Мы и её величество ДНК

Мендель и первые его последователи работали на уровне организма: изучали передачу признаков в поколениях. Вслед за тем вместе с цитологами генетики «пробрались» внутрь клетки, занялись ее хромосомами. А далее генетиков заинтересовали бактериофаги и вирусы... Не путь ли это от сложного к простому, не деградация ли в исследованиях? Изучали наследственность высших растений, животных и человека, и вдруг занялись бактериями... Не шаг ли это назад? Нет. Это шаг вглубь. Только изучение бактерий и вирусов, молекулярный уровень подводят нас к познанию: что такое ген? Как он устроен? Не зная этого, не овладеть процессом управления генами, не заглянуть под темную вуаль, прячущую от нас лик ее величества ДНК.

Поиски бактериальных пап и мам

К сожалению, между пишущим и читающим в момент, когда ведется работа над книгой, нет еще обратной связи. Она появляется позже, когда читатели получают книгу в руки. Однако уже сейчас я все же осмеливаюсь предположить, что внимательный читатель из предыдущих глав понял: чтобы изучать, как же родители передают свои признаки потомкам, нужно иметь хотя бы... родителей. А вот у бактерий их долгое время найти не могли. Было известно: бактерии размножаются бесполым путем. Попробуй тут изучить менделирование, составить хромосомные карты!

Однако совсем недавно у бактерий нашлись родители. Работа велась, прежде всего, на кишечной палочке — бактерии, паразитирующей в кишечнике человека. Превосходно живет эта бактерия также в пробирках на искусственных средах. С помощью электронного микроскопа было выяснено, что у нее имеются две формы F₊ и F_-. Между ними происходит половой процесс, так называемая конъюгация. Конечно, этого оказалось достаточно, чтобы генетики далее уже разобрались. Дело в том, что во время конъюгации хромосомный материал из F₊-бактерии переходит постепенно в F_--бактерию. Внедрение довольно продолжительно по времени. В опыте процесс можно по желанию прерывать. Таким путем удалось установить не только, в какой последовательности лежат в хромосоме гены, но и на каком расстоянии (в данном случае в единицах времени — минутах, потребных для проникновения) они друг от друга находятся.

Одного этого метода было бы недостаточно, чтобы создать точные хромосомные карты. Но выяснилось, что идет у бактерии и обмен хромосомными участками того же фипа, что и при кроссинговере у дрозофил. Это дало возможность проверить один метод другим. Хромосома у штамма К-12 кишечной палочки кольцевая и гены расположены по окружности.

Однако как же их удается «разглядеть», эти гены? Как практически ведется работа? Заглянем в лабораторию доктора биологических наук С. И. Алиханяна. Навстречу нам идет Виталий Суходолец, молодой исследователь, занимающийся именно этим вопросом. Обратимся-ка мы к нему:

— Будьте добры, расскажите, как вы ловите у кишечной палочки перекресты.

— Элементарно.— Суходолец пожимает плечами: только, мол, этого не хватало: рассказывать общеизвестные вещи.

А дальше он заговорит о тимин- и тимидиннедостаточности, про Hfr-штаммы или, например, так:

— Для определения порядка расположения мутаций проводим реципрокные трехфакторные скрещивания...

Вот тут-то и окажется, что то, что для Суходольца элементарно, для нас с вами, читатели, непостижимо. Однако все эти сложности, труднопроизносимые термины — частности. В принципе же перекресты у кишечной палочки ловят так же, как у дрозофилы.

Бактерию разводят на средах, состоящих из набора различных веществ. Формы, несущие мутантный ген, отличаются от немутантных в большинстве случаев тем, что не могут синтезировать то или иное вещество. И тогда для успешной жизни мутантного штамма это вещество приходится дополнительно вводить в среду. Среды подбирают с таким расчетом, чтобы на них развивались бактерии-перекрестники, т. е. те, у которых прошел кроссинговер.

В генетических лабораториях всегда работают в белых халатах. Однако если для дрозофилиста белый халат всего лишь форма, то для генетика-микробиолога это обязательная одежда. Тут почти всегда нужно соблюдать абсолютную стерильность.

Крутятся центрифуги, сутками качаются культуры в специальных качалках, в лабораториях микробиологов множество термостатов, автоклавов и различных, подчас очень хитрых приборов.

Трансформация

Сейчас уже широко известно: бактерии приспосабливаются к лечебным препаратам. Как бы ни было могущественно лекарство, со временем оно или совсем перестает действовать на бактерии или действует на них слабее. Раньше полагали, что бактерии попросту привыкают к лекарству. Позже точными опытами выяснили, что это не так. Среди миллионов бактерий находятся единицы, а может быть, и единица, где возникла мутация, обуславливающая стойкость к препарату. Легко понять, что немутатные бактерии гибнут, а мутатные выживают и начинают размножаться. Именно так возникли пневмококи, устойчивые к стрептомицину.

В опыт взяли бактерии, устойчивые и неустойчивые к стрептомицину. Бактерии стрептомициноустойчивые убивали и размельчали. Затем в среду, содержащую убитые и размельченные бактерии, пускали бактерии неустойчивые. И тогда с ними происходили странные изменения: от своего мертвого предшественника они воспринимали нехватающее им свойство, делались стрептомициноустойчивыми!

Результаты заинтересовали ученых, и поэтому они продолжили опыты, но уже в других вариантах. При помощи фильтрации и прочих приемов обработки из убитых, устойчивых к стрептомицину бактерий извлекали чистую ДНК (дезоксирибонуклеиновую кислоту). И оказалось, что при воздействии ею, как и при воздействии размельченными бактериями, неустойчивые по отношению к стрептомицину бактерии становятся устойчивыми.

Через ДНК они воспринимают от мертвого предшественника свойственный ему ген и включают его в свой генотип.

Это явление получило название трансформации. Оно показало: носителем наследственной информации является ДНК.

На грани живого и неживого

Написал заголовок и сразу же усомнился в его правильности. Очень уж исторически неустойчива она, эта грань. Некогда простейшими из живых существ люди считали сложно устроенных губок и кишечнополостных.

Потом благодаря изобретению микроскопа открылось человеческому глазу чудо микробного мира. Сколько с тех пор прошло времени? Не так уж много. А мы уже знаем вирусов и бактериофагов и именно их принимаем сейчас за простейшие проявления жизни. И, конечно, не можем быть уверены в том, что через сто или двадцать лет наука не обнаружит что-то еще более простое и более загадочное.

По поводу вирусов до сих пор идут споры: что это — живое или неживое?

Микроскопически малые размеры (чтобы рассмотреть их, требуется увеличение в 100000 раз), загадочное свойство переходить в кристаллическое состояние и пребывать в нем неограниченно долго — право же есть в вирусах немало удивительного!

Для генетики вирусы интересны чрезвычайно. Особенно бактериофаги.

Ни один из вирусов не в состоянии существовать самостоятельно, вне клетки того или иного хозяина. При этом вирусы поступают с хозяином безжалостно: изменяют ход обычных реакций, вынуждая производить не новые клетки собственного тела, а новые частички вирусов. Проследить это можно на бактериофагах — вирусах, «нападающих» на бактерии, вступающих с ними в сложнейшие взаимоотношения.

Фотография фага под электронным микроскопом показывает, что частица его состоит из сравнительно округлой головки и вытянутого в трубку хвостика. Однако при более тщательном изучении выясняется, что сравнение с головастиком крайне неубедительно. Это скорее шприц, где «хвостик» — игла. Протыкая в онределенном месте тело бактерии, фаг «впрыскивает» в нее свое содержимое. А содержимое — это не что иное, как нуклеиновая кислота — вещество, ответственное за генетическую информацию. Этот «заряд» ДНК заключен в белковую капсулу. Интересно, что для заражения бактерии нужна лишь ДНК. Белок не входит в бактериальную клетку. Специальными опытами показано, что его можно полностью удалить и заражение произойдет без него.

Попав в клетку, ДНК фага подавляет синтез нуклеиновой кислоты бактерии и превращает бактериальную ДНК в фаговую.

Схема бактериофага.

Не всегда, напав на бактерию, фаг уничтожает ее, воссоздавая собственные частицы. Иногда процесс происходит иначе, и вот эти-то случаи особенно интересны. Нуклеиновая кислота фага, попав в клетку, не начинает тотчас же свою разбойничью деятельность. Напротив, она прикрепляется к бактериальной хромосоме, образуя так называемый профаг. Он ведет себя скромно, уподобляясь новому гену бактерии: делится вместе с бактериальной хромосомой. Его даже можно нанести на бактериальную хромосомную карту. При постоянных внешних условиях такого рода бактерии могут существовать практически бесконечное числе поколений: они, попросту говоря, включили в свой генотип дополнительно еще генотип фага. Но в то же время такая бактерия несет в себе как бы заряд взрывчатки. При изменении условий происходит «взрыв», фаг становится хозяином положения, и бактерия распадается, образуя фаговые частицы. При этом совершаются очень интересные вещи. Не только формируются в большом числе генотипы бактериофага, но отдельные фаговые частицы захватывают, включают в себя, в состав своей оболочки и генотипа куски хромосомы бактерии. Понятно, что когда такие фаги заражают новые клетки, они приносят туда не только свой собственный, но дополнительно и бактериальный генетический материал. Далее между профагом и бактериальной хромосомой может произойти перекрест, и бактерия получит новые гены. Это явление называют трансдукцией. Отсюда уже нетрудно сделать заключение, что взаимоотношение фага с бактерией не только взаимоотношение жертвы и хищника. Нет, они много сложнее: этим способом переносится информация, осуществляются генетические перекомбинации. В меняющихся условиях жизни это для бактериального вида оказывается очень важным.

Ее величество ДНК

В то время как генетики-микробиологи ставили свои поистине сенсационные опыты с бактериями и бактериофагами, показавшие, что хромосома есть не что иное, как очень длинная полимерная молекула ДНК, биохимики штурмовали ту же проблему с другой стороны. Изучали химическое строение хромосомы.

Полимерная цепочка — молекула ДНК— всегда имеет форму нити, слагающейся из очень большого числа отдельных элементов — нуклеотидов. Последние, в свою очередь, тоже сложно устроены, однако каждый из них состоит из трех составных частей: основания, углеводного компонента (сахара) и фосфорной кислоты. Соединены они между собой всегда следующим образом:

Основание ............. Сахар ............. Фосфорная кислота

Разные нуклеотиды соединены между собой в ДНК путем чередования углевода и фосфорной кислоты, а основания всегда лежат сбоку. При этом сахар и фосфорная кислота по всей длине цепочки одинаковы, в то время как основания здесь четырех типов: аденин, цитозин, гуанин и тимин. Для простоты их обозначают буквами А, Ц, Г и Т. В разных ДНК эти основания расположены в различной последовательности, а поскольку длина полимерной цепочки очень велика, образуется практически бесконечное число различных типов ДНК, несущих разную генетическую информацию. Ее величество многолика! Через нее осуществляется передача наследственной информации у всего живого: от вирусов до человека.

На рисунке изображена модель химического строения ДНК, созданная Уотсоном и Криком. Молекула ДНК состоит из двух нитей, которые соединены между собой через основания. И если в каждой из нитей комбинации четырех оснований могут быть самыми различными, то соединения между нитями возможны лишь парные. «Перекладины» могут быть образованы только так: аденин (А) соединяется всегда с тимином (Т), а гуанин (Г) — с цитозином (Ц). Подобная упорядоченность очень важна. Так, например, если участок одной из нитей будет содержать основания в последовательности: ГГАТЦТТА, то противолежащий ему участок второй нити обязательно будет ЦЦТАГААТ. Только таким образом могут соединиться пары.

Модель строения ДНК (по Уотсону и Крику).

А вот теперь разберемся в генетическом смысле модели Уотсона — Крика. Мы уже знаем, что для передачи генетической информации из поколения в поколение совершенно необходимо, чтобы ее величество в точности воспроизводила себе подобную нуклеиновую кислоту. Модель Уотсона — Крика вполне соответствует этой задаче, объясняет, каким же путем происходит удвоение хромосом перед клеточным делением. Забудем на минуту о сахаре и фосфорной кислоте, благо, по всей длине молекулы (значит, и хромосомы) они одинаковы. Изобразим модель ДНК упрощенно, в виде цепочки из оснований.

Теперь допустим, что обе нити разделились и между основаниями образовались свободные связи. В то же время предположим, что в окружающей молекулу ДНК среде имеются свободные нуклеотиды. По химическим законам свободные связи будут стремиться к замещению. Около каждой из разделившихся нитей образуется связанная с ней нить-антипод.

Схема синтеза белков.

В результате молекула ДНК удвоится, причем первоначальная последовательность в ней нуклеотидов будет в точности соблюдена. Каждая из нитей по отношению к другой представляет собой как бы негатив по отношению к позитиву. С каждого из негативов может быть напечатан позитив — нить в результате удвоится. И уж совсем просто можно представить молекулу ДНК в виде короны ее величества, только разрезанной и распрямленной в пластинку. Зазубрины короны — это форма, шаблон. А по шаблону отливается его антипод — такая же пластина, только иначе направленная.

Ученые считают, что сходная картина имеет место при синтезе белков. Белки отличаются один от другого последовательностью и составом входящих в них аминокислот. Синтез белков наглядно изображен на схеме. Происходит он в цитоплазме клетки, в так называемых рибосомах. Информация от ДНК поступает сюда в виде длинных молекул рибонуклеиновой кислоты РНК. Эти молекулы образуются на ДНК, как на матрице, и отличаются от соответствующих участков ДНК тем, что в состав РНК входит другой сахар. Но кроме этой, так называемой информационной РНК, есть еще другая РНК, растворимая, низкомолекулярная — ее молекулярный вес 25000—30000. «Ничего себе низкомолекулярная», — скажет читатель. Однако сравните: молекулярный вес информационной РНК 250000—500000, то есть в десять и более раз больше. Растворимая РНК как бы подтаскивает в рибосому нужные кислоты, а там уже, на информационной РНК, происходит в соответствии с наследственным заданием синтез белка.

Ученые создавали в пробирке модель этой схемы. В ее состав входил полный набор аминокислот, рибосомы, растворимая РНК, а также искусственно полученные фрагменты информационной РНК. В таких условиях удавалось добиться синтеза простейших белков.

Ген. Что это такое?

Бывают моменты, когда полезно оглянуться назад, на пройденный путь. Именно такой момент настал для нас с тобой, читатель, — нам нужно вспомнить Менделя.

Он не мог заглянуть в глубь клетки, не было тогда еще самого термина — ген, но Мендель проследил путь генов, ориентируясь на их проявление, на признаки, которые они вызывают. И Мендель четко себе представлял, что наследственные задатки в зиготе парные, однако не смешиваются, а при образовании гамет разделяются, и парность их восстанавливается при оплодотворении.

Как же представлял себе Мендель наследственный задаток — ген? Прежде всего как частицу. Он не позволял себе теоретизировать. Это был экспериментатор, теории которого лишь обобщали эксперимент. Итак, наследственный задаток, по Менделю, — частица, нечто изначальное, неделимое, подобное атому, каким представляли его в те времена.

Вслед за Менделем пришли в науку новые люди и новые мысли. Моргану и его соратникам дело представлялось уже иначе. Теоретический взор ученого — он проникает через любые преграды — проник и сквозь клеточную оболочку. Гены для Моргана тоже частицы — именно он окончательно формулирует корпускулярную теорию наследственности. Но эти частицы уже объединены, они составляют группы сцепления — хромосомы. «Бусы на нитке» — вот, образно говоря, представления Моргана о расположении генов. Они ни в чем не нарушают менделевское теоретическое видение, а дополняют и развивают его. Теория становится стройной, однако все еще грешит недостатками — в ней нет места взаимосвязям и взаимодействиям внутри генотипа. Недостаток понятный и даже простительный: и Мендель и Морган — экспериментаторы, а главная заповедь любого экспериментатора — делать выводы, только непосредственно вытекающие из эксперимента.

Жизнь не стоит на месте, наука развивается, пополняется новыми данными, и вот уже экспериментаторы нового времени, сперва американец А. Стертевант, а затем молодые в ту пору советские исследователи Н. П. Дубинин и Б. Н. Сидоров, переместив ген из одной хромосомы в другую, обнаруживают, что меняется его проявление. Эффект положения! Открытие, сразу же внесшее в науку представления о связях и взаимных воздействиях. Теперь уже ген — все еще «висящая на нитке бусина» — не независим от генотипа. Напротив, выступает на первый план роль генотипа как целого.

Дубинин работал с линией дрозофилы, у которой хорошо была изучена мутабильность в первой хромосоме. И вдруг мухи устроили «сюрприз»: исследователи ввели во вторую хромосому инверсию — изменение, при котором часть хромосомы как бы переворачивается, порядок расположения генов в ней меняется на обратный. Из-за этой перестройки, легко осуществляемой путем скрещиваний, сильно изменилась мутабильность первой хромосомы.

Следовательно, мутабильность, то есть частота, с которой происходят генные перестройки, возникают мутации, зависит от всего генотипа в целом. Но мутации, в конечном итоге, — результат воздействия того или иного фактора среды, и значит, внешнее и внутреннее объединяется в единый взаимосвязанный комплекс.

Дубинину не было еще двадцати лет, когда скрупулезные эксперименты привели его к мысли поистине дерзкой — о делимости гена! Частица Менделя, корпускул Моргана, единица, представлявшаяся первичной и изначальной, как представлялся исследователям прошлого первичным и изначальным атом, оказывается довольно сложной, ее даже можно разделить кроссинговером! Целая серия превосходных экспериментов, подтверждающих эту мысль, была проведена сорок лет назад Дубининым и другими молодыми исследователями под руководством А. С. Серебровского. Вот мы и приблизились к современному понятию о гене — ген как участок ДНК. Если эксперименты прошлого лишь наводили на мысль о взаимосвязях между генами одной хромосомы и в генотипе в целом, то теперь эти связи стали настолько ясны, что даже... утратилось строгое представление о границах, разделяющих гены! Можно ли теперь сказать, что ген — корпускул, частица? И да и нет! Да, потому что он ведет себя как отдельность, частица в скрещиваниях. Нет, потому что не обнаружишь, где, собственно, проходит грань между «бусинами». Таким образом, современные представления, не отвергая, усложняют представления прошлого.

Проблема тонкой структуры гена сейчас одна из основных и главных проблем генетики. Мы в нее не будем вникать, однако кое-что, быть может, и не самое главное, но зато понятное, я расскажу.

Как происходит химическая мутация? Вопрос спорный и сложный, но вот один из возможных путей: для этого достаточно заменить в нуклеотидной цепочке лишь одну пару оснований. На практике возможен такой путь. 5-бромурацил, сокращенно называемый БУ, — это тимин, у которого метильная группа замещена бромом. По мнению Фриза, мутация под его воздействием происходит так: БУ в паре оснований А — Т замещает тимин. Однако при последующих делениях БУ не может сохраниться, так как у него нет сродства с аденином, он не составляет с ним пары. В результате из пары А — БУ может возникнуть пара БУ — Г. Гуанин, таким образом, уже заместил аденин. Но и с гуанином БУ не составит пары, поэтому при последующем удвоении нити ДНК БУ неизбежно будет заменен на Ц, и в нуклеотидной цепочке вместо первоначальной пары А — Т окажется новая пара: Г — Ц. А это уже мутация.

Но если замена одной пары нуклеотидов означает мутацию, то не следует ли считать, что каждая из пар в цепочке — обособленный ген? К сожалению, эту заманчивую возможность приходится, попросту говоря, отбросить. Ген — несравненно более сложное образование, недаром его можно разделить кроссинговером. Верно, что замена одной пары оснований — мутация, но неверно, что пара оснований — ген. По всей видимости, большинство генов включает в себя сотни нуклеотидных пар.

Что же представляет собой ген с точки зрения современной генетики? Сейчас ученые атакуют ген с трех сторон. Так, по поведению в скрещиваниях, по внешнему проявлению в виде контролируемого геном признака мы должны вслед за Морганом считать ген за единицу наследственности и даже признавать его относительную неделимость. Это чисто генетический подход. Другие исследования, биохимические, обнаруживают в составе гена тысячи нуклеотид; изменения хотя бы в одной их паре уже мутация. И наконец ген с точки зрения цитологической. Не так давно я с удовольствием развернул перед недоверчивым читателем фотографию хромосом из слюнных желез дрозофилы: «Видишь исчерченность? Смотри и удивляйся: это и есть гены». Сейчас я не собираюсь отказываться от своих слов, однако должен признаться: для сегодняшней генетики этих фактов уже недостаточно. И цитологи подбираются к гену новым путем: через электронную микроскопию.

Изучение тонкой структуры гена привело к выделению некоторых единиц. Так наименьший участок, который может быть выделен при помощи кроссинговера, называют реконом. Опыты на вирусах показали, что величина рекона 0,02% перекрестов. Следующая из выделенных единиц — мутон. Это наименьшее число нуклеотидных пар, изменение которых может вызвать мутацию. Исходя из описанной теории Фриза, мутоном может быть одна пара нуклеотид. Однако мутон, выделенный за счет генетической комбинаторики, составляет 0,05% перекреста. Третьей генетической единицей, которую выделили в последнее время, является цистрон. Очень трудно охарактеризовать его, не прибегая к изложению большого дополнительного материала. Однако по своему действию, по функциям цистрон соответствует старому доброму понятию «ген». По своей протяженности на ДНК цистрон больше рекона и мутона, так как внутри гена возможен перекрест, а изменение одной нуклеотидной пары внутри гена уже мутация.

Итак, каково сейчас состояние проблемы гена? Она в пути. Большие открытия и свершения и позади, и происходят сегодня, н впереди.