Гены и развитие организма

Дифференцированные клетки взрослого организма отличаются одна от другой не только строением и функциями. Они отличаются и временем жизни. Некоторые из них, например нервные, обычно живут столько, сколько живет сам организм. Клетки крови или эпителия кожи существуют значительно меньше — их время жизни измеряется неделями или месяцами. Наконец, эпителиальные клетки кишечника сохраняются не более одного-двух дней.

Если почему-либо погибают нервные клетки (например, при мозговой травме), их уже невозможно восстановить: нервные клетки, как известно, не делятся. При потере части клеток печени (это бывает не только при хирургическом удалении доли печени, но и при некоторых тяжелых отравлениях и болезнях) происходит полное восстановление нормального числа клеток за счет деления оставшихся. В отличие от нервных клеток дифференцированные клетки печени сохраняют полную способность к делениям, хотя в норме почти не делятся.

Поддержание постоянного количества дифференцированных клеток крови, таких, например, как эритроциты, за счет деления их самих совершенно невозможно. У млекопитающих эритроциты вообще лишены ядра, но и ядерные эритроциты у других позвоночных настолько специализированны, что необратимо потеряли способность к делению. Также не способны делиться наполненные кератином клетки поверхностных слоев эпителия кожи и обращенные в полость кишки клетки, лежащие на концах ворсинок. Поддержание нормального числа специализированных клеток во всех этих случаях, а также во многих других происходит путем их постоянной дифференцировки из менее дифференцированных делящихся клеток. В различных органах содержится запас таких малодифференцированных клеток. Некоторая их часть дифференцируется и при этом теряет способность к делению, а часть делится и этим поддерживает постоянное число малодифференцированных клеток.

Если эти процессы изобразить схематически, они будут выглядеть, как дерево с прямым стволом и боковыми ветвями. Ствол — это ряд непрерывно делящихся малодифференцированных клеток, а боковые ветви — это клетки, вступившие на путь дифференцировки и после нескольких делений превращающиеся в полностью дифференцированные клетки, которые через некоторое время погибают. Эта схема привела к термину «стволовые клетки», которым и называют малодифференцированные клетки, способные к делению и к дифференцировке в одном или нескольких направлениях. Раньше в этих случаях обычно использовали ботанический термин — «камбиальные клетки».

Внешне стволовые клетки трудно или даже невозможно отличить от других малодифференцированных клеток, уже начавших свою дифференцировку. В случае эпителия кожи или кишечника эта задача решается проще и не требует специальных методов.

1. Эпителий кожи и кишечника

Эпителий кожи многослойный, и его стволовые клетки находятся в нижнем (базальном) слое, лежащем на мембране, отделяющей эпителий от соединительной ткани. Клеточные деления происходят в базальном слое, и часть клеток при этом вытесняется в верхние слои, вступая тем самым на путь терминальной дифференцировки. Эта дифференцировка в основном состоит в накоплении нерастворимого белка кератина, который постепенно заполняет всю клетку, превращая ее в часть роговой чешуйки, которая слущивается с наружной поверхности кожи. Одна стволовая клетка делится несколько раз и образует в базальном слое группу из 8—10 клеток, которые затем передвигаются в сторону поверхности кожи и в конце концов образуют одну роговую чешуйку.

Кишечный эпителий образует ворсинки, выдающиеся в полость кишки. Дифференцированные клетки нескольких типов выстилают поверхность ворсинки, контактируют с пищей, способствуют ее перевариванию и осуществляют всасывание растворимых пищевых веществ. На кончике ворсинки клетки сохраняются не более одного дня, затем они погибают и отторгаются. На смену им вдоль боковых стенок ворсинки движутся эпителиальные клетки, которые дифференцируются из стволовых клеток.

Между ворсинками в стенке кишки находятся углубления — крипты, около дна которых располагаются и делятся стволовые клетки. После деления, очевидно случайно, одна из клеток оказывается ближе к краю крипты — она и вступает на путь дальнейшей, терминальной дифференцировки. В начале дифференцировки клетка проходит еще несколько делений, так что число дифференцирующихся потомков одной стволовой клетки увеличивается во много раз. Ta же клетка, которая после деления исходной стволовой клетки случайно оказывается вблизи дна крипты, сохраняет свой малодифференцированный характер, т. е. остается стволовой. Немногие клетки в результате деления попадают на самое дно крипты. Они дифференцируются в особые клетки Пеннета.

В результате делений число клеток в крипте увеличивается, их избыток переходит в ворсинку, движется вдоль нее от основания к верхушке, и на этом пути клетки завершают свою дифференцировку. Деление клеток, попавших в ворсинку, прекращается. Дифференцировка их выражается в основном биохимически: в клетках транскрибируются долгоживущие мРНК, а на них транслируются пищеварительные ферменты. Скорость трапскрипции в ядрах по мере дифференцировки замедляется.

В ворсинках эпителия кишечника дифференцировка происходит в нескольких направлениях. Основным видом клеток являются каемчатые клетки. На их наружной поверхности, обращенной в полость кишки, вырастают микроворсинки (их длина 1–1,5 мкм, а диаметр — менее 0,10 мкм), между ними и происходит основная часть пищеварения. Ho кроме того, в эпителии встречаются и особые бокаловидные клетки, выделяющие слизь, а также энтероэндокринные клетки. Все они, по-видимому, образуются из одних и тех же стволовых клеток, каждая из которых, следовательно, может дифференцироваться в одном из четырех направлений или оставаться стволовой. Когда дифференцированные клетки, достигнув вершины ворсинки, отторгаются, они попадают в полость кишки и погибают, а пищеварительные ферменты, освободившиеся из них, начинают функционировать.

2. Клетки крови

Система кроветворения сложнее других систем с постоянным обновлением дифференцированных клеток. В этом случае нет такого простого пространственного разделения стволовых клеток, дифференцирующихся клеток и клеток, достигших терминальной дифференцировки, какое мы видели в коже и в кишке. Кроветворение у взрослых животных происходит в костном мозге и в селезенке, где и располагаются вместе стволовые клетки и клетки на всех стадиях дифференцировки. Поэтому отличить стволовую клетку от тех, которые уже вступили на путь дальнейшего развития, не удается. Дифференцировка клеток крови происходит во многих направлениях. Из единой стволовой кроветворной клетки образуются не только эритроциты, хотя их большинство, но также и белые клетки крови (гранулоциты, макрофаги) и мегакариоциты. Кроме того, из тех же стволовых клеток возникают и клетки иммунной защиты — лимфоциты, о которых подробнее говорится в следующей главе.

Дифференцировка клеток крови проходит через ряд стадий, подробное описание которых занимает много страниц в соответствующих руководствах. Особенно подробно, и с морфологической и с биохимической точек зрения, прослежено образование эритроцитов. Ho в этой главе нам важны не конкретные описания, а некоторые общие принципы или правила, по которым в организме происходит пополнение числа дифференцированных клеток и поддерживаются определенные количественные соотношения между ними. В зависимости от состояния организма и внешних условий за счет деятельности органов кроветворения осуществляется регуляция числа клеток крови. После кровопотери происходит быстрое восстановление числа эритроцитов, а в горах, где воздух разрежен, — постепенное увеличение их количества. При воспалениях количество лейкоцитов увеличивается. He случайно анализ состава клеток крови позволяет диагностировать многие заболевания.

Отличить дифференцирующиеся клетки друг от друга удается только да относительно поздних этапах, когда выбор направления дифференцировки уже осуществлен. Для того же чтобы выяснить, что происходит на более ранних этапах дифференцировки, нужны специальные методы исследования. Прежде всего возникает вопрос: на каком основании мы полагаем, что все клетки крови и лимфоциты образуются из одних и тех же стволовых клеток, сохраняющихся на протяжении всей жизни организма? Было бы легче представить, что уже в раннем развитии возникают зачаточные клетки, судьба которых однозначно определена, и что из одних путем деления и дифференцировки возникают только эритроциты, из других — только лимфоциты, из третьих — мегакариоциты и т. д. Ответ на этот вопрос дали опыты с радиационными маркерами.

С помощью облучения можно получить различные хромосомные перестройки, многие из которых безвредны, и их легко видеть в делящейся клетке под микроскопом. Раз возникнув, такая перестройка сохраняется во всех потомках этой клетки. Например, при транслокации часть одной хромосомы переносится на другую, причем исследователь точно знает, какие из 20 разных хромосом мыши в данной перестройке участвуют. Каждый вид транслокации достаточно редок и при облучении одной мыши два раза в одной ткани произойти практически не может. Поэтому, если через несколько дней после облучения мы видим две клетки с одинаковой хромосомной перестройкой, можно уверенно утверждать, что они произошли от одной клетки. Такие перестройки были названы радиационными маркерами, так как позволяли надежно метить клетки и их потомков. Обнаружив один и тот же маркер и в делящихся эритробластах, и в делящихся промиэлоцитах — предшественниках гранулоцитов, можно было с уверенностью утверждать, что они образовались из общего предшественника — стволовой клетки, которая еще была таковой во время облучения этой мыши. Именно так и было установлено, что все виды клеток крови происходят от одних стволовых клеток.

Вместе с тем в аналогичных опытах было найдено, что нередко радиационные маркеры обнаруживаются только в клетках-предшественниках различных более узких групп клеток крови. Например, только в лимфоцитах или, напротив, только в клетках «красного ряда» — предшественниках эритроцитов. Это показывает, что, кроме полипотентных стволовых клеток, существуют и клетки-пред- шественники с ограниченными возможностями дифференцировки. Из них образуются два, три или только один тип клеток. Такие, уже более дифференцированные, предшественники были названы полустволовыми клетками.

Увидеть кроветворную стволовую клетку не удается, так как до сих пор неизвестны морфологические признаки, позволяющие отличить ее в массе клеток костного мозга или селезенки. Однако изучать их все же можно. Один из методов такого изучения был предложен американскими исследователями Тиллом и Маккуллохом. Если мышь облучить высокой дозой радиации, около 1000 р, то процесс кроветворения у нее постепенно прекратится, так как при такой дозе погибают все кроветворные стволовые клетки, как наиболее радиочувствительные. Такую мышь можно, однако, спасти, если ввести ей в кровяное русло взвесь клеток костного мозга, выделенную из необлученной мыши. Уже через несколько дней после такой инъекции в селезенке облученной мыши можно увидеть очаги кроветворения — сначала небольшие колонии, которые, однако, растут и в конце концов захватывают всю селезенку. Чем больше клеток костного мозга ввести мыши, тем больше колоний возникает одновременно. Метод радиационных маркеров показал, что каждая такая колония — потомки одной стволовой клетки.

Многие колонии дифференцируются только в клетки «красного ряда» — эритроциты, некоторые — только в клетки «белого» ряда — лейкоциты, а в некоторых образуются и те и другие. Интересно, что если клетки одной из таких колоний, например целиком «красной», снова ввести в кровь облученной мыши, то в ее селезенке опять появятся «красные», «белые» и смешанные колонии. Эти опыты показывают, что полипотентные стволовые клетки, образующие колонию и сохраняющиеся в ней, способны дифференцироваться в различных направлениях и эта их способность сохраняется в непрерывном ряду стволовых клеток.

Возникают важные вопросы: от чего зависит, оставаться ли клетке стволовой или вступить на путь дифференцировки, и каковы механизмы, определяющие направление дифференцировки? Играют ли роль в этих процессах факторы, внешние по отношению к стволовым клеткам (их непосредственное окружение, гормоны), или все определяется внутри самих клеток? Однозначного ответа на эти вопросы пока нет. Можно было бы, например, думать, что в результате деления образуются две различные клетки: одна остается стволовой, а другая дифференцируется.

Более правдоподобным кажется предположение, что стволовые клетки вступают на путь деления или дифференцировки с той или иной степенью вероятности. Такой механизм обеспечивает и поддержание постоянного числа стволовых клеток, и непрерывный переход к дифференцировке части клеток. Представления о случайном механизме могут быть справедливыми и для выбора направлений дифференцировки, хотя вероятность того или иного направления неодинакова. В главе о механизмах возникновения различий между клетками мы уже упоминали о таком способе «рулетки». Можно представить, что в стволовых клетках на самом деле действует подобный механизм, не зависящий от внешних условий и подчиняющийся только законам случайности.

Вместе с тем мы хорошо знаем, что конечное число терминально дифференцированных потомков кроветворной стволовой клетки — регулируемая величина. Образование эритроцитов, например, ускоряется в ответ на кровопотери, на недостаток кислорода и т. д., количество лейкоцитов увеличивается при воспалении. Сейчас очевидно, что регуляция осуществляется за счет числа и скорости делений субстволовых клеток и клеток, уже вступивших на путь дифференцировки. Одним из факторов такой регуляции является гормон «красного» кроветворения — эритропоэтин. Этот полипептидный гормон синтезируется в почках в количествах, обратно пропорциональных количеству кислорода в крови. Таким образом, и уменьшение числа эритроцитов, и снижение кислорода в воздухе вызывают усиленную продукцию эритропоэтина. Уже невысокие концентрации этого гормона ускоряют деление и дифференцировку клеток, вступивших на путь эритропоэза. Самые ранние стадии эритропоэза менее чувствительны к эритропоэтину — можно думать, что стимуляция их деления происходит в случае лишь особенно большой нехватки эритроцитов. Предполагается, что в «красном» кровяном ряду клетки проходят около пятнадцати делений, т. е. из каждой полустволовой клетки, вступившей на этот путь, образуется 215 (около 30 тыс.) зрелых эритроцитов. Эритропоэтин может ускорять эритропоэз и увеличивая число митозов в ряду кроветворения, и уменьшая продолжительность митотических циклов. Предполагается, что аналогично действуют гормоны и на дру гих направлениях дифференцировки, хотя сами гормоны лейкопоэза и лимфопоэза еще не обнаружены.

Особую роль в кроветворении играют клетки, в окружении которых случайно оказались стволовые клетки — так называемое микроокружение. Его образуют клетки стромы костного мозга и селезенки, которые сами в клетки крови дифференцироваться не могут. Достаточно заметить, что, если стволовые клетки попадают в костный мозг, они чаще дифференцируются по «белому ряду», а если в селезенку, то чаще но «красному». Может быть, и в пределах одного органа, например селезенки, выбор пути развития зависит от случайных соседей: одни клетки стромы стимулируют, например, лейкопоэз, а другие — эритропоэз. С этих позиций, а в их пользу говорят и другие экспериментальные данные, направление дифференцировки определяется тем, где случайно окажется стволовая клетка. В принципе эта та же «рулетка», которая находится не внутри клетки, а снаружи ее.

Система стволовых клеток, очевидно, «удобна» тем, что открывает возможности для регуляции количества дифференцированных клеток. Ho факторы регуляции (такие, как эритропоэтин) не определяют направления дифференцировки, а лишь ускоряют пролиферацию клеток, уже дифференцирующихся в раз выбранном направлении. Такой путь регуляции, очевидно, проще и эффективнее, чем ранняя детерминация отдельных зачатков для красных, белых и всех других типов клеток крови.

Есть и еще одно соображение о биологическом смысле системы стволовых клеток. Во время дифференцировки, видимо, возрастает вероятность генетических повреждений, например ведущих к злокачественному перерождению клетки. В стволовых клетках вероятность таких повреждений меньше и делений они проходят относительно мало. А клетки, вступившие на путь дифференцировки, хотя и проходят много делений, но в конце концов все погибают, освобождая организм от своего присутствия. Для понимания этих проблем нам, однако, необходимо знать механизмы, определяющие стабильность стволовых клеток и их вступление на путь дифференцировки.