Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №2

Трудно быть богом

ПРОТОРЕННЫЕ ДОРОГИ БОГОВ

Каждый из нас, вольно или невольно, хоть раз в жизни был богом… ну по крайней мере, богом для таких мельчайших организмов как, например, бактерии, дрожжи. Если у вас на кухне прокисло что-нибудь, то будьте уверены без первых или вторых там дело не обошлось. И в каждом кубическом сантиметре прокисшего их может оказаться вплоть до миллиарда. Куда там сравнивать с жалкими несколькими миллиардами человеческой расы, живущей на Земле. И в вашей воле было добавить этим мельчайшим пищи, отправить их всех в тартарары канализации или заставит работать на себя, законно ожидая от них вполне определенных даров. Собственно говоря, человек научился использовать их еще на заре цивилизации, для получения или сохранения продуктов питания. Кое в чем мы, уже в то далекое время, даже обставили обитателей леса из повести Стругацких "Улитка на склоне", например, до получения спиртных напитков с помощью дрожжей они явно не дошли. Как-то бы ни было, но сейчас микроорганизмы используются в заводских масштабах, для получения широкого спектра веществ, от простых спиртов до диагностикумов и сложных лекарственных средств.

Когда какое-либо вещество производится промышленно, в относительно больших объемах, с помощью микроорганизмов или клеток более сложных организмов, то сейчас это принято называть биотехнологией. В принципе возможно получение тех же самых веществ и в рамках химической технологии. Зачастую выбор производства определяется на основе экономических критериев, причем по ходу прогресса экономичность той или иной технологии, для конкретного вещества, может меняется.

Боги никогда не успокаиваются, они нуждаются во все новых и новых, более совершенных, более производительных, мельчайших. И они создают их, вопреки опасениям, что кто-нибудь из мельчайших, сумеет улизнуть из лабораторного или заводского "рая".

В прошедшем столетии мы не только разобрались, с чем конкретно мы имеем дело, каких мельчайших используем, когда варим пиво и квасим капусту, но и изрядно поднаторели в деле добывания нужных нам микроорганизмов. Самый простой и дешевый способ получения требуемых микроорганизмов — "охота За микробами". Суть его несложна. Допустим нам нужен микроорганизм утилизирующий углеводороды нефти, например, для очистки сточных вод. Тогда стоит поискать его там, где, например, есть застарелые нефтяные пятна, разливы нефти. Обязательно найдется какой-нибудь микроорганизм, активно утилизирующий нефть. А если поискать во многих местах, то можно найти и такой, что делает это лучше других.

В данном конкретном случае идея заключается в том, что если за счет химического превращения какого-либо соединения в другое, можно получить энергию, то обязательно какие-нибудь микроорганизмы на Земле используют это превращение для своей жизнедеятельности. Исключений похоже не бывает. Если уж жизнь, как «форма существования биологических объектов» была занесена на на Землю извне — засеяна, то она нашла здесь очень разнообразную питательную среду.

На другом полюсе по стоимости находится метод генной (генетической) инженерии. Метод хотя и дорогостоящий, но перспективный. Впрочем, высокая стоимость — это дело временное, пока не разработаны более эффективные способы получения нужных ДНК-модифицирующих ферментов и не налажено крупномасштабное производство их и соответствующего оборудования. В самом способе ничего особо сверхсложного нет, так, например, начиная с 80-х годах прошлого века, в США и других странах, выпускаются даже наборы по генетической инженерии, в том числе, и для школьников. Эти наборы доступны даже через Интернет.

Собственно говоря все химические реакции, протекающие в живой клетке, осуществляются высоко эффективными и очень специализированными биохимическими катализаторами — ферментами. Клетка конструирует нужные ферменты на основе информации закодированной в генах. Перетаскивая нужные гены из генома одного микроорганизма в геном другого и иногда слегка изменяя их, или даже конструируя новые гены (в будущем), можно заставить какой-либо микроорганизм производить то, что нам нужно или производить так, как нам нужно. И не только микроорганизм. Уже давно в ходу генетически модифицированные сельскохозяйственные растения. Можно поэкспериментировать и с мелкими млекопитающими. Рано или поздно дойдет очередь и до человека. Это ведь просто один вид из гигантского числа видов многоклеточных организмов, обитающих на Земле. Так что рано или поздно будет продолжение сериала «Адам и Ева». Ну скажем, «Адам и Ева»-2 или, например, так: Adam&Eve-SE, ver.4.10.2222.А.

Но большинство промышленных модификаций (штампов) микроорганизмов по-прежнему получается с помощью метода классической селекции. В основе этого метода лежит то, что гены могут меняется случайным образом — мутировать. Эти мутации следует рассматривать как небольшие ошибки при копировании (репликации) генома во момент размножения организма. У бактерий и некоторых других простейших микроорганизмов (прокариотов) геном в основном представляет собой одноцепочную молекулу ДНК и результат мутации проявляется сразу. У более сложных организмов (эукариотов, к которым относятся все животные и растения, но и некоторые микроорганизмы тоже, например, дрожжи), имеющих двухцепочную ДНК, в этом деле все сложнее. Мутации могут накапливаться и проявляться более интегрированно, в результате комбинирования геномов в половом размножении.

Половое размножение дает больше вариантов для отбора, а значит и больше возможностей для приспособления вида к среде обитания. Ни один организм в природной среде не является «вещью в себе», это часть чего-то более общего, часть самой среды. В природе все, что может давать энергию, является источником питания организмов, в том числе и другие организмы. Там нет исключений, и для человека тоже. Сплошная конкуренция за источники питания и приспособление к среде обитания. Суммарное количество органики на Земле практически не меняется, меняется ее использование (кругооборот) в преобразовании энергии солнечного света в тепло. Одни мутации способствуют освоению новой ниши по питанию в среде обитания или же выживанию организма в среде (которая и сама меняется) и он отбирается естественным образом (естественный отбор), давая начало другому, слегка измененному прежнему, но все-таки немного другому виду. Другие, на данный момент времени и состояния среды, оказываются вредными и их носители потихоньку (точнее статистически) исчезают из природы. Исчезают виды, не сумевшие приспособится к новым условиям непрерывно меняющейся среды обитания. Исчезнувшие заменяются другими. Для одних находятся подходящие мутации на их пути изменения, на их пути приспособления к условиям изменяющейся среды. Для других нет, их направление изменения оказалось ошибочным, тупиковым. Сейчас мы называем эти процессы эволюцией органического мира. Организмы могут как усложнятся в процессе эволюции, так и упрощается, в зависимости от того, что оказывается более подходящим для приспособления на конкретном этапе, в конкретной нише окружающей среды. Одни древние виды организмов могут сосуществовать с новейшими, но происходящими от них же, от других остались только ископаемые останки, да и то не от всех. Вопрос о том, что происходит при этом с жизнью в целом, остается открытым.

Это в природе, а в лаборатории «боги» могут отбирать то, что им нужно. Они испокон веков этим занимаются, хотя и не всегда в лабораториях. Путем скрещивания (то есть комбинированием геномов, содержащих разные мутации) и отбора создали для себя подходящих животных, растений, микроорганизмов. Сельскохозяйственных, домашних, промышленных. Многие из таких, созданных в результате искусственного отбора (классической селекции), видов уже не могут существовать без человека, в природе они не конкурентноспособны. В первую очередь это касается микрорганизмов. Например если какая-то бактерия является сверпродуцентом какого-либо вещества, то эта функция у нее осуществляется в ущерб другим биохимическим процессам и, следовательно, другие процессы недополучат доступной в клетке энергии (биохимической энергии, переносимой молекулами АТФ). Как результат, бактерия-сверпродуцент не сможет размножаться так же быстро, как природные, «дикие» виды и будет вытеснена ими.

Все было бы прекрасно, если бы метод классической селекции не был столь трудоемок, а главное не требовал так много времени. Селекция видов длится порой столетиями и даже тысячелетиями. Микроорганизмы растут очень быстро, по сравнению с животными и растениями, но даже их селекция — процесс достаточно длительный. Так например пивоваренные и винодельческие дрожжи селектируются в течение уже сотен лет. Появление нужных мутаций — процесс случайный. В какой-то степени его можно ускорить, если увеличить частоту мутаций. В ход идет большое число самых разнообразных воздействий, физической и химической природы. Наиболее часто используется ультрафиолет, определенной длины волны, и ряд веществ-мутагенов. Это помогает, но все равно получение подходящего промышленного штамма микроорганизмов как правило рассматривается как единичный удачный случай всей жизни микробиолога-селекционера. Дело здесь в самой технологии микробиологической работы. Высевы на чашки Петри, размножение в пробираках, испытание штаммов требует достаточно много времени. А нельзя ли автоматизировать сам отбор, создать ускоренную "эволюцию в пробирке"? Один из вариантов решения этого вопроса и будет рассмотрен далее.

В ПОИСКЕ ОБХОДНЫХ ПУТЕЙ

Среди диссертаций в библиотеке Homelab нашлась такая: «Управление скоростью роста в турбидостате действием ингибиторов". Изложенный в ней подход как раз целенаправлен на осуществление эволюции в ферментере для культивирования микроорганизмов. Для начала следует разобраться, что такое турбидостат и почему его следовало бы использовать для селекции штаммов микроорганизмов. Для этого воспользуемся книгой Перта "Основы культивирования микроорганизмов и клеток".

Рис. 18. Турбидостат (схематически) с автоматической регуляцией оптической плотности культуры.

_{1 — поступление среды, 2 — насос, 3 — мешалка, 4 — сток культуры, 5 — фотоэлемент, 6 — источник света.}

Вначале Брайсон изобрел турбидостат, по существу представляющий собой тот же хемостат, но снабженный фотоэлектрическим элементом, чувствительным к мутности культуры. Когда плотность биомассы поднимается выше некоторого выбранного уровня, то фотоэлемент запускает подачу среды. Измерения мутности по методу турбидостата имеют ограниченную область применения только для культур одноклеточных организмов. Турбидостатный контроль с фотоэлектрическим элементом, чувствительным к плотности биомассы, схематически представлен на рис. 18. Когда оптическая плотность культуры превышает наперед выбранное значение, сигнал фотоэлемента приводит в действие насос, подающий среду. При этом объем среды поддерживается на постоянном уровне при помощи специального приспособления. С помощью турбидостатного контроля, таким образом, устанавливается плотность биомассы, а скорость разбавления сама подстраивается под стационарное значение.

Турбидостат применяется как средство для поддержании культуры в течение многих генераций при избытке субстрата и постоянных условиях среды. Система будет отбирать более быстро растущие организмы, поскольку скорость роста в системе не фиксируется. Брайсон первым использовал этот метод для автоматической селекции организмов, резистентных к антибиотикам.

В самой же диссертации отмечается: Первоначально же турбидостат, разработанный в 1952 году, предназначался исключительно для целей вьделения штаммов, устойчивых к действию ингибиторов роста. Суть предложенного метода селекции заключалась в переориентации естественной для турбидостата автоселекции штаммов по скорости роста на адаптацию к вредному, ингибирующему фактору. Для этого предлагалось увеличивать величину ингибирующего фактора в среде, что должно приводить к частичному или полному снижению скорости роста культуры В целом. Вследствие непременного наличия мутантов в популяции, в ферментёре должно появляться какое-то количество клеток способных расти с большей скоростью. Скорость роста культуры в целом при этом увеличится, что может являться основанием для дальнейшего наращивания величины ингибирующего фактора.

При чем здесь ингибитор вроде бы понятно. Под ингибитором понимается любое вредное вещество понижающее скорость роста. В принципе это вообще может быть любое соединение не используемое для питания и даже используемое, но в достаточно больших концентрациях. Не исключено, что для нейтрализации некоторых ингибиторов микроорганизмы могут интенсивно производить какие-нибудь соединения из спектра закодироанных в геноме. Что собственно и добиваются от промышленных штаммов микроорганизмов. Но даже и без этого есть потребность в штаммах, устойчивых к каким-либо соединениям (и по возможности разрущающих эти соединения), например для систем очистки сточных вод химических производств. Требуются штаммы устойчивые к большим концентрациям веществ, используемых для питания микрорганизмов и также устойчивые к продуктам собственного метаболизма.

Можно привести конкретный пример: очень сильно требуются штаммы дрожжей устойчивых и работающих при больших концентрациях этилового спирта. Этанол рассматривается как альтернатива бензину при истощении запасов нефти. Производство же этанола с помощью дрожжей тем выгодней, чем большую концентрацию его в растворе они производят. Экономически и энергетически выгоднее перегонять спирт по возможности большей концентрации. Спирт концентрацией 40 % может сразу поступать на ректификацию, без предварительных одной-двух перегонок. От используемых сейчас в виноделии штаммов дрожжей удается выжать до 18 процентов спирта на выходе. Это при дробном добавлении сахаров, большие концентрации сахаров дрожжи не выдерживают. Тогда как известны бактерии производящие до 30 процентов спирта на выходе. Пока они не нашли места в производстве спирта. Используемые для этого дрожжи являются более привычными и более безопасными микрорганизмами. Кроме того они вытесняют на сахаросодержащих средах все другие микроорганизмы и производство спирта можно вести в нестерильных условиях. С этим человек познакомился еще в древности, освоив получение вина из винограда.

Итак цели ясны, задачи поставлены. Вот только с реализацией автоселекции штаммов в турбидостате оказалось не все так просто. Очень даже не просто оказалось управлять скоростью роста микроорганизмов в турбидостате действием ингибиторов. Собственно решению этой задачи и посвящена сама диссертация. Хорошо хоть к этому делу, на современном этапе развития техники, можно было приспособить компьютер (см рисунок установки) и соответственно использовать кое-какие математические вычисления.

Рис. 3.1. Структурная схема экспериментальной установки.

_{1 — стеклянный стакан; 2 — фторопластовая крышка; 3 — активатор; 4 — управляющая мини-ЭВМ; 5 — фото-резистор; 6 — электронная схема предобработки сигнала; 7 — АЦП; 8 — осветитель; 9, 10 — перистальтические насосы; 11 — смеситель; 12 — блок электронных ключей; 13 — буферная ёмкость.}

Изобретателю турбидостата, Брайсону, было куда трудней добиться желаемого. Тем не менее достигнутые результаты не впечатляют. Выводы же скорее пессимистичны. И внимательное прочтение диссертации позволило понять почему. Турбидостат в принципе, даже теоретически не годится для автоселекции штаммов, для осуществления эволюции на лабораторном столе. Во-первых, если для нейтрализации действия какого-нибудь ингибитора клетке нужно усиленно производить хоть какое-нибудь соединение, то синтез этого соединения потребует дополнительного расхода биохимической энергии (АТФ). В ущерб других процессов. И как результат скорость роста клеток будет падать. Она может возрасти только если мутации позволят использовать дополнительный источник энергии, присутствующий в среде. А это не всегда возможно. По-видимому не просто так в экспериментах использовались, для питательных сред, соли лимонной кислоты. Ингибирование закислением тоже осуществлялось с помощью лимонной кислоты. Лимонная кислота является участником цикла Кребса, поставляющего энергию клеткам. Но это мелочь. О более серьезной вещи прямо говорится в тексте диссертации: Таким образом, преследуя цель автоселекции штамма, следует производить турбидостатное культивирование в следующих условиях:

1. При больших скоростях роста (для увеличения вероятности появления, мутанта);

2. При малых скоростях скоростях роста, достигнутых действием ингибитора (для увеличения вероятности сохранения мутанта);

3. При непрерывном и линейном снижении скорости роста исходного штамма воздействием ингибитора (для наискорейшего выделения мутанта).

Совместить эти, попарно альтернативные условия, можно только динамически, то есть культура микроорганизмов поочерёдно (на некоторое время) должна попадать в каждое из этих условий.

Мутант, даже если он обладает большой скоростью роста, практически не имеет шансов задержатся в ферментере турбидостата. Медленно растущий мутант — тем более. В самом деле, приведенные расчеты это показывают. Посмотрите внимательно график зависимости вероятности сохранения мутанта от скорости роста. Гамма это отношение скорости роста мутанта к скорости роста нормальных клеток. По оси абсцисс время выраженное в делениях клеток.

Рис. 2.6. Вероятность полного отсутствия вымывания делящегося мутанта.

Как тут не упомянуть о пользе математической биологии. Если бы эти расчеты были сделаны до проведения работы, а не после, то и сама работа возможно не была бы проделана. Проходит то время когда биологи рассуждали на пальцах. Позволю себе еще раз процитировать идею автоселекции в турбилостате впервые высказанную Брайсоном и многократно повторенную в работах разных авторов, занимающихся популяционной микробиологией: Для этого предлагалось увеличивать величину ингибирующего фактора в среде, что должно приводить к частичному или полному снижению скорости роста культуры В целом. Вследствие непременного наличия мутантов в популяции, в ферментёре должно появляться какое-то количество клеток способных расти с большей скоростью. Скорость роста культуры в целом при этом увеличится, что может являться основанием для дальнейшего наращивания величины ингибирующего фактора.

Игнорирование числовых (математических) выражений явлений и рассмотрение только качественных приводит к парадоксам типа "Ахиллесчерепаха", в которых спортсмен никогда не сможет догнать даже медленное животное. Конечно, если бы экспериментатор проверял математически каждую пришедшую ему на ум идею, то тогда он целыми днями только бы и сидел за расчетами. Этим должен заниматься отдельный специалист — теоретик, специализирующийся в области биологии.

Выходит что на этой идеи можно ставить точку. Нет, "еще не вечер". Но об этом в следующем, заключительном, разделе.

ПУТИ НЕИСПОВЕДИМЫЕ

Если турбидостат не подходит для целей автоселекции штаммов, то стоит подумать, чем его можно заменить. Тут требуется метод непрерывного культивирования, позволяющий максимально повысить вероятность сохранения мутанта в ферментере. Одним из вариантов может быть применение отъемно-доливного культивирования, упомянутого в книге Перта. Суть его в том, что время от времени часть культуральной среды удаляется их ферментера при постоянном поступлении свежей питательной среды. Если объем ферментера по возможности велик, то слив большей части накопившейся культуральной среды можно производить достаточно редко и появившийся в культуре мутант будет иметь возможность размножится. Конечно, работать с большими объемами в условиях домашней лаборатории довольно затруднительно. Трудно выдержать стерильные условия. Тем не менее, есть одна микробиологическая технология, доступная многим, оперирующая большими объемами и как раз в нестерильных условиях. Это просто домашнее виноделие. Точнее получение этилового спирта в домашних условиях. Очень замечательная технология: результаты даже неудачных опытов всегда можно перегнать на спирт. Есть и подходящая цель экспериментов, изложенная в предыдущей разделе: селекция штаммов дрожжей, производящих по возможности больше алкоголя. Любая удача на этом пути обернется в первую очередь экономией труда и ресурсов, для самого экспериментатора, при перегонке полученного сусла на спирт. Там есть только одна проблема: куда девать полученный спирт. Поскольку речь в данном случае идет о выделении штаммов дрожжей работоспособных при повышенных концентрациях алкоголя в среде, то следует напрочь отказаться от идеи стабилизации, как скорости роста, так и плотности культуры в среде. Тем более что эти идеи на самом деле не работоспособны. В данном случае стабилизировать следует скорость производства спирта. А регулировать ее подачей раствора сахара в ферментер. Ингибитор одновременно является и питательной средой, очень удобно. Размножится в ферментере более устойчивый к спирту и сахару мутант дрожжей, значит, увеличится скорость продукции спирта и можно будет увеличить скорость подачи раствора сахара. Следующий мутант — еще приращение добавления сахара. Технически измерение скорости продукции спирта несложно. Выделение алкоголя дрожжами напрямую связано с выделением углекислого газа. Если выхлоп пропускать через водяной затвор, что, собственно говоря, обычно делается и должно делаться для осуществления брожения, то остается каким либо методом подсчитывать количество прошедших пузырьков газа в единицу времени.

Для этого подойдет, например ячейка для измерения электропроводности воды — проходящий пузырек газа разорвет проводящую цепь. Ферментером может являться большая, литров на 50 стеклянная бутыль или фляга. Компьютер же для управления уже не является проблемой, подойдет даже XT с 8086 процессором.

Итак цели ясны, задачи поставлены, можно попытаться поиграть в эволюцию на лабораторном столе и выяснить самому насколько трудно быть богом. Надеюсь вы не забыли урок изложенный в предыдущем разделе: идея любого эксперимента должна быть по возможности вначале изучена математическими методами. Это добавить ясности в вопросе о том как его проводить и стоит ли вообще его проводить.

Литература:

1. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. (1978)

2. Печеркин М.П. Управление скоростью роста в турбидостате действием ингибиторов. Дисс. (1988)