Как растения защищаются от болезней

СУММА СЛАГАЕМЫХ

Н. И. Вавилову принадлежит высказывание о том, что фитоиммунитет представляет собой сумму из множества слагаемых. «Новейшие данные показали еще более ясно сложность природы иммунитета растений и невозможность свести ее к единой физиологической и биологической причине»[14]. Слагаемыми являются отдельные защитные реакции, которые в сумме и определяют устойчивость растения. Речь, конечно, идет не о механической сумме отдельных реакций, а об их взаимодействии друг с другом. Одни защитные реакции дополняют друг друга, в результате чего вместе взятые они и оказывают больший эффект, чем каждая в отдельности. В ряде случаев они наносят паразиту последовательную цепь разных по природе ударов, под воздействием которых последний в конечном счете погибает.

В этом отношении растения мало чем отличаются от животных организмов, устойчивость к болезням у которых также основывается на множество разнообразных защитных механизмов, как внутренних, так и внешних, многие из которых обладают неспецифическим действием.

Многочисленные защитные механизмы растений против возбудителей инфекционных болезней обычно разделяют на конституционные, т. е. присутствующие в интактных тканях хозяина, и индуцированные, т. е. возникающие в них в ответ на контакт с паразитом или его экстрацеллюлярными соединениями. Вроде бы нетрудно доказать, что в большинстве случаев первостепенная роль принадлежит индуцированным защитным механизмам. Ведь один и тот же сорт растения с одними и теми же конституционными механизмами является устойчивым к одной расе патогена и одновременно восприимчивым к другой. Следовательно, устойчивость, равно как и восприимчивость, развивается при взаимодействии неких комплементарных механизмов обоих партнеров. Но ведь сама комплементарность теснейшим образом связана с какими-то конституционными элементами хозяина и паразита, которые присутствуют в них еще до контакта друг с другом и которым, по-видимому, принадлежит первостепенная роль во взаимодействии партнеров.

К числу защитных реакций растений принадлежат различного рода механические барьеры, как предсуществующие в растении, так и образующиеся в нем в ответ на инфицирование, состоящие из клеток, стенки которых пропитаны стойким веществом типа суберина, кутина и лигнина. Сюда же относятся механизмы, с помощью которых паразит обездвиживается. Важнейшим средством защиты является наличие в растительных тканях антибиотических соединений, способных подавить рост паразита и инактивировать его токсины и экзоферменты. К числу защитных реакций растений относится и их способность создавать в своих тканях недостаток веществ, необходимых паразиту для роста и развития, и другие способы уничтожить паразита или ограничить его рост.

Предметом фитоиммунологии является множество болезней, вызываемых множеством патогенов у множества растений. Если в центре внимания медицины стоит один-единственный вид — Homo sapiens — человек разумный, то фитоиммунология занимается сотнями видов растений, из которых каждый подвержен многим болезням. Естественно, что у разных партнеров могут быть разные защитные механизмы, по крайней мере одним и тем же защитным реакциям может принадлежать разный удельный вес в сумме защитных механизмов разных болезней. Последнее только усиливает необходимость поиска среди них тех общих механизмов устойчивости, которые характерны для растений в целом.

Одной из таких реакций, вероятно, свойственной всему живому, является необходимость обеспечить энергией средства защиты. Ведь для того чтобы бороться, нужны сырье, машины, энергия. Поэтому универсальной ответной реакцией устойчивых растений на большинство неблагоприятных воздействий, в том числе и на инфицирование фитопатогенными микроорганизмами, служит усиление процессов дыхания и энергетического обмена. Большой вклад в исследование роли окисления в больном растении внес советский исследователь профессор Б. А. Рубин, который является основоположником школы о защитных функциях окислительных и энергетических процессов в явлении фитоиммунитета.

Процессы окисления и связанные, или, как говорят, сопряженные, с ними процессы фосфорилирования снабжают клетку энергией. Последняя запасается в виде богатых энергией (макроэргических) фосфорных связей в универсальном биологическом горючем — аденозинтрифосфорной кислоте (АТФ). Молекулы АТФ направляются в те части клеток, где в них возникает необходимость. В устойчивом растении, находящемся в условиях стресса, производство таких молекул возрастает, поскольку построение механических заграждений, обездвиживание паразита и особенно синтез антибиотических веществ требуют затрат энергии.

Дыхание служит не только источником энергии, но и поставщиком исходного пластического материала для различного рода биосинтетических процессов. Поэтому усиление активности дыхания одновременно с энергией поставляет и сырье для синтеза соединений, необходимых для обороны.

Каким образом удается клеткам усиливать процессы окисления и фосфорилирования? Главным образом за счет возрастания числа митохондрий. Митохондрии, как известно, являются энергетическими центрами клетки, в которых и вырабатывается АТФ. Естественно, что две митохондрии вместо одной образуют и вдвое большее количество энергии. Для добывания необходимой энергии и сырья защищающееся растение пускает в ход все свои запасы и резервы. Запасные полимеры клетки в виде различного рода полисахаридов распадаются на составные части, которые сжигаются в акте дыхания. Только такой ценой достигается противостояние паразиту.

Естественно, что генерировать энергию и сырье могут только живые клетки растений. Клетки убитые либо поврежденные токсином, так же как колонизированные паразитом, уже выведены последним из строя и ни на что не пригодны. Поэтому устойчивость прежде всего и состоит в способности растительных тканей не допустить воздействия паразита на свои клетки, с тем чтобы дать возможность соседним здоровым клеткам мобилизовать свои ресурсы на борьбу с инфекцией.

И. И. Мечников писал, что у организмов существуют два типа реакций, защищающих от инфекций. Один из них заключается в обезвреживании токсических выделений паразита, тогда как другой (основной) состоит в подавлении самого паразита. Такое разделение поразительно соответствует различной стратегии защитных реакций растений, направленных против некротрофов и биотрофов.

Выше уже говорилось о том, что некротрофные паразиты еще до проникновения в растительную клетку убивают ее токсинами, а затем питаются содержимым убитых клеток, переваривая их с помощью своих ферментов. Поэтому если стратегия некротрофов состоит в совершенствовании своих орудий убийства, то стратегия защиты от них заключается в обезвреживании этих орудий.

Иное дело биотрофы. Если условием паразитирования некротрофов является убийство растительных клеток, то биотроф, напротив, не может погубить питающую его клетку, поскольку ее гибель ставит под угрозу существование паразита. Растение безошибочно находит уязвимое место биотрофа. Если для его существования необходима живая клетка, то следует самому погибнуть, чтобы не допустить развитие паразита. А уже потом за паразита, находящегося в погибшей клетке, принимаются антибиотики, которые и доводят его до гибели. Естественно, что так гибнут не все растительные клетки, а только те из них, в которые паразит проник. Гибель части во имя спасения целого и лежит в основе стратегии защиты растительной клетки от биотрофно питающихся паразитов. Она получила название сверхчувствительности и является своеобразной защитной реакцией, характерной для растений. Реакцию сверхчувствительности мы будем еще подробно рассматривать в дальнейшем. Ниже коротко суммированы общие принципы агрессии некротрофов и биотрофов, так же как стратегия защиты от них.

РАНЕВОЙ СТРЕСС

Трудно, пожалуй, найти другой научный термин, который так прочно вошел бы в жизнь современного общества, как стресс. Впервые этот термин ввел известный канадский физиолог Ганс Селье в 1936 г. для объяснения реакции организма на самые различные невзгоды, для преодоления которых требуется напряжение всех его сил.

Согласно определению самого Селье, стресс представляет собой совокупность всех неспецифических изменений, возникающих под влиянием любых сильных воздействий, и сопровождается перестройкой защитных сил организма. Уже из определения следует, что неспецифические реакции имеют прямое отношение к иммунитету против инфекционных болезней, хотя в целом иммунитет рассматривается как проблема специфичности. Ведь что может быть более специфичным, чем реакция антиген-антитело. И все же очень большую роль, особенно в иммунитете растений, играют неспецифические реакции. Более того, они в ряде случаев могут определить исход взаимоотношений между хозяином и паразитом. К тому же изучение неспецифических реакций может приблизить нас к пониманию специфических и, следовательно, к проблеме иммунитета в целом.

К числу самых распространенных неспецифических защитных реакций, по крайней мере в растительном мире, относится реакция на механические поранения, которые неизбежны при ветре, граде и других неблагоприятных условиях. Такого рода реакции, несомненно, возникли еще до появления паразитов, и можно думать, что они в какой-то мере явились основой для развития у растений защитных реакций против паразитов. Ведь многие паразиты способны проникать в растительную ткань только лишь после того, как механически ее повредят.

Реакцию растений на механическое повреждение часто называют еще процессами репарации, залечивания, заживления, образования раневой перидермы. Особенно хорошо исследована раневая реакция клубней картофеля, которые являются излюбленным объектом для проведения такого рода работ. Неповрежденный клубень покрыт так называемой естественной перидермой, точной копией которой является раневая перидерма, которая образуется на пораненном участке. Естественная перидерма защищает клубни от неблагоприятных воздействий и излишнего испарения.

Под микроскопом видно (рис. 4 см. вклейку), что естественная перидерма представляет собой многослойные ряды уплощенных клеток, расположенных одна под другой. Оболочки таких клеток содержат особое вещество типа пробки, носящее название суберина. Суберин адкрустирует клеточную оболочку, накладываясь на нее изнутри. Под электронным микроскопом суберинизация клеточных стенок выглядит слоистой из-за чередования слоев суберина и воска.

Суберин представляет собой полимер оксимонооксидин дикарбоновых кислот. В составе его находятся также некоторые полициклические вещества терпеновой природы. Вещества, входящие в состав пробки, делают ее высокоустойчивой к влиянию множества химических воздействий, таких, как органические кислоты, разбавленная соляная кислота, слабые щелочи. Наличие суберина в составе покровных тканей усиливает их механические свойства, поскольку большинство микроорганизмов не содержит ферментов, расщепляющих эти полимеры.

В процессе суберинизации происходит закупоривание пор в клеточных оболочках, в результате чего прерываются межклеточные контакты. Содержимое клеток, оболочки которых пропитываются суберином, постепенно отмирает, их полости наполняются воздухом, в результате чего клетки становятся термо- и влагонепроницаемыми.

В ответ на механическое поранение растения отвечают защитной раневой реакцией, суть которой сводится к образованию на пораненном участке точно такой же перидермы, какой является естественная. В результате поранения нарушается структурная и функциональная целостность растения или отделенного от него органа. В ответ на нарушение включаются системы иммунологического контроля, имеющие целью ликвидировать повреждение и восстановить нарушенную целостность. Образующаяся на месте поранения раневая перидерма по своим структурным и функциональным характеристикам ничем не отличается от естественной. Ее образование имеет целью как можно скорее закрыть ворота в кладовые растительных тканей, которые оказались открытыми в результате поранения. Неспособность растительных тканей быстро реагировать на повреждение может оказаться гибельной для организма в целом.

Как же происходит образование раневой перидермы? Взрослые клетки, давно прекратившие клеточные деления и находящиеся на поверхности поранения или залегающие непосредственно под ним, вновь приобретают меристематическую активность (способность к делению). Клетки обычно делятся параллельно пораненной поверхности, в них закладывается феллоген или пробковый камбий (см. рис. 4). Феллоген начинает делиться, отделяя наружу себе подобные по форме клетки, которые называются феллемой. В большинстве случаев это мертвые клетки, оболочки которых пропитаны суберином. Внутрь клубня феллоген также отпочковывает часть клеток такой же формы, которые остаются живыми и носят название феллодермы. Весь перидермальный комплекс состоит из приблизительно одинаковых расположенных друг под другом клеток феллемы, феллогена и феллодермы.

Для того чтобы взрослые клетки на поверхности поранения приобрели меристематическую активность, они должны получить стимул к делению или раневому возбуждению. Вокруг природы этого стимула развернулась длительная дискуссия. Существование раневого гормона предсказал еще 60 лет тому назад Г. Габерлапд на основании своих опытов. На разрезанной поверхности кольраби, как и на клубне картофеля, образовывалась раневая перидерма. В том случае, если поверхность ломтика промывалась водой, образование перидермы задерживалось. Если же на предварительно промытую поверхность наносили кашицу из растертых тканей, перидерма вновь начинала образовываться. Это позволило Габерланду прийти к заключению, что из продуктов отмерших и разрушенных клеток образуются вещества, вызывающие раневое возбуждение. Он назвал их раневыми гормонами или пекрогормонамп.

Вещество, получившее название раневого гормона, было выделено в конце 30-х годов Д. Инглишем и Д. Боннером. Им оказалась Д-децеи-1,10-дикарбоновая кислота, получившая название травматиновой кислоты, или травматина. Это вещество было обнаружено в картофеле, брюссельской капусте, люцерне, рисе, томатах, апельсинах и других растениях, но отсутствовало в тканях животных. В качестве раневого гормона испытывались также иные кислоты жирного ряда. Выяснилось, что активность коррелировала с присутствием двойной связи в молекуле и возрастала при увеличении числа углеродных атомов.

В самое последнее время другое вещество, напоминающее по своим свойствам раневой гормон, было обнаружено у ряда растений. Под влиянием различных стрессовых воздействий, в том числе и поранения, это вещество освобождалось из клеточных стенок растений, быстро передавалось по проводящей системе и индуцировало в здоровых тканях, удаленных от места повреждения, образование ингибиторов протеиназ, т. е. веществ, подавляющих ферментные системы, расщепляющие белки. Растения, таким образом, как бы заранее готовятся отражать атаку ферментов паразитарного микроорганизма, который может проникнуть через места механических поранений. Поскольку образующийся сигнал принадлежит самому растению, а не вводится паразитом, он подходит под определение раневой гормон. По предварительным данным, вещество представляет собой рамногалактуронан.

Вещество широко распространено в растительном мире. Если экстракты из 37 видов растений наносили на молодые листья томатов, то они индуцировали в них накопление ингибиторов протеиназ. Только два вида экстрактов из сельдерея и кабачка не вызвали их накопления.

Еще 40 лет назад А. Л. Курсанов установил, что процесс раневого залечивания сопровождается возрастанием дыхания. Субстратом возросшего дыхания в залечивающихся клубнях картофеля являлся крахмал, количество которого в тканях, прилегающих к месту поранения, постепенно уменьшалось, взамен чего возрастали моносахара, сгорающие в акте дыхания.

Процессы репарации нуждаются в источниках энергии. Показано, что в зоне поранения возрастало число митохондрий. Дополнительно образованные митохондрии генерировали энергию с такой же скоростью, как и пред-существующие в свеженарезанных клубнях. Очевидно, энергия, необходимая растениям для залечивания поранений, реализуется за счет дополнительно образовавшихся митохондрий.

В ответ на механическое поранение в клубнях картофеля происходило также образование нуклеиновых кислот. Показано, например, что через 10 минут после разрезания в бобе гороха в 10 раз возрастало количество рибонуклеиновой кислоты. В зоне поранения увеличивалось также и содержание аскорбиновой кислоты. К примеру, в раневой зоне клубня картофеля содержание аскорбиновой кислоты в 4–5 раз выше, чем ее количество в интактных клубнях.

Неоднократно предпринимались попытки установить корреляцию между устойчивостью клубней картофеля и толщиной их покровов. В конце концов исследователи вынуждены были признать, что такой зависимости не существует. Не обнаружено связи и между способностью клубней картофеля образовывать раневую перидерму и ее устойчивостью к ряду паразитарных микроорганизмов. По-видимому, образование перидермы на поверхности поранения клубней картофеля является второстепенным фактором в устойчивости клубней к ряду фнтопатогенов, поскольку для ее образования требуется время, в течение которого паразит может проникнуть в клубень. Однако уже сформированная раневая перидерма вполне способна надежно защитить клубни от проникновения инфекции.

Еще сравнительно недавно считалось, что защитная роль перидермы по отношению к фитопатогенным микроорганизмам определяется только ее механическими свойствами. Позднее стало ясным, что перидерма является не только механическим, по и токсикологическим барьером на пути проникновения инфекции. Дело в том, что в зоне поранения накапливаются антибиотические вещества, которые подавляют проникновение инфекции. Эти вещества различной химической природы и, следовательно, обладают различным механизмом действия. Такие антибиотические вещества присутствуют как в составе раневой, так и естественной перидермы. Они как бы защитным чехлом покрывают растение и его органы снаружи. Вот, например, как располагаются ингибиторы в составе перидермы клубня картофеля: в наружных отмерших клетках феллемы находятся некоторые фенольные соединения, в том числе кофейная кислота. Под ними в меристематической ткани залегают высокотоксические гликоалкалоиды, а еще ниже располагается хлорогеновая кислота. Таким образом, проникающему паразиту, помимо механических покровов, приходится преодолевать несколько последовательно расположенных токсических барьеров из ингибиторов различной химической природы с различными спектрами антибиотического действия. К тому же расположение ингибитора в отмерших тканях наружных растительных покровов позволяет создать их чрезвычайно высокие локальные концентрации

РАЗОРУЖЕНИЕ ПАРАЗИТА

Разоружать можно только вооруженного врага. А таким до зубов вооруженным паразитом является некротроф, обладающий мощными орудиями агрессии в лице токсинов и экзоферментов. Однако и биотрофы не лишены оружия нападения, хотя оно у них утонченно и усовершенствовано. Ведь этим паразитам все время приходится лавировать между опасностью погубить питающую их клетку хозяина и необходимостью прокормить самого себя. Итак, токсины…

Еще в начале нашего века предполагалось, что оксидазы растений, в частности пероксидаза, могут участвовать в разрушении токсинов микроорганизмов. Однако экспериментальные данные о способности растительных тканей детоксицировать токсины патогенов пока еще очень ограниченны. Известно, например, что устойчивые растения овса, райграса и сорго способны поглощать и детоксицировать виктории — токсин возбудителя гельминтоспориоза овса. Из тканей устойчивых растений токсин быстро исчезал, тогда как восприимчивые растения теряли тургор и выделяли викторин в окружающую среду. Механизм обезвреживания токсина пока не ясен.

Известен и другой способ растений избежать воздействия токсинов паразита — потерять к ним чувствительность, но это возможно только лишь по отношению к специализированным патотоксинам, имеющим в клетке определенную мишень действия. Что касается фито- и вивотоксинов, не обладающих избирательностью действия и одновременно нарушающих многие звенья обмена, то к ним вряд ли могут возникнуть нечувствительные формы. Вообще к ингибиторам, не имеющим определенной мишени, на которую они действуют, а неспецифически повреждающим многие «сайты», адаптация маловероятна. Возможно, поэтому к неспециализированным некротрофным паразитам, обладающим неспецифическими токсинами с широким спектром антибиотического действия, нет и не может быть устойчивых форм растений, а существуют только более или менее восприимчивые.

Примером устойчивости растений, основанной на его нечувствительности к токсину паразита, являются взаимоотношения сахарного тростника и возбудителя глазчатой пятнистости Helminthosporium sacchari. Гриб вызывает на листьях тростника своеобразные пятна в виде глаз, от которых распространяются красно-коричневые полосы. Поскольку возбудитель удается выделить только из пятен, считается, что сами гифы гриба находятся в местах пятен, а полосы — это результат воздействия его токсина. Токсин получил название гельминтоспорозида и представляет собой 2-оксициклопропил-D-галактопиранозид.

Было испытано 182 клона сахарного тростника и установлено, что устойчивые к паразиту клоны устойчивы и к его токсину. В чем дело? Может быть, в устойчивых растениях токсин разлагается, поскольку в них есть ферменты, способные его детоксицировать? Определения показали, что это не так. Меченый токсин вводили в растения как устойчивых, так и восприимчивых клопов тростника, а затем спустя некоторое время определяли его количество, оставшееся в растениях. Разницы не нашли.

Картина несколько прояснилась, когда удалось обнаружить, что токсин связывается с цитоплазматической мембраной хозяина, однако не у всех клонов растений. Только у восприимчивых. Значит, у восприимчивых растений в отличие от устойчивых на мембране есть некое вещество — рецептор, который связывает токсин. И такой рецептор удалось выделить. Для этого мембрану восприимчивого клона обработали детергентом, а потом расфракционировали выделенные белки. Рецептор оказался белковым тетрамером, т. е. состоял из 4 белковых субъединиц, с молекулярной массой 48 000. Токсин связывается с рецептором на восприимчивых сортах, в результате чего их клетки погибали.

Далее оказалось, что мембрана устойчивого клона тоже содержала такой же (правда, не точно такой же!) белок. Во всяком случае, белок из устойчивого клона выделялся тем же способом и имел ту же молекулярную массу.

Более того, белок-рецептор устойчивого и восприимчивого сортов не смогли различить даже антитела кролика, поскольку они связывались как с одним, так и с другим белком.

Оказалось, что различие между белками, которое не заметили даже антитела, заключается в 4 аминокислотах (лизине, серине, глицине, глютаминовой кислоте). Эти аминокислоты маскируют у устойчивого клопа центры связывания белка с токсином, что и делает растение нечувствительным к нему. Кстати, если белок из устойчивого клона тростника обработать детергентом, в результате чего его маскировка нарушается, ои приобретает свойство связываться с токсином паразита, и растение из устойчивого превращается в восприимчивое. Наоборот, если ткани восприимчивого клона тростника обработать антисывороткой, полученной на их белок-рецептор, то восприимчивый клон тростника превратится в устойчивый. Дело в том, что имеющиеся в антисыворотке антитела свяжутся с белком-рецептором и защитят его от действия токсина.

Таким образом, из проведенных опытов можно сделать вывод, что восприимчивость растения зависит от наличия специфического рецептора, тогда как устойчивость определяется его отсутствием. Устойчивость в этом случае можно рассматривать не как активную защитную реакцию, а как пассивный признак.

Теперь относительно защиты от системы экзоферментов паразита, в первую очередь пектолитических, которым, как уже говорилось, принадлежит ведущая роль в патогенезе растений.

Нужно сказать, что стратегия обороны растения от экзоферментов у некротрофов и биотрофов не может не быть различной. Для защиты от некротрофов, для которых быстрая гибель растительных клеток является залогом их успешного паразитирования, экзоферменты паразита должны быть как можно скорее инактивированы. Защита от биотрофов предполагает не столько инактивирование фермента, сколько его регулирование. Некоторая доля активности ферментов, в частности пектолитических, может быть даже полезна для растения. Так, К. В. Васильевой было показано, что пектолитические ферменты некоторых ш разитов могут служить не только патогенными факторами, но и индукторами защитных реакций растения.

Регулирование действия пектолитических ферментов, как, впрочем, и некоторых других экзоферментов фитопатогенов, достигается с помощью нескольких механизмов. Это прежде всего регулирование на уровне образования молекул фермента либо за счет его подавления, либо, наоборот, индуцирования. Дело в том, что пектолитические ферменты у паразитов вырабатываются только в том случае, если в среде, где они растут, присутствует пектин, который и вызывает их образование. Это так называемое явление субстратной индукции. Таким образом, пектолитические ферменты индуцируются только веществами, которые им предстоит разлагать. Поэтому наличие либо отсутствие субстрата так же, как его состав, является средством регулирования синтеза этих ферментов.

Одним из способов регулирования ферментов является их катаболитная репрессия. Катаболитная репрессия — механизм экономного и целесообразного образования лишь тех ферментов, которые позволяют организму существовать с наименьшими энергетическими затратами. Предположим, у микроорганизма есть на выбор несколько источников питания. В таком случае он будет в первую очередь потреблять те вещества, использование которых ему наиболее выгодно. Например, в среду с пектином, где растет некий фитопатоген, добавляется глюкоза. Естественно, что паразит предпочтет глюкозу пектину, поскольку для использования пектина его нужно сначала разложить, а для этого образовывать ферменты, расщепляющие его пектиновые вещества, тогда как можно начать прямо с глюкозы, для превращения которой ферменты всегда имеются в наличии. Патоген начинает потреблять глюкозу вместо пектина, а пектолитические ферменты за ненадобностью перестает образовывать. Вот и получается, что добавление глюкозы (катаболита) к пектину подавляет (репрессирует) выделение паразитом пектолитических ферментов. Это и есть катаболитная репрессия.

Явление катаболитной репрессии удалось использовать для защиты от болезни платана. На места поражения наливали раствор сахара, в результате чего образование грибом экзоферментов, являющихся фактором его патогенности, прекращалось. Так сахаром удавалось вылечить болезнь.

Предохранить клеточные стенки растений от действия разрушающих ферментов возможно и с помощью их суберинизации и лигнификации. Суберин и лигнин, откладываясь в составе стенок, стабилизируют их и делают содержащиеся в них вещества недоступными для ферментов фитопатогенов.

И все-таки главным фактором защиты от экзоферментов фитопатогенов является их инактивирование с помощью различного рода ингибиторов. Важная роль в этом принадлежит фенольным соединениям, особенно продуктам их окисления, которые являются мощными факторами песпецифического ингибирования ферментов паразита.

Дело в том, что окисленные производные фенолов легко образуют комплексы с SH-, NH₂- и NH-группами белков-ферментов, в результате чего последние теряют сдою активность.

Подобный механизм ингибирования может иметь значение и в защите растений от некротрофиых патогенов, и в явлении сверхчувствительности, возникающей в ответ на проникновение несовместимых биотрофов. Например, катехины, присутствующие в клеточных стенках плодов винограда, подавляют активность пектолитических ферментов возбудителя серой гнили, причем чем больше их содержание, тем выше степень устойчивости. А продукты окисления хлорогеновой и кофейной кислот, содержащиеся в некротизирующихся в ответ на проникновение возбудителя фитофтороза тканях картофеля, подавляют пектиназы этого паразита.

Но если паразиты имеют ферменты, разрушающие клеточные стенки растения, то и растения в свою очередь тоже образуют ряд ферментов, повреждающих клеточные стенки паразитов: если стенки патогена состоят из хитина — хитиназы, если из глюкана — различного рода глюканазы и т. д. В ответ на это паразит образует ингибиторы, подавляющие действие этих ферментов. Получается, что взаимоотношения паразита и хозяина заключаются в непрерывном процессе взаимной индукции: субстрат (клеточная стейка паразита) индуцирует ее разрушающий фермент, а присутствие фермента индуцирует у паразита ингибитор, его подавляющий.

К. В. Васильевой было показано, что, для того чтобы подавить активность ферментов патогена, нужна значительно меньшая концентрация ингибиторов, чем для подавления роста самих патогенов. Например, в ксилемных сосудах вилтоустойчивых сортов хлопчатника присутствуют живые споры возбудителя болезни, однако сами симптомы болезни отсутствуют. По-видимому, присутствующие в сосудах ингибиторы подавляют экстрацеллюлярные (внеклеточные) ферменты паразита, не нарушая или почти не нарушая его жизнеспособности. Не подсказывает ли этим сама природа новый подход к использованию химических средств защиты растений, основанный на ингибировании не самих патогенов, а их патогенных факторов. Иными словами, не столько уничтожать паразита, сколько его разоружать, что вполне соответствует духу времени, в котором мы живем.

К. Т. Сухоруковым с сотрудниками была проведена серия опытов, свидетельствующих о способности растений образовывать белки-аитиферменты. Так, в ответ на введение гидролитических ферментов паразитов в растениях образовывались антиферментные ингибиторы. Причем образовывались не просто ингибиторы, а ингибиторы специфические, т. е. подавляющие только тот фермент, который вводился в растение. Ведь до сих пор речь шла только о неспецифических низкомолекулярных ингибиторах ферментов, к которым относятся окисленные производные фенолов. Эти вещества инактивируют любой фермент, лишь бы в составе его белка (а все ферменты — белки) содержались сульфгидрильные и другие реакционноспособные группы.

Вопрос о наличии специфических ингибиторов фер-меитов в растениях до сих пор оставался открытым, и лишь в последние годы удалось получить некоторые доказательства их существования. Оказалось, например, что в клеточных стенках двудольных, но не однодольных растений присутствуют высокомолекулярные белки, ингибирующие эндонолигалактуроназы паразитарных грибов. Более того, количество таких ингибиторов возрастало в ответ на инфицирование.

В последнее время выяснилось, что у растений имеются высокоспецифическиё ингибиторы белковой природы, обладающие способностью подавлять протеолитические ферменты, т. е. ферменты, расщепляющие белки (протеиназы). Такие ингибиторы обнаружены в семенах растений семейства бобовых, злаковых, сложноцветных, а также в клубнях картофеля, топинамбура, корнях турнепса. Большинство ингибиторов представляют собой белки со сравнительно невысокой молекулярной массой от 8000 до 30 000 Дальтон.

Особенностью белковых ингибиторов является их устойчивость к денатурации и протеолитическому расщеплению. Ингибиторы образуют стойкие комплексы с протеиназами, в результате чего последние теряют активность. Наличие в клетках протеиназ позволяет разрушать, а следовательно, выводить из строя нужный фермент в нужный момент, что является одним из факторов их регулировки. Но и сами протеиназы также нуждаются в регуляции, которую и берут на себя их ингибиторы.

Однако большинство ингибиторов протеиназ, обнаруженных в растениях, проявляют специфичность к протеиназам животных и микроорганизмам, и только несколько ингибиторов растений могут подавлять собственные растительные протеиназы, да и то эти ингибиторы присутствуют лишь в небольших количествах. Отчасти из-за этого, а отчасти из-за того, что большинство ингибиторов протеиназ были обнаружены в семенах и хранящихся органах растений, считается, что эти ингибиторы выполняют защитные функции, препятствуя деятельности протеиназ патогенов.

Защитная роль ингибиторов протеиназ еще более подтвердилась, когда стало известно, что после нападения колорадского жука в тканях картофеля, удаленных на некоторое расстояние от места внедрения, быстро накапливались. ингибиторы протеиназ. А затем стало очевидным, что ингибиторы протеиназ образуются не только в ответ на насекомых, а на любой тип нарушений, включая механические поранения. Эти нарушения высвобождают вещества, названные фактором, индуцирующим накопление протеиназ.

Если лист томатов подвергнуть сильному механическому поранению, то в других листьях образуются два ингибитора протеиназ, которые составляют свыше 10 % от всех растворимых белков. Накопление этих ингибиторов требует определенных условий освещенности и температуры 37 °C. Ингибитор I с молекулярной массой 39 000 состоит из 4 идентичных субъединиц, ингибитор II с молекулярной массой 25 000 состоит из 2 идентичных субъединиц. Оба сильно ингибируют протеиназы — хемотрппсип и субтилизин и слабо — трипсин. Фактор, индуцирующий накопление ингибиторов протеиназ, освобождался в воду, если листья молодых томатов срезали бритвой, а срезанный конец помещали в сосуд с водой. Этот фактор, будучи введен в листья, вызывал накопление ингибитора протеиназ с линейной скоростью.

В качестве индуктора ингибитора испытывали пидолилуксусную кислоту, кинетин, гиббереллин, абсцизовую кислоту и этилен — пи одно из них не оказывало такого действия, как фактор, индуцирующий ингибиторы протеиназ. Образовавшись в клетках, ингибитор откладывается в центральной вакуоли в виде белковых кристаллов. Там они могут сохраняться длительное время, не разрушаясь.

Большим числом исследователей доказано участие ингибиторов протеиназ в регулировании свертывания крови, процесса оплодотворения, секреции ферментов и гормонов. Их недостаток в организме может приводить к тяжелым заболеваниям. В частности, нарушение равновесия между протеолитическими ферментами и их ингибиторами является одной из причин злокачественных новообразований. Препараты ингибиторов протеиназ широко используются в качестве терапевтических средств при лечении эмфиземы легких, панкреатита, шока и других болезней.

Таким образом, наличие специфических высокомолекулярных ингибиторов ферментов, защищающих растения от фитопатогенов, сомнений не оставляет. Сомнительным остается другое, а именно способность растений в ответ на введение в них определенного фермента образовывать строго специфические антиферменты, подавляющие только этот и никакой другой фермент. Признать это все равно, что признать за растениями способность образовывать антитела в ответ на введение антигена.

МЕХАНИЧЕСКИЕ ПРЕГРАДЫ

Для того чтобы превратить растение в источник своего питания, паразит прежде всего должен в пего проникнуть. А это не так уже и просто, поскольку каждое растение, его листья, корни, стебли, плоды, клубни и корнеплоды, одеты покровными тканями. Покровные ткани растений включают эпидермис и перидерму. Эпидермис — первичная покровная ткань растений, образующаяся из клеток, возникающих в результате первичного роста. У многих растений стебли и корпи еще дополнительно нарастают в толщину. На таких вторичных утолщениях эпидермис заменяется перидермой.

Эпидермис, образующий непрерывный слой на поверхности органа, как правило, состоит из одного ряда клеток таблитчатой формы. Наружная стенка клеток эпидермиса пропитывается липофильным веществом — кутином, представляющим собой полимер оксимонокарбоновых кислот, образующих пространственную сетку. Кутин входит также в состав кутикулы — бесклеточной пленки, покрывающей поверхность эпидермиса. На внешней поверхности кутикулы находится слой воска, благодаря чему инфекционные капли, содержащие споры патогена, не могут удерживаться на их поверхности и скатываются, что предохраняет растения от инфицирования.

Вторичная покровная ткань называется перидермой. О перидерме и цементирующем ее липофильном соединении суберине мы уже говорили в разделе «Раневой стресс».

На эпидермисе надземной части растений встречаются особые отверстия — устьица, через которые осуществляется транспирация и воздухообмен растений. На поверхности перидермы находятся чечевички — рыхло расположенные клетки, также обеспечивающие обмен воздуха и воды.

Бактерии преимущественно проникают в растительные ткани сквозь естественные отверстия на поверхности растений — чечевички, устьица, либо через раны. Вирусы могут проникать через раны, поэтому механические поранения растений, возникающие при уходе за ними, способствуют проникновению инфекции. Патогенные грибы обладают способностью к активному самостоятельному проникновению в неповрежденные растительные ткани. Правда, отдельные грибы различаются по своей проникающей способности. Группа эволюционно более древних грибов получила название «раневых», поскольку они проникают в растения только через раны. Другие грибы хотя и способны проникать через неповрежденные покровы, по все же предпочитают естественные отверстия или раны. Некоторые из них развивают на копчике гифы давление, не уступающее давлению на поршень в цилиндре мотора самолета.

Покровные ткани представляют собой не только механическую преграду на пути инфекции, но и токсический барьер, поскольку в их составе содержатся различные по природе антибиотические вещества. Об антибиотических веществах, содержащихся в составе перидермы, мы уже рассказывали.

Токсические соединения присутствуют также и в составе кутикулы и волосков, представляющих собой выросты эпидермиса. Подобные выросты обламываются при соприкасании с ними, выделяя ядовитые вещества на поверхность растительных тканей (вспомните ваши ощущения после того, как вы дотронулись рукой до крапивы).

Все, о чем мы рассказывали до сих пор, представляет собой предсуществующие механические барьеры, т. е. барьеры, имеющиеся в растении еще до того, как оно подвергается паразитарной атаке. Это так называемые конституционные барьеры. Ранее их относили к пассивным факторам иммунитета. Однако теперь стало очевидным, что такие барьеры могут активно образовываться или индуцироваться в ответ на повреждение, в том числе и на инфицирование.

Например, перидерма отграничивает область некротизированных клеток, которые погибли в результате реакций сверхчувствительности, возникшей в ответ на проникновение несовместимой расы возбудителя фитофторы в клетки картофеля.

Очаг инфекции тем самым как бы отделяется от здоровой ткани.

Иногда удается наблюдать выпадение участков некротизированной ткани в результате их окружения зоной перидермы. Так, листья миндаля, пораженные Clasterosporium carpophilum (Lev.) Aderh., на просвет кажутся как бы простреленными дробью, поскольку единичные образовавшиеся некрозы, окруженные перидермой, выпадают из ткани листа. Ограничивание очагов поражения на ветвях выглядит как изъязвление и шелушение участков. Некротизированная ткань как бы заключается в капсулу и активно вытесняется здоровыми тканями.

Выпадение пораженных очагов наблюдается тогда, когда перидерма, локализующая инфекцию, закладывается в направлении, перпендикулярном поверхности листа. В том случае, если деление происходит в периклинальном направлении, очаг инфекции как бы вышелушивается.

Очаг инфекции в растении чаще всего не удаляется, а только локализуется. Последний хотя и отграничивается перидермой, по остается соединенным со здоровой тканью. Перидерма, отграничивающая зараженный участок, выполняет три важные функции:

локализует паразита и тем самым препятствует его распространению;

прекращает приток питательных веществ из здоровых тканей растений в очаг инфекции;

защищает организм хозяина от токсических продуктов взаимодействия партнеров.

Очень интересны наблюдения внедрения возбудителя мучнистой росы в клетки ячменя и вигны. Оказалось, что еще до момента проникновения паразита в клетку, как раз под тем местом, где находится аппрессорий гриба (орган, с помощью которого паразит прободает клеточную стенку), последняя начинает утолщаться. Материал для утолщения стенки доставляется специальными цитоплазматическими пузырьками (пузырьки аппарата Гольджи), которые скапливаются под местом предполагаемого проникновения паразита. Возникает своеобразная «папилла» (бугорок), в составе которой обнаружен лигнин и кремний. Тем самым укрепляются механические свойства клеточной стенки и ее устойчивость к воздействию разрушающих ферментов гриба. Если папилла образуется своевременно, то паразит проникнуть не может, если образование папиллы запаздывает — проникновение патогена все же происходит.

Своеобразной механической преградой на пути распространения паразита служат тиллы, образующиеся в сосудах растений, пораженных возбудителями инфекционного увядания. Вилт (увядание) — одна из наиболее вредоносных болезней растений, которые поражают многие травы, деревья и кустарники. Но особенно страдает от вилта хлопчатник, который поражают грибы из родов Verticiilium и Fusarium. У заболевших растений нарушается водопроводящая система, они теряют упругость, желтеют, темнеют и, наконец, засыхают. Паразит через корпи пробирается в сосуды ксилемы, а затем с током воды распространяется по всему растению. Так происходит в восприимчивых сортах. А в устойчивых — распространению паразита по сосудам препятствуют пробки, которые образуются в сосудах выше местонахождения гриба. При этом в просвет сосуда выпячивается содержимое расположенных рядом с ннм паренхимных клеток — образуются тиллы, которые заливаются затем пектиновыми гелями. Гриб как бы замуровывается в просвете сосуда, а затем подвергается воздействию антибиотических веществ. Если такие закупорки многочисленны, то растение начинает страдать от недостатка воды. Для того чтобы этого избежать, растению приходится образовывать новые дополнительные сосуды ксилемы, которые компенсируют закупоренные.

13 последнее время все большее внимание фитоимму-пологов привлекает процесс лигнификации (одревеснения) клеточных оболочек как защитная реакция против фитопатогенов. Лигнин представляет собой гетерополимер трех фенилпропановых производных — кумарилового, копиферилового и синапового спиртов. Предполагается, что в образовании лигнина принимает участие фермент — пероксидаза и перекись водорода.

Известно, что оболочки растительных клеток в основном состоят из целлюлозы, которая образует каркас, погруженный в матрикс из веществ неуглеводной природы. Лигнин, откладывающийся в матриксе, связывается с полисахаридами клеточной стенки с помощью ковалентных связей, придавая оболочке жесткость. Важным свойством лигнина является его устойчивость к микроорганизмам: даже из числа паразитарных лишь немногие (например, дереворазрушающие грибы) могут расщеплять лигнин, да и то достаточно медленно. Поэтому одревесневшие оболочки клеток служат преградой на пути распространения инфекции. Накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что устойчивые растения в ответ на заражение способны лигнифицировать оболочки тех клеток, в которых ранее лигнин отсутствовал. В результате этого вокруг внедряющегося паразита образуется кольцо лигнифицированных клеток, что создает ему враждебное окружение в силу следующих причин:

лигнин повышает механическую прочность оболочек растительных клеток, в результате чего они становятся устойчивыми к проникновению паразита;

лигнин химически связывается с основными компонентами клеточных стенок и поэтому экранирует их от атаки ферментами паразита;

присутствие лигнина в клеточных стенках ограничивает не только распространение токсинов паразита по клеткам растений, но и приток питательных веществ из клеток в структуры паразита;

фенольные предшественники лигнина, так же как свободные радикалы, возникающие при его образовании, являются высоко токсичными для паразита.

И, наконец, последнее — сенсационное сообщение. Оказывается, лигнин, образуемый растением-хозяином, может откладываться в клеточной стенке гиф паразитарных грибов, ограничивая их рост, сковывая и обездвиживая. Более того, хитин — основной компонент клеточных стенок многих паразитарных грибов, с одной стороны, является как бы индуктором процессов лигнификации, т. е. сигналом, оповещающим растение, что лигнификацию следует начинать, а с другой — матриксом, где лигнин и откладывается. На какие только уловки не пускается растение, чтобы выиграть бой.

СВЕРХЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ, ИЛИ ГИБЕЛЬ ЧАСТИ ВО ИМЯ СПАСЕНИЯ ЦЕЛОГО

Термин сверхчувствительность (СВЧ), или гиперчувствительность, т. е. повышенная чувствительность, заимствован из медицины. Это воспалительная реакция повышенной интенсивности, возникающая у предварительно сенсибилизированного организма в ответ на повторное введение того же антигена. Различают гиперчувствительность быстрого и замедленного типа. Гиперчувствительность быстрого типа возникает у животного, в крови которого уже имеются антитела на определенный антиген, поэтому его повторное введение вызывает воспалительную реакцию повышенной интенсивности. При гиперчувствительности замедленного типа готовых антител в крови еще нет, но зато есть предварительно сенсибилизированные антигеном лимфоциты, и поэтому повторное введение антигена вызывает воспалительную реакцию, однако не столь быстро возникающую.

СВЧ в фитоиммунологии имеет мало общего с медициной. Эта местная защитная реакция растений, основанная на быстрой локальной гибели части инфицированных, клеток вместе с проникшим в них патогеном. Таким образом, в медицине и фитоиммунологии под одним и тем же термином подразумевают различные явления — СВЧ у растений возникает при первичном контакте с инфекцией, тогда как у человека только в ответ на повторное введение антигена. Это своеобразная жертва частью клеток во имя сохранения целого растения, в результате чего паразит локализуется и погибает. Растение может позволить себе потерять часть своих тканей, группу клеток, лист, часть корней или даже ветвь, но остаться при этом живым, тогда как животное, как правило, не может лишиться ни одного из своих специализированных органов. Тем не менее защитная реакция, основанная на гибели части своих тканей, вряд ли может считаться эволюционно совершенной.

Впервые реакцию СВЧ обнаружил и описал ботаник из Кембриджа Г. Вард еще в 1902 г. Оп заметил, что клетки устойчивых сортов злаков настолько чувствительны к ржавчине, что погибали сразу же после установления физиологического контакта с паразитом. У восприимчивых растений инфицированные клетки оставались живыми, во всяком случае в первый период после заражения, их обмен даже активизировался, а паразит беспрепятственно распространялся по тканям. Хотя явление СВЧ впервые описал Вард, однако сам термин ввел в литературу не он, а американский фитопатолог Э. Стокман спустя 14 лет.

Кажется парадоксальным, что устойчивые растения не поражаются инфекцией именно потому, что они к ней слишком чувствительны. Казалось бы, наоборот, чувствительными должны быть восприимчивые, а не устойчивые растения. Однако именно в силу повышенной чувствительности клетка погибает, а ее гибель влечет за собой гибель проникающего патогена.

Именно благодаря сверхчувствительной реакции растения паразит не может проникнуть дальше, чем в первую или первые несколько клеток хозяина. При совместимом взаимодействии клетки хозяина и находящийся внутри них паразит длительное время сосуществуют, оставаясь живыми.

Реакция СВЧ известна также под названием гиперэргической, некрогенной или абортивной. Абортивной она называется еще и потому, что отмершая часть клеток как бы отторгается от живых механическим барьером из перидермы. При этом некротизированная ткань заключается в капсулу и активно вытесняется здоровыми тканями (рис. 5, см. вклейку).

Чем интенсивнее выражена реакция СВЧ, тем быстрее отмирают инфицированные клетки и, наоборот, чем больше степень совместимости паразита и хозяина, тем дольше они сосуществуют. Так, клетка листа картофеля отмирает уже спустя 30 минут после того, как гифа несовместимой расы возбудителя фитофтороза соприкасается с цитоплазматическим содержимым хозяина. Чем выше степень устойчивости, тем меньшее число клеток отмирает, т. е. тем меньше та жертва, которую приходится платить инфицированному растению за выживание и освобождение от паразита, а самое главное — тем быстрее локализуется инфекция. Иногда это всего лишь одна-две потемневшие клетки, которые удается увидеть только под микроскопом.

Поскольку отмершие клетки спустя некоторое время темнеют или «некротизируются», то наличие потемневших клеток на месте инфицирования долгое время было единственным критерием для того, чтобы судить о том, произошла ли реакция СВЧ или нет. В результате любую гибель клеток, сопровождающуюся их покоричневением, стали объяснять реакцией СВЧ, тогда как причины гибели растительных клеток могут быть самыми различными. Например, гибель клеток под влиянием токсинов некротрофов также в ряде случаев сопровождается покоричневением, однако к СВЧ она никакого отношения не имеет. Мало того, чувствительность клеток к токсину свидетельствует об их восприимчивости, а совсем не об устойчивости. Создается положение, когда слишком широкое использование термина СВЧ отнюдь не способствует прогрессу фитоиммунологии, но, наоборот, даже замедляет его. Более того, мы знаем сейчас о природе СВЧ слишком мало, поскольку ученые до сих пор еще ограничиваются только использованием термина СВЧ, не предпринимая попыток понять ее природу.

Правда, фитоиммунологов давно интересовало, отчего паразит в отмершей клетке прекращает свой рост. Этот вопрос задавал себе еще Вард, глядя в микроскоп на гифы ржавчины, погибающие в некротизированных клетках. Однако, по его собственному признанию, это оказалось выше его понимания. Поскольку реакция СВЧ главным образом защищает растения от биотрофных паразитов, которые могут питаться содержимым живых клеток, то их гибель должна приводить к голодной смерти паразита. Однако вскоре стало ясным, что голодание не является основной причиной гибели паразита. Если стать на точку зрения, что паразит внутри отмершей клетки погибает голодной смертью, то гибель растительной клетки должна вызывать последующую гибель паразита. Однако это происходит далеко не всегда, т. е. гибели паразита, как правило, предшествует гибель клетки, но совсем не всякая гибель клетки приводит к гибели в ней паразита. Это заставляло задуматься, не определяется ли гибель паразита накоплением в некротизированных клетках токсических соединений. Ведь не всякая гибель клетки сопровождается образованием таких ингибиторов. Иными словами, бывает токсический некроз, приводящий паразита к гибели, а бывает нетоксический, при котором паразит продолжает жить.

Собственно, вопрос о том, как быстро погибает паразит в некротизированной клетке и всегда ли он погибает, до сих пор еще не слишком ясен. Важно то, что развитие паразита локализуется, и в силу этого он не способен к дальнейшему размножению. Поэтому главный смысл защитной реакции — СВЧ состоит не в уничтожении паразита, а в лишении его возможности спороносить.

В этой главе мы намеревались познакомить читателя только лишь с внешним проявлением столь своеобразной защитной реакции растений, какой является СВЧ, не касаясь механизмов ее сущности. Фактически при этом мы не исказили положения вещей, поскольку явление СВЧ до сих пор еще является загадкой для фитоиммунологов. Неужели растения, поражающие нас своим эволюционным совершенством, научившиеся усваивать углерод атмосферы с невиданно высоким КПД, не сумели выработать ничего лучшего, чем жертвовать частью своих клеток для того, чтобы избежать инфекций? Но так ли это на самом деле? Мы еще не раз вернемся к СВЧ в свете новых данных и попробуем показать, что подобная жертва не является столь уж бессмысленной и эволюционно несовершенной.

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ПАТОГЕНА

В латинском словаре слово «immobilis» означает «неподвижный». Устойчивое растение обездвиживает паразита, который пытается в пего проникнуть. Прорастающие споры паразита склеиваются между собой, кончик гиф грибов перестает расти, а бактериальные клетки приковываются к клеточным оболочкам растения и постепенно теряют жизнеспособность. Как это происходит? Исследования последних лет свидетельствуют о том, что свойством обездвиживать патогенов обладают особые вещества, получившие название лектинов.

Лектины — белковые соединения, которые избирательно связывают углеводы, не вызывая при этом их химического превращения. Избирательность их взаимодействия с углеводами подчеркивается самим термином «лектин» (от латинского legere — выбирать).

Все разнообразие функциональных свойств лектинов связано с их способностью связывать различные углеводные группировки, которыми могут быть как свободные моно- и олигосахара, так и углеводные остатки в составе высокомолекулярных гликопротеидов, гликолипидов и полисахаридов. Поскольку в молекуле лектина находится не менее двух участков связывания углеводов, то лектины способны агглютинировать (агрегировать, группировать, склеивать) между собой живые клетки, в том числе и эритроциты. При этом один участок связывания в молекуле лектина прикрепляется к одной клетке, а второй — к другой.

Примерно 100 лет назад в составе бобов клещевины было найдено вещество (лектин), вызывающее агглютинацию эритроцитов и их гемолиз. С тех пор и до 1965 г. было получено только 3 изолированных лектина: рицин из семян клещевины, конканавалин А из семян конкава-валии мечевидной и лектин из фасоли. Поскольку на первых этапах все лектины были выделены только из тканей растений, они получили название фитоагглютининов. Впоследствии, когда стало ясным, что лектины присутствуют почти у всех организмов — от бактерий до млекопитающих, название лектины постепенно вытеснило фитоагглютинины.

К настоящему времени известно не менее 100 лектинов, полученных в чистом виде. Исследование лектинов стало модным направлением в науке. Ежегодно им посвящается большое число экспериментальных сообщений и обзоров. Появилась даже новая наука — лектинология.

Из числа всех обследованных растений, а их более 3000 видов, лектины найдены примерно у 1000. Практически в каждом семействе растений обнаружены представители, содержащие лектины.

Каких-либо структурных особенностей, характерных для лектинов, не существует. Большинство из них представляют собой гликопротеины с молекулярной массой от 25 000 до 400 000, но есть и исключения. Таким образом, лектины — достаточно гетерогенная группа веществ, объединенная лишь общим функциональным свойством.

Различные группы лектинов связывают различные углеводные группировки. На этом основании лектины разделяют на 6 классов. Одни из них связывают D-маннозу или D-глюкозу, другие N-ацетил-D-глюкозамин, третьи — N-ацетил-D-галактозамин, четвертые — D-галактозу и т. д. Избирательность связывания углеводов лектинами в какой-то мере напоминает реакцию антиген-антитело. Однако антитела обладают значительно более высокой специфичностью, при взаимодействии их с антигенами образуются уникальные структуры. Что касается лектинов, то один и тот же лектин может связываться со многими веществами, лишь бы они содержали одну и ту же углеводную группировку. К тому же сродство антител к антигену на несколько порядков выше, чем у лектинов.

Основным тестом для определения лектинов является агглютинация эритроцитов, поскольку на поверхности последних находится широкий набор углеводов, принадлежащий гликопротеидам и гликолипидам. Последние ориентированы таким образом, что направляют свои углеводные группы к внешней поверхности эритроцита, образуя своеобразный углеводный чехол.

Поскольку каждый лектин связывается с определенным углеводом, то добавление извне такого же углевода препятствует связыванию и соответственно предотвращает агглютинацию эритроцитов. Такие моносахара (или олигосахара), блокирующие активные центры лектинов, получили название гаптенов.

В настоящее время лектины успешно используются как инструменты для исследования поверхности клеток и биологических мембран. Особенно перспективным является исследование физиологической функции лектинов. Предполагается, что лектины участвуют в транспорте и накоплении углеводов в растениях, запасании веществ в семенах, процессах клеточного деления, распознавании пестиком типа пыльцы и других процессах. Однако особо важная роль принадлежит лектинам в процессах узнавания и взаимодействия клеток. Именно на этом свойстве и основана защитная роль лектинов в растениях, способных иммобилизовывать фитопатогены.

Иммобилизация может быть нескольких типов, например склеивание между собой проросших и непроросших спор фитопатогенных грибов или клеток бактерий. Так, лектины, выделенные из батата, вызывают слипание спор возбудителя черной гнили; лектин картофеля агглютинирует споры и цисты возбудителя фитофтороза, бактериальные клетки Pseudomonas solanacearum. Естественно, что склеенные клетки и споры не могут прорастать и распространяться и, следовательно, теряют свою вредоносность.

Предположим, споры паразита попадают на пораненный участок растительной ткани. Лектины, присутствующие в растительном соке, выступившем на месте поранения, агглютинируют их и тем самым спасают растение от заражения.

Однако тут есть одна существенная деталь. Дело в том, что лектины растения, как правило, способны склеивать клетки и споры только тех форм патогенов, к которым данное растение устойчиво. Так, лектины батата агглютинируют споры штаммов черной гнили, выделенных из растений кофе, сливы, какао, дуба, лимона, но не из батата. Лектин картофеля агглютинирует 34 авирулентных штамма Р. solanacearum, но не склеивает ни одного из 55 вирулентных. Лектин кукурузы агглютинирует 16 штаммов Erwinia sp., которые авирулентны или слабо вирулентны к кукурузе, и почти не склеивает клетки вирулентных штаммов.

Оказалось, что у вирулентных штаммов бактерий имеются вещества, препятствующие их агглютинации лектинами своего растения-хозяина. Это особого рода экстрацеллюлярная слизь, которая выделяется патогенными штаммами бактерий, окружает их чехлом и препятствует доступу лектинов к поверхности.

Собственно, логично, что вирулентные штаммы патогенов не попадают в лектиновую ловушку своего растения-хозяина. Ведь если бы они в нее попадали, то восприимчивых растений бы не существовало.

Вторым способом обездвиживания патогена является способность лектинов связывать кончик растущей гифы паразитарных грибов. Оказалось, что лектин прорастающих семян пшеницы связывается с гифами паразитарных грибов, оболочки которых состоят из полимера N-ацетил-D-глюкозамина — хитина. Лектин прикрепляется к N-ацетил-В-глюкозамину, образуя поперечные связи между цепями хитина в оболочке грибов. Интересно, что лектин связывает хитин на копчике гиф гриба, поскольку это единственное место, где хитин находится на их поверхности, так как по всей длине гифы, кроме кончика, хитин сверху покрыт слоем глюкана и, следовательно, не доступен для лектина. Но именно кончик гифы — ее наиболее ответственный участок. Здесь формируется новая клеточная стенка, синтезируются новые молекулы хитина, т. е. гифа растет на конце. Растение безошибочно находит наиболее уязвимое место у фитопатогена. Связывая цепи хитина на кончике гифы, лектин растения тем самым прекращает рост паразита.

Весьма возможно, что пшеница таким способом предохраняет свои прорастающие семена от поражения теми паразитарными микроорганизмами, на поверхности которых находится хитин (а таких патогенов чрезвычайно много). Точно так же можно предположить, что лектины семян, обладающих сродством к иным углеводам (например, глюкозе), могут стоять на страже процесса прорастания, охраняя семена от паразитов, оболочки которых состоят из глюканов. Недаром содержание лектинов в семенах настолько высоко, что вызывает удивление» исследователей.

Третьим способом иммобилизации патогенов с помощью лектинов является возможность связывания ими клеток авирулентных штаммов бактерий в сосудах флоэмы, по которым некоторые бактерии (Erwinia amylovorа) распространяются. Возможно, что лектины участвуют в иммобилизации паразита и при других сосудистых заболеваниях.

И, наконец, наиболее впечатляющими работами по иммобилизации бактерий являются исследования американского бактериолога Л. Секвейра. Он последовательно, этап за этапом на протяжении многих лет изучал поведение бактерий Р. solanacearum в тканях табака и картофеля, постепенно раскрывая тайны их взаимоотношений. Большинство фитопатогенных бактерий развивается в межклеточном пространстве растений за счет веществ, выделяемых клетками через плазмалемму и клеточную стенку.

Все началось с наблюдения, что сапрофитные бактерии, либо бактерии, авирулентные к табаку, либо, наконец, вирулентные бактерии, но предварительно убитые нагреванием, после введения в ткани табака как бы окутывались каким-то веществом и прикреплялись снаружи к клеточным стенкам. Клетки, к стенкам которых бактерии прикреплялись, погибали в процессе реакции СВЧ. Если же в ткани вводились живые вирулентные бактерии, ничего подобного не происходило — бактерии быстро развивались в межклеточном пространстве, не вызывая СВЧ-гибели растительных клеток.

Под электронным микроскопом удалось увидеть, что стенка клетки в том месте, где к ней прикрепляется бактерия, сильно изменена, а пленка, окружающая бактерию, как бы выходит из места повреждения клеточной оболочки.

События, предшествующие прикреплению бактерии, развивались следующим образом. На внутренней стороне клеточной стенки, как раз там, где находится бактерия, начинали скапливаться пузырьки (везикулы), которые, по всей вероятности, и транспортируют обволакивающий бактерию материал. Бактериальные клетки как бы попадают в ловушку, которая захлопывается. Разве это не напоминает лист росянки, покрытой капельками слизи, к которым прилипают невезучая муха или комар, которые потом с помощью ресничек притягиваются к поверхности листа?

Удалось показать, что прикрепление бактерии к клеточной стенке происходит с помощью лектина растения. Лектин табака и картофеля связывается с N-ацетил-D-глюкозамином, который присутствует в большинство оболочек грибов и бактерий. В случае Р. solanacearum лектин прикрепляется к липополисахариду, который находится на наружной мембране бактерий.

По-видимому, на иммобилизованную бактерию начинают затем воздействовать ингибиторы, поступающие из погибшей клетки. Ведь легче попасть в неподвижную мишень, чем в движущуюся. К тому же в месте прикрепления бактерии проще создать локальную токсичную концентрацию ингибиторов.

Иммобилизация бактерий на клеточной стенке растения, помимо ее обездвиживания, преследует и другую не менее важную цель — распознавание клеткой растения чужеродного начала в лице проникающего патогена. Обволакивание и прикрепление бактерий служит обязательным этапом в распознавании. Однако эта тема специальной главы, которую вам еще предстоит прочесть.

Что же происходит с вирулентной бактерией? Вот в том-то и дело, что с ней ничего не происходит. Она преспокойно питается содержимым клеток, размножается и распространяется по тканям растений. И причиной всему та самая экстрацеллюлярная слизь, выделяющаяся бактерией наружу и не позволяющая растению ни прикрепить бактерию, ни распознать ее.

До сих пор речь шла об участии лектинов в защите растения от фитопатогенов при несовместимой комбинации паразита и хозяина. Однако в целом ряде случаев связывание поверхностей взаимодействия растения и паразита посредством лектина является условием, необходимым для их совместимости. Особенно ярким примером этому служат симбионтные взаимоотношения корней растений семейства бобовых с клубеньковыми бактериями из рода Rhizobium.

Аэробные бактерии из этого рода, обитая сапрофитно в почве, образуют слизистые нити, которые проникают в корни бобовых растений через корневые волоски. Клетки корня в ответ на проникновение увеличиваются в размерах и делятся, в результате чего возникают корневые клубеньки. Бактерии проникают в клетки растения, где окружаются мембраной и образуют бактероиды. На этой стадии защитные реакции затихают и отношения партнеров становятся симбиотическими. Клубеньковые бактерии, неспособные усваивать азот воздуха пока они ведут сапрофитный образ жизни, попав в корневые клубеньки, начинают интенсивно фиксировать азот. Образующиеся при этом аминокислоты частично достаются растению.

Каждому виду бобовых соответствует своя бактерия. Так, один вид Rhizobium специфичен к сое, другой — к клеверу и т. д. Растение как бы «узнает» свой вид бактерий. Вернее, узнает не растение, а его лектины, которые связывают углеводные рецепторы на поверхности клеток только подходящего вида бактерий. Иными словами, образование или необразованно клубеньков у растения определяется тем, узнает или не узнает его лектин соответствующие углеводные группировки на поверхности бактерий. Если узнает, клубеньки образуются и азот фиксируется, если не узнает, ничего не получится.

На конечной стадии бактерии размножаются и покидают растение, а оставшиеся бактероиды перевариваются растительной клеткой и служат, таким образом, для нее ценным источником азота.

Существует много видов Rhizobium, специализированных к различным видам бобовых. Наиболее хорошо исследованы две системы симбионтов: это соя и ее специфический симбионт Rhizobium japanicum, а также клевер и R. trifoli. Даже в этих двух системах лектины локализованы по-разному, хотя и выполняют одну и ту же роль притягивания поверхностей растения и бактерии. У сои лектин находится на поверхности корневых волосков. А вот у клевера лектин выделяется из корней наружу и служит как бы мостиком между сходными углеводными группировками на поверхности клеток бактерий и соответствующего ей растения. Однако в том и другом случае лектин растения узнает свою бактерию и притягивает ее к себе.

Итак, две, казалось бы, противоположные функции лектинов во взаимодействии растения с фитопатогенами и симбионтами основаны на процессе притягивания и распознавания микроорганизмов. Только в первом случае (фитопатогены) распознается несовместимость, в результате чего происходит СВЧ-реакция и гибель паразита, а во втором — возникает, наоборот, совместимое взаимодействие. Однако и в том и в другом случаях функция лектинов приносит очевидную пользу растению: избавляя его от поражения патогеном в первом и обеспечивая снабжение азотом во втором случае.

Чтобы покончить с ролью лектинов в процессе защиты растения, следует еще рассказать о небольшой группе токсических лектинов, хотя об этом, скорее, следовало бы говорить в разделе антибиотических веществ. Речь идет о двух токсических лектинах семян — абрине и рицине, которые рассматриваются как своеобразная защита от поедания этих семян животными и насекомыми. Устойчивые к действию гидролитических ферментов, эти лектины вызывают нарушение функции всасывания в кишечнике, повышая его проницаемость для бактериальных токсинов и продуктов гниения.

ФИТОНЦИДЫ

Кто из нас не испытывал на себе благотворное влияние леса, парка, сада, поля — наших давних и верных зеленых друзей, по праву называемых царством жизни и красоты. Растения не только снабжают нас пищей и энергией, не только пополняют запасы кислорода в атмосфере, которые отнюдь не беспредельны, они исцеляют нас от самых разнообразных болезней. О целебном действии многих растений знал еще первобытный человек. На использовании лекарственных растений основана народная медицина. Известна старая русская поговорка «лук от семи недуг». Во многих странах простудные заболевания и сейчас часто лечат домашним способом путем вдыхания распаренных растений, например лаванды, картофельной кожуры, шелухи овса и т. д. Многим эмпирическим наблюдениям народных лекарей сейчас дано научное обоснование. Современная медицина широко использует растения для получения разнообразных лекарств. И тем не менее далеко не все лечебные свойства растений еще раскрыты, многие из них продолжают оставаться тайнами живой природы.

В конце 20-х годов нынешнего столетия важное открытие сделал профессор Борис Петрович Токин. Его исследования показали, что растения выделяют вещества, способные задержать развитие и даже убивать микроорганизмы, вызывающие болезни животных и самих растений. Он назвал эти вещества фитонцидами (от греческого фитон — растение и латинского цедере — убивать) и охарактеризовал как «продуцируемые растениями бактерицидные, фунгицидные, протистацидные вещества, являющиеся одним из факторов их иммунитета и играющие роль во взаимоотношениях организма в биоценозах»[15].

Сам автор открытия часто говорил, что фитонциды — его «незаконнорожденное дитя в науке». Дело в том, что он открыл их, уже будучи видным эмбриологом. Все эти годы, ведя фундаментальные исследования, ученый при активном участии многих исследователей и любителей природы успешно развивал и свое учение о фитонцидах, которые получили всеобщее признание в науке.

Подсчитано, например, что на 1 га лиственного леса выделяется летом 2 кг фитонцидов, хвойного — 5 кг, а можжевелового — даже 30 кг. Разумеется, дело не только в количестве, так как биологическая активность разных веществ далеко не одинакова. Например, бегония и герань снижали содержание микроорганизмов в окружающем воздухе на 43 %, циперус — на 51 %, мелкоцветная хризантема — на 66 %. Выделение фитонцидов зависит от физиологического состояния растений. Так, многие из них больше всего выделяются во время цветения. Их общее количество, содержащееся в растениях на гектаре соснового бора, достаточно для того, чтобы оздоровить воздух от патогенных микробов среднего по величине города. В этом одна из основных причин благотворного действия воздуха вблизи растений.

Уже в первых опытах было установлено, что грибы, бактерии и даже лягушки и мыши погибали в атмосфере разрезанного лука. Но гибель каждого из них наступала в разное время и зависела от продолжительности воздействия выделений, их концентрации и многих других факторов. Летучие фитонциды ряда растений, вызывающие смерть лягушки в течение нескольких минут, не могли убить некоторые инфузории даже в течение нескольких часов. Подобные различия в действии зависели от того, в какой мере подавлялись важнейшие процессы жизнедеятельности того или иного организма.

Видный советский фитопатолог Д. Д. Вердеревский. много занимавшийся изучением роли фитонцидов, пришел к выводу, что в иммунитете растений они имеют столь же важное значение, как и фагоцитоз у животных. В самом фанте более сильного выделения этих веществ пораненными растениями заложен глубокий биологический смысл. Мы уже говорили, что поранения как бы открывают ворота для проникновения микроорганизмов в растительную ткань, а интенсивным выделением фитонцидов растение перехватывает патогены еще на лету, создавая против них первую линию обороны. Ведь в природных условиях растения в той или иной степени непрерывно повреждаются от ветра, дождя, града, насекомых, птиц и т. д.

Однако далеко не все фитонциды являются летучими, имеются и нелетучие. Сосредоточены они в основном в покровных тканях растений и создают как бы вторую линию обороны против проникновения чужеродных пришельцев.

Ядовитость растений по праву рассматривается как такое же важное приспособление к их выживанию, как и другие защитные реакции. Но фитонциды не только яды, по и лекарства. Ведь недаром книга о них названа «Целебные яды растений…». Все зависит от дозы. Известно, что лекарственные вещества при повышенных концентрациях тоже могут стать ядами. Еще во времена средневековой медицины писалось: «Все есть яд, и ничто не лишено ядовитости, одна лишь доза делает яд незаметным». Так, выделения лука в малых концентрациях не только не вызывают гибель микроорганизмов, но даже стимулируют их рост. Поскольку различные организмы сильно различаются между собой по чувствительности к фитонцидам, то легко понять, что этим веществам принадлежит важная роль в биоценозах, т. е. в сообществе живых организмов, населяющих однородный по условиям жизни участок природы и связанных друг с другом определенными взаимоотношениями.

Итак, все антибиотические вещества растений являются фитонцидами. Однако они настолько разнообразны по составу, свойствам и местонахождению, что в целях упорядоченности должны быть систематизированы. Многие исследователи неоднократно предпринимали попытки систематизировать антибиотические вещества высших растений, и к настоящему времени существует несколько классификаций, разделяющих их по химическому составу, активности, механизму действия и другим признакам. Для целей настоящей книги, наверное, наиболее интересна классификация, основанная на способности этих веществ оказывать защитное действие против фитопатогенов. Именно на этих свойствах антибиотиков и построил свою систему Ингхем, который разделил все антибиотические вещества высших растений на 4 группы:

1) конституционные ингибиторы, содержащиеся в интактных (неповрежденных) растительных тканях в количествах, достаточных для подавления роста патогена;

2) полуконституционные ингибиторы, которые содержатся в интактных тканях в количествах, недостаточных для ингибирования патогенов, по накапливаются в них в ответ на повреждение до токсических концентраций;

3) полуиндуцированные антибиотики, которые отсутствуют в неповрежденных растительных тканях, но возникают в них в ответ на повреждение в результате распада более сложных нетоксических или малотоксических соединений;

4) индуцированные антибиотики ничем, кроме происхождения, не отличающиеся от веществ третьей группы: они так же, как и предыдущая группа, отсутствуют в интактных тканях растений, возникают в ответ на инфицирование, однако своим образованием обязаны не гидролизу сложных веществ, а, наоборот, синтезу антибиотических веществ из более простых (к ним относятся фитоалексины, которым будет посвящена особая глава в этой книге).

Однако одно дело содержаться в ткани в концентрациях, токсических для паразита, и совсем другое — защищать от него растения. Для того чтобы токсическое вещество защищало растительную ткань от определенного фитопатогена, оно должно оказаться в нужном месте, в нужное время, в нужной (токсической) концентрации в клетке хозяина-растения. Доказать, что в каждом конкретном случае это так, очень нелегко. Особенно сложен вопрос о пространственной локализации антибиотических веществ в клетке или межклетнике растения, так как методы определения местонахождения антибиотиков в клетке еще мало разработаны. Поскольку, как правило, они не обладают избирательным действием, то будут оказывать токсическое влияние не только на проникающего патогена, по и на растительные клетки, в которых содержатся. В силу этого содержащиеся в клетках антибиотики обычно изолированы от клеточных органоидов (митохондрий, рибосом и др.) и сосредоточены в определенных структурах клетки, чаще всего в ее вакуолях, где отделены мембраной (тонопластом) от цитоплазмы клетки и не могут поэтому вредить клеточному метаболизму. Для того чтобы вещества оказали токсическое действие на проникшего в клетку паразита, ее структура должна быть нарушена, в результате чего только и может, произойти соприкосновение антибиотических веществ с проникшим патогеном. Именно так это и происходит при поражении растительных тканей некротрофными паразитами, которые прежде, чем проникнуть в клетку, убивают ее с помощью токсических выделений и, следовательно, нарушают ее структуру.

Иное дело биотрофный паразит, который никогда не убивает (во всяком случае, на первых этапах паразитирования) клетки растений, а следовательно, не нарушает их целостности. Так содержащиеся в клетках ингибиторы продолжают оставаться должным образом пространственно отделенными от него и не могут поэтому вредить патогену. Разумеется, имеется в виду взаимодействие биотрофа с восприимчивым к нему растением-хозяином или совместимое взаимодействие. А вот при несовместимости все происходит как раз наоборот. Реакция СВЧ, которая, как вы, наверное, помните, лежит в основе устойчивости растений к биотрофно питающимся паразитам, возможно, и рассчитана на нарушение целостности тех вместилищ, в которых хранятся яды. Таким образом, если стратегия патогенности биотрофа заключается в сохранении целостности клетки растения, то стратегия защиты от него, наоборот, состоит в ее нарушении.

Так что же представляют собой антибиотические вещества высших растений? Они представлены широким набором низкомолекулярных соединений, принадлежащих к различным химическим группам. Как правило, это вещества вторичного происхождения, природа которых определяется систематической принадлежностью растений, их продуцирующих.

Известно, что к первичным веществам относятся соединения, встречающиеся в каждой живой клетке, интенсивно превращающиеся в основном обмене веществ. Это прежде всего углеводы, белки, липиды и нуклеиновые кислоты'. Но наряду с ними встречаются и более редкие, не повсеместно распространенные вторичные вещества, которые образуются в процессах вторичного обмена и не имеют значения пи как источники энергии, пи как запасные вещества. У растений существуют тысячи таких вторичных веществ, у животных они встречаются реже. Как правило, у растений они образуются из первичных продуктов, возникающих в процессе фотосинтеза.

К антибиотикам растений принадлежат алифатические и ароматические соединения, хиноны, гетероциклические вещества, гликозиды. Сюда относятся терпеноидные соединения. многие из которых летучи, и именно они создают фитонцидное облако вокруг хвойных пород, предохраняя их древесину от древоразрушающпх грибов. Некоторые терпеноидные соединения входят также в состав воска кутикулы на поверхности листьев и плодов. Большую группу антибиотиков растений представляют различные гликозиды, молекулы которых состоят из сахарного остатка, соединенного с веществом пеуглеводной природы, называемой агликоном. В качестве агликона могут выступать фенолы, спирты, гетероциклические соединения и другие вещества.

Аглпкрны гликозидов часто бывают высокотоксичными не только для патогена, по и для живой клетки, в которой они находятся. Поэтому гликозиды и ферменты, их расщепляющие (гликозидазы), находятся в различных частях клетки: гликозиды — в вакуоли, а гликозидазы — в цитоплазме. При повреждении целостности клетки ферменты и их субстраты приходят в соприкосновение, в результате чего высвобождаются чрезвычайно токсичные агликоны.

Терпеновые гликозиды содержат в качестве агликонов тритерпены и стероидные соединения. К их числу относятся многие сапонины и гликоалкалоиды (последние встречаются у растений семейств пасленовых и лилейных). Эти соединения, особенно их агликоны, нарушают свойства клеточных мембран.

Цианогенные гликозиды, обпаружейпые не менее чем у 200 видов растений, содержат циан в качестве агликона, который и накапливается в клетках после разрыва гликозидной связи и освобождения агликона. Поскольку циан является дыхательным ядом, то патогены, устойчивые к этим ядам, обладают способностью переключать свое дыхание на обходной альтернативный путь, нечувствительный к циану.

Наибольшую группу составляют фенольные гликозиды, агликонами которых служат фенольные соединения. Последние вообще играют исключительно важную роль в устойчивости растений к фитопатогенам, особенно основанной на СВЧ-ответе. Фенолы были первыми антибиотиками, наличием которых исследователи пытались объяснить устойчивость растений к болезням. Им посвящено бесчисленное число работ. Была предложена даже фенольная гипотеза устойчивости (1929 г.), которая сейчас представляет скорее исторический интерес.

Фенольные соединения всегда присутствуют в тканях здоровых растений. Их количество обычно сильно возрастает в поврежденных тканях (инфицированных, механически пораненных, облученных УФ-лучами или подвергнутых воздействию какого-либо химического агента). Многие фенольные соединения, ранее отсутствующие в растениях, возникают в них заново, либо за счет разложения гликозидов, либо в результате образования из простых предшественников. Таким образом, фенольные соединения имеются во всех 4 группах антибиотиков по классификации Ингхема.

Отличительным свойством фенольных соединений является их способность к окислению с помощью ферментов, носящих название полифенолоксидаз, активность которых также резко возрастает в ответ на повреждение растительной ткани. Первым продуктом, возникающим при окислении полифенолов, являются хиноны — высокотоксические, крайне реакционноспособные вещества, имеющие в силу этого короткий период жизни, которые затем быстро полимеризуются.

Фенольные соединения в здоровой растительной клетке находятся в вакуоли, тогда как полифенолоксидазы — в цитоплазме.

Иными словами, субстраты и превращающие их ферменты в клетке пространственно разобщены, и поэтому их окисление, если и происходит, то в ограниченных количествах. Последнее контролируется проницаемостью тонопласта — мембраны, окружающей вакуоль. К тому же процессы окисления в клетках компенсируются процессами восстановления, и поэтому продукты окисления фенолов не накапливаются.

В погибшей или погибающей в результате реакции СВЧ клетке проницаемость мембран нарушается, а затем они разрушаются совсем. В результате фенолы бесконтрольно и необратимо окисляются полифенолоксидазами, в конечном счете образуя меланины, присутствием которых в основном и объясняется темный цвет некротизированных клеток.

Защитные свойства фенольных соединений многообразны. Фенолы, содержащиеся в интактных растительных тканях, обычно недостаточно токсичны для того, чтобы подавлять развитие паразитов. Другое дело продукты, образующиеся при их окислении, особенно хиноны. Известно, что чем большей способностью к окислению обладает фенольное соединение, тем выше его токсичность по отношению к патогенам. Однако время существования хинонов настолько мало, что делает маловероятным их непосредственное воздействие на паразита. По мере дальнейшего окисления фенольных соединений и полимеризации их токсичность обычно падает.

Даже не действуя непосредственно пд сам патоген, фенольные соединения, особенно их окисленные формы, оказывают значительное влияние на процессы патогенеза. Прежде всего это инактивация экзоферментов паразита, в первую очередь пектолитических, с помощью которых паразиты прободают клеточную стенку растений. Мы уже упоминали, что окисленные производные фенолов реагируют с сульфгидрильными, а также амино- и аминогруппами белков, чем и объясняется в значительной мере их инактивирующее воздействие на ферменты. Эти же свойства фенольных соединений лежат в основе их — способности дезорганизовывать мембранные структуры, а также нарушать ростовые процессы растений. Выше уже говорилось, что фенольные соединения, конденсируясь, образуют лигнин, предохраняющий оболочки клеток от разрушения.

Паразитарные микроорганизмы, обладающие в силу высокого коэффициента размножения широкими возможностями адаптации, обычно легко приспосабливаются к антибиотикам своего растения-хозяина. Как правило, антибиотики I, II и частично III группы мало защищают растения от поражения специфическими патогенами. В течение коэволюции со своим хозяином эти паразиты приобрели способность либо превращать и детоксицировать такие ингибиторы, либо вырабатывать толерантность к ним. Однако антибиотики этих групп выполняют весьма важную роль в механизме видового песпецифического фитоиммунитета.

Значительно сложнее осуществляется адаптация паразитов к антибиотикам IV группы — фитоалексинам, поскольку они отсутствуют в здоровой растительной ткани и возникают только в ответ на инфицирование. Именно этим антибиотикам и принадлежит ведущая роль в защите растений от фитопатогенов.

ФИТОАЛЕКСИНЫ

В 1940 г. немецкий профессор К. Мюллер со своим ассистентом Г. Бергером опубликовал статью, которой суждено было открыть новую страницу в учении об иммунитете растений к инфекционным болезням. В статье были представлены доказательства (правда, косвенные), что устойчивость растений, основанная на уже известной реакции СВЧ, связана с накоплением в некротизированных клетках антибиотиков. Эти вещества были названы фитоалексинами (от греческого фитон — растение, алексо — отражение атаки). Одновременно в статье были сформулированы основные положения будущей фитоалексинной теории.

Мюллер с сотрудниками уже в течение ряда лет работал над выведением фитофтороустойчивых сортов картофеля. Он знал, что у фитофторы существуют различные по вирулентности расы и что один и тот же сорт картофеля, высокоустойчивый к одной расе возбудителя фитофтороза, т. е. несовместимый к ней, легко поражается другой, совместимой расой. Совместимая раса проникала в клетки картофеля, долго и успешно в них развивалась, прежде чем клетки погибали. Но те же клетки погибали сразу (некротизировались), как только в них проникала несовместимая раса, вслед за тем погибали и гифы гриба. Разыгрывалась типичная реакция СВЧ, о которой в те годы уже хорошо знали.

Мюллер задумал выяснить, а нет ли в погибших некротических клетках картофеля некоего токсического начала, которое и губит паразита. Взяли и заразили ломтики клубней картофеля вначале несовместимой расой, которая вызывала некроз клеток, а затем день спустя ту же поверхность снова заразили, но уже совместимой расой, которая в обычных условиях должна расти на этом сорте картофеля. И хотя она должна была расти, однако почему-то не росла. Тогда попробовали заразить несовместимой расой только часть ломтика, нанося взвесь спор паразита на поверхность среза в виде креста. А затем через день, как и раньше, всю поверхность ломтика заражали спорами совместимой расы. Спустя несколько дней увидели, что получилось. Весь ломтик был покрыт белым пушком споропошения гриба, кроме темных мест, на которые предварительно наносили несовместимую расу. На белом фоне заражения чернел незаряженный крест (рис. 6 см. вклейку). Совместимая раса не сумела поразить некротизированную ткань.

Итак, предварительное инфицирование несовместимой расой паразита предохранило картофель от последующего заражения. Более того, оно защищало ломтики и от второго паразита картофеля — возбудителя сухой гнили Fusarium coeruleuro. Защищенными оказались только поверхностные клетки и несколько нижних, прилегающих к ним рядов. Остальные клетки остались восприимчивыми. Вот, собственно, и весь опыт, который позволил его авторам не столько доказать, сколько предсказать существование в погибших клетках токсических веществ. Таг кпм образом, на основании очень простых по технике исполнения опытов были сделаны далеко идущие широкие обобщения.

А теперь предоставим слово самим автором и послушаем, какие выводы они сделали из своего эксперимента. Воспроизведем их почти дословно, но в более популярной форме.

1. Причиной гибели паразита в клетках устойчивого сорта картофеля не может быть присутствие антибиотического вещества, которое уже имелось в клубне до его инфицирования. Ею не может быть и отсутствие в клетке веществ, необходимых для развития паразита. Причина гибели заключается в изменении состояния клеток хозяина, которые контактировали с паразитом. В результате их изменения образуется новое антибиотическое соединение, которое мы называем «защитной реакцией».

2. Защитная реакция связана с живыми клетками хозяина.

3. Антибиотическое вещество возникает либо активируется в клетках хозяина и может быть конечным продуктом «некробиоза», вызванного паразитом.

4. Это еще не выделенное и поэтому пока гипотетическое защитное вещество, названное фитоалексином, не специфично по своему действию. Оно подавляет по только фитофтору, по и другие грибы, паразитирующие на картофеле, а также сапрофитные грибы. Различные виды паразитов различаются по чувствительности к фитоалексину.

5. Судьбу паразита, так же как и хозяина, решает чувствительность его клеток к некоему соединению, образованному фитофторой, причем чем больше чувствительность клеток растения, тем выше его устойчивость. Способность клеток хозяина реагировать определена гепотинически и проявляется в скорости, с которой образуется защитное вещество.

6. Защитная реакция проявляется только в тканях, оккупированных грибом, а также непосредственно прилегающих к ним, а не распространяется на весь индивидуум.

7. Если в устойчивых сортах происходит иммунизация части ткани, пораженной патогеном, то в восприимчивых наоборот: клетки хозяина, пораженные вирулентной расой, через некоторое время становятся чувствительны даже к грибам, неспособным поражать интактные клубни картофеля. При этом различные грибы способны поражать зараженные фитофторой ткани в различной степени.

8. Состояние устойчивости не наследуется; наследуется только способность к его приобретению, что происходит после контакта с паразитом. В результате этого срабатывает механизм, превращающий часть атакуемых паразитом клеток из состояния индифферентности в состояние устойчивости.

Прошло 45 лет. Многое прояснилось, некоторые выводы пришлось пересмотреть и уточнить. Но в целом они выдержали испытания временем.

Сейчас, оглядываясь назад, становится ясным, что в 1940 г. было открыто новое биологическое явление — способность растительных тканей образовывать в ответ на инфекцию антибиотические вещества, подавляющие развитие патогена.

А что же было дальше? А собственно, дальше ничего не было, по крайней мере в течение последующих 18 лет до того момента, когда тот же Мюллер выступил с новой статьей, в которой изложил метод быстрого и простого обнаружения фитоалексинов. Метод получил название капельных диффузатов.

Он очень прост. Из зеленых бобов фасоли осторожно вынимают семена, а на их место в семянные впадины помещают капли воды со спорами патогена. Споры прорастают, выделяя вещества, проникающие в ткани стручка. В ответ на это в растительной ткани образуются фитоалексины, которые диффундируют в инфекционные капли с тем, чтобы подавить в них рост паразита. Если через 2 суток такие капли собрать, проросшие споры удалить, то это и есть диффузат. Чем хороши стручки? Тем, что на их внутренней поверхности нет кутикулы, и фитоалексины поэтому легко проникают в инфекционные капли из тканей, в которых образуются (рис. 7).

Рис. 7.

Метод капельных диффузатов (пояснения в тексте)

Последствия нового метода вскоре дали себя знать. Уже через год таким способом из бобов гороха был выделен первый фитоалексин, который был назван пизатин (от латинского Pisuni — горох). Честь открытия принадлежит австралийскому фитоиммунологу Круикчанку и его сотруднице Перрин. Еще через год эти же авторы получили другое вещество, на этот раз из фасоли, и назвали его фазеоллином (от латинского Pliaseolis — фасоль). Оба вещества оказались хроманокумаранами.

И тогда стало ясным, что два фитоалексина уже давно известны, только никому не приходило в голову их так называть. Это фуранотерпеноид — иномеамарон, который еще в 1943 г. обнаружил в батате Хиура, и фенантрен — орхинол, выделенный Гойманом и Керном из клубней орхидей в 1945 г. Пятым и шестым были сесквитерпеноиды картофеля — риширии и любимин, выделенные в Японии в лаборатории Томияма и в СССР, в нашей лаборатории.

Ежегодно появлялись работы, которые захватывали все новые и новые ряды исследователей. В их числе оказались и авторы этих строк. Затем поток сообщений принял прямо-таки лавинообразный характер. В среднем 25–30 % всех сообщений в мировой литературе по фитоиммунологии посвящалось и посвящается фитоалексинам. Последние стали самой горячей точкой фитоиммунологии.

Вот что мы имеем сегодня. Сейчас уже открыты около 200 фитоалексинов. Они обнаружены у голосемянных и покрытосемянных, однодольных и двудольных, в число которых входят растения, принадлежащие более чем 20 семействам. Среди них бобовые, пасленовые, мальвовые, розоцветные, вьюнковые, зонтичные, сложноцветные и др. Долгое время никак не удавалось обнаружить фитоалексины у злаковых и тыквенных. Во всяком случае, их не удавалось обнаружить теми методами, с помощью которых у представителей других семейств это сделать удалось. Однако в самое последнее время появились сообщения, что и у растений этих двух важнейших семейств такие вещества имеются.

До настоящего времени нет общепринятой номенклатуры. А каждый исследователь, открывающий новый фитоалексин, естественно, хочет как-то его назвать: кто по названию вида растений, из которого он выделен, кто по наименованию сорта, а кто — в соответствии с химической природой. Например, ришитии и любимиц получили свои названия от сортов картофеля (Ришири и Любимец), из которых были впервые выделены, фитуберип — от наименования патогена — фитофтора и видового названия культурного картофеля — Solannm tuberosum, солаветивон — от родового наименования Solannm.

До сих пор много споров вызывает само определение фитоалексинов. Некоторые ученые предлагают их называть стрессовыми метаболитами, т. е. веществами, возникающими в растениях в ответ на неблагоприятные воздействия. Ведь стрессы есть и у растений тоже. Но, во-первых, эти вещества возникают совсем не на всякие стрессы, а во-вторых, в растительных тканях, попавших в условия стресса, возникает много разных веществ, по совсем не все они являются фитоалексинами.

В определении фитоалексинов обязательно должна быть отражена их главная биологическая функция — защита растений. Поэтому нам представляется, что фитоалексины — низкомолекулярные антибиотики высших растений, которые практически отсутствуют в их здоровых тканях, возникают в ответ на контакт с фитопатогенами и при быстром достижении антимикробных концентраций могут выполнять защитную роль в фитоиммунитете. Поскольку слишком много соединений-самозванцев претендуют быть названными фитоалексинами, канадский исследователь Стоессл установил, что эти вещества должны иметь 4 обязательных признака:

иметь умеренно низкую молекулярную массу;

обладать фунгитоксичностью;

отсутствовать в здоровой ткани растений, но индуцироваться в ней патогенами;

синтезироваться заново из мелких универсальных блоков (о последнем мы уже говорили, когда обсуждали классификацию антибиотических веществ).

Но вот насчет фунгитоксичности. Мюллер хотя и обнаружил фитоалексины в зараженных грибом тканях картофеля, однако назвал их не антигрибными, а антибиотическими веществами, подавляющими рост патогенных микроорганизмов, а не только грибов. До самого последнего времени выделение фитоалексинов рассматривали только как средство защиты растений от паразитарных грибов, однако сейчас установлено, что многие из них обладают антибактериальным и даже антинематодным действием.

Сюда относятся вещества, различные по химическому строению. Они являются конечными продуктами того измененного обмена веществ, который возникает в растительных тканях в ответ на заражение. А у растений разных таксономических групп происходят разные изменения обмена, в результате чего у разных растений образуются его разные конечные продукты. Например, у пасленовых под влиянием заражения начинают образовываться сесквитерпеноидные вещества, которых раньше в здоровых тканях не было, у бобовых — изофлавоноиды, у сложноцветных — полиацетилены.

Получается, что структура фитоалексина является как бы признаком определенного таксона: вида, рода, а иногда и семейства растений.

Однако у всякого правила есть свое исключение. Например, только что обнаружили, что у томатов, наряду с сесквитерпеноидными, существуют и фитоалексины ацетиленовой природы.

У каждого растения образуется не один фитоалексин, а несколько. Однако все они представляют собой группу химически родственных соединений. То, что их много — очень важно, поскольку микроорганизмы, как известно, легко приобретают нечувствительность к антибиотикам. Но если привыкнуть к одному антибиотику относительно легко, то к двум уже труднее, а к нескольким — совсем трудно. К тому же образующиеся вещества хотя и близкие родственники, но часто обладают различными способами воздействия на патоген, т. е. действуют вкупе, дополняя друг друга. Так, у картофеля, зараженного фитофторой, обнаружено около десятка стрессовых метаболитов, примерно столько же их в инфицированных тканях фасоли. Правда, не все из них еще завоевали право называться фитоалексинами, поскольку пока недостаточно исследованы.

Еще Мюллер заметил, что фитоалексины являются «продуктом некробиоза» клеток хозяина. Он и здесь не ошибся, поскольку сейчас установлена связь между некрозом клеток растений, погибающих в ходе реакции СВЧ, и образованием этих веществ. Правда, продуктом некроза фитоалексины быть не могут, поскольку их синтез требует энергии и поэтому не может протекать в погибших или погибающих клетках. Скорее погибающие клетки подают своеобразный сигнал для синтеза.

Синтез фитоалексинов берут на себя здоровые клетки, окружающие некроз, так называемые «бордюрные» клетки. Именно в них эти вещества и образуются, а затем направляются навстречу опасности — в некротизированные клетки, в которых находится паразит. Нечто вроде армии, которая мобилизуется в тылу и посылается на фронт. Кстати, для того чтобы защищаться, тыл определенного размера необходим. Например, ломтик фитофтороустойчивого картофеля теряет свою устойчивость, если он слишком топкий. Подсчитано, что для успешного сопротивления нужен слой не менее чем из 15 рядов клеток, иначе при заражении не из чего будет синтезировать фитоалексины. Их перемещения из здоровых клеток в некротизированные показаны для устойчивых сортов батата, картофеля, бобов и сои. Что руководит этим направленным током в некротизированные клетки — никто не знает. Может быть, у некротизированных клеток нарушается проницаемость клеточных мембран, в результате чего через них легче проникают фитоалексины? Ведь большинство из них липидорастворимые вещества, а чем лучше вещество растворяется в липидах, тем больше у пего шансов пробраться через мембрану.

Фитоалексины не только подавляют прорастание спор и рост фитопатогенов, но некоторые из них, кроме того, ингибируют активность их экзоферментов, иными словами, и убивают, и разоружают агрессора.

Считается, что фитоалексины являются антибиотиками «широкого спектра действия», поскольку они токсичны не только для грибов и бактерий, но и для некоторых нематод и насекомых, а также для клеток растений и животных. Известно, например, что ипомеамарон батата повреждает печень, является нервно-паралитическим ядом. Госсинол хлопчатника вызывает застой и отек органов, падение гемоглобина, разрушение эритроцитов, блокирует спермообразоваиие. Некоторые фитоалексины бобовых вызывают гемолиз эритроцитов.

Растительные клетки не способны выдерживать высокие концентрации фитоалексинов, может быть поэтому они и накапливаются в токсических дозах в погибших клетках, которым уже нечего терять. Вероятно, поэтому их передвижение из здоровых клеток в некротизированные может происходить, минуя содержимое клеток, за пределами их цитоплазматической мембраны, т. е. апопластно по взаимосвязанной системе клеточных стенок и межклетников. Такой способ передвижения удалось установить у клубня картофеля, инфицированного возбудителем фитофтороза.

Поскольку фитоалексины принадлежат к различным химическим классам, трудно ожидать, что они будут иметь единый механизм токсического действия. Считается, что фитоалексины действуют не на специфическую мишень в клетке (в отличие от микробиальных антибиотиков и системных фунгицидов), а подавляют сразу многие звенья обмена, т. е. являются мультисайтовыми ингибиторами. Однако у многих из них есть общее свойство — они повреждают мембраны, прежде всего окружающую клетку цитоплазматическую мембрану.

Большинство устойчивых растений в ответ на инфицирование образует большее количество фитоалексинов, чем восприимчивые.

Однако при оценке защитной роли фитоалексинов нужно учитывать не только их суммарное количество, по также скорость образования и местонахождение (локализацию фитоалексинов в растении). Правда, сделать это очень трудно.

Представьте себе сосуд ксилемы (трахею) хлопчатника, по которой снизу вверх от корней к листьям вместе с током воды распространяются споры возбудителя инфекционного увядания (вилта). Что происходит в устойчивом растении? Просвет сосуда быстро перекрывается за счет образования в нем тилл и пробок, о которых уже шла речь. В закупоренном сосуде прекращается ток воды и споры попадают в ловушку, накапливаясь в пространстве сосуда ниже места закупорки. Вот тут-то за них и принимаются фитоалексины. Локальное местонахождение спор создает возможность создания вокруг них токсических концентраций антибиотиков, которые быстро с ними расправляются.

Вот так в хлопчатнике реализуется принцип «в нужное время, в нужном месте и в нужном количестве». Кстати, обратите внимание, что реализовать этот принцип возможно только, если в дело включаются два типа защитных реакций: формирование механических преград в виде пробок и образование фитоалексинов. Каждая реакция в отдельности не смогла бы сработать. Это и есть синергизм защитных реакций растений, при котором одна из них дополняет другую.

А в восприимчивом сорте хлопчатника споры паразита, не встречая препятствий со стороны растений, спокойно распространяются по его сосудам. Образование фитоалексинов происходит даже в большем объеме, чем в устойчивом сорте (во многих местах, где рассеяны споры паразита), да только это мало помогает. Восприимчивое растение тратит много сил на образование фитоалексинов, но не в состоянии вовремя остановить распространение спор и создать вокруг них токсическую зону, поэтому паразиту удается захватить все растение.

Известны данные, когда удаление фитоалексинов из тканей устойчивого растения превращает его в восприимчивое и, наоборот, добавление этих веществ к восприимчивому растению делает его устойчивым.

Если растение выдержать в плохих для него условиях (при повышенной температуре, недостатке кислорода), то его болезнеустойчивость падает и параллельно уменьшается способность образовывать фитоалексины. Б хороших условиях, наоборот, возрастает как устойчивость, так и образование антибиотиков. Интересно, что если после временного воздействия повышенной температуры растение вновь перенести в условия нормальной температуры, где оно через некоторый срок приходит в себя, то вместе с возвращением болезнеустойчивости восстанавливается и способность образовывать фитоалексины.

Если устойчивые растения обработать определенными ингибиторами обмена, которые, не затрагивая паразита, подавят в растительных тканях образование ферментов, ответственных за синтез фитоалексинов, то такие растения из устойчивых превращаются в восприимчивые. Более того, описаны случаи, когда устойчивое растение, в котором тем или иным способом подавлена способность к образованию фитоалексинов, становится восприимчивым не только к своему специализированному патогену, но и к тем микроорганизмам, которые никогда ранее это растение не поражали. Иными словами, фитоалексины защищают растение не только от его специализированных паразитов (сортовая устойчивость), но и от неспециализированных к нему патогенов (видовой иммунитет).

Можно привести еще много примеров того, как коррелирует устойчивость растений с их способностью образовывать фитоалексины. Однако ученые со свойственной им скрупулезностью требуют все новых и новых доказательств участия этих веществ в защите растений. Корреляция между их образованием и устойчивостью к болезням получена для десятков сортов растений. Однако когда сравнивают между собой разные сорта растений, всегда есть опасность, что их способность образовывать фитоалексины определяется какими-либо иными свойствами сорта, а не только его устойчивостью к тому или иному патогену. Генотип сортов может оказаться настолько различным, что их вообще трудно сравнивать между собой но устойчивости.

Более достоверные сведения можно получить на изогенных линиях растений. Эти линии выравнены по всем генам, кроме одного, в нашем случае по гену устойчивости к той или иной болезни. Правда, на практике получаются не изогенные, а скорее близкие к изогенным линии. Оказалось, что устойчивые линии кукурузы, льна, перца, томатов, сои образуют фитоалексины вдвое, втрое, а то и в десять раз интенсивнее, чем соответствующие восприимчивые линии.

Собственно, что более всего смущает фитоиммунологов? Да тот же самый уже знакомый нам вопрос: а всегда ли в устойчивых растениях фитоалексины образуются в нужном месте, в нужное время и в нужном количестве, чтобы покончить с паразитом? Таких данных пока еще очень мало. И не потому, что поведение этих веществ редко соответствует такому требованию, а потому, что методы определения их локального местонахождения еще не разработаны. К тому же о токсичности фитоалексинов мы пока еще судим только по тому влиянию, которое они оказывают на патогены, будучи добавленными в среду его роста. А будет ли эта величина соответствовать их токсичности в растительных тканях? Например, возбудитель корневой гнили гороха индуцирует в его тканях концентрации пизатина, в несколько десятков раз превышающие те дозы, при которых рост гриба полностью подавляется в пробирке, тем не менее это не мешает ему развиваться в содержащих пизатин тканях. Значит, токсичность веществ в растениях и в пробирке может не совпадать?

Тем не менее из числа всех биохимических показателей, известных нам, образование фитоалексинов лучше остальных коррелирует со свойством болезнеустойчивости. И это краппе важно, поскольку для решения ряда практических задач, таких, как селекция, интродукция, сортоиспытание растений, необходимы показатели, характеризующие устойчивость растительных тканей к болезням. Насколько нам известно, уже сейчас не без успеха предпринимаются попытки использовать фитоалексины как объективный критерий устойчивости растений.

Хотя роль фитоалексинов в сортовой устойчивости более очевидна, чем других групп антибиотиков, тем не менее многие специализированные патогены обладают способностью и их преодолевать. Если бы это было не так, то на свете не существовало бы пи специализированных патогенов, ни восприимчивых к ним сортов растений. Многие специализированные некротрофы обладают способностью разлагать образовавшиеся фитоалексины своего растения-хозяина — пизатин, фазеоллин, помеамарон, вайероновую кислоту, капсидиол и др. В основе процесса лежат самые разнообразные химические превращения — окисления, гидроксилирования и др. Часто детосикация осуществляется фитопатогеном в несколько этапов, причем каждый последующим продукт ферментативного превращения обладает меньшей фунгитоксичностыо, чем предыдущий. Например, пектрия галлообразующая детоксицирует фитоалексин яблони — бензойную кислоту в 2 этапа. Вначале бензойная кислота превращается в геоксибензойную, при этом токсичность по сравнению с исходной падала в 20 раз. Затем геоксибензойная кислота деградировала в протекатеховую, токсичность которой в 40 раз ниже исходной.

Интересно, что различные грибы детоксицируют один и тот же фитоалексин различными путями, а один и тот же патоген превращает родственные по строению фитоалексины одним и тем же путем.

Однако детоксикация фитоалексинов своего растения-хозяина не является единственным путем их преодоления. Другой возможностью является способность специфических патогенов препятствовать образованию фитоалексинов в растении. Это может достигаться за счет их способности проникать в растение незамеченным, о чем' пойдет речь при дальнейшем изложении. Такой механизм преодоления защитных реакций растения патогеном наиболее вероятен среди партнеров, взаимоотношения которых укладываются в систему геи — на — ген, т. е. для высокоспециализированиых биотрофов.

ЛИШЕНИЕ ПАТОГЕНА САМОГО НЕОБХОДИМОГО

Если целью паразита является превращение хозяина в источник своего питания, то растение, наоборот, стремится этого не допустить. Отсюда следует, что если растение сумеет превратить свои ткани в неудобоваримые, а то и просто в ядовитые для паразита, то оно перестанет им поражаться.

Малоспециализированные некротрофы слабо зависят от состава питательных веществ поражаемого ими растения. Прежде всего их биосинтетические возможности значительно шире, они больше привыкли рассчитывать на себя, чем на питающее их растение. Наоборот, высокоспециализированпые биотрофы потому и не могут существовать вне живой клетки, что используют готовые органические вещества, которые в них синтезируются. Иными словами, такие паразиты заставляют растения биосинтезировать определенные соединения вместо себя, а сами часто даже утрачивают эту способность. И одни из механизмов уже описанной реакции СВЧ как раз и состоит в лишении паразита необходимого ему питания и в навязывании голодовки.

Чем теснее приурочен биотроф к обмену своего растения-хозяина, чем более он от него зависим, тем более вероятно, что такая зависимость может быть нарушена при том или ином изменении обмена растения. Известно, что биотрофы потенциально более подвержены вымиранию, чем некротрофы, поскольку целиком зависят от судьбы своего хозяина (гибель растения приводит и к гибели его облигатного паразита). Может быть, именно поэтому облигаты так дорожат жизнью своего хозяина, не оказывая на пего летального воздействия. Приспособленность паразита к составу клеток своего растения-хозяина, как к единственному источнику питания, носит название пищевой специализации.

Конечно, паразиты в меньшей мере испытывают дефицит от наличия в составе растений первичных соединений — углеводов, липидов, белков, которые встречаются в каждой живой клетке и превращаются в основном обмене веществ. Более вероятно, что пищевая специализация определяется наличием либо концентраций относительно редко встречающихся соединений, так называемых веществ вторичного обмена.

В середине 50-х годов Э. Гарбер предложил гипотезу устойчивости растений, основанную на зависимости паразита от состава питательных веществ хозяина. Работая с 7 мутантами бактерий, зависимыми по ряду аминокислот, он пришел к выводу, что растение окажется устойчивым, если не обеспечивает патогена необходимым питанием. В том случае, если оно способно прокормить паразита, имеет место восприимчивость.

Согласно гипотезе Гарбера, устойчивость растений определяется отсутствием в их тканях некоторых физиологически активных веществ, которые паразит не в состоянии самостоятельно синтезировать. Это могут быть некоторые витамины, незаменимые аминокислоты, ростовые вещества и ряд других соединений. Подобная гипотеза фитоиммунитета получила название питательно-тормозящей.

Еще до Гарбера близкая концепция устойчивости была сформулирована советским исследователем, основоположником патофизиологии растений К. Т. Сухоруковым, который провел серию интересных исследований, касающихся роли питания паразита в устойчивости хлопчатника к возбудителю инфекционного увядания и картофеля к возбудителю фитофтороза. Вот что Стало ясным после его работ. Для роста фитофторы необходимы растворимые сахара, однако в картофеле они находятся в неудобоваримой для фитофторы форме — в виде крахмала. Казалось бы, чего проще: фитофтора должна выделять фермент — амилазу, расщепляющую крахмал до сахаров, и проблема решена. Но в том-то и дело, что амилазы у фитофторы пет, зато она есть у картофеля, а следовательно, ею можно воспользоваться. Однако опять неудача: амилаза у картофеля хотя и есть, по она заблокирована особым ингибитором — систоамплазой. Паразит преодолевает и эту трудность: освобождает амилазу из блока, с ее помощью расщепляет крахмал и потребляет образующиеся при этом моносахара. Видите, как сложно и с каким дальним прицелом управляет фитофтора в своих интересах обменом пораженного картофеля. Правда, в конце паразиту все же приходится расплачиваться. На заготовленных им для себя сахарах поселяются сапрофиты, которые раньше не могли поражать картофель, и постепенно вытесняют неспособную с ними конкурировать фитофтору.

Обмен биотрофа настолько тесно приспособлен к обмену его растения-хозяина, что всегда существуют некие узкие места, в которых паразит особенно уязвим. Вопрос только в том, чтобы эти места обнаружить. Чаще всего узкие места находит само растение-хозяин, изменяя свой обмен таким образом, что паразит лишается некоего фактора, необходимого ему для существования. Тем самым растение как бы само указывает на узкий участок паразитирования патогена, а человеку остается только попять, как оно это делает. Читатель простит нас за излишний антропоморфизм. Конечно, на самом деле все происходит по-другому: некая мутация превращает растение в устойчивое и тем самым позволяет избежать заражения. Отбор подхватывает эту полезную мутацию, благодаря чему мутанты и получают преимущество в потомстве.

В качестве примера можно привести наши работы по изучению того же возбудителя фитофтороза, который в ходе сопряженной эволюции со своим хозяином — картофелем утратил способность самостоятельно синтезировать стерины. И не потому, что они ему не нужны. Стерины фитофторе просто необходимы. Во-первых, они являются обязательным компонентом цитоплазматических мембран эукариотов, создавая их прочный каркас. Во-вторых, выполняют функции гормонов либо их предшественников. Оказалось, например, что без стеринов фитофтора не может образовывать споры. Удалось даже установить ту мишень, которая нарушается в отсутствие стеринов: без них не происходит формирования цитоплазматической мембраны зооспор паразита, т. е. нарушается его главный процесс — воспроизведение.

Паразит утрачивает способность самостоятельно синтезировать стерины не потому, что последние ему не нужны, а потому что он может воспользоваться готовыми стеринами, имеющимися в составе хозяина-картофеля. Зачем утруждать себя синтезом, если можно без лишних хлопот получить сразу готовый продукт? Более того, фитофтора сумела приспособиться и к качественному составу стеринов своего хозяина. Главным стершим картофеля является β-ситостерин, который составляет более половины от всех имеющихся стеринов. Именно этот стерин стал самым «любимым» для фитофторы, поскольку он наиболее соответствует ее питательным потребностям.

Вскоре последовал ответный удар со стороны растения. В инфицированном картофеле обмен изменился так, что стерины синтезироваться перестали. Конечно, не во всем растении (прожить без стеринов картофелю невозможно), а только в зоне инфицирования. Особенно резко сокращалось количество любимого фитофторой β-ситостерина. Фитофтора оказалась как бы в кольце бесстериновых клеток, а следовательно, была лишена возможности размножаться.

Но и этого оказалось мало. Те вещества, которые ранее использовались в биосинтезе в качестве предшественников для стеринов, теперь стали предшественниками для фитоалексинов, ингибирующих развитие паразита. Дело в том, что сесквитерпеноидные фитоалексины картофеля и стерины образуются из общих предшественников единым биогенетическим путем (рис. 8). На определенном этапе биогенеза находится поворотный пункт: если метаболизм пойдет в одном направлении, образуются стерины, если в другом — сескитерпеноиды. Поскольку первых в зоне инфицирования фитофтороустойчивого картофеля нет, а вторые присутствуют в избытке, можно полагать, что вместо стеринов образуются токсические фитоалексины. Так что же получается? Паразит не только голодает, но и отравляется? Два удара по паразиту и оба достигаются одним и тем же изменением процесса метаболизма.

Рис. 8. Биогенез терпеновых соединений в картофеле, инфицированном совместимой и несовместимой расами возбудителя фитофтороза

Но и это еще не все. Казалось бы, несмотря на общее происхождение обеих защитных реакций, каждая из них воздействует на паразита самостоятельно: отсутствие стеринов делает невозможным спороношепие паразита, а фитоалексины оказывают на него токсическое воздействие. Но это только на первый взгляд. В отсутствие стеринов ослабляется ригидность цитоплазматических мембран паразита, и он становится значительно чувствительнее к воздействию фитоалексинов. Так, если для полного подавления роста паразита, содержащего стерины, необходимо 200 мкг/мл ришитина, то для гибели того же паразита, лишенного стеринов, их нужно только 6–7 мкг/мл, т. е. в 30 раз меньше. Для бесстеринового паразита фитоалексины значительно более опасны, и, для того чтобы его погубить, растению нужно синтезировать их значительно в меньшем количестве. Недаром считается, что стерины защищают организм от неблагоприятных факторов среды — температурного стресса, ионизирующего излучения, воздействия токсических веществ. Усиленный синтез стеринов представляет собой приспособительную реакцию организма на выживание.

Таким образом, изменение терпеноидного биогенеза, происходящее в фитофтороустойчивом картофеле, наносит по паразиту не двойной, а тройной удар:

1) гриб лишается стеринов, необходимых ему для размножения и патогенных свойств;

2) взамен стеринов образуются токсические фитоалексины;

3) лишенный стеринов гриб становится чувствительнее к фитоалексинам.

Итак, отдельные защитные реакции растения действуют сообща, взаимодополняя и усиливая друг друга. Результат их воздействия представляет собой пример синергизма, поскольку, взятые вместе, они оказывают больший эффект, чем сумма эффектов каждой реакции в отдельности. Да так, собственно, и должно быть, поскольку каждая из защитных реакций ослабляет паразита. А ослабленный предыдущим воздействием паразит, естественно, становится более уязвим для последующего удара.

Как вы, наверное, помните, Гарбер считал, что устойчивость растения объясняется отсутствием в его тканях того или иного необходимого паразиту вещества еще до контакта с патогеном. Растение с дефицитом такого вещества уже должно было быть устойчиво к данному паразиту. Однако из сказанного выше следует, что растение до встречи с паразитом может содержать все продукты, необходимые для того, чтобы его прокормить.

Но как только паразит, «соблазнившись» богатыми растительными запасами, пробует проникнуть в растение, последнее изменяет свой обмен так, что в его тканях перестают образовываться нужные паразиту вещества, взамен чего начинают синтезироваться яды. Теоретическая возможность подобного механизма устойчивости была предсказана еще В. Н. Эфроимсоном, который предполагал, что устойчивость растений может проявляться в изменении структуры того гена, который ответствен за выработку продукта, необходимого для существования паразита, и превращения его в соединение, тормозящее деятельность патогена или активность его ферментов.

Приспособленность паразита к стероидному обмену хозяина не может не удивлять. Мало того, что паразит утратил способность самостоятельно синтезировать стерины с тем, чтобы пользоваться стеринами картофеля, а фитофтора приспособилась к качественному составу стеринов хозяина (более всего «полюбив» главный стерин-β-ситостерин), оказалось еще, что развитие паразита точно повторяет содержание стеринов в вегетирующих растениях картофеля.

Возбудитель фитофтороза картофеля, согласно теории иммуногенеза М. С. Дунина, относится к болезням нисходящей фазы онтогенеза. Фитофтороз впервые появляется к моменту цветения картофеля и достигает своего максимального развития в конце лета. Недаром эта болезнь называется еще поздней гнилью. Динамика появления и накопления стеринов в листьях точно отражает появление и развитие болезни: содержание стеринов во всходах очень низкое, оно резко возрастает к началу цветения и достигает своего максимума к началу естественного отмирания ботвы (рис. 9). Получается, что слабо функционирующий стериновый биогенез ограничивает развитие гриба на первых этапах вегетации, а возрастание содержания стеринов позволяет ему распространяться и спороносить на более поздних фазах развития растений.

Рис. 9. Соответствие накопления стеринов развитию фитофтороза

ЧТО ТАКОЕ КСЕНОБИОТИКИ И КАК ОНИ УНИЧТОЖАЮТСЯ

Лекарственные вещества и промышленные загрязнения, пестициды и продукты бытовой химии, пищевые добавки и консерванты — вот тот поток чужеродных соединений, который со всевозрастающей силой обрушивается на нашу планету и живущие на ней организмы. Эти синтетические компоненты добавляются к огромному разнообразию чужеродных веществ природного происхождения, которые образуются растениями, грибами, бактериями и другими организмами. Недаром эти соединения получили название «ксенобиотики», т. е. «чуждые жизни».

В столь острой ситуации все живое давно бы оказалось под угрозой гибели, если бы не обладало механизмами, неустанно поддерживающими свою «химическую чистоту». Организмы высших животных и человека в ответ на введение антигенов образуют антитела и тем самым нейтрализуют их воздействие на организм. Однако антигенными свойствами, т. е. способностью вызывать образование антител, обладают только высокомолекулярные ксенобиотики — белки, гликопротеиды, некоторые полисахариды и нуклеиновые кислоты. А как же обезвреживаются ксенобиотики низкомолекулярные? Исследования показали, что такую функцию берет на себя цитохром Р-450-оксигеназпая система, присутствующая в печени млекопитающих.

Недаром говорят о «барьерной» роли печени, которая является своеобразным фильтром, очищающим организм от вредных веществ. G помощью этой ферментной системы превращаются и тем самым обезвреживаются многие ядовитые для организма неполярные, а значит, нерастворимые в воде соединения — лекарственные вещества, наркотики и др. Задача этой системы — превращение нерастворимых соединений в растворимые в воде, с тем чтобы можно было вывести их из организма.

Цитохром Р-450 обнаружен у многих животных, растений и бактерий. Его нет у бактерий-анаэробов, живущих в бескислородных условиях.

А. И. Арчаков называет цитохром Р-450 «мембранным иммуноглобулином». Последний находится в мембранах эндоплазматического ретикулума. К 1980 г. было известно не менее 20 форм цитохрома Р-450. Множественность форм характерна именно для высших организмов, тогда как бактерии содержат лишь один тип цитохрома Р-450.

Существование множественных форм, вероятно, объясняет широкую субстратную специфичность оксигеназной системы, которая может окислять самые различные молекулы. Предполагается, что в ответ на введение в организм определенного класса ксенобиотиков синтезируется и определенная группа цитохрома Р-450, подобно тому как в ответ на введение макромолекулярного антигена возникают строго комплементарные к нему антитела.

Таким образом, в организме млекопитающих существуют две системы иммунологического надзора. Первая из них — лимфоидная система, уничтожающая клетки и высокомолекулярные соединения, вторая — монооксигеназная система, детоксицирующая ксенобиотики. Если первая иммунная система защищает организм от чужеродных макромолекул, то вторая — от чужеродных низкомолекулярных веществ. Предполагается, что иногда обе иммунологические системы действуют в совокупности. После окисления оксигеназной системой ксенобиотика его окисленная форма связывается с определенным белком. Образовавшийся коньюгат приобретает антигенные свойства и начинает вызывать образование антител. Роль коньюгазы опять-таки выполняет цитохром Р-450. Получается, что ксенобиотик, попадая в организм животного, индуцирует не только свое окисление, по и биосинтез соответствующих антител.

С помощью оксигеназной системы окисляются не только экзогенные ксенобиотики, по и ряд эндогенных (внутренних), образующихся в организме: стероидные гормоны, жирные кислоты, простагландины и др.

В печени млекопитающих существует еще одна система, помогающая им убирать из организма ксенобиотики. Это присоединение, или конъюгация, к различного рода лекарствам, ядам, наркотикам и другим соединениям глютатиона, в результате чего ксенобиотики обезвреживаются, а затем и выводятся из организма.

Однако в действии обезвреживающих систем бывают и осечки. Известны случаи, когда эти системы, стремясь обезвредить какое-нибудь токсическое вещество, превращают его в канцероген, т. е. в соединение, способное вызывать злокачественную опухоль.

Все, что сказано, относится к системам обезвреживания ксенобиотиков в организмах млекопитающих, где эти процессы усиленно исследовались и продолжают исследоваться, А как обстоит дело у растений? Вопрос далеко не праздный, поскольку именно растениям приходится в основном принимать на себя тот бесконечный поток чужеродных веществ, который сам человек и созданная им промышленность обрушивают на их поверхность. К сожалению, такие исследования если и проводились, то в крайне ограниченном количестве. А те сведения, которыми мы располагаем, в основном относятся к способности растительных тканей превращать гербициды (главным образом 2,4-дихлорфенолуксусную кислоту), а также некоторые инсектициды. Даже знаменитый ДДТ в этом отношении до сих пор остается почти неисследованным, более того, существует мнение, что растения не в состоянии ею метаболизировать.

Однако те ограниченные сведения, которые все же имеются в литературе, позволяют заключить, что и у растений имеются системы детоксикации ксенобиотиков, напоминающие по своим свойствам оксигеназную систему микросом печени млекопитающих. В составе растений, принадлежащих к 20 видам, обнаружен цитохром Р-450, спектральные характеристики которого удивительно похожи на спектры соответствующих цитохромов из печени млекопитающих. В микросомах более чем 20 видов растений обнаружено наличие оксигеназной активности, способной превращать ряд ксенобиотиков. Эта ферментная система зависит от наличия липидного кофактора и подавляется теми же ингибиторами, что и оксигеназы из микросом печени. У растешгы присутствует также ряд ферментов, ответственных за присоединение к гербицидам глютатиона. Предполагают, что такой механизм обезвреживания может объяснить нечувствительность некоторых растений к гербицидам.

К числу эндогенных ксенобиотиков высших растений принадлежат и фитоалексины. Тот факт, что они являются чужеродными соединениями для растительных тканей, в сочетании со свойством фитотоксичиости диктует настоятельную необходимость их удаления из растений. И действительно, эти вещества, накопившись в тканях устойчивых растений в токсических для паразита концептрациях и тем самым уничтожив находящихся в них паразитов, затем исчезают из растительной ткани. И хотя роль оксигеназных цитохромсодержащих систем растений до сих пор никем не исследовалась, однако имеющаяся к настоящему времени, пусть даже и ограниченная, информация позволяет предполагать их участие в детоксикации фитоалексинов.

Получение прямых доказательств участия монооксигеназной системы в способности растений детоксицировать экзогенные и эндогенные ксенобиотики и тем самым поддерживать свой химический гомеостаз, нуждается в более пристальном внимании фитоиммунологов, чем то, которое до сих пор ему уделялось. Не исключено, что результаты этих исследований покажут, что растения на нашей планете функционируют не только как «зеленые легкие», образуя кислород в процессе фотосинтеза, но и как «зеленая печень», осуществляющая метаболизм ксенобиотиков и защищающая биосферу от загрязнения.