Гены и развитие организма

Проблема возникновения различий между клетками имеет длительную историю: попытки ее экспериментального решения предпринимались еще в конце прошлого столетия, а теоретические споры преформистов и эпигенетиков восходят к XVII в. Сейчас уже стали известны некоторые важные механизмы, ответственные за дифференцировку клеток зародыша в разных направлениях. Однако до сих пор в этой области больше неясного, а многое еще остается совершенно непонятным.

Этот раздел биологии развития находится почти вне всякой связи с генетикой и молекулярной биологией, а существующие гипотезы носят пока умозрительный характер. Поэтому здесь во многом сохранились чисто феноменологические понятия, т. е. используемые термины являются лишь условными обозначениями того или иного явления. В связи с этим нам кажется правильным начать эту главу с общих представлений, без которых трудно войти в мир экспериментальной эмбриологии, или, как ее еще называли, механики развития.

Различия в размерах и морфологии клеток млекопитающих

Все клетки нарисованы при одинаковом увеличении: 1 — многоядерная «клетка» — волокно поперечно-полосатой мышцы; 2 — шванновская клетка, окружающая аксон нейрона; 3 — большая нервная клетка головного мозга; 4 — клетка Пуркинье из мозжечка; 5 — коллагенообразующая клетка соединительной ткани; 6 — клетки гладкой мускулатуры; 7 — палочки и колбочки сетчатки глаза; 8 — клетки реснитчатого эпителия; 9 — полиморфно-ядерные нейтрофилы — один из типов «белой» крови; 10 — антителообразующий лимфоцит; 11 — поперечный срез капилляра, образованного одной клеткой эндотелия, в просвете видны эритроциты; 12 — эритроциты; 13 — клетка хряща; 14 — клетка печени; 15 — слизистая клетка желудка; 16 — жировая клетка соединительной ткани, почти целиком заполненная жиром; 17 — ооцит и окружающие его фолликулярные клетки; 18 — сперматозоид

1. Что происходит при возникновении различий

В 20-е годы немецкий ученый Фогт сумел проследить судьбу разных частей яйца в развитии. Для этого он окрашивал небольшие участки бластулы амфибий безвредными витальными красителями и наблюдал движение этих участков во время гаструляции и их последующую судьбу. Так была составлена нанесенная на рисунок бластулы карта презумптивных зачатков, т. е. обозначены те клеточные территории, которые при нормальном развитии станут теми или иными зачатками, а потом и органами. Важно подчеркнуть, что презумптивная судьба клеток реализуется только при нормальном развитии. В эксперименте же их судьбу на этой стадии еще нетрудно изменить. Задача биологии развития во многом и заключается в том, чтобы выяснить во всех подробностях, как происходит реализация этой карты. Или, иначе, каким образом расположенные рядом районы, состоящие на стадии бластулы фактически из одинаковых клеток, становятся зачатками разных органов, клетки которых по мере развития все больше отличаются друг от друга.

Эта задача складывается из двух других в значительной степени самостоятельных проблем, хотя на первый взгляд их трудно разграничить. Первую проблему можно сформулировать так: как происходит дифференциация зародыша, т. е. каким образом он распадается на группы неодинаковых клеток и как достигается строго определенное расположение сначала зачатков, а затем и органов развивающегося организма. Вторая проблема состоит в попытке понять, как происходит специализация клеток, т. е. последовательные изменений, превращающие эмбриональную клетку или ее потомков в высокоспециализированные клетки взрослого организма характерного строения и с узко ограниченной функцией.

Оба явления — дифференциацию и специализацию — в принципе можно представить независимо друг от друга. Можно вообразить искусственную ситуацию, когда возникнет правильное расположение зачатков и произойдет морфогенез органов, хотя клетки их внешне почти не будут отличаться друг от друга (в действительности этого никогда не бывает). А можно представить и обратную картину — беспорядочное скопление высокодифференцированных клеток: нервных, мышечных, эпителия кожи и т. д. (нечто похожее встречается в особых опухолях — тератомах).

В этой главе речь идет только о первой проблеме, т. е. о том, как происходит закономерное и прогрессирующее разделение зародыша на все большее число составляющих его зачатков различных органов. Мы будем здесь больше говорить о том, как возникают различия между клетками, и меньше о том, в чем эти различия состоят.

Напомним элементарные основы эмбриологии амфибий. В результате сложных перемещений из верхней (анимальной) части бластулы образуется эктодерма, из нижней (вегетативной) — энтодерма, а из промежуточной, или экваториальной, зоны — мезодерма. В конце гаструляции все эти три зародышевых листка располагаются концентрическими слоями: эктодерма снаружи, энтодерма внутри, мезодерма между ними. Из части эктодермы на спинной стороне зародыша образуется нервная пластинка, которая свертывается в нервную трубку. Передняя ее часть образует головной мозг и глаза, а задняя — спинной мозг. Остальная эктодерма образует в основном эпителий кожи. Из энтодермы развиваются кишечник и его производные — печень, легкие, поджелудочная железа. Мезодерма дифференцируется наиболее сложно: ее центральная часть, которая при гаструляции оказывается на спинной стороне, образует хорду и спинную мускулатуру, далее по обе стороны от хорды располагаются части мезодермы, из которых образуются соединительная ткань, хрящ и кости, еще ниже (ближе к брюшной стороне) возникают почки, а на брюшной стороне — сердце, сосуды и клетки крови. Таким образом, в раннем эмбриогенезе зародыш сначала разделяется на три части, а затем каждая из них тем или иным путем дифференцируется еще на ряд зачатков. На более поздних стадиях каждый из этих зачатков образует органы и дифференцируется еще на ряд тканей и клеточных типов,

У других позвоночных гаструляция происходит иначе, но в итоге создается похожий трехслойный эмбрион, зародышевые листки которого дифференцируются приблизительно так же, как у амфибий. Особенностью позвоночных является то, что уже бластула состоит из тысяч клеток и все зачатки даже в начале дифференцировки состоят из очень многих клеток,

У беспозвоночных, у которых также различают и бластулу и гаструляцию, число клеток обычно меньше и дифференциация зародыша нередко происходит на очень ранних стадиях, когда отдельные зачатки состоят из немногих клеток или даже представлены одним бластомером. Уже на стадии 50—100 клеток такой зародыш представляет собой как бы мозаику, у которой судьба каждой клетки уже точно определена. Поэтому развитие многих беспозвоночных, хотя и не всех, называют мозаичным. Этот термин обычно противопоставляют другому — регуляционное развитие. Мозаичным называют такое развитие, когда различия между частями зародыша с самого начала практически необратимы. При регуляционном развитии на ранних стадиях (бластула — гаструла) судьба клеток еще может быть искусственно изменена. Если ранний зародыш лягушки на стадии двух клеток или на стадии тысячи клеток разделить на две части, то каждая из частей обычно способна образовать целый зародыш, только меньшего размера. Если на стадии бластулы удалить значительную часть клеток эктодермы (т. е. на анимальном полюсе), то зародыш все равно будет вполне пропорционален. Очевидно, что в обоих этих экспериментах многие клетки должны дифференцироваться не в то, чем бы они стали, если бы в их судьбу не вмешался экспериментатор. Иными словами, развитие части (половинки или большей части) может регулироваться до целого. Такой способностью к регуляционному развитию обладают в большей или меньшей степени зародыши амфибий, рыб, иглокожих, млекопитающих и некоторых других групп животных.

Различия мозаичного и регуляционного типов развития в определенном смысле количественные: в первом случае судьба клеток необратимо определяется раньше, чем во втором. Ho эти количественные различия говорят и о качественной разнице: у мозаичных яиц большую роль играют одни механизмы развития, а у регуляционных — другие.

При описании клеточной дифференцировки используют два важных понятия — «компетенция» и «детерминация». Компетенцией называют способность клеток при соответствующих внешних воздействиях дифференцироваться в нескольких (обычно немногих) направлениях. Классическим примером компетенции является способность эктодермы под влиянием зачатка хорды и прилегающей к ней мезодермы (хордомезодермы) дифференцироваться в нервную ткань, а без такого влияния — в эпидермис кожи. Хвост головастика лягушки компетентен к тому, чтобы резорбироваться (рассосаться), но эта компетенция реализуется только под действием гормонов, выделяемых щитовидной железой. Другие части головастика, хотя и получают ту же дозу гормона, не резорбируются, так как имеют другую компетенцию (см. следующую главу). Стволовые клетки крови в костном мозгу или селезенке взрослого организма компетентны к дифференцировке по меньшей мере в трех направлениях: в красные клетки крови — эритроциты, в белые клетки — различные лейкоциты и в мегакариоциты.

В эмбриогенезе компетенция быстро меняется во времени: будущая эктодерма (анимальная часть бластулы) компетентна к дифференцировке почти в любом направлении (тотипотентна), на стадии гаструлы она сохраняет компетенцию к дифференцировке в эпидермис и нервную систему, еще немного позже компетенция к развитию нервной ткани теряется. Компетенция энтодермы, напротив, с самого начала очень узка и ограниченна. В ходе дифференцировки одна компетенция закономерно сменяет другую: собственно каждый этап дифференцировки это приобретение не только некоторых новых свойств, но и новой компетенции. И только достигнув окончательного высокоспециализированного состояния — терминальной дифференцировки, как, например, эритроциты или ороговевающий эпидермис кожи, клетки теряют всякую компетенцию. Молекулярная природа компетенции неизвестна, но, очевидно, она должна заключаться в каком-то особом состоянии регуляторного аппарата клетки или определенных генов, которые хотя еще не активны, но более других готовы к активации.

Детерминация, пожалуй, более четкое понятие. Это такое состояние клеток, когда они уже (часто необратимо) вступили на путь определенной дифференцировки, но внешне сама дифференцировка еще никак не выражается. Молекулярная природа детерминации также неизвестна, но, вероятно, включение определенных генов — если не первый, то непременный этап всякой детерминации. Широкая компетенция эктодермы не позволяет считать ее окончательно детерминированной, хотя при отсутствии особых влияний она дифференцируется в эпидермис. Напротив, компетенция энтодермы так узка, что ее можно называть детерминированной в направлении развития кишечника. Из этого примера ясно, что детерминация — это сужение компетенции. При описании процессов кроветворения чаще употребляют термин «коммитирование». Коммитированной называют клетку, уже осуществившую выбор направления дифференцировки, например в красные или в белые клетки крови.

Между детерминацией и дифференцировкой не может быть четкой границы. Это видно из самого определения детерминации. Оно говорит лишь о том, что доступными нам сейчас средствами мы не видим в клетках проявлений дифференцировки. Может быть, завтра эти проявления мы уже сможем увидеть, например в виде синтеза определенных мРНК. Считать ли их проявлением дифференцировки или условиться называть дифференцировкой только появление особенностей клетки, начиная с синтеза в ней новых белков, — дело вкуса. Поэтому, наверное, правильнее считать детерминацию не процессом, предшествующим дифференцировке, а ее начальным этапом.

И в заключение еще один круг вопросов. В механике развития часто говорили (и иногда используют эти понятия до сих пор) о самодифференцировке и зависимой дифференцировке. В первом случае предполагается, что клетки способны дифференцироваться в каком-либо направлении благодаря их внутренней структуре и свойствам. Как мы увидим дальше, это действительно часто бывает в раннем развитии — целые районы зародыша или отдельные бластомеры исходно различаются особенностями цитоплазмы. На более поздних этапах развития представить самодифференцировку труднее: для того чтобы две действительно одинаковые клетки развивались разным путем, необходимо, чтобы одна из них получила извне какое-то воздействие или информацию, которую не получила другая. Однако и в этом случае, возможно, существует механизм спонтанного вступления на путь дифференцировки, когда отдельные клетки выбирают то или иное направление развития с определенной вероятностью, может быть, под влиянием некоего внутреннего устройства, чем-то напоминающего рулетку.

Однако основным механизмом возникновения различий между клетками являются локальные внешние воздействия. Такая дифференцировка называется зависимой. Эти воздействия могут быть различными — от совсем простых и неспецифических до высокоспецифических, если их вызывают такие соединения, как белки. В настоящее время нам известны десятки примеров зависимой дифференцировки, но, вероятно, ни в одном случае мы не знаем точного механизма таких воздействий. Поэтому мы можем только предполагать, хотя и с большими основаниями, что все локально действующие факторы, вызывающие дифференцировку, в конце концов приводят к активации (включению) определенного набора генов.

Карта презумптивных зачатков — схема расположения в яйце на стадии ранней гаструлы лягушки материала будущих частей зародыша

Карта могла быть нарисована с большими подробностями, но в действительности на этой стадии между собой различаются только клетки эктодермы, мезодермы и энтодермы. 1 — зачаток эктодермы — будущий эпидермис; 2 — зачаток эктодермы — будущая нервная трубка; 3 — зачаток мезодермы — будущая хорда; 4 — зачаток мезодермы — будущие мышцы спины; 5 — зачаток мезодермы — будущая соединительная ткань, почки, кровь; 6 — зачаток энтодермы — будущий кишечник и его производные (легкие, поджелудочная железа, печень); 7 — бластопор — место, с которого начинается гаструляция: вворачивание энтодермы и мезодермы внутрь зародыша

2. Ооплазматическая сегрегация

Этим термином обозначают возникновение различий между разными частями цитоплазмы яйца (ооплазмы), разделение (сегрегацию) яйца на зоны с несколько различными свойствами. Обычно ооплазматической сегрегацией называют те перемещения компонентов цитоплазмы, которые происходят после оплодотворения и до начала дробления яйца. В действительности же многие процессы ооплазматической сегрегации осуществляются еще в оогенезе, а некоторые продолжаются и в ходе первых делений дробления.

Простейшая ооплазматическая сегрегация происходит в яйцах морского ежа. После четырех делений дробления бластомеры отличаются по способности образовывать некоторые структуры зародыша (султан на анимальном полюсе и кишку на вегетативном). Эта способность меняется вдоль анимально-вегетативной оси. Такое постепенное изменение свойств яйца называют градиентами. У некоторых видов морских ежей эти градиенты проявляются в виде распределения пигментных гранул, располагающихся близко к одному полюсу или образующих кольцо в области экватора.

Более сложно выглядит ооплазматическая сегрегация в яйце амфибий. Еще в ооците создается неравномерное распределение желтка и пигмента вдоль анимально-вегетативной оси: желтка больше на вегетативном полюсе, пигмент покрывает анимальную половину яйца. Ядро оплодотворенного яйца сильно сдвинуто к анимальному полюсу и окружено цитоплазмой, свободной от желтка. После оплодотворения происходит дальнейшая сегрегация: на одной из сторон яйца (она станет спинной стороной) в области экватора возникает более светлая область — серый серп (будущая хордо-мезодерма). Внутри яйца происходят и другие перемещения. В итоге в яйце амфибий можно различать три различно окрашенные зоны: пигментированную анимальную, или эктодермальную; светлую вегетативную, или энтодермальную; экваториальную кольцевую, более широкую в области серого серпа, — мезодермальную. Если до оплодотворения яйцо имело только одну анимально-вегетативную ось, то теперь в нем можно провести и перпендикулярную ей дорсовентральную ось от спины к животу. Две оси образуют плоскость симметрии, которая делит будущий зародыш на правую и левую половины.

В яйце асцидий до оплодотворения никакой сегрегации не обнаруживается: яйцо можно разрезать пополам в любой плоскости и половина, содержащая ядро, образует нормальный зародыш. Такое яйцо изотропно. После оплодотворения в яйце происходят сложные перемещения, которые удается видеть благодаря наличию в цитоплазме различно окрашенных гранул. В итоге в яйце асцидий можно различить не менее четырех зон — анимальную, вегетативную и две серповидные различно окрашенные области, лежащие на уровне экватора друг против друга.

Очень сложные перемещения происходят в яйцах моллюсков. После оплодотворения на вегетативном полюсе образуется так называемая полярная плазма, которая затем движется вдоль поверхности яйца к анимальному полюсу. У некоторых морских моллюсков ооплазматическая сегрегация выражается еще драматичнее: перед первым делением дробления на вегетативном полюсе временно выпячивается особый вырост — полярная лопасть, которая в ходе первого деления достается одному из двух бластомеров, а после второго деления — одному из четырех. В состав этой лопасти попадает полярная плазма и значительная часть митохондрий яйца.

У морских кишечнополостных — гребневиков оплодотворенные яйца имеют у поверхности зеленый слой — эктоплазму, которая в начале дробления равномерно попадает во все бластомеры. Однако в результате последующих делений образуются две группы клеток: одни из них содержат только эктоплазму, другие лишены ее.

Приведенные здесь примеры относятся к тем случаям, когда за ооплазматической сегрегацией можно следить визуально благодаря различной окраске цитоплазматических компонентов. Ho, наверное, чаще — у большинства видов морских ежей, у костистых рыб, птиц и т. д. — ее просто не видно, хотя она, по всей вероятности, существует. Например, яйцо дрозофилы, как и других насекомых, почти не обнаруживает признаков ооплазматической сегрегации, если не считать особых гранул (половых детерминантов), находящихся на заднем конце яйца. Мы уже говорили, как они определяют судьбу ядер, попавших в эту часть яйца. Почти все остальные ядра — после восьми делений их около 250 — перемещаются из центра яйца к его поверхности, где образуют бластодерму. В это время, как было показано экспериментально, определяется их судьба и ядра, попавшие в определенные зоны поверхностной цитоплазмы, образуют клетки так называемых имагинальных дисков. Из каждого диска (они парные) впоследствии образуются определенные органы взрослой мухи (имаго — взрослая). Поэтому можно утверждать, что цитоплазма поверхности яйца неоднородна и что, хотя она вся внешне выглядит одинаково, в действительности в оогенезе происходит ооплазматическая сегрегация, в ходе которой и возникают различные по свойствам зоны цитоплазмы. Некоторые ядра остаются в центре яйца и образуют специальные желточные клетки.

Из сказанного здесь уже ясен смысл ооплазматической сегрегации: создавая первичные различия в составе цитоплазмы, она в результате делений дробления приводит к образованию клеток, отличающихся по составу цитоплазмы. А это, в свою очередь, определяет их дальнейшую судьбу. Таким образом, ооплазматическая сегрегация является первым фактором, создающим исходные различия между клетками, или, иначе, первым (по времени) фактором дифференцировки.

Роль ооплазматической сегрегации доказывается не только описательно, когда различно окрашенные зоны яйца (там, где эти зоны можно видеть и проследить их судьбу) образуют в нормальном развитии строго определенные зачатки зародыша и затем органы. Экспериментальный метод доказательства обычно состоит в разделении ранних зародышей, на стадии двух, четырех и более клеток, на отдельные бластомеры или на их группы и затем в наблюдении за их судьбой. Возвратимся к приведенным выше примерам.

Если яйцо морского ежа на стадии восьми бластомеров разделить на две или четыре части в плоскости анимально-вегетативной оси, то из каждой части, состоящей из четырех или двух клеток, разовьется нормальный зародыш. Если же такой зародыш разделить на две части по экватору, то образуются два ненормальных зародыша: один будет лишен кишки, которая образуется у вегетативного полюса, а другой — султана из длинных ресничек, который расположен с анимальной стороны. Более детальные эксперименты с разделением 16-клеточного зародыша и комбинацией разных клеток показали, что «анимальные» свойства постепенно падают вдоль оси яйца, а навстречу ей так же постепенно нарастают «вегетативные» свойства. Речь, очевидно, идет о градиентах концентраций каких-то веществ или структур вдоль анимально-вегетативной оси.

У амфибий судьба двух разделенных бластомеров зависит от того, как прошла плоскость первого деления. Если она прошла через серый серп и разделила его на две, пусть неравные, части, то оба изолированных бластомера разовьются в нормальных зародышей. Но если случайно первая плоскость деления оставила весь серый серп в одном бластомере, то только он даст нормального зародыша. Другие разнообразные эксперименты показали, что три зоны яйца определяют образование трех зародышевых листков.

В последние годы, однако, получены новые данные, которые говорят о том, что у амфибий первично возникают только две зоны — анимальная и вегетативная, а промежуточная между ними — будущая мезодерма — появляется позже как результат взаимодействия первых двух. Как сочетать эти данные с предыдущими надежными результатами, показывающими ведущую роль серого серпа, пока неясно. Сейчас появились работы, где пересматриваются эти, казалось бы классические, представления о роли серого серпа.

Мы видим, что понятия мозаичного и регуляционного развития должны быть близко связаны с ооплазматической сегрегацией. У мозаичных яиц она обычно более выражена, т. е. яйцо содержит больше различных зон (6–8). Ho главное в том, что различия между участками цитоплазмы яйца у них, очевидно, более глубоки, так как необратимо предопределяют судьбу клеток, которые эту цитоплазму получают. В яйцах регуляционного типа и зон меньше (2–3), и судьба клеток лишь отчасти зависит от состава цитоплазмы. В не меньшей степени она зависит от взаимоотношений между клетками. Благодаря этим взаимным влияниям зародыш, лишенный части клеток, способен нормально развиваться. Яйца же мозаичного типа образуют группу правильно расположенных, но относительно независимых клеток. Если часть их удалить, другие клетки уже не могут изменить свой путь развития и заменить отсутствующие. Таким образом, ооплазматическая сегрегация является важным и первым фактором дифференциации. Вероятно, только при развитии зародышей млекопитающих она не играет заметной роли.

Механизмы создания ооплазматической сегрегации известны плохо. Важнейшие события самой сегрегации или подготовки к ней происходят в оогенезе. Так, в оогенезе амфибий возникают различия вдоль анимально-вегетативной оси, да и сами анимальный и вегетативный полюсы яйца определяются уже в ооците. Предполагают, что полюсы и неравномерное отложение желтка создаются благодаря ориентировке ооцита по отношению к кровеносным сосудам, из которых в яйцо поступает предшественник желтка — вителлогенин.

Место образования серого серпа во многом, если не целиком определяется внешними к яйцу факторами, уже после оплодотворения. Одним из них может служить место вхождения сперматозоида — серый серп образуется с противоположной стороны. Однако этот фактор не единственный, а у большинства видов он, по-видимому, совсем не играет роли.

Если яйцо амфибий (или осетровых рыб) в первое время после оплодотворения наклонить набок и дать ему снова подняться анимальным полюсом вверх, то серый серп образуется в плоскости поворота на той стороне, которая была внизу. Эту манипуляцию можно повторить несколько раз: серый серп образуется в плоскости последнего поворота. Ho через 30–40 мин положение серого серпа детерминируется и изменить его уже нельзя.

Механизм ооплазматической сегрегации у других видов животных практически не изучен. Можно, по-видимому, утверждать, что в оогенезе, например, асцидий образуются различные вещества и структуры, которые до оплодотворения распределены в яйце более или менее равномерно. Ho после оплодотворения эти вещества каким-то образом концентрируются и локализуются в виде полярных плазм, «серпов» и других образований, которые затем закономерно перемещаются по яйцу.

Важную роль в ооплазматической сегрегации, по-видимому, играет поверхность яйца, служащая своеобразным каркасом. Это иллюстрируется опытами, в которых яйца амфибий центрифугировали так, что вся организация яйца нарушалась. Однако после этого происходило постепенное восстановление нормальной организации яйца, включая ту, что была достигнута в результате ооплазматической сегрегации.

Ооплазматическая сегрегация костистых рыб изучалась в нашей лаборатории. У вьюна только что отложенное яйцо шарообразно. Однако в течение первого получаса на его поверхности выделяется тонкий прозрачный свободный от желтка слой, который стягивается к анимальному полюсу и в итоге образует на нем бластодиск — цитоплазматический бугорок, который у вьюна занимает 1/5—1/10 часть объема всего яйца (у разных видов рыб бластодерма составляет от 1/3 до 1/20 всего объема). В бластодиске находится ядро, и только бластодиск делится во время дробления яйца, образуя на анимальной стороне «шапочку» клеток — бластодерму. Оказалось, что в бластодерме сконцентрированы многие (хотя и не все) ферменты яйца — их в ней от 50 до 80 %, т. е. концентрация ферментов в бластодерме в 10–25 раз выше, чем в остальной части яйца, заполненной желтком. Каков механизм такой концентрации? Исследуя это явление разными методами, мы обнаружили, что в бластодерме происходит связывание ферментных молекул со структурами клетки.

Очевидно, ооплазматическая сегрегация у рыб происходит в два этапа. Сначала на поверхности яйца образуется цитоплазматический бугорок — бластодиск. Механизм этого процесса остается неизвестным, но в нем, по-видимому, участвуют структурные белки клеточного скелета, каким-то образом отделяющиеся от массы желтка. Затем уже эти структурные белки связывают ферменты и как бы насасывают их в бластодерму. Этим создается неравномерность распределения ферментов по яйцу, в результате чего запасенные в оогенезе ферментные белки оказываются собранными в клетках зародыша, где они и должны функционировать.

Нам осталось рассмотреть вопрос о том, каким образом ооплазматическая сегрегация создает различия между клетками, т. е. почему некоторые (может быть, небольшие) различия в составе цитоплазмы приводят к разным направлениям дифференцировки. Сами исходные различия в цитоплазме между бластомерами, очевидно, не следует называть дифференцировкой: до определенного времени эти различия никак не сказываются на форме и поведении клеток. Ho затем, часто с началом гаструляции, различия в метаболизме и поведении клеток становятся очевидными. Можно предполагать, что даже небольшие различия цитоплазмы приводят к активации разных наборов генов. Однако каковы те конкретные химические вещества, которые создают различия зон цитоплазмы яйца, и каким образом эти вещества определяют включение разных генов, неизвестно.

3. Индукция

В «классической» механике развития эмбриональной индукцией называют такое влияние одной ткани на другую, соседнюю, которое вызывает в месте контакта новую дифференцировку. Иногда (обычно в искусственной экспериментальной ситуации) индуцирующая ткань (индуктор) уподобляет индуцируемую ткань себе (гомотипичная индукция). Ho в нормальном развитии индуктор вызывает в индуцируемой части второй ткани новую, третью дифференцировку. Таким образом, эмбриональная индукция приводит к увеличению числа клеточных типов и этим усиливает дифференциацию зародыша.

Главной моделью и объектом большинства исследований была и есть так называемая первичная эмбриональная индукция у амфибий, когда в ходе гаструляции или тотчас после нее зачаток хордомезодермы вдоль спинной стороны зародыша индуцирует в эктодерме над собой зачаток нервной системы — нервную пластинку, которая свертывается в нервную трубку и дифференцируется в головной и спинной мозг. Остальная эктодерма почти целиком становится эпителием кожи, и только на границе эктодермы и нервной пластинки узкая полоска ткани (нервный гребень) превращается в мигрирующие клетки, которые участвуют в образовании хряща и пигментных клеток кожи. Если зачаток хордомезодермы еще в самом начале гаструляции удалить, нервной системы не образуется, если же этот зачаток пересадить под раннюю эктодерму на боку или животе другого зародыша, то там образуется вторая нервная система.

Первичная эмбриональная индукция является региональной. Это означает, что передняя часть зачатка хордомезодермы индуцирует в эктодерме передние отделы мозга, следующая за ней — средний и задние отделы головного мозга, а задняя половина хордомезодермы индуцирует спинной мозг. Позже, когда уже образуется хорда, а нервная пластинка замыкается в трубку и погружается под эктодерму, она сама становится индуктором и индуцирует в окружающих ее свободноподвижных мезенхимных клетках дифференцировку в хрящ позвонков.

Второй классической моделью индукции, традиционно изучаемой в нашей стране, является развитие глаз. У нас есть эмбриологи, успешно работающие над этой проблемой более 40 лет. Зачатки глаз (глазные пузыри) вначале являются парными выростами переднего мозга. Глазной пузырь подходит к эктодерме, касается ее, а затем его передняя поверхность начинает вворачиваться внутрь наподобие того, как можно вдавить плохо надутый мяч. Так из глазного пузыря возникает глазной бокал. Внутренняя стенка бокала станет очень сложно устроенной сетчаткой, а наружняя — очень просто организованным пигментным эпителием. Когда глазной пузырь касается эктодермы, он индуцирует в ней образование хрусталика (линзы). Клетки эктодермы впячиваются в полость глазного бокала и образуют эпителиальный однослойный пузырек, который отделяется от эктодермы. Далее клетки задней стенки этого пузырька вытягиваются и заполняют всю его полость. Это и есть готовый хрусталик.

Если глазной пузырь удалить до того, как он коснется эктодермы, линзы обычно не образуется; если же глазной пузырь пересадить под эктодерму в любом месте зародыша (но в довольно узкий период развития), то линза образуется там. В следующий период развития, когда глазной бокал и линза в нем уже образованы, они еще раз становятся индукторами и снова действуют на эктодерму. На этот раз они вызывают в ней просветление — образование прозрачной роговицы глаза.

Явление эмбриональной индукции было открыто в первые десятилетия нашего века и связано с именем Ганса Шпемана. Ho относительно недавно был показан еще один случай индукции, действующей на самых ранних стадиях, еще до индукции нервной системы. Голландский ученый Ньюкоп удалял у тритона экваториальную часть бластулы, т. е. будущую мезодерму. В этом случае мезодерма у таких зародышей все же возникала — она индуцировалась в эктодерме, очевидно, под влиянием энтодермы. Из этих опытов следует, что ооплазматическая сегрегация определяет только два зачатка, а третий возникает между ними как результат индукции. Однако многочисленные данные о роли серого серпа и другие факты не позволяют так легко отказаться от ужо имеющихся представлений.

Представления о механизме индукции имеют длинную и сложную историю, в которой пока нет ясного конца. Проще всего представить, что индуктор выделяет, а индуцируемая ткань получает некое индуцирующее вещество. Это вещество не обязательно должно быть очень сложным и специфичным, важно, чтобы на данной стадии развития оно попадало в индуцируемую ткань только в необходимом месте и тем самым определяло место новой дифференцировки.

Низкая специфичность индуктора очевидна из ряда опытов. Если под эктодерму одного вида животных пересаживать индуктор от другого вида, то характер индуцируемой нервной трубки всегда идет не в соответствии с видом индуктора, а в соответствии с видовыми особенностями индуцируемой эктодермы. Индукцию можно получить при действии очень различных чужеродных источников индукции. Например, из зародыша цыпленка, причем на поздней стадии, удалось выделить индуцирующие вещества, действующие на амфибий. Все это показывает, что специфическую роль играет компетенция индуцируемых клеток — она существует только у определенной ткани и обычно только в течение короткого периода раз- вития. Тем не менее те индуцирующие вещества, которые удалось очистить, оказались белками, т. е. достаточно сложными веществами.

Из недавних опытов немецкого ученого Тидемана следует, однако, что чистый индуктор, который вызывает индукцию нервной системы (нейральный индуктор), не проникает в клетки эктодермы, а, очевидно, остается на поверхности клеток (ниже мы увидим, что так же действуют все белковые гормоны). Следовательно, вряд ли имеет смысл говорить, что индукторы могут дать клетке программу дифференцировки, скорее они лишь осуществляют выбор среди тех немногих программ, которые уже имеются в компетентных клетках.

Впрочем, вопрос этот в большой степени терминологический: что значит определить саму программу или осуществить выбор среди программ? Зависит ли от индуктора, быть или не быть данной дифференцировке? Конечно, зависит. Содержит ли вещество индуктора, пусть самое сложное, информацию о том, какой должна быть дифференцировка, какова будет форма клеток или органа и т. д.? Конечно, нет. В таком случае, кажется, удобнее говорить о выборе программ, а не о самой программе. Иначе термин «программа» теряет всякий смысл.

В истории изучения индукции большое место занял период, когда индукцию вызывали, действуя самыми различными факторами, включая убитые ткани и солевые растворы. Финский исследователь Тойвонен показал, что региональность индуцирующего действия хордомезодермы у лягушки можно хорошо имитировать, действуя в разных соотношениях экстрактами убитых кипячением кусочков печени и костного мозга морской свинки. Даже чистые индукторы, полученные Тидеманом, никак нельзя считать естественными: ведь в тканях большого зародыша цыпленка не может случайно оказаться тот же самый белок, который вызывает индукцию нервной системы в нормальном развитии раннего зародыша амфибий.

Очевидно, подобные вполне чистые вещества можно выделить из очень разных источников, в том числе и из амфибий, но это лишь свидетельствует об их низкой специфичности. Получить же в чистом виде естественный индуктор, т. е. то самое вещество, которое поступает из хордомезодермы в эктодерму, пока еще не удалось никому.

Иногда предполагают, что сами индуцируемые клетки содержат много разных индукторов, но в неактивном виде.

Далее одни клетки выделяют эти индукторы наружу, а другие, напротив, концентрируют их в себе или активируют внутри себя. Подобные построения позволяют создать много различных схем. Проверить их пока одинаково трудно, поэтому ценность таких схем невелика.

Об индукции можно говорить еще очень много, но это скорее следствие не обилия, а, напротив, недостатка знаний. Мы знаем много фактов на клеточном уровне, но мало — на молекулярном. В результате мы не имеем пока хорошей теории, в которую бы укладывались все известные факты. Подводя итоги, можно сказать, что индукции играют важнейшую роль в эмбриональных дифференцировках и некоторую роль в дифференцировках во взрослом организме. Однако ими можно объяснить далеко не все случаи дифференцировки, часто действуют другие, пока еще неизвестные механизмы.

Индукция, по определению, может произойти при близком контакте индуцирующей и индуцируемой тканей, во всех случаях она, по-видимому, происходит путем миграции определенных веществ. Однако в одних случаях эти вещества могут, преодолевая некоторое расстояние, мигрировать из клеток индуктора в клетки индуцируемой ткани, а в других — необходим прямой контакт между этими клетками. Вероятно, это свидетельствует о различной природе индуцирующих факторов. Хотя естественный индуктор ни в одном случае не выделен, похоже, что это белки небольшого молекулярного веса.

Однако то, что пока не смогли сделать на высокоорганизованных амфибиях, удалось на представителях низших многоклеточных животных — кишечнополостных актиниях и гидре. У них в самое недавнее время группой американских ученых был обнаружен и выделен в чистом виде индуктор, определяющий формирование головного конца животного. Индуцирующим веществом оказался олигопептид — цепочка, состоящая из одиннадцати определенных аминокислот. У морских актиний и пресноводной гидры (два разных класса) последовательность аминокислот оказалась тождественной, т. е. за много миллионов лет раздельной эволюции этих групп животных индуцирующее вещество не изменилось. Механизм индукции неясен, но трудно сомневаться в том, что в конечном итоге он состоит в активации определенных генов, запускающих всю программу дифференцировки. Роль индукции в развитии состоит в определении места дифференцировки, т. е. индуцирующее вещество — это источник позиционной информации, по которому индуцируемая клетка «узнает», где она оказалась и кем ей «следует стать». Поэтому индукцию следует считать важным (но не единственным) инструментом пространственной организации зародыша и его развития.

4. Другие механизмы возникновения различий

В эту категорию попадают многочисленные случаи, когда мы почти ничего не знаем о механизмах дифференцировки. Пожалуй, наиболее изучена сейчас первичная дифференциация зародыша млекопитающих на собственно зародыш и внезародышевое образование — трофобласт, из которого потом возникает часть плаценты.

До стадии 16 клеток зародыш млекопитающих практически не дифференцирован, хотя наружные клетки уже площе внутренних. При нормальном развитии эти наружные клетки станут трофобластом, а внутренние (по некоторым данным, их всего три) — собственно зародышем. Ho если на этой стадии клетки механически перемешать, разделить зародыш пополам (по восемь клеток) или, напротив, соединить два зародыша вместе — развитие будет идти нормально. Это означает, что на стадии 16 клеток их судьба еще не предопределена, они не детерминированы.

Оказалось, что фактором дифференцировки является само положение клеток: если они на стадии 16 клеток и позже окажутся снаружи, их развитие необратимо пойдет в сторону трофобласта. Неясно, происходит ли это потому, что нечто в среде индуцирует в наружных клетках этот путь развития, или, наоборот, его детерминирует вымывание из наружных клеток каких-то компонентов в среду. Очевидно, что в этом случае раннему зародышу «было нужно» найти какой-либо сигнал, который позволил бы по-разному определить судьбу наружных и внутренних клеток. Для этого и был использован один из двух способов отыскания такой позиционной информации: преимущественное получение или выделение веществ наружными клетками.

Похожий механизм направляет по разным путям развитие тканей глаза: оказавшаяся внутри часть глазного бокала дифференцируется в сетчатку, а оставшаяся снаружи — в пигментный эпителий. Искусственные нарушения этой ситуации приводят к передифференцировке сетчатки в пигментный эпителий и наоборот.

Вероятным фактором дифференцировки является плотность клеточной популяции. Многие дифференцировки (хрящей, кости и т. д.) начинаются с собирания рассеянных мезенхимных клеток в плотные скопления. Неясно, что тут первично: собираются ли эти клетки вместе потому, что детерминированы стать хрящом, или становятся хрящом оттого, что собираются вместе. Так или иначе, при высокой плотности клеток концентрация выделяемых ими веществ становится выше, и это может служить фактором определенной дифференцировки для клеток, которые были к ней компетентны.

По-видимому, определенную роль в некоторых дифференцировках играет случайность. Например, при делении камбиальных (стволовых) клеток эпителия кожи одна из дочерних клеток случайно оказывается ниже (ближе к базальному слою) и остается стволовой, а другая — выше (ближе к наружной поверхности) и дифференцируется в эпидермис, наполняется кератином (ороговевает) и в конце концов слущивается. Аналогично определяется судьба клеток в основании ворсинки кишечника, хотя здесь случайности уже нет места: при делении та дочерняя клетка, которая остается ближе к основанию, сохраняется как стволовая, а та, которая расположена ближе к стенке ворсинки, движется вдоль нее до вершины, дифференцируется в кишечный эпителий и, достигнув вершины, погибает.

Мы видим, что существует несколько механизмов возникновения различий между клетками. Общим для них является, по-видимому, то, что факторы дифференцировки обычно малоспецифичны. Так, например, отличия цитоплазмы в случае ооплазматической сегрегации не приводят к необратимой дифференцировке, а лишь как бы «намечают» план расположения будущих зародышевых листков. Даже такие, казалось бы, высокоспецифические вещества, как индуцирующие белки, могут быть получены из очень разных и явно чужеродных источников, а следовательно, являются различными, хотя и осуществляют одну и ту же индукцию. Это и есть выражение их низкой специфичности. Ясно, что такой фактор дифференцировки не может нести программу развития, а в лучшем случае осуществляет выбор одного из немногих путей, предопределенных компетенцией. Еще в большей мере понятие неспецифичности относится к другим факторам дифференцировки. Ho в отдельных случаях, например при определении судьбы будущих половых клеток, решающую роль играют какие-то рибонуклеопротеидные. гранулы, функция которых может быть и очень специфичной.

Специфичность дифференцировки — действительные различия между клетками возникают лишь тогда, когда в них синтезируются разные белки, а следовательно, активируются разные гены. Механизмы же включения генов, которые к этому уже готовы (компетентны), могут быть не очень сложными.

В эволюции естественным отбором задаются такое строение организма, взаимное расположение и относительные размеры составляющих его органов, которые обеспечивают его наилучшую выживаемость или, точнее, наилучшую способность к воспроизведению. Следовательно, механизмы, создающие в развитии форму, подчинены этому доминирующему условию. Для создания формы необходимо создание различий между клетками по определенному пространственному плану. Для этого эволюция использует «любые» возможности: наличие хорды, различия условий внутри и снаружи глазного бокала, различия между внутренними и наружными клетками раннего зародыша млекопитающих и т. д. А далее естественные, пусть небольшие, различия в особенностях метаболизма, например, клеток будущей хорды используются в качестве фактора дифференцировки. С одной стороны, эти особенности метаболизма могут усиливаться и приводить к выделению уже специального индуктора, а с другой — повышается чувствительность дифференцирующихся клеток даже к небольшим отличиям в среде, к действию ничтожных концентраций индуктора. Так можно себе представить постепенное появление в эволюции механизмов, определяющих пространственную организацию зародыша путем создания различий между клетками.