: «друг человека» выдавал его с «головы до пят».

Да, не повезло главному герою романа в его злоключениях. Маленькая собачонка смогла учуять невидимого беглеца и стала его главным врагом. А чьим бы «носом» воспользоваться ученым, чтобы обнаружить молекулы феромона в экстракте? К сожалению, орган обоняния человека или собаки здесь не поможет. Но совсем не потому, что насекомые более чувствительны к запаховым молекулам. Просто у каждого живого организма своя индивидуальная способность распознавать разнообразнейшие запахи. Люди, не ощущают многих существующих в окружающем мире летучих веществ. Так природа оберегает органы обоняния человека от излишнего воздействия внешней среды.

В настоящее время для поиска феромонов пользуются двумя основными приемами. Один из них был предложен немецким ученым Д. Шнейдером, который исследовал привлекающие молекулы многих насекомых, в том числе и тутового шелкопряда.

Изучая механизм восприятия различных запахов насекомыми, этот ученый пришел к выводу, что «датчик» присутствия молекул-невидимок — антенна насекомых. Используя этот «нос» в качестве локатора, шестиногие ориентируются в мире «химических слов». Исследователь обнаружил, что при попадании пахучих молекул на «антенну» возникает электрический биопотенциал, который можно наблюдать по отклонению луча на экране осциллографа или записать на бумаге самописцем. Этот интересный и очень необходимый химикам метод назван электроантеннограммой.

Второй метод — изучение поведения насекомых при «дегустировании» различных химических веществ. Впервые его применил известный французский энтомолог Жан-Анри Фабр. Великий натуралист наблюдал за «ночными визитерами» — самцами сатурнии, прилетавшими к самке, находящейся в его кабинете. Вот как описывал Ж. А. Фабр свои впечатления после домашних опытов над одной из красивейших ночных бабочек — павлиньим глазом: «...Нельзя забыть то, что мы увидели. Вокруг колпака с самкой, мягко хлопая крыльями, летают огромные бабочки. Они подлетают и улетают, поднимаются к потолку, опускаются вниз. Кинувшись на свет, они гасят свечу, садятся на наши плечи, цепляются за нашу одежду. Пещера колдуна, в которой вихрем носятся нетопыри. И это — мой кабинет».

Энтомолог отметил, что самцов привлекает тончайший аромат, недоступный нашему обонянию. Запах этот пропитывает всякий предмет, к которому прикасалась самка. Ученый обратил внимание на явление поглощения привлекающего вещества пористыми материалами, например картоном или порошком глины.

В одном из опытов Фабр вокруг садка с самочкой расставил блюдечки с различными пахучими веществами, которые были у него под рукой: керосином, нафталином, лавандой и пахнущим тухлыми яйцами сероуглеродом. В этом наборе были представлены «ароматы» на любой вкус. Но, несмотря на присутствие таких разных неприятных запахов, самцы сатурнии нашли дорогу к самочке. Исследователь был поражен особой чувствительностью обонятельных органов насекомых к молекулам, «ответственным» за встречу особей противоположного пола в мире шестиногих.

Современные исследования энтомологов подтвердили, что половые феромоны воздействуют на самцов, несмотря на большие расстояния и посторонние запахи. Так, самки бабочки-монашенки привлекают самцов с расстояния 200...300 м, айлантовой сатурнии — 2...2,5 км, непарного шелкопряда — 3...4 км, а ночного павлиньего глаза, над которым проводил опыты Фабр, — 8...10 км.

Интересные исследования были проведены с самцами бабочки-глазчатии. Меченых насекомых выпускали через окно движущегося поезда на различном удалении от места, где находилась в садке под марлей самка. Энтомологи подсчитали, что с расстояния 4,1 км на зов самки откликнулись около 40% самцов, а с 11 км — лишь 26%. Как видно, реакция самцов во многом зависит от расстояния до привлекательной самки, скорости ветра и географического расположения местности. Кроме того, существует индивидуальная чувствительность воспринимающих органов насекомых, зависящая от возраста, жизнеспособности, времени суток и других факторов. Поэтому при всем совершенстве электрофизиологических тестов роль того или иного вещества в поведении насекомых может быть определена лишь с помощью оценки их реакций на него в лабораторных или природных условиях. Изучая с помощью фото- и киносъемки ответы насекомых на действие феромонов, ученые смогли установить сложную структуру поведенческих актов этих животных. Сначала шестиногие совершают движения, связанные с переходом их организма в активное состояние. Они начинают поднимать антенны, двигать или чистить их, вибрировать крыльями, поворачиваясь при этом на месте. Такие движения «антеннами» увеличивают вероятность попадания молекул феромонов на рецептор. Затем насекомые двигаются в струе феромона против ветра. На траекторию полета оказывает влияние концентрация феромона. Подобное поведение способствует сближению особей, которое на небольших расстояниях зависит и от их зрения. Далее насекомые обмениваются химическими, визуальными и другими сигналами для стимуляции полового партнера к осуществлению спаривания.

Изучая поведенческие реакции насекомых в специальных устройствах, исследователи пытаются определить ключевой ответ, который можно в дальнейшем регистрировать в биотестах на активность пахучих молекул. Однако из-за многокомпонентности половых феромонов эти ответы бывают различными и зависят от концентрации феромона и привыкания к нему насекомых. Это свидетельствует о необходимости нового подхода к оценке биологической активности феромонов.

Поведенческие реакции насекомых исследуют в специальных устройствах — ольфактометрах. Самый простой из них представляет собой обыкновенную банку или садок с неподвижным воздухом. Более совершенная конструкция у специальных туннельных ольфактометров — цилиндрических устройств с вентиляторами, в которых можно регулировать поток воздуха и визуально наблюдать реакции насекомых как на свету, так и в темноте. Подопытные экземпляры в таких устройствах получают возможность свободно двигаться, а исследователи — наблюдать за их поведением. Для бабочек изготовляют специальные просторные «трубы», а для жуков — лабиринты, путешествуя по которым эти насекомые отыскивают источники пахучих молекул. Такие ольфактометры можно использовать и для сравнительной оценки различных источников феромона.

Известно, что «нос» насекомых может различить самый тонкий аромат среди множества других запахов. Современные химики-аналитики также научились выделять определенные пахучие молекулы из огромного количества химических веществ. Исследователи делают это с помощью новейших методов анализа, один из которых — хроматография.

Этот метод был открыт русским ученым М. С. Цветом в 1906 г. Исследователь еще в юношеские годы заинтересовался тайной зеленого пигмента — хлорофилла. Изучая этот пигмент — «трансформатор» энергии солнечных лучей в энергию химических связей молекул, ученый совершил важное научное открытие. Он изобрел великолепный метод разделения органических веществ, основанный на различной способности их к адсорбции. Используя для разделения зеленых пигментов производные петролейного эфира, М. С. Цвет наблюдал две окрашенные полоски — темно-зеленую и синюю (хлорофиллы а и в). Работая со смесью пигментов из листьев крапивы, ученый с помощью специальной колонки (цилиндра из стекла) получил такое расположение разноцветных слоев: верхний — бесцветный, затем желтый, снова светлый, желто-зеленый, зеленовато-синий, три слоя желтых и последний — светло-серый. Почти настоящая радуга! Химические компоненты зеленого пигмента расположились друг за другом в колонке с адсорбентом, и эту разноцветную картину можно было уже идентифицировать как качественно так и количественно. Красный столбик с пигментом ученый назвал хроматограммой, а сам способ такого разделения сложных веществ — хроматографическим методом. М. С. Цвет, как и многие другие скромные труженики науки, не получил при жизни признания и высокого положения в обществе, но вклад его в науку по достоинству оценен учеными XX в.

Метод, открытый русским ученым, произвел научную революцию во многих областях человеческого знания: биологии, химии, физике и медицине. Благодаря хроматографии стало возможным быстро и точно определить строение и химический состав белков, удалось расшифровать состав очень редких и загадочных веществ, пришельцев из космоса — углистых хондритов. Этот метод широко применяется для анализа загрязнения окружающей среды и установки правильного диагноза в клинических лабораториях. Для химиков хроматографический метод стал надежным помощником в исследованиях молекул: от простых газов до сложнейших углеводородов и аминокислот. Без хроматографии не обходятся и исследователи феромонов. Со временем открытия «молекул любви» тутового и непарного шелкопрядов и до наших дней этот метод надежно служит охотникам за молекулами.

Так, для разделения экстрактов из насекомых применяют различные виды хроматографического анализа. Результаты его регистрирует перо самописца, вырисовывая множество низких и высоких пиков. Например, при расшифровке феромона тутового шелкопряда бомбикола ученые наблюдали около 30 различных пиков.

Со времени открытия этого пахучего вещества положение дел у охотников за летучими молекулами значительно улучшилось. Благодаря современным методам исследований стало возможно определить содержание изучаемого феромона в массе вещества менее 0,1 мг. Если доктору А. Бутенандту потребовалось 20 лет на разгадку тайны пахучих молекул шелкопряда, то сейчас в течение 2...3 лет ученые расшифровывают структуру аттрактантов десятков насекомых. Стали известны химические формулы феромонов яблонной плодожорки, хлопкового долгоносика, бабочки-гелехиды, медоносной пчелы, капрового жука и других шестиногих. Теперь известно, что для общения на химическом языке насекомые пользуются многоатомными спиртами, эфирами, кетонами и различными циклическими соединениями. В настоящее время исследователи обладают целым арсеналом средств для разгадки строения пахучих молекул. В этом химикам в значительной степени помогли физики, и прежде всего тем, что создали физико-химические методы анализа органических веществ. Однако для успешного решения задачи мало располагать точными методами и сложными приборами, без которых сейчас не обходится ни одна аналитическая лаборатория. Охотнику за молекулами-невидимками нужно иметь глубокие знания и опыт, а также уметь правильно сделать выбор методики, необходимой в каждом конкретном случае.

Для разделения смеси феромонов химики, как правило, пользуются методом газо-жидкостной хроматографии. Обладая высокой чувствительностью, он позволяет обнаружить одну молекулу искомого феромона среди 10¹² молекул газа-носителя. Сущность этого метода заключается в том, что смесь пахучих молекул пропускают через колонку с неподвижной жидкой фазой при помощи инертного газа. Компоненты смеси разделяются в зависимости от их свойств между газовым потоком и неподвижной фазой и выходят из колонки в определенном порядке. Затем они регистрируются специальными детекторами и записываются в форме пиков на перфоленте хроматографа. Для идентификации полученных компонентов сравнивают их показатели при разделении на колонке с аналогичными параметрами известных чистых веществ — «свидетелей». На проведение такого анализа уходят минуты, а его возможности позволяют не только разделить смесь феромонов, но и накопить отдельные вещества в количестве, необходимом для дальнейшей работы.

Однако даже самый совершенный газовый хроматограф не позволяет расшифровать структуру молекул изучаемых веществ. Для того чтобы установить полный «портрет» феромона, химики обращаются за помощью к таким физическим методам, как масс-спектрометрия, инфракрасная спектроскопия, электронные спектры поглощения как в видимой, так и в ультрафиолетовой областях, а также ядерному парамагнитному резонансу.

Масс-спектрометрия — самый чувствительный из методов, позволяющих исследовать структуру молекул. Ведь для такого анализа исследователю достаточно располагать следовыми количествами феромонов — 10^–9 г. На чем же основан принцип этого метода? В специальном приборе масс-спектрометре на пары исследуемого вещества воздействуют пучком быстрых электронов, которые ионизируют молекулы и превращают их в положительно заряженные ионы. Затем магнитное поле делит полученные частицы на молекулярные и осколочные ионы, которые регистрируются с помощью коллектора и системы усиления сигналов. На ленте прибор выписывает пики, которые соответствуют ионам с определенным отношением массы к заряду. Соответствующая обработка полученных результатов позволяет ученым идентифицировать тот или иной компонент феромона.

В последнее время широкое распространение получили приборы, созданные путем слияния двух методов: газо-жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Компьютеры этих электронных роботов, получивших название «хроммассов», располагают огромной памятью о спектрах уже известных веществ, и поэтому для идентификации исследуемых компонентов химического языка насекомых не требуется много времени. Современные приборы позволяют анализировать практически почти все известные классы органических соединений. Для проведения анализа достаточно располагать всего лишь 10^–9 г вещества.

Довольно часто обращаются химики к методу инфракрасной спектроскопии, который позволяет определить в молекуле такие функциональные группы, как C=0, C=C, OH и другие. Этот метод возник после первых опытов Исаака Ньютона по разложению солнечного света на разноцветные полоски. Дальнейшие исследования спектров атомов и молекул позволили немецким ученым Р. В. Бунзену и Г. Р. Кирхгофу изобрести спектральный метод анализа. Благодаря ему ученые узнали химический состав Солнца, многих звезд и туманностей. Для инфракрасной спектроскопии необходимо располагать несколькими миллиграммами исследуемого вещества, чтобы получить данные о его химической структуре. А вот для того, чтобы снять спектры молекул в видимой или ультрафиолетовой области, нужно иметь и того менее — всего лишь доли миллиграмма. Эти методы позволяют определить в изучаемых объектах наличие хроматофоров и ароматических колец.

При расшифровке структуры феромонов исследователям довольно часто приходится иметь дело с пространственными изомерами молекул. Здесь на помощь химикам приходит метод ядерного парамагнитного резонанса (ЯМР). Он помогает установить расположение в молекуле водорода, фтора и других атомов, обладающих парамагнитными свойствами. К недостатку метода относится необходимость располагать не менее 3...5 мг изучаемого вещества. В 1944 году советский ученый Е. К. Завойский обнаружил явление электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). При помощи этого метода можно судить о наличии в молекуле свободных радикалов.

Определенный интерес для аналитиков представляет разработанный на кафедре биофизики МГУ профессором Б. Н. Тарусовым и его сотрудниками метод биохемолюминесценции. При помощи специальной электрохимической ячейки в результате окисления некоторых соединений, например циклических аминокислот, создается постоянный фон сверхслабого свечения. Добавляя в такую среду изучаемое вещество, ученые наблюдают изменение фона свечения и по этим данным судят о свойствах молекул.

Для изучения реакционной и радикальной активности, а также интенсивности различных запахов, советские исследователи А. X. Тамбиев и А. Ш. Агавердиев в 1966 году предложили метод химических моделей, называемый еще методом термоокисления ДОФА. Он заключается в том, что исследуемыми веществами воздействуют на специальные соединения-индикаторы, которые под влиянием последних изменяют такие свои свойства, как интенсивность хемолюминесценции, оптическую плотность, окраску и другие. Довольно часто для регистрации таких воздействий применяют 3,4-диоксифенилаланин (ДОФА). Оптические свойства этого индикатора могут изменяться под влиянием феромонов, что позволяет судить об интенсивности и реакционной способности пахучих молекул.

Используя чудо-технику XX века, исследователи пытаются узнать секреты химического языка насекомых. Расшифровка любого феромона — совсем не простое дело и нередко напоминает работу по расшифровке египетских иероглифов или решение археологических загадок. На этом пути ученых на каждом шагу подстерегают ошибки и удачи, разочарования и находки.

Поэтому успех в расшифровке феромонов насекомых зависит не сколько от технического оснащения, сколько от знаний, опыта, терпения и настойчивости исследователей невидимых кирпичиков здания жизни.