Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №5

Культивирование грибов

Стаметс П., иллюст. Аберта и др.

_{(три главы из книги, с сокращениями)}

Методы разведения грибов, независимо от вида, в основном схожи. Несмотря на то, что два вида могут отличаться по требованиям к температурным условиям, предпочтительному уровню кислотности среды или типу субстрата, шаги ведущие к плодоношению в сущности одни и те же. Заключаются они в следующем:

1. Приготовление и разлив агара по чашкам Петри.

2. Проращивание спор и выделение чистого грибного мицелия.

3. Увеличение массы мицелия на агаровом носителе.

4. Приготовление зерна.

5. Инокуляция зерна чистым мицелием с агара.

6. Инкубация грибницы на Зерне.

7. а) перенос зерновой грибницы в лотки,

или б) инокуляция зерновой грибницей бедного субстрата.

8. Гобтировка (кейсинг) — нанесение увлажнённого покровного слоя из смеси торфа и других материалов (не для всех видов — прим. ред).

9. Плодоношение — снижение температуры, повышение влажности до 95 %, увеличение циркуляции воздуха, снижение уровня углекислого газа и/или

10. Сбор урожая — поддержание температуры, снижение влажности до 85–92 %, поддержание циркуляции воздуха, углекислого газа и/или уровня освещённости.

Многие виды могут дать небольшие урожаи прямо на зерне с покровным слоем. Но культиватор может пойти дальше ещё на один шаг и инокулировать зерном компост, солому или дерево. В любом случае для плодоношения грибам необходимы условия с высоким и легко контролируемым уровнем влажности. Без правильной влажности грибы расти не будут.

В последующих главах будут рассмотрены стандартные методы проращивания спор, а затем и способы выращивания мицелия на агаре, производство грибницы на зерне и/или отрубях, приготовление компостных и некомпостных субстратов, инкубация грибницы, гобтировка (кейсинг) и образование примордий. После последнего шага методы для плодоношения различных видов расходятся, и приёмы присущие каждому грибу излагаются отдельно. Список обычно встречающихся проблем поможет культиватору определить и преодолеть встречающиеся затруднения. Затем следует исчерпывающий разбор инфекций и вредителей грибной культуры и глава, посвящённая генетическим особенностям грибов. В целом книга представляет собой систему знаний объединяющую опыт, накопленный грибоводами всего мира, используя который вполне реально вырастить грибы дома.

ГРИБЫ И ГРИБНАЯ КУЛЬТУРА

Тем, кто сталкивается с грибами впервые, они обычно внушают благоговейный трепет. Они иные. Непохожие ни на растения, ни на животных грибы обладают исключительно собственной фактурой, наружностью и манерой развития. Высшие грибы представляют малую ветвь эволюции царства грибов эумицетов известную как «мясистый гриб». В сущности, грибы это лишённые хлорофилла организмы, которые эволюционировали из водорослей. Основная роль грибов в экосистеме это разложение — звено в цепочке микробов, которые разрушают и перерабатывают мёртвую органическую массу. И хотя известны десятки тысяч грибов, высшие грибы составляют только малую долю насчитывающую несколько тысяч видов.

Независимо от вида, несколько шагов являются универсальными в культивации всех грибов. Не удивительно, что они в точности повторяют жизненный цикл грибов. Задача культиватора здесь состоит в том, чтобы изолировать требуемый вид от агрессивных соперников природного мира и поместить его в подготовленную среду, которая даст выращиваемому грибу явные преимущества над конкурирующими организмами. Три главных шага в выращивании грибов соответствуют трём фазам в их жизненном цикле:

1. Сбор спор, проращивание спор и изоляция мицелия; или клонирование ткани гриба.

2. Приготовление инокуляционного материала путём наращивания массы мицелия на обогащённом питательном носителе на основе агара и затем на зерне. Высаживание зерновой грибницы в компостные и некомпостные субстраты или использование непосредственно зерна как субстрата для плодоношения.

3. Создание условий для появления и развития плодовых тел (собственно грибов).

Понимание основ жизненного цикла гриба значительно упрощает изучение базовых методов культивации.

Плодовые тела это цветы грибного растения — мицелия. Мицелий пронизывает землю обширными сетями соединённых между собой клеток и живёт практически вечно. Скрытый от глаз мицелий производит плодовые тела, которые мы и называем грибами, только в оптимальных условиях включающих в себя температуру, влажность и наличие питательных веществ. В большинстве случаев у мицелия есть практически только одна возможность обеспечить выживание вида: выбросить чудовищное количество спор.

В масштабе жизненного цикла грибного растения плодовое тело появляется лишь на мгновение. Сети мицелия могут находиться в состоянии спячки месяцами, а иногда и годами и произвести единственную волну грибов. В течение этих нескольких недель плодоношения мицелий переходит в состояние бешеного роста, аккумулируя питательные вещества и формируя уплотнения в виде маленьких шариков называемых примордиями, которые со временем увеличатся и образуют плодовые тела грибов. Первыми из тканей развиваются гимениальные пластинки на нижней части шляпки, проявляясь сначала как складки, превращаются затем в прямые гребни и в конечном счёте вытягиваются образуя плоские вертикальные пластинки. Эти симметричные рационально расположенные пластинки покрыты клетками производящими споры — базидиями.

С конструктивной точки зрения гриб является эффективным репродуктивным телом. Его шляпка выступает куполообразным щитом, защищающим расположенные под ним гимениальные пластинки от разрушающего воздействия дождя, ветра и солнца. Многие виды грибов обладают так называемой частичной вуалью защищающей пластинки, растягиваясь от шляпки и окаймляя ножку. Споры начинают сыпаться как раз незадолго до разрыва вуали. После отсоединения частичной вуали спороношение продолжается с нарастающей скоростью. Шляпка гриба опирается на подобную колонне ножку, которая поднимает гимениальные пластинки над землёй, где даже малейшие потоки воздуха с лёгкостью уносят споры. Совершенно очевидно, что каждая часть плодового тела гриба предназначена, для того чтобы дать спорам наилучшие возможности для созревания и распространения во внешней среде, условия которой зачастую оказываются суровыми и резко изменяющимися.

По мере созревания гриба продуцирование спор замедляется, прекращаясь в итоге вовсе. Это последние часы жизни плодового тела. Вскоре в процесс вступают бактериальное разложение и низшие грибы, которые быстро превращают некогда величественный гриб в комочек склизкой и зловонной массы, стекающей в землю из которой она и произошла.

ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ ГРИБА

Культивация грибов это одна из лучших возможностей для наблюдения Жизненного Цикла Гриба во всей его полноте. Жизненный цикл начинается со споры, которая порождает первичный мицелий. Вторичный появляется при скрещивании клеток мицелия произошедших от двух разных спор. Этот мицелий продолжает развиваться вегетативно. Когда вегетативный мицелий созреет, его клетки будут способны на феноменально быстрый уровень деления, на пике которого он возводит плодовые тела грибов. Это последнее функциональное изменение в результате которого он становится третичным мицелием. Эти три типа мицелия представляют собой три последовательные фазы жизненного цикла гриба.

Споры большинства грибов генетически гаплоидны (1N) и одноядерны. Это значит что каждая спора содержит в себе одно ядро и половину набора хромосом своего вида. Таким образом, у споры есть «пол» в том смысле что для созревания до мицелия способного к произведению потомства ей необходима спора противоположного типа. Сразу после выбрасывания споры представляют собой полностью готовые к прорастанию объёмные «влажные» клетки. Но вскоре начинается их обезвоживание и, высыхая стенки клетки, свёртываются к центру.

В таком виде они смогут находится в состоянии покоя, пережидая сухие сезоны или сильные засухи. Когда погодные условия смягчатся и предоставят достаточный уровень влажности, споры снова напитаются влагой и вернутся к прежнему объёму. Только в этом случае возможно прорастание спор.

В пределах одного вида структура и форма спор в некоторой степени схожи. Однако если рассматривать споры разных видов то можно заметить значительные отличия. Некоторые гладкие в и имеют форму лимона (род Copelandia, к примеру); многие эллиптические (как у рода Psilocybe); тогда как другие обладают неправильной формой и сложной структурой поверхности (Lactarius или Entoloma). Верхушечные зародышевые поры присутствуют у спор многих грибов и особенно у псилоцибиновых видов.

Зародышевая пора это округлое углубление на одном конце споры из которого выпускается гаплоидная ниточка мицелия, называемая гифом. Гиф продолжает расти и, разветвляясь, образует мицелиальную сеть. При встрече двух генетически взаимодополняющих гифовых сетей в момент соприкосновения стенки клеток входящих в контакт растворяются, и происходит обмен цитоплазматическим и генетическим материалом. Эротично это или нет, но это «грибной секс». Весь мицелий появляющийся впредь будет двухъядерным и дикариотическим. Это означает, что в каждой клетке будет содержаться два ядра и полный набор хромосом. За несколькими исключениями, только полностью зрелый (дикариотический) мицелий способен к производству плодовых тел. Обычно дикариотический мицелий быстрее колонизирует субстрат и в принципе более сильный, чем монокариотический. Плодоношение уже принципиально возможно, как только мицелий вступает в дикариофазу. У Psilocybe cubensis период между прорастанием спор и появлением зачатков плодовых тел может занять всего две недели; у некоторых видов Panaeolus это может произойти уже через неделю. У большинства грибов, тем не менее, на это уходит несколько недель или месяцев.

Культиваторы, занимающиеся выведением новых штаммов, путём скрещивания выделенных односпоровых культур используют как признак для определения зрелости (перехода в дикариофазу) мицелия наличие так называемых спаечных соединений. Спаечные соединения это микроскопические мосты, объединяющие две клетки, и встречаются они только в дикариотическом мицелии. Спайки можно легко увидеть даже с помощью слабого микроскопа с увеличением Х100-400. Не все виды образуют спаечные соединения. (Agaricus brunnescens не образуют, зато почти все виды Psilocybe и Panaeolus образуют). И, напротив, у мицелия полученного из гаплоидных спор спайки отсутствуют. Эта характерная особенность является бесценным инструментом для исследователя, выводящего новые штаммы. (За дополнительной информацией о стратегиях селекции см. Главу XV.)

Две сети мицелия, растущие вместе, могут обменяться генетической информацией и образовать новый штамм. Это случается при объединении двух гифальных систем и называется анастомоз. А если пересекаются две несовместимых колонии мицелия, то зачастую в месте их встречи образуется участок подавленного роста. На агаре подобный участок несовместимости будет виден невооружённым взглядом.

Когда мицелий начинает плодоносить, в его метаболизме происходит несколько радикальных перемен. До этого момента он развивался вегетативно. В вегетативной стадии гифальные клетки накапливают питательные вещества. Удивительно, что количество ядер в каждой клетке постепенно увеличивается и иногда даже достигает десяти в момент перед началом образования примордий. Непосредственно перед формированием плодовых тел эти ядра передаются через стенки вновь образующимся клеткам, и их количество усредняется до двух на клетку. По-видимому, такое увеличение количества ядер является необходимым условием для плодоношения у многих видов грибов.

По мере формирования гимениальных пластинок появляется всё больше базидиальных клеток, проявляясь поначалу маленькими пузырьками напоминающими булыжную мостовую. Базидия — это основная цель репродуктивной фазы жизненного цикла гриба. Тем не менее, базидии не созревают все сразу. К примеру, у вида Panaeolus базидиальные клетки появляются очагами, придавая поверхности пластинок пятнистый вид. Клетки, из которых образуется базидия, обычно двухъядерные, и т. к. каждое ядро содержит одинарный набор непарных хромосом (1N), то клетка является дикариотической. И состав новых базидиальных клеток сходный. В определённый момент времени два ядра базидии начинают движение навстречу друг другу и объединяются в одно целое диплоидное (2N) ядро. Это превращение известно как кариогамия. Вскоре после этого диплоидное ядро претерпевает мейоз в результате, которого обычно рождаются четыре гаплоидных дочерних клетки.

На поверхности базидии возникают стеригмы — выступы похожие на щупальца, по которым движутся эти ядра. У большинства видов на кончиках этих выступов образуются четыре споры. Споры продолжают развиваться до тех пор, пока некое усилие не вытолкнет их в пространство. Сам механизм освобождения споры пока не объяснён учёными. Но наиболее распространённая в микологическом сообществе модель основывается на предпосылке, что это происходит из-за пузырька газа образующегося в месте соединения споры и стеригмы. Пузырёк газа надувается и взрывается «отстреливая» спору в полость между пластинками, откуда её уносят воздушные потоки. Обычно подобным образом освобождаются и другие споры. Спороношение завершает жизненный цикл гриба.

Не у всех видов грибов базидии производят четыре гаплоидных споры. Agaricus brunnescens (= Agaricus bisporus), обычный шампиньон, обладает базидиями с двумя диплоидными (2N) спорами. Это означает, что мицелий, полученный из одной такой споры уже полностью готов к плодоношению. Agaricus brunnescens — это только один пример диплоидного биполярного вида. У некоторых Copelandian Panaeoli (сильно синеющие виды рода Panaeolus) две споры и те же условия созревания, что и у Agaricus brunnescens. У других видов грибов базидии только с тремя спорами; у некоторых с четырьмя; а у несколько видов, таких как лисичка обыкновенная, на каждую базидию приходится восемь спор!

Осведомлённость начинающего грибовода о жизненном цикле значительно упростит первые попытки выращивания грибов. Как только будет достигнуто понимание сути грибной культуры и жизненного процесса этих организмов, культиватор сможет перейти к более сложным и интересным темам, таким как генетика и селекция штаммов. Такой всесторонний подход способствует углублению понимания вопроса и закладывает фундамент для развития инновационного подхода к разведению грибов.

_{(см. также статью «Выращивание грибов. Советы начинающим.» во втором номере журнала «Домашняя лаборатория» за 2007 г. — прим. ред.)}

Воздух которым мы дышим подобен живому океану, кишащему микроскопическими организмами, он колышется приливами и отливами от малейшего дуновения ветерка. Плесени, бактерии, вирусы и растения используют атмосферу для распространения своего потомства в новые ареалы обитания. И если не предпринять определённые меры предосторожности, то эти микрочастицы могут сделать поддержание стерильности технологии затруднительным, однако если вам удастся пресечь или сильно сократить движение этих организмов в воздухе, то в успехе стерильной технологии можно быть практически уверенным.

Существует пять основных источников заражения при работе с грибной культурой:

1. Непосредственно окружающая среда (воздух);

2. Субстрат (носитель культуры);

3. Инвентарь для культивации;

4. Сам культиватор (грибовод) и его или её одежда;

5. Споры грибов или мицелий.

Грибы, как и вообще все живые организмы постоянно конкурируют друг с другом за доступные питательные вещества. Создавая стерильные условия, вы просто даёте грибной культуре значительные преимущества перед несметным множеством других конкурентов. Пред тем как начать работу непосредственно с культурой, первым шагом будет изготовление камеры для инокуляции или оборудование стерильной лаборатории.

ПРОЕКТИРОВАНИЕ И ОБУСТРОЙСТВО СТЕРИЛЬНОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Большинство грибоводов терпят неудачу в своих начинаниях только из-за того, что не удосуживаются оборудовать место для стерильной работы. Хотя всё что может для этого потребоваться это полдня работы по переоборудованию стенного шкафа или кладовки в приемлемую лабораторию для инокуляций.

Начните с того, что уберите все коврики, шторки и прочие тканно-вязаные изделия в которых скрывается большое количество пыли и спор. Тщательно вымойте полы, стены и потолки с мягким дезинфектантом. Если вы покрасите помещение глянцевой белой эмалью, это упростит уборку в будущем. Закройте все окна и другие источники потенциальных сквозняков листовым пластиком. Либо с внешней, либо с внутренней стороны сконструируйте тамбур, который будет служить защитным шлюзом. Такая система будет выполнять роль защитного буфера между внешней средой и лабораторией. Тамбур следует организовать таким образом чтобы одна дверь могла бы оставаться закрытой, когда открывается другая дверь. Укомплектуйте лабораторию следующими предметами:

1. стул и устойчивый стол с гладкой поверхностью;

2. пропановая горелка, спиртовка или бутановая зажигалка (рекомендуем спиртовый факел, немного спирта налитого на крышку жестяной кофейной банки — прим. ред.);

3. чётко помеченный пульверизатор с 10 % раствором гидрохлорида натрия (белизны, отбеливателя);

4. стерильные чашки Петри и пробирки;

5. самоклеющиеся листочки (или лейкопластырь), блокнот, ручка и нестираемый маркер;

6. нож для агара (скальпель) и инокуляционная петля (рекомендуем жесткий крючок — прим. ред.).

Все эти предметы должны всегда оставаться в лаборатории. Если что-то из этого было вынесено, перед возвращением убедитесь в абсолютной чистоте предмета.

Поддерживать в лаборатории условия близкие к стерильным можно простой тщательной уборкой, с частотой зависящей от частоты использования помещения. Степень тщательности будет зависеть от насыщенности воздуха спорами в вашем конкретном случае. В зимний период объём свободно перемещающихся спор радикально снижается, тогда как весной и летом можно заметить очевидный рост этого объёма. Следовательно, в эти периоды пикового роста количества контаминантов потребуется большая тщательность в уборке. Ещё более важно выносить из лаборатории все заражённые банки и чашки Петри способом, не представляющим угрозы для стерильности лаборатории.

Завершив обустройство лаборатории необходимо строго и неколебимо блюсти в ней жёсткую гигиену. Помещение следует мыть с дезинфектантом, полы со шваброй и напоследок распылять 10 % раствор белизны из пульверизатора. После распыления в лабораторию нельзя входить в течение 15 минут, пока не осядут все взвешенные в воздухе частицы. Вы ДОЛЖНЫ проводить весь комплекс гигиенических процедур перед каждой инокуляцией. Запомните, как правило: заражение проще предупредить, чем уничтожить после появления.

Прежде чем продолжать, необходимо напомнить об осторожности. Стерильная работа требует концентрации, внимания к деталям и твёрдости руки. Работайте в пределах разумных промежутков времени, а не до полного изнеможения. Никогда не оставляйте без присмотра спиртовку или бутановую горелку и всегда помните о том что в замкнутом пространстве очень быстро заканчивается запас кислорода.

Некоторые грибоводы выводят войну с контаминантами за пределы разумного и иногда даже во вред собственному здоровью. Начинают «бойню» в лаборатории, накачивая её токсичными фунгицидами и бактерицидами, подвергая себя воздействию чрезвычайно опасных химических веществ. Вот был случай, когда лаборант вошёл в помещение, основательно накачав его гермицидом на основе фенола (карболовой кислоты). Из-за высокой концентрации яда он потерял чувство опасности и через несколько минут испытал сильное затруднение дыхания, онемение конечностей и конвульсии. Эти симптомы продержались несколько часов, и он полностью не восстановился даже через несколько дней. А вот ещё был случай, один человек установил в рабочем главбоксе (см. ниже — прим. ред.) коротковолновую ультрафиолетовую (кварцевую) лампу и проводил инокуляции голыми руками в течение месяца даже не подозревая об опасности. Источник света такого типа может вызвать рак кожи после продолжительного воздействия. Существуют альтернативные способы и средства, не причиняющие или причиняющие незначительный вред здоровью и позволяющие бороться с контаминантами также, а иногда и более эффективно.

Если, несмотря на все ваши сверхусилия сохраняется высокий уровень контаминации, есть несколько дополнительных способов повышения стерильности. Первый, самый простой и недорогой, использует коллоидный раствор лёгкого масла распыляемый в воздухе лаборатории; второй включает в себя изготовление камеры с неподвижным воздухом, т. н. главбокс (glovebox — ящик с перчатками); а третий относительно дорог, т. к. требует использования высокоэффективных микронных фильтров.

1 — При распылении стерильного масла создаётся облако крайне вязких, маленьких капель. По мере оседания оно связывает все находящиеся в воздухе частицы. В этом способе используется триэтиленгликоль, испаряемый с поверхости подогреваемого тампона. Мелкодисперсный и более летучий, чем минеральное масло, триэтиленгликоль не оставляет сколько-нибудь заметной масляной плёнки. Использование триэтиленгликоля не отменяет стандартные меры по поддержанию гигиены.

2 — Главбокс — это воздухонепроницаемая камера, которая предоставляет условия для создания стерильной среды, в которой и проводится работа с культурами. Простейшая конструкция представляет собой ящик из фанеры, со смотровым окошком. В отверстиях для рук закрепляются перчатки, в которые вставляются руки. Иногда вместо перчаток передняя часть ящика прикрываются сменной хлопковой тканью, которую следует периодически стерилизовать. Главное преимущество главбокса заключается в том, что он, являясь уменьшенным в масштабе и недорогим подобием лабораторной комнаты, предоставляет удобный для чистки объём, в котором нет или почти нет движения воздуха и можно спокойно работать со стерильными культурами.

3 — Современные лаборатории решают проблему инфекциии переносимой по воздуху установкой высокоэффективных воздушных фильтров частиц (high efficiency particulate air (HEPA) filter). Эти фильтры задерживают все частицы диаметр которых превышает 0,1–0,3 микрона, т. е. меньше любых спор грибов и практически всех бактерий (суть там довольно проста, воздух продувается через наэлектризованную высоким напряжением многослойную пластиковую сетку или фильтр и вся пыль прилипает к ней — прим. ред.). НЕРА-фильтры встраиваются в т. н. ламинарные шкафы. В некоторых стерильных лабораториях из НЕРА-фильтров набирается целиком герметичная стена или потолок и через них подаётся внешний воздух. В результате внутри лаборатории создаётся позитивное давление, которое не даёт проникнуть нестерильному воздуху. Устройство и типы ламинарных шкафов подробно обсуждаются в приложении IV.

У некоторых культиваторов практически не возникает проблем, при том что они работают в, казалось бы, совсем примитивных условиях (быстрые движения натренированных рук и понимание сути действий позволяют достичь очень высокого уровня стерильности — прим. ред.). Другие испытывают явные проблемы с постоянными заражениями и им приходится вкладываться в высокотехнологичные устройства контроля окружающей среды. Каждые конкретные условия вынуждают принимать определённые контрмеры. И независимо от того выращиваете ли вы грибы дома или организовываете работу лаборатории, вы испытаете одинаковые трудности отличающиеся лишь в масштабах.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ АГАРА

Завершив обустройство стерильной лаборатории следующим шагом можно приступать к приготовлению питательного носителя на основе агара. Агар — это вырабатываемое из морских водорослей студнеобразующее вещество, наподобие, но несколько более эффективное, чем желатин. Существует много рецептов приготовления обогащённых агаровых носителей пригодных для разведения грибной культуры. Стандартными можно считать картофельный (Potato Dextrose Agar (PDA)) и солодовый (Malt Extract Agar (MEA)) агары, которые нередко дополняют дрожжами в качестве питательной добавки. В микологических журналах часто упоминаются агары на пептоне и неопептоне — два самых доступных источника протеина для грибного мицелия. Есть ещё один тип агара, который авторы рекомендуют, на бульоне от варки ржи или пшеницы с добавлением солодового сахара (или мальтоза — дисахарид, образованный двумя остатками глюкозы).

Если вы испытываете трудности связанные с инфицированием бактериями, то добавление антибиотиков в питательный носитель предотвратит их размножение. Большинство антибиотиков, таких как стрептомицин, разрушаются в процессе автоклавирования и, поэтому их следует добавлять в агар после стерилизации, пока он жидкий. Один антибиотик, сульфат гентамицина, выдерживает автоклавирование и эффективен против широкого круга бактерий. Антибиотики негативно влияют на мицелий некоторых видов грибов.

Десятки обогащённых агаровых сред были успешно использованы для культивации грибов и у каждого грибовода складываются свои предпочтения основанные на личном опыте. Независимо от типа используемой агаровой среды, важнейшей её характеристикой является pH — логарифмическая шкала, отмечающая уровень кислотности или щёлочности в диапазоне от 0 (кислота) до 14 (щелочь), где 7 нейтральный уровень. Различные виды Psilocybe предпочитают носитель сбалансированный между 6,0–7,0, тогда как Agaricus brunnescens и близкие к нему лучше растут в нейтральной среде. По большей части мицелий достаточно терпелив и хорошо растёт в промежутке 5.5–7.5 pH. О показателе pH стоит беспокоиться только тогда, когда на носителе не прорастают споры или рост мицелия чрезвычайно замедлен (придется запастись лакмусовыми бумажками для оценки pH — прим. ред.).

Ниже приведены несколько формул сбалансированных питательных сред обогащённого агара, в высшей степени пригодных для выращивания мицелия видов Agaricus, Pleurotus, Lentinus, Stropharia, Lepisia, Flammulina, Volvariella, Panaeolus и Psilocybe. Из приведённых формул авторы предпочитают две: PDY (картофельный с декстрозой и дрожжами — Potato Dextrose Yeast) и MPG (зерновой с солодом и пептоном — Malt Peptone Grain) агаровые составы. Добавлением в любому составу молотой ржи или зернового экстракта можно добиться преобладающего роста нитевидного мицелия, т. е. наиболее предпочитаемого за его быстрый рост.

Выберите формулу, смешайте ингредиенты в сухом виде, поместите всё в мерную чашку и добавляйте воду пока не получите литр состава (дайте агару набухнуть перед стерилизацией — прим. ред.).

(избегайте использования тёмного пивного карамелизованного солода, требуемый солод именно светлого, слегка подрумяненного цвета, более сыпучий и нелипкий)

(Прим. ред.: Если агар не удастся достать или купить, например, у китайцев, то можно попробовать взять цветной мармелад. Его следует измельчить и отмыть от всех пищевых добавок, выдерживая в воде несколько дней, периодически, несколько раз в день, меняя воду. Затем высушить.)

Для задерживания роста бактерий на каждый литр воды до стерилизации можно добавлять 0,1 гр 60–80 % сульфата гентамицина (см. Приложение VII).

Качество воды, её pH и минеральный состав отличаются в зависимости от региона. Если качество вашей воды находится под сомнением, рекомендуем использовать дистиллированную воду. Для практических нужд, тем не менее, сгодиться и вода из водопровода, без особого вреда для мицелия. В некоторых случаях сбалансированный уровень pH важен, например, для проращивания спор или разведения мицелия экзотических видов грибов. Изменить pH носителя можно добавляя в него по капле соляной кислоты (HCL) или каустическую соду (NaOH) (вероятно сойдет уксус и пищевая сода — прим. ред.). Затем основательно перемешав состав, нужно снова измерить его уровень pH. (pH соляной кислоты — 0; pH каустической соды — 12; pH дистиллированной воды — 7).

Тщательно смешав все ингредиенты стерилизуйте состав в скороварке в течении 30 минут при давлении в 1,05 атм (15 psi).

(Скороварка является безопасным и эффективным средством стерилизации субстратов при условии использования строго в соответствии с инструкцией производителя — многие производители настолько помешаны на безопасности скороварок, что из-за всех их причиндалов, их скороварки вообще никуда не годятся, но изображенная на фотографии является неплохой — прим. ред.). Для автоклавирования агара рекомендуем использовать колбу с узким горлом. Если у вас нет специально приспособленного для этого сосуда, подойдёт любая похожая по форме бутылка.

Обязательно заткните горлышко ватным тампоном и прикройте сверху фольгой до помещения в скороварку.

Колбу можно наполнить только на 2/3-3/4 от полного объёма.

Наполненный сосуд поместите в скороварку налив достаточное для образования пара количество воды. (Обычно достаточно 1 см от дна). Приведите скороварку в рабочее состояние следуя инструкции производителя. Поставьте её на огонь и дождитесь появления густой струи пара. Выждав 4–5 минут закройте паровой клапан. Медленно поднимите давление до 1,05 ат (15 psi) и поддерживайте его в течении получаса. Не позволяйте температуре подниматься выше 121 °C, в противном случае сахар в агаровой среде карамелизуется. Карамелизованный сахар в носителе подавляет рост мицелия и повышает вероятность генетических мутаций.

В лаборатории следует иметь стерильную тряпичную ухватку или кусок свежевыстиранной ткани для удобства обращения с горячей посудой с агаром.

Время необходимое для стерилизации разнится в зависимости от высоты над уровнем моря. В неизменном объёме существует прямая зависимость между давлением и температурой (известная как закон Бойля-Мариотта). Когда рекомендуется определённое давление (равно как и температура), оно основано на стандартной высоте над уровнем моря. Культиваторам, проживающим в местах расположенных значительно выше уровня моря (например на Эвересте — прим. ред.), придётся стерилизовать дольше и при более высоком давлении, чтобы достигнуть того же эффекта. Ниже приведена сокращённая таблица, показывающая зависимость между давлением и температурой, и изменение температуры закипания воды на различных высотах. Увеличивайте рекомендованное давление исходя из температуры кипения воды зависящей от вашего положения над уровнем моря. К примеру на высоте в 1,5 километра температура кипения воды снизится приблизительно на 5,5 °C. Это значит что давление необходимо увеличить до 1.4 ат (20 psi), т. е. на 0,35 от рекомендуемых 1,05 ат (15 psi). Смотрите в таблице требуемое давление при изменении температуры на 5 °C. (На самом деле температура остаётся прежней, а вот давление изменится).

http://sci.aha.ru/ALL/bl7.htm — зависимость температуры кипения воды от давления

Заметьте что эффект стерилизации получаемый при кипячении в течении 60 минут с давлением в 1,05 атм (15 psi) будет таким же от 30 минут с 2.1 ат (60 psi). Таким образом увеличение давления вдвое сократит время стерилизации вполовину. Но большинство скороварок не могут работать с таким давлением. Ещё некоторое время всё-таки стоит прибавить для достаточно хорошего проникновения пара в субстрат, особенно если используется большой и плотно Загруженный автоклав (Прим. ред.: Не морочьте голову, большинство скороварок рассчитано на 1 атм давления пара. Если стерилизуемое богато микрофлорой и спорами, то следует стерилизовать 1,5 часа. Если стерилизуемое нестойко к температуре — то 15 мин. В остальных случаях 30–60 мин.).

После стерилизации поместите скороварку в лабораторию или комнату с условиями близкими к стерильным и, до того как откроете, дайте давлению в ней выровняться с атмосферным (то есть дайте остыть немного, а то при открывании все закипит; наличие давления можно проверять, слегка открывая клапан скороварки — прим. ред.). Одним литром агара можно сполна залить 30 чашек Петри размером 100 х 15 мм. Способы разлива агара отличаются от грибовода к грибоводу. Если нужно разлить только одну или две стопки по десять чашек, их можно разложить на рабочем столе все рядом. Если необходимо приготовить больше чем две стопки или поверхность рабочего стола ограничена, тогда более удобно будет разливать, перемещая чашки из стопки в стопку.

Перед разливом энергично взболтайте колбу с расплавленным агаром для равномерного распределения питательных веществ. Опытные культиваторы наполняют чашки в темпе и без перерывов. Если разливаемый агар всё ещё очень горячий, на крышке чашки Петри может образоваться конденсат. Чтобы уменьшить количество конденсата, можете подождать некоторое время, перед тем как разливать агар. Если после того как давление выровняется скороварка постоит ещё 45 минут, то посуду с жидким носителем можно будет брать в руки не опасаясь обжечься.

От выбранного гриба можно получить два типа культуры: произвести новый мицелий из спор или клонировать живую ткань гриба (рекомендуем последний, как более стерильный — прим. ред.). Каждый из способов даёт в результате жизнеспособный мицелий. У обоих способов есть свои преимущества и недостатки. Большинство грибоводов начинают культуру из спор. Преимущество использования спор заключается в том, что они сохраняют всхожесть от недель до месяцев, после того как плодовое тело произведшее их разложилось. Другой путь получения культуры — вырезать кусочек ткани из внутренней части живого образца (на свежем, то есть стерильном, изломе — прим. ред.), в сущности клонировав его. Образец ткани для культуры необходимо взять в течение одного или двух дней, после того как гриб был сорван, иначе с каждым днём будет всё труднее получить здоровый клон мицелия (тем не менее удавалось клонировать грибы, купленные в магазине — прим. ред.).

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ ИЗ СПОР

Получение спорового отпечатка

Для того чтобы собрать споры отделите шляпку от ножки свежего, хорошо очищенного гриба и положите её пластинками вниз на лист чистой белой бумаги

Шили на чистую стеклянную поверхность, типа предметного стекла для микроскопа. Если шляпка частично высохла, добавьте каплю чистой воды для облегчения спороношения. Для уменьшения высыхания за счёт испарения и защиты от воздушных потоков накройте шляпку гриба чашкой или стеклом. Через несколько часов споры упадут в соответствии с радиальной симметрией гимениальных пластинок. Если вы использовали бумагу, вырежьте отпечаток, сложите пополам, положите в воздухонепроницаемый контейнер и надпишите дату, вид и номер сбора (или чашку Петри — прим. ред.). Если использовалось предметное стекло, то споры можно накрыть таким же стеклом и обернуть плёнкой во избежание проникновения спор контаминантов. Неаккуратно взятый или хранимый отпечаток, будет инфицирован (в этом и проблема — прим. ред.) и шансы на получение чистой культуры из него резко упадут.

Agaricus brunnescens, Psilocybe cubensis и многие другие виды грибов обладают частичной вуалью — тонким слоем ткани растягивающимся от краёв шляпки к ножке. Вуаль может помочь в получении спор почти свободных от контаминантов. Вуаль прикрывает пластинки снаружи, создавая практически стерильные условия внутри и споры можно получить не сильно опасаясь заражения. Выбрав молодой и здоровый образец с сохранившейся вуалью и затем убрав её в асептических условиях, можно получить практически чистый споровый отпечаток. Это идеальный путь для начала мультиспоровой культуры.

Способы проращивания спор

Получив отпечаток, можно начинать производство грибной культуры. Простерилизуйте инокуляционную петлю или скальпель поместив его в пламя спиртовки или бутановой горелки на пять или десять секунд, пока он не разогреется докрасна. (Если используется бутановая горелка, приберите её пламя до минимума, чтобы минимизировать перемещение воздушных потоков). Охладите скальпель, поместив его кончик в стерильную среду в чашке Петри, и затем соскребите немного спор с отпечатка. Перенесите их на агар проведя по его поверхности скальпелем. Подобного результата можно добиться потерев скальпелем по отпечатку, так чтобы споры сами упали в открытую чашку Петри (на снимке, вместо чашки Петри, используется подходящая банка — прим. ред.). Начиная культуру со спор, желательно заразить как минимум три чашки с агаром, чтобы получить хорошие шансы на всхожесть. Мицелий выращенный таким образом называется мультиспоровой культурой.

Только выпав из шляпки споры представляют собой влажные набухшие клетки с высоким процентом всхожести. С течением времени они высыхают, разрушаясь и сжимаясь ближе к центру, и им уже не так просто прорасти. Вероятность прорастания обезвоженных спор увеличивается после замачивания их в стерильной воде. Простерилизуйте в течении 30 минут при 1,05 ат (15 psi) пипетку или шприц и пробирку с водой или колбу Эрленмейера на 25-250 мл с горлышком заткнутым ватным тампоном (лучше ватной пробкой, делается также как для пробирок — прим. ред.) и накрытым алюминиевой фольгой. Возьмите немного спор на кончик скальпеля и опустите их в стерильную воду. Плотно закройте и дайте отстояться 6-12 часов. Выждав положенное время наберите немного воды со спорами в пипетку или шприц и проинокулируйте несколько чашек с агаром одной или двумя каплями. Помните о том, что споровый отпечаток обычно берётся в нестерильных условиях и таким способом вы даёте возможность прорасти не только грибным, но и спорам контаминантов.

Характерные признаки грибного мицелия

Независимо от способа инокуляции или проращивания, заражение на любых начальных стадиях станет заметно уже на сроке от трёх до семи дней. Прорастающие споры выглядят как нитеподобные состоящие из клеток волоски исходящие из точки происхождения. Эти ниточки мицелия поначалу серые и разрозненные вскоре становятся белыми по мере ветвления соединяются перемычками, разрастаются и распространяются по носителю.

Мицелий большинства видов, таких как Agaricus, Coprinus, Lentinus, Panaeolus и Psilocybe на вид имеет цвет от сероватого до белого. Другие виды имеют различную пигментацию мицелия. Мицелий Lepisfa nuda может быть заметно багрянисто-синим; у Psilocybe tampanensis часто разноцветный с уклоном в коричневые тона. Помните, однако, что цвет мицелия зависит даже от штамма или используемого типа субстрата. Другая сторона внешнего вида мицелия — это какой тип роста он показывает: воздушный или плотный, пушистый или корнеподобный. Воздушный мицелий может быть отличительной чертой вида или результатом избытка влаги. Плотный мицелий тоже может быть признаком вида или показателем сухих условий произрастания. Более детально типы мицелия обсуждаются ниже в подразделе о сегментировании.

После того как мицелий был определён как грибной, места произрастания спор следует перенести в новые чашки Петри с агаром. Таким образом, грибовод выборочно изолирует грибной мицелий, и вскоре получает чистую, свободную от заражений культуру. Если одновременно с мицелием на агаре появились признаки заражения, то участки с проросшим мицелием следует вырезать и удалить от колоний контаминантов. Т. к. большинство распространённых контаминантов это плесени размножающиеся спорами, будьте осторожны и постарайтесь не трясти ёмкость с культурой, и не делайте ничего, что могло бы рассыпать споры. Также перед тем как резать агар убедитесь, что скальпель охлаждён. Раскалённый скальпель при соприкосновении с агаром произведёт реактивный выброс пара, что в пределах пространства чашки Петри вызовет перемещение воздуха и рассеет споры соседствующих плесеней.

Ответвления мультиспоровой культуры

Мультиспоровая культура это наименее сложный способ получения жизнеспособного мицелия, но не абсолютно чистого штамма. Прорастая в большом количестве, споры фактически создают множество штаммов, некоторые из которых несовместимы с другими, обладают разными потенциалами роста и нуждаются в различных условиях для плодоношения. Такая смесь штаммов подавляет рост более активных из них. В целом штаммы, полученные из спор, с большой вероятностью наследуют свойства своих предков. Если родители быстро захватывали субстрат и хорошо плодоносили в лабораторных условиях, то можно ожидать схожего поведения и от потомства. Культуры же, полученные от дикорастущих образцов, но испорченные в искусственных условиях, обычно плодоносят плохо. Как и в случае с дикорастущими растениями, штаммы дикорастущих грибов необходимо совершенствовать селекцией.

Из многих штаммов получаемых из спор некоторые могут быть способны только на вегетативный рост. Такой мицелий может усваивать питательные вещества, но не способен образовывать плодовые тела (следствие генеративного роста). Клеточная сеть, растущая из единственной споры, называется монокариотической. Монокариоты не способны к производству спорообразующих плодовых тел. При встрече и слиянии двух совместимых монокариотов происходит обмен цитоплазматическим и генным материалом. Полученный в результате дикариотический мицелий уже может производить плодовитое потомство. Сетеобразное объединение ветвей различных дикариотических штаммов называется анастомоз. Такая рекомбинация возможна на любой стадии выращивания мицелия: на агаре, зерне, или уже в бедном субстрате. Подобные пересечения грибных штаммов аналогичны созданию гибридов в садоводстве.

Другой способ создания культуры заключается в выделении отдельных спор разбавлением в объёме стерильной воды. Далее эта споровая взвесь разводится ещё большим количеством стерильной воды, которое уже в свою очередь и используется для инокуляции чашек с носителем. В этом случае культиватор получает возможность наблюдать за отдельными монокариотами и самостоятельно управлять процессами слияния для выведения высокоурожайных штаммов.

Грибоводы, нуждающиеся исключительно лишь в получении жизнеспособных культур, эту технику могут опустить, т. к. их должно полностью удовлетворить мультиспоровое разведение. Но для тех, кто заинтересован в скрещивании монокариотических штаммов и изучении характеристик получаемых таким образом культур, этот метод окажется бесценным. Помните, что из сотни спор прорастает в среднем от одной до пяти. Штаммы и генетика штаммов более детально обсуждаются в Главе XV.

Наибольшая опасность в приготовлении концентрированных мультиспоровых взвесей скрывается в увеличенной вероятности заражения, особенно бактериального. Некоторые бактерии паразитируют на клеточных оболочках мицелия, тогда как другие стимулируют прорастание спор для дальнейшего перемещения и медленного переваривания самого мицелия. Поэтому некоторые штаммы нездоровы изначально и обычно ассоциируются с высоким уровнем заражений. При попытке прорастить споры в очень большом количестве, те из них, что уже инфицированы, увеличивают вероятность распространения болезни на соседние.

Многие грибы, тем не менее, образуют уникальные симбиотические связи с другими микроорганизмами. Как ни удивительно, некоторые бактерии и дрожжи стимулируют развитие спор, которые в случае стерильной культуры было бы сложно прорастить. Споры Cantharellus cibarius, обычной и высоко ценимой лисички, не прорастали в искусственных условиях, противостоя усилиям лучших микологов мира. Но относительно недавно шведский миколог Nils Fries (1979) установил, что при добавлении в среду активированного угля и красных дрожжей (Rhodotorula glutinis (Fres.) Harrison) споры вскоре успешно прорастают. (Использование активированного угля рекомендуется для любых грибов с затруднённой всхожестью спор.)

Многие грибоводы сообщают, что определённые культуры пышно разрастаются при случайном заражении или намеренном внесении бактерий. Было установлено что Pseudomonas putida, Bacillus megaterium, Azotobacter vinelandii и некоторые другие микробы оказывают схожий эффект на различные виды грибов — и на прорастание спор, и на рост мицелия или образование плодовых тел. (Curto и Favelli, 1972; использование этих бактерий рассматривается в Приложении III). Однако большинство контаминантов с которыми приходится сталкиваться при разведении грибов, перенесены ли они воздушным путём или уже находились на спорах, делу не помогают. Из всех конкурентов наиболее пагубны бактерии. Прилежное соблюдение норм лабораторной гигиены, использование НЕРА-фильтров и правильные методы лабораторной работы призваны справится с этой напастью.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ ИЗ ЖИВОЙ ТКАНИ

Культура из ткани является гарантированным способом сохранения соответствующих генетических признаков конкретного гриба. Мицелий, полученный из ткани, в точности клонирует образец, тогда как мультиспоровая культура образует новый штамм. Ткань для клонирования гриба необходимо брать в течении 24–48 часов с момента сбора. Выделение чистой культуры вызовет затруднения, если образец уже пролежал несколько дней, слишком сухой или перезрелый. С другой стороны споры сохраняются в течение долгого времени.

Так как весь гриб состоит из уплотнённого мицелия, то жизнеспособную культуру можно получить из любой части плодового тела гриба. Шляпка, верхняя часть ножки и/или область где пластинки соединяются с нижней частью шляпки, являются лучшими местами для иссечения чистой ткани. Шляпку некоторых грибов покрывает кутикула. Сорвав эту тонкую кожицу также можно взять ткань из мякоти расположенной под ней. Протрите поверхность гриба ватным тампоном смоченным в спирте и удалите всю грязь и повреждённую внешнюю ткань.

Надломите шляпку или ножку гриба, обнажая его внутренние гифы.

Незамедлительно разогрейте скальпель докрасна и остудите его в чашке Петри со средой. Теперь надрежьте мякоть и извлеките маленький кусочек ткани гриба. Перенесите этот фрагмент ткани в центр чашки Петри с питательной средой как можно быстрее, избегая продолжительного контакта, как ткани так и агара с открытым воздухом. Повторите все действия и поместите культуру ещё в три или ещё лучше пять чашек. Пометьте каждую чашку видом гриба, датой, типом культуры (ткань) и разновидностью агаровой среды. При благоприятном стечении обстоятельств по прошествии от трёх до семи дней рост мицелия будет очевиден.

10 % — это общесредний уровень заражений, с которым грибовод может смириться (да, начинающий — прим. ред.). Тем не менее в первичных культурах, когда образцы берутся от диких видов, не будет чем-то необычным уровень контаминации в 25 %. Разнообразные и красочные заражения появляются обычно недалеко от точки пересадки на агар. Количество появившихся контаминантов зависит от чистоты образца ткани или спор, а также от гигиенический условий лаборатории. В культуре клонированной из ткани гриба чаще всего встречаются бактериальные заражения.

Заражение это факт жизни каждого грибовода. Контаминанты только тогда становятся проблемой, когда их количество увеличивается сверх всяких разумных пределов, что можно считать признаком грядущей катастрофы в лаборатории. Если пять, десять или даже пятнадцать процентов можно считать нормальным уровнем контаминации для любого культиватора, то резкий скачок без каких-либо видимых изменений в условиях поддержания гигиены может стать причиной для поисков новых способов борьбы.

Как только ткань покажет признаки роста, её следует переместить в другую чашку. Если нет явных признаков заражения, то быстрая пересадка не столь необходима. Если по соседству уже развивается плесень и готовится выбросить споры, то культуру следует сразу же изолировать. Продолжайте переносить культуру, отделяя её от контаминантов, пока не получите чистый штамм. Очевидно, что выделить мицелий из частично заражённой культуры, гораздо сложнее, чем пересадить из чистой. Попытки изолировать мицелий от соседствующих контаминантов усложняются опасностью распространения их спор. К тому же незримо для нас, когда мы поднимаем крышку чашки Петри в неё врывается внешний воздух и споры плесени разносятся его потоками в атмосферу лаборатории. Таким образом, чем быстрее культиватор обретёт независимость от инфицированных чашек, тем скорее сможет вывести чистую культуру. Тем не менее помните, что не смотря на то что невооружённому глазу культура может казаться чистой, в ней всё ещё могут скрываться споры контаминантов. Присутствие затаившихся плесеней или бактерий в мицелии станет видимым только тогда, когда вы инокулируете им стерильное зерно.

Различные меры могут быть предприняты для минимизации уровня заражения в лаборатории. Мы уже обсудили применение распыляемого масла, НЕРА-фильтров и главбоксов. Но ваше личное отношение к заражению и чистоте в лаборатории много важнее любой её части. Авторам случалось видеть высокотехнологичные лаборатории с высоким уровнем контаминации и чуланы с относительно низким. Дадим два совета придерживаясь которых начинающие культиваторы должны преуспеть:

1. Приложите максимум стараний к первой попытке создания стерильной культуры. Всё должно быть чисто: лаборатория, одежда, инструменты и особенно сам культиватор (главное — это все-таки техника движений рук, ее нужно отрабатывать и совершенствовать, иначе вам даже НЕРА не поможет — прим. ред.).

2. Получив чистую культуру, примените максимум усилий для поддержания её чистоты. Сохраняйте только те чашки Петри, в которых нет признаков плесени или бактерий. Выбрасывайте все инфицированные чашки, несмотря на то что они могут быть заражены только частично.

Не отчаивайтесь, если столкнётесь с неудачей после первой попытки. Работа со стерильными культурами пойдёт просто и гладко, но только после некоторой практики, когда вы наберётесь немного опыта.

Работа с агаром это только первый шаг в разведении грибов. Для выращивания грибов сам по себе агар непрактичен. Его преимущества, для работы с грибной культурой, заключаются в возможности быстро разрастить мицелий из малейшего кусочка ткани. И достаточно легко поддерживать чистоту такой культуры, т. к. любое заражение легко заметить на плоской поверхности агаровой среды в чашке Петри.

СЕГМЕНТИРОВАНИЕ: СЕЛЕКЦИЯ И УЛУЧШЕНИЕ ШТАММОВ

Захватывая поверхность агара мицелий демонстрирует поразительное разнообразие форм. Некоторые культуры довольно однообразны на вид, тогда как другие поначалу проявляя полиморфность (неоднородность) позже неожиданно развиваются в гомогенный (однородный) мицелий. В этом природа мицелия — непрерывно изменяться и эволюционировать.

Мицелий называется сегментированным, когда, развиваясь из единственной точки инокуляции в разные стороны, он показывает разные типы роста. Сегмент определяется исключительно по внешнему виду, контрастирующему с окружающим преобладающим типом мицелием. Существует два основных типа роста мицелия: ризоморфный (корнеобразный, нитевидный) и войлочно-опушённый (ватный, облачками). К тому же встречаются и промежуточные типы линейного роста, ориентированные относительно радиальных направляющих (к стенкам чашки), но не имеющие выраженных скрученных нитей или переплетённых гифов характерных для ризоморфного типа роста. Ризоморфный мицелий более предрасположен к образованию примордий. Линейный мицелий тоже склонен к обильному образованию примордий, но делает это обычно после того как преобразуется в ризоморфный. Однако не забывайте о том, что характеристики внешнего вида плодоносящего мицелия так же зависят о разновидности гриба и могут немного отличаться от приведённых выше.

В чашке плотно поросшей ватным мицелием, веероподобная веточка жилистого мицелия будет называться ризоморфным сектором, и наоборот. Сегментирование очень часто встречается на культуре грибов, но так же очень мало известно о назначении и причинах появления сегментов. Очевидно, что большую роль в этом играют генетические свойства, возраст мицелия и состав питательной среды.

Согласно Stoller (1962) рост пушистых сегментов обусловлен присутствием в субстрате взорванных или сломанных зёрен, которые увеличивают содержание крахмала в носителе грибницы. Работая с Agaricus brunnescens Stoller заметил, что рост мицеля быстрее при высоких значениях pH (7,5), чем при отклонении pH в кислотность (6,5), но сегментирование случается чаще. Он выяснил что сегментирование на зерне можно сократить, уменьшив количество раскрывшихся Зёрен (результат наличия избыточной влаги), и понизив pH до 6,5 используя комбинацию мела (углекислый карбонат кальция) и гипса (сульфат кальция).

Коммерческие грибоводы давно заметили, что медленно растущий ватный мицелий уступает более быстрому ризоморфному. Существует несомненная зависимость между пушистым видом мицелия на агаре и последующим образованием «стромы», плотного сплетения гифов мицелия покрывающего кейсинг, через которое редко прорастают грибы. Кроме того, примордии чаще образуются на ориентированном на плодообразование ризоморфном, нежели на склонном к вегетативному росту ватном мицелии. И ещё один интересный факт: при наблюдении под микроскопом гифы ризоморфного мицелия выглядят более толстыми и менее разветвлёнными, чем у ватного.

Ризоморфный мицелий быстрее захватывает субстрат, образует больше примордий и в результате лучше плодоносит, чем пушистый мицелий. Это видно на Фото 37. Ломтик был пересажен на агар и из него выросли два различных типа мицелия. Сегмент с нитевидным ростом образовал многочисленные примордии, тогда как на ватном мицелии ничего не появилось — такое часто случается на агаре.

По мере роста мицелий постепенно начинает стареть. Стареющий мицелий, как и любое пожилое растение или животное, гораздо менее жизнеспособен и плодовит, чем молодой. Вообще превращение мицелия, из нитевидного в ватный, служит сигналом начала вырождения штамма. Если культура изначально ризоморфная со временем начинает сегментироваться, существует несколько способов предотвращения деградации штамма и сохранения ризоморфизма.

1. Производить пересадку только ризоморфных секторов и избегать ватных.

2. Регулярно меняйте питательный носитель, используя приведённые здесь формулы. Не желательно использовать одну и ту же агаровую среду, так как питательный состав носителя выборочно воздействует на возможность выработки различных пищеварительный ферментов грибным мицелием. Изменение компонентов среды позволяет сохранить широкую ориентированность пищеварительной системы и повысить выживаемость мицелия. Виды сильно отличаются по своим предпочтениям. И если у вас нет определённых данных на этот счёт, то вам придётся идти путём проб и ошибок.

3. Получив количество мицелия, необходимое для производства грибницы, верните штамм на хранение до следующего использования. Не ждите что мицелий, росший несколько лет при оптимальных температурах, сохранит свойства первоначальной культуры, из которой он был получен. Вследствие многочисленных делений клеток и непрерывных пересадок с большой вероятностью выделился подштамм, который имеет отдалённое сходство с жизнеспособностью, внешним видом и потенциалом плодоношения оригинала.

4. Если все усилия направленные на сохранение жизнеспособного штамма провалились, следует выделить новый из мультиспоровой культуры.

5. Другой альтернативой являются постоянные эксперименты с целью создания гибрида штаммов скрещивая дикариотические мицелии двух генетически отличающихся родителей. (Однако эксперименты с Agaricus brunnescens показали что большая часть гибридов плодоносит меньше, чем кто-либо из задействованных в скрещивании штаммов. И лишь меньшая их часть даёт хорошие урожаи.)

Домашние культиваторы могут выборочно развивать штаммы грибов выбирая мицелий по следующим нескольким признакам:

1. Ризоморфизм — быстро развивающийся и разрастающийся мицелий

2. Чистота штамма — отсутствие ватных секторов.

3. Чистота мицелия — отсутствие конкурирующих микроорганизмов (бактерий, плесеней и клещей).

4. Время задержки реакции в ответ на создание условий благоприятствующих образованию примордий.

5. Количество появившихся примордий.

6. Коэффициент прорастания появившихся примордий.

7. Размер, форма и/или цвет плодовых тел.

8. Общий урожай.

9. Сопротивляемость заболеваниям.

10. Чувствительность/переносимость С02.

11. Температурные ограничения.

12. Простота сбора урожая.

Используя эти характерные особенности, грибные селекционеры могут разумно оценивать качество штаммов, и со временем научатся выбирать из них те, которые наилучшим образом соответствуют их предпочтениям.

ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР: СПОСОБЫ КОНСЕРВАЦИИ ГРИБНЫХ ШТАММОВ

Получив чистый изолированный штамм, благоразумным решением будет сохранить его путём консервации. Консервированные культуры или как их обычно называют «скосы» — это стеклянные пробирки наполненные стерильным носителем и проинокулированные мицелием. Подходящий размер пробирки для хранения культур 20x100 мм, с плотно подогнанной пробкой. У каждого опытного культиватора имеется своя коллекция культур называемая «банк видов». Банк видов является неотъемлемой частью процесса разведения грибов. С его помощью грибовод может сохранять штаммы годами.

Для приготовления скосов сначала смешайте компоненты агаровой среды, используя обсуждавшиеся выше в этой главе формулы. Наполните пробирки на треть от их высоты, заткните ватным тампоном и накройте алюминиевой фольгой, или просто закройте пробкой подходящего размера. Стерилизуйте в скороварке 30 минут при давлении в 1,05 атм (15 psi). Дождитесь пока давление в скороварке сровняется с атмосферным и переместите её в стерильную комнату не открывая. Достаньте пробирки, мягко взболтайте их для равномерного распределения питательных веществ и расположите их под углом 15–30 градусов до охлаждения и затвердевания.

По мере готовности проинокулируйте скосы фрагментами мицелия. Пометьте каждую пробирку датой, типом агара, видом и штаммом. Для подстраховки сделайте как минимум три скоса на каждый штамм. Инкубируйте в течении недели при температуре 24 °C. Как только мицелий покроет основную поверхность агара и на поверку окажется свободным от заражений, помещайте на хранение при температуре 2–4 °C. При таких температурах снижается метаболическая активность большей части мицелия и практически прекращается поглощение питательных веществ. В идеале неплохо бы проверять жизнеспособность хранимого мицелия каждые полгода, высаживая его фрагменты в новые чашки Петри. После того как мицелий захватит 2/3 поверхности носителя в чашке, отберите сильный (ризоморфный) мицелий и проинокулируйте новые скосы. Подпишите и храните их пока они вам не понадобятся. Зачастую, проращивание такой миникультуры становится хорошей проверкой хранимого штамма на всхожесть и плодовитость.

Превосходным способом сохранения культур является передача дубликатов видов и штаммов знакомым коллегам культиваторам. Штаммы грибов теряются, иногда с большей лёгкостью, чем от них того ожидают. А, потеряв, вы никогда уже не сможете их вернуть.

Вышеописанный метод помогает надёжно сохранять культуры в большинстве случаев. Тем не менее, некоторые алчные культиваторы с лёгкостью могут обзавестись пятидесятью, а то и сотней штаммов и необходимость постоянного поддержания их жизнеспособности может стать утомительной и обременительной. Когда библиотека культур разрастается до таких объёмов, существует несколько дополнительных мер позволяющих увеличить срок хранения штаммов.

Простейший способ консервации культур на долгий срок использует тонкий слой стерильного минерального масла наносимого на живой мицелий после его прорастания в пробирке. Минеральное масло не токсично для мицелия, сильно снижает его метаболизм и препятствует испарению влаги из агаровой основы. После этого культура хранится при 3–5 °C до востребования. Недавние исследования (Perrin, 1979) показали, что все 30 видов грибов хранимых под минеральным маслом на протяжении 27 лет произвели живой мицелий. Для возобновления штаммов скосы были перевёрнуты вверх ногами для того чтобы стекло масло, и затем инкубированы при 25 °C. В течение трёх недель каждый скос показал обновлённые признаки роста и, будучи перенесёнными на агар, дали незаражённые культуры.

Четыре других способа консервации включают: погружение скосов в жидкий азот (дорогостоящая процедура); инокуляция стерильного компоста на основе конского навоза и соломы с последующим хранением при 2–3 °C (см. Главу V о приготовлении компоста); инокуляция носителя на основе опилок и отрубей мицелием грибов предпочитающих дерево (см. Главу III об альтернативных носителях мицелия); или хранение спор в тёмном прохладном месте — возможно наипростейший способ для домашних культиваторов.

Независимо от используемого способа консервации помните, что для грибов естественно плодоносить, спорулировать и развиваться. Методы культивации должны развиваться вместе с грибами и культиватор должен выборочно изолировать и поддерживать многообещающие штаммы по мере их появления. Так что не удивляйтесь, если спустя пять лет хранения, штамм слабо похож на оригинальный по характеристикам плодоношения и форме.

РАЗВИТИЕ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ЗЕРНОВОЙ ГРИБНИЦЫ

Зерновая грибница используется для инокуляции приготовленного субстрата. Она состоит из материала-носителя полностью колонизированного мицелием. Тип носителя зависит от вида культивируемых грибов, хотя большинство изготовителей зерновой грибницы выбирают рожь. История развития способов приготовления инокуляционного материала для выращивания Agaricus brunnescens наглядно демонстрирует прогресс в этой области за последние 100 лет.

В 19 веке культиваторы Agaricus получали инокуляционный материал собирая его в естественных условиях произрастания. Далее такую «девственную грибницу» дополняли такими же естественными питательными материалами, в данном случае конским навозом. Также иногда использовался отработанный субстрат от предшествующих заходов. Такого рода инокуляционный материал содержал большое количество контаминантов и паразитов, в результате урожай получался небольшим. Для перехода к более серьёзному, коммерчески выгодному выращиванию грибов необходимо было разработать методики гарантирующие получение качественного мицелия в больших количествах.

Появление техник работы с чистой культурой, размножение мицелия путём проращивания спор или клонирования ткани грибов сменило собой использование дикорастущей грибницы. С этого момента культиваторы смогли быть уверенными не только в качестве инокуляционного материала, но и с некоторой долей достоверности прогнозировать свойства штамма. Впервые в истории появилась возможность селекции и развития высокоурожайных штаммов благодаря возможности сохранения культуры на специально приготовленном субстрате. Стерилизованный, мелкопорубленный компост стал наиболее предпочитаемым носителем исходной чистой культуры и на годы вперёд стал стандартом индустрии производства Agaricus.

В 1932 г. доктор Джеймс Синден запатентовал процесс приготовления инокуляционного материала использующий зерно как носитель мицелия. С тех пор наиболее используемым зерновым злаком стала рожь, хотя также использовали и просо, и пшено, и пшеницу. Новаторский подход Синдена установил новый стандарт изготовления зернового мицелия и сформировал базу современной индустрии. Ощутимое преимущество зернового мицелия заключается в увеличенном количестве точек инокуляции. Каждое отдельное зёрнышко становится такой точкой, от которой может разрастаться мицелий. Таким образом, литр грибницы на ржи, содержит приблизительно 25 тысяч зёрен, и представляет собой неоспоримое превосходство над более грубым инокуляционными материалами.

Ниже перечислены злаковые крупы пригодные для приготовления грибницы. Непосредственно за этим списком следует таблица, иллюстрирующая некоторые физические свойства важные для приготовления субстрата.

РИС: используют немногие культиваторы, даже придерживаясь правильных уровней влажности трудно избежать слипания отдельных зёрен, в виду клейких свойств внешнего покрытия

ПРОСО: хотя предоставляет большее количество точек инокуляции, чем рожь, немного сложнее на его основе изготовить носитель грибницы. Amycel (компания изготовитель зерновой грибницы) разработала формулу приготовления проса и использует его как основной носитель для приготовления коммерческих образцов субстрата.

СОРГО: обладает зёрнами круглой формы и работает относительно неплохо как носитель грибницы, но его сложно раздобыть.

ПШЕНИЦА: одинаково хороша для приготовления грибницы и выращивания плодовых тел.

СЕМЕНА ПЫРЕЙЯ и РАЙГРАСА (знать бы, что это такое — прим. ред.): оба обладают большим количеством ядрышек на грамм, чем зерно. Минусы использования этих семян заключаются в их склонности терять влагу и неспособности разбиваться на отдельные ядрышки, отчего их сложно встряхивать (семена пырейя и райграса широко используются для развития склероций Psilocybe tampanensis, Psilocybe mexicana и Psilocybe armandii. Могут быть использованы годовалые и многолетние семена, хотя годовалые более дёшевы. Дополнительные параметры по этим видам грибов смотрите в 11-й главе этой книги)

РОЖЬ: доступность, низкая стоимость и хорошая способность разделятся на отдельные зёрна, являются свойствами, позволяющими рекомендовать её для использования в качестве субстрата для выращивания мицелия и плодоношения.

В одном единственном грамме с/х ржи (Secale cerealе) по приблизительным оценкам количества отдельных клеток присутствуют 50'000–100'000 бактерий, более 200'000 актиномицетов, 12'000 грибков и плесеней, а также большое количество дрожжей. Таким образом стерилизация уничтожает приблизительно 300'000 контаминантов! В банке с зерном, весом превышающим сто грамм, с добавлением воды количество клеток в популяциях живых организмов достигает астрономических высот. Из всех десяти групп таких организмов бактерии являются наиболее пагубными. В таких условиях одна единственная бактерия размножается до более чем миллиона экземпляров за менее чем десять часов. Ещё за десять часов каждая из этих бактерий произведёт ещё по миллиону копий.

Если только маленькая толика всех этих микроорганизмов переживёт стерилизацию, они смогут превратить зерно в бесполезную массу всего за несколько дней.

Большинство микроорганизмов уничтожаются во время стерилизации. Для жидкостей стандартное время паровой стерилизации составляет 25 минут при давлении в 1,05 атмосферы или 15 psi (120 °C). Для твёрдых объектов, таких как рожь, время стерилизации следует увеличить, чтобы позволить пару проникнуть во все воздушные карманы и впадины свойственные структуре зёрен. В пределах этих углублений бактерии и другие термостойкие организмы, будучи защищены от разрушающего воздействия пара, получают лучшие шансы пережить короткий период стерилизации, нежели долгий. Следовательно, полный час — это минимально рекомендуемое время стерилизации банок с зерном.

Некоторые партии зерна имеют необычайно высокое содержание бактерий и плесеней. Уровень контаминации такого зерна остаётся относительно высоким даже после автоклавирования перед инокуляцией. От такого материала стоит немедленно избавиться и заменить его зерном известного качества.

После того как зерно было простерилизовано можно считать, что все конкуренты нейтрализованы. Следующим наиболее вероятным источником контаминации может послужить воздух, непосредственно окружающий банки. По мере того как банки остывают они засасывают воздух вместе с воздушными контаминантами. Если содержание вредоносных спор во внешней среде достаточно высоко, некоторые из них будут внесены в субстрат ещё даже до первой инокуляции! В обычной комнате в одном кубическом метре содержится приблизительно 350'000 частиц, размер которых превышает 0,3 микрона (это пыль, споры и пр.), тогда как в «стерильной» лаборатории приблизительно 3'500. Зная об этих фактах, вы можете провести ещё две следующих процедуры, которые позволят снизить шанс заражения:

1. Если вы стерилизуете зерновой субстрат вне лаборатории в нестерильных условиях (на кухне к примеру), не забудьте начисто вымыть скороварку до того как перенесёте её в стерильную инокуляционную комнату.

2. Инокулируйте банки, как только они достигнут комнатной температуры, несмотря на то, что многие культиваторы оставляют банки на ночь в скороварке, это является нежелательным.

Объём воды, добавляемый в зерно, является очень важным фактором влияющим на вероятность заражения. Излишняя влага в банке с грибницей способствует размножению бактерий и других конкурентов. На влажном зерне грибной мицелий уплотняется и замедляется в росте. Переувлажнённые зёрна взрываются в процессе стерилизации, а внутренняя часть зерна ещё больше подвержена заражению. Также влажное зерно, сплетённое мицелием, слипается и его трудно разделить между собой. Когда такое зерно вступает в контакт с нестерильными субстратами, например компостом, оно чаще становится причиной заражения. С грибницей, уровень влажности которой сбалансирован, таких проблем не возникает. Она легко разделяется на отдельные зерна, покрытые мицелием, увеличивая тем самым количество точек инокуляции, каждая из которых становится источником роста сети мицелия.

Определить точную влажность зерна несложно. Единожды высчитав её для имеющегося зерна, культиватор будет точно знать какое количество воды надо добавить в зерно. Находящаяся в продаже рожь для проращивания содержит 11 % воды от общей массы (±2 процента). Точное содержание влаги в зерне можно просто подсчитать, отняв вес зерна просушенного в духовке (3 часа при 120 °C) от исходного его веса. Полученная цифра и есть естественная доля влаги в зерне.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЗЕРНОВОЙ ГРИБНИЦЫ

Оптимальная влажность зерна для приготовления субстрата для грибницы находиться между 49–54 %. Нижеследующие составы используют хлебную рожь, обычная влажность которой составляет 11 %. Следует ожидать некоторых отклонений зависящих от производителя, размера ядра, географии произрастания и условий хранения зерна.

Стандартными ёмкостями для грибницы для домашнего культиватора можно считать литровые банки, а для крупных производителей 4-х литровые. Домашние культиваторы также широко использовали банки с широким горлом, благодаря нескольким книгам популяризирующим плодоношение прямо в этих банках. Предполагалось, что из банок с широким горлом урожай собирать легче, чем из обычных. Но не только этот метод непрактичен как устаревший, но и банки с широким горлом имеют несколько серьёзных недостатков и, таким образом, не могут быть рекомендованы к использованию. Стандартные банки с узким горлом дают воздушным контаминантам меньше возможностей проникнуть внутрь и на их крышках проще использовать синтетические фильтрующие диски. Назначение контейнера для грибницы — дать временный приют и создать благоприятные условия для развития мицелия, до того как он будет выложен в лотки или использован для инокуляции бедных субстратов. Банки не очень хорошо подходят для использования в качестве контейнера при плодоношении. Многие промышленные производители грибницы используют синтетические диски в качестве фильтров, которые обеспечивают проникновение воздуха и свободный газообмен, но задерживают вредоносные споры. Домашние же культиваторы используют не полностью закрученные резьбовые крышки, которые пропускают некоторое количество воздуха. Такой способ неплохо работает в условиях близких к стерильным, но не обеспечивает никакой защиты. Лучшим вариантом была бы крышка с просверлённым в ней отверстием диаметром 9-12 мм, прикрытым фильтром (лучше с отверстием побольше, заткнутым ватной пробкой — прим. ред.). Лично авторы находят использование 2 л банок идеальным вариантом. (Заметьте, что такие банки следует инокулировать путём переноса зерна из мастер-банки — техника, которая будет объяснена ниже в данной главе). Использование фильтра на весь размер крышки у банок с широким горлом не рекомендуется, в связи с повышенным уровнем испарения влаги из зерна.

Чтобы получить зерно с влажностью 48–52 % используйте смеси, приведённые ниже, и автоклавируйте в скороварке 1 час при давлении 1,05 атмосферы (15–18 psi). Примите во внимание, что столовые мерные чашки не достаточно точны и ошибка может достигать 10 % от объёма. Проверьте вашу мерную чашку специальным градуированным цилиндром. Выяснив точность, используйте мерную чашку для зерна и мерную чашку для воды для соблюдения пропорций приведённых ниже:

СМЕСИ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЗЕРНА

Данные смеси позволяют добиться заполнения банки на 2/3 после автоклавирования. В качестве добавки к этим формулам можно использовать мел/известь (СаСО₃) и гипс (CaSО₄) в пропорции 1–3 части по весу к 100 частям зерна (сухой вес). Соотношение мела и гипса 1:4. Добавление этих ингредиентов в субстрат опционально для большинства видов, но необходимо при выращивании Agaricus brunnescens. В варианте с использованием известкового буфера к формулам стоит добавить ещё 10 % воды.

После того как заполненные по формуле банки были автоклавированны, их следует перенести в стерильную комнату и остудить до комнатной температуры.

До момента внесения банок в стерильную комнату окружающий воздух следует обеззараживать используя стандартные методы дезинфекции или НЕРА-фильтры (или и то и другое).

Вынув банку из скороварки или автоклава её следует перетряхнуть для того чтобы разрыхлить зерно и перемешать сухие и влажные зёрна. Перетряхивание также позволяет избежать слипания зерна на дне банки.

Превосходным инструментом упрощающим процедуру перетряхивания может послужить лысая автопокрышка или обитый стул. Тщательно очищенная и продезинфицированная шина должна быть установлена в вертикальное и устойчивое положение. Поверхность покрышки идеально подходит для соударения при перетряхивании, уменьшает дискомфорт для рук и позволяет избежать травм, если банка разобьётся. Шина будет использоваться и на других стадиях развития зерновой культуры, так что мойте её регулярно. В тех же целях промышленные производители зерновой грибницы используют мешалки для краски, но это неприемлемо в домашних условиях.

Когда банки достигли комнатной температуры можно начинать инокуляцию зерна мицелием с агара. Ещё раз: очень важно соблюдение хорошей гигиены. При переносе мицелия с агара на зерно добавляется ещё одно измерение в котором могут распространятся контаминанты. На агаре мицелий захватывает двухмерную плоскую поверхность и легко заметить заражение, если оно присутствует. На зерне в игру вступает добавляемое измерение глубины и контаминанты становятся более неуловимыми, часто ускользающими от распознания даже внимательным и проницательным глазом. Не будучи замеченными, контаминанты получают возможность распространится, когда данной грибницей будет инокулировано новое стерильное зерно.

Перед проведением пересадки примите все предосторожности и убедитесь в стерильности окружающей среды, в которой проводится инокуляция. После чистки комнаты не рискуйте её чистотой, входя в неё в грязной одежде. К сожалению лишь немногие культиваторы принимают во внимание тот факт, что они сами являются главным источником инфекции. На самом деле само человеческое тело суть среда, кишащая бактериями и микроскопическими клещами, усеянная спорами плесеней и семенами растений.

Только убедившись, что соблюдены все условия чистоты, можно приступать к производству грибницы.

Инокуляция стерильного зерна культурой на агаре

Выберите чашку с наиболее интенсивно растущей культурой, чей мицелий покрывает не более 3/4 поверхности агара. Следует избегать культур, которые полностью захватили поверхность чашки Петри, т. к. чаще всего контаминанты проникают в зазор между половинками чашки. Если внешние края заросли мицелием, эти захватчики могут проникнуть незамеченными. Так как периферийный мицелий засорён спорами контаминантов, любое зерно инокулированное им будет испорчено.

Простерилизовав скальпель в пламени горелки вырежьте треугольный ломтик агара покрытый мицелием, так как это описано в технике пересадки с агара на агар. Осторожно, отточенным и быстрым движением перенесите ломтик в ожидающую банку с зерном, как можно меньше держа её открытой. Прокаливая скальпель перед каждой пересадкой, инокулируйте ломтиком мицелия сколько вам угодно банок. Чашки Петри на две трети покрытой мицелием, должно хватить на 6–8 литровых банок с зерном (максимально возможное количество: 10–12 банок). Чем больше пересажено мицелия, тем быстрее колонизация и меньше шансы заражения.

С этого момента банки содержат в себе «мастер-культуру» и вы должны сделать всё возможное, чтобы гарантировать высочайший уровень её чистоты.

Авторы рекомендуют использовать технику «двойного ломтика», в которой исходный треугольник разрезается ещё на две части, и будучи насаженными на скальпель переносятся в ожидающую банку со стерильным зерном. Банки инокулированные данным методом зарастают гораздо быстрее, нежели при переносе целого ломтика.

Ослабление крышки банки перед инокуляцией облегчает быструю пересадку. По мере завершения каждого переноса с агара на зерно, закрывайте крышку и переходите к следующей инокуляции. Обработав таким образом всю партию, плотно заверните крышки и тщательно встряхните каждую банку для равномерности распределения ломтиков с мицелием. В ходе тряски ломтики перемещаются через массу крупы оставляя везде фрагменты мицелия прилипающие к зёрнам. Если ломтик прилипнет к стеклу, распределение затруднится и распространение мицелия задержится. Данная проблема указывает на то, что агар был налит в чашки слишком тонким слоем или пересушен. Встряхнув, инкубируйте грибницу в банках при температуре свойственной виду (повторное перетряхивание может потребоваться на 4-й или 5-й день). Чаще всего мицелий должен полностью колонизировать банки за 7-10 дней.

Инокуляция зерна мастер-культурой

Будучи полностью колонизированными эти мастер-банки могут быть использованы для дальнейшего производства зерновой грибницы в литровых или 2-х литровых контейнерах. Пересадку мастер-культуры следует произвести в течении нескольких дней после полной колонизации банок, в противном случае могут возникнут трудности с разделением грибницы на отдельные зёрна. Ниже приведено пошаговое описание техники пересадки с зерна на зерно:

1. Тщательно исследуйте каждую банку на наличие признаков заражения. Обратите внимание на следующие отклонения: слишком плотное зарастание; участки со слабым или подавленным ростом; зёрна покрытые слизью или выглядящие мокрыми (признак бактериального заражения); лопнувшие зёрна с мертвенно-бледной, неровной поверхностью; и любые необычные оттенки цвета. В случае возникновения сомнений слегка приподнимите крышку и понюхайте грибницу — кислый запах «гнилого яблока» или же сильный душок обычно являются признаками бактериальной деятельности или заражения плесенью. От банок с таким ароматом следует избавиться. (Иногда банки только частично поражённые бактериями можно использовать для плодоношения, нанеся покровный слой). Никогда НЕ используйте подозрительные банки для последующих инокуляций.

2. Выбрав самые красивые банки с мастер-грибницей, разбейте мицелий ударяя банки о шину или похлопывая ладонью. Грибница должна легко разделиться на отдельные зёрна. Встряхните столько мастер-банок сколько вам может потребоваться, учитывая что каждой из них вполне достаточно для инокуляции от десяти до двенадцати литровых или от семи до девяти двухлитровых банок. Перетряхнув, ПОСТАВЬТЕ ЭТИ БАНКИ С ГРИБНИЦЕЙ НА ОТДЕЛЬНУЮ ПОЛКУ И ВЫЖДИТЕ ОТ ДВЕНАДЦАТИ ДО ДВАДЦАТИ ЧЕТЫРЁХ ЧАСОВ ДО ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ. Этот период выжидания очень важен, т. к. в некоторых из них грибница не сможет развиваться дальше, обычно по причине бактериального заражения. Если бы эти банки были использованы для дальнейших пересадок, заражение разнеслось бы ещё на десять банок.

3. Повторно проинспектируйте банки на признаки контаминации. После 12 ч или суток мицелий снова покажет признаки роста.

4. Если вы перетряхнули мастер-банки вечером, то наутро уже можно приступать к инокуляции или как только остынут новые банки с зерном (второе поколение, G-2). Опять, вымойте лабораторию, проведите комплекс мер в рамках личной гигиены и наденьте свежевыстиранную рабочую одежду.

Поместите 10 стерилизованных банок с зерном на рабочую поверхность в стерильной комнате. Ослабьте крышки на каждой из них так, чтобы они легко снимались одной рукой. Мягко встряхните мастер-банку чтобы зерно рассыпалось и разделилось на отдельные зёрна. Держите банку с мастер-культурой в вашей основной руке, другой рукой удалите её крышку и откройте крышку первой банки для инокуляции. Покручивая мастер-банку из стороны в сторону отсыпьте десятую часть грибницы в первую банку, накройте её крышкой и переходите ко второй, третьей, четвёртой и так пока не проинокулируете всю партию. Закончив с первой партией накрепко заверните все крышки. Заверните крышку и на пустой уже мастер-банке и поставьте её в сторону. По очереди возьмите каждую проинокулированную банку и, чередуя потряхивание и вращение, распределите мицелий равномерно по всей банке.

5. Инкубируйте при температуре присущей культивируемому виду. Уже через неделю мицелий должен распространиться на всё зерно. Пометив эти банки как G-

2, можете использовать их для дальнейших инокуляций, как грибницу для внесения в бедные субстраты или для плодоношения прямо с зерна.

Некоторые виды менее агрессивны, чем другие. У Agaricus brunnescens, к примеру может уйти до двух с половиной недель на колонизацию зерна, в от время как Psilocybe cubensis может управиться за неделю или дней десять. Как раз на этом этапе и может снова пригодиться помощь автопокрышки для перетряхивания субстрата в банках. Расписание перетряхивания для медленнорастущих видов приходится на 5-й и 9-й дни после инокуляции. Банки следует инкубировать в условиях близких к стерильным при температуре наиболее подходящей для культивируемого вида (см. главу XI).

После пересадки мицелия с агара на зерно, можно переходить от этих зерновых культур к получению большего количества банок с грибницей. Серия переносов мицелия начиная с мастер-банок, помеченных как G-1, через ещё два «поколения» банок (G-2 и G-3, соответственно), позволяет добиться экспоненциального наращивания массы мицелия. К примеру, если с агаровой культуры было инокулировано 10 банок (G-1), в дальнейшем с их помощью можно произвести инокуляцию ещё 100 банок (G-2), которые в свою очередь дают ещё 1000 банок (G-3). Совершенно очевидно, что чистота первой партии банок должна быть безупречной, т. к. в конечном счете, с её помощью будет проинокулировано ещё 1000 банок! Не рекомендуется продолжать инокуляции за пределы третьего поколения. На самом деле если уровень потерь по причине заражений превысит 10 %, то второе поколение должно стать последним. Полученные культуры можно использовать для заражения бедных субстратов или непосредственно укладывать в лотки под покровный слой для плодоношения. Перенос с зерна на зерно (G2G) является наиболее эффективным способом производства грибницы. Этот метод предпочитают большинство лабораторий занимающихся культивированием пластинчатых (agaricus) грибов. В свою очередь зерновая грибница второго или третьего поколения продаётся простым фермерам и культиваторам, которые используют её для оплодотворения своего компоста. Пересадка с зерна на зерно, при производстве большого количества грибницы, по скорости и лёгкости во много раз превосходит инокуляцию зерна непосредственно с агара. Тем не менее, любой культиватор должен возвращаться к агаровой культуре в целях сохранения и поддержания чистоты штамма.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ НОСИТЕЛИ ГРИБНИЦЫ

Некоторые виды грибов на зерне растут не очень хорошо и им больше подойдут альтернативные носители грибницы. Другие грибы не растут на зерне вовсе. К примеру такие обитающие на деревьях грибы как Lentinus edodes и Flammulina velutipes предпочитают опилки и отруби в качестве субстрата. Ещё один вид носителя состоит из отрубей и перлита. Перлит это стекловидный камень разогретый свыше 500 °C и взорванный как попкорн. Тонкие хлопья отрубей легко стерилизуются, в то время как перлит создаёт структуру смеси. Рецепты приготовления следующие:

Замочите опилки в воде как минимум на двадцать четыре часа. Дайте стечь воде затем тщательно смешайте с отрубями. Если смесь обладает правильным уровнем влажности, то при сжатии в кулаке выделится только несколько капель воды. Плотно наполните доверху контейнер (с широким горлом) субстратом. Японские производители грибницы делают в субстрате по центру отверстие до дна, которое впоследствии заполняют инокуляционным материалом. Стерилизуйте 60–90 минут при 1,05 атм (15 psi). После остывания инокулируйте агаром, жидкой эмульсией или зерном. Полностью колонизированная ёмкость с грибницей на опилках с отрубями может быть также использована для дальнейших инокуляций.

Просейте перлит чтобы удалить из него пыль и мелкий мусор. Наполните контейнер (с узким горлом) сухими ингредиентами и хорошо смешайте. Добавьте воду и продолжайте перемешивать пока ингредиенты не увлажняться полностью. Стерилизуйте час при 1,05 атм (15 psi). Инокулируйте агаром или жидкой эмульсией.

МЕТОДЫ ИНОКУЛЯЦИИ ЖИДКОСТЬЮ

Способ инокуляции зерна взвесью измельчённого грибного мицелия в стерильной воде обладает высокой эффективностью. Эта насыщенная мицелием смесь содержащая сотни коротких клеточных цепочек впрыскивается в банку со стерильным зерном. По мере того как эта жидкость просачивается через зерно, каждый из равномерно распределённых фрагментов мицелия становится точкой инокуляции. В течении нескольких дней видимые признаки роста могут не появиться или рост будет слабым. На четвёртый или пятый день после впрыскивания при сохранении оптимальной температуры станут заметными места активного роста мицелия. В течении буквально часов эти участки увеличатся и вскоре зерно будет поглощено мицелием. Способ жидкой инокуляции позволяет избежать частого перетряхивания банок и использовать одну чашку Петри для инокуляции до 100 банок, а это в десять раз больше, чем получилось бы при использовании обычного способа пересадки агара. Существует несколько способов изготовить взвесь мицелия в воде, два из которых описаны здесь.

Первый способ достаточно прост. Используя стерильный шприц впрысните 30–50 мл стерильной воды в чашку со здоровой культурой. Затем поскребите иглой по поверхности мицелия и втяните в шприц как можно больше его фрагментов. Всего 5 мл полученной жидкости достаточно для инокуляции литровой банки с зерном.

Второй способ включает использование блендера со специальной автоклавируемой насадкой-ёмкостью для размешивания. (Несколько компаний производят специальные ёмкости из алюминия и нержавеющей стали приспособленные для работы с жидкой культурой — см. Приложение к данной книге). Её надо наполнить водой на две трети или три четверти, накрыть алюминиевой фольгой, стерилизовать и дать остыть до комнатной температуры.

В асептических условиях поместите в неё плотно поросшую мицелием пластинку агара разрезав её на четыре дольки или на тонкие полоски. Поскольку большинство контаминантов сосредоточено по внешнему периметру чашки, не рекомендуется использовать эти области. Положите все дольки или полоски в жидкость. Включите блендер на максимальной скорости не более чем на 5 секунд. (Более продолжительное перемешивание приведёт к разрушению не только клеточных цепочек, но и к повреждению самих клеток. Такая взвесь окажется непригодной). Наберите в стерильный шприц 5-10 мл концентрата мицелия и инокулируйте готовую банку с зерном.

Дальнейшее совершенствование этого способа предполагает разведение концентрированной взвеси в соотношении 1:10. Введите по 50 мл концентрата в сосуды содержащие по 450 мл стерильной воды. Для этого хорошо подойдут стеклянные банки с узким горлом объёмом около литра. Мягко встряхните каждую банку для равномерного распределения мицелия. После этого можно инокулировать банки с зерном используя по 10–15 миллилитров раствора на каждую. В результате использования этого метода вы получаете экспоненциальное увеличения объёма инокуляционного материала с помощью воды, которая является носителем который доставит частицы мицелия глубоко в банки наполненные зерном. Это пока единственная технология использующая взвесь мицелия в воде для инокуляции. Нет сомнений что со временем появятся дальнейшие улучшения благодаря микофилам, которые в ходе собственных экспериментов разработают свои технологии.

При использовании металлических крышек для банок в них можно сделать отверстия диаметром 1–2 мм и заклеить их липкой лентой или пластырем. Перед инокуляцией стерильных контейнеров откройте отверстие, введите а него иглу шприца, впрысните в него взвесь и верните пластырь на место. При использования такого способа инокуляции шанс проникновения воздушной инфекции за одну или две секунды в такой маленький зазор минимален.

Метод жидкой инокуляции отлично работает при условии, что исходная культура чиста и свободна от посторонних спор; в противном случае вся партия проинокулированная из этой чашки будет потеряна. Недостаток тут кроется в том, что в воду попадают как нужный мицелий так и споры контаминантов и если бы при традиционном способе инокуляции заражению подверглись бы только несколько банок, то в случае с жидкой инокуляцией до сотни банок с субстратом могут стать непригодными.

Хотя взвесь большинства видов грибов полученная таким способом пригодна для инокуляции, мицелий некоторых грибов не выдерживает перемешивания в блендере.

ИНКУБАЦИЯ ГРИБНИЦЫ

С каждым последующим шагом процесса разведения нарастает масса мицелия и соответственно субстрата. Через неделю-две после инокуляции банки с носителем должны быть полностью колонизированы грибным мицелием. Опасность здесь заключается в том, что если инфекция останется незамеченной, то плесень или бактерии будут воспроизведены в больших количествах. Следовательно со временем чистота мастер-банок становится первостепенной. Правильный баланс параметров среды, особенно температуры, создаёт благоприятные условия для развития именно грибного мицелия.

После инокуляции банки следует хранить на полках в комнате с легко регулируемой температурой в практически стерильных условиях. Свет и влажность не столь важны на данном этапе, т. к. закрытые банки удерживают влажность. Циркуляция воздуха важна только в том случае, если банки перегреваются. Опасность перегрева повышается, если все полки комнаты плотно заставить банками. Многие грибки термофилы неактивные при комнатной температуре процветают при температурах для грибов слишком высоких. Основной трудностью при создании инкубатора для большого числа банок является разделение воздуха на слои с различной температурой (стратификация). Чтобы избежать этого следует, если возможно, заблаговременно принять соответствующие меры.

Важнейшим фактором, влияющим на скорость роста мицелия, является температура. Для каждого вида существует оптимальный уровень температуры, при котором скорость роста максимальна. Как правило, лучшая температура для вегетативного роста на несколько градусов выше оптимальной температуры стимулирующей плодоношение. В Главе XI наиболее подходящие температурные условия перечислены для более чем дюжины культивируемых грибов. Ещё один фактор влияющий и на скорость роста и на восприимчивость к заражению это процент влажности. Эта тема обсуждалась выше в этой главе.

Банки надо осматривать почти каждый день, выискивая малейшие признаки заражения. Наиболее распространены зелёные плесени Penicillium и Aspergiltus. Ели признаки заражения обнаружены, запечатайте банку и вынесите её из лаборатории и вообще из помещения, где происходит проращивание. Если у вас есть только подозрение на то, что банка заражена, пометьте её для дальнейшего обследования.

Не все изменения цвета мицелия фактически являются заражением. Грибной мицелий выделяет желтоватую жидкость — это продукт его обмена веществ, который собирается капельками вокруг зёрен покрытых мицелием. По мере старения культуры и постепенного переваривания зерна скапливается всё больше отходов жизнедеятельности мицелия. Эти выделения состоят по большей части из спиртов (этанол и ацетон) и со временем появляются кислоты, которые снижают уровень pH субстрата. Эти отходы создают благоприятные условия для размножения бактерий, которые буйно разрастаются в них. Небольшие количества этой жидкости не представляют опасности для культуры; избыточное количество жидких продуктов обмена веществ (когда сам мицелий приобретает желтоватый оттенок) определённо нежелательно. Если жидкости скопится слишком много, то мицелий ослабнет и скорее всего погибнет в собственной экскреции. Такое избыточное «потение» показатель одного или комбинации следующих условий:

1. Температура инкубации слишком высока для данного вида. Учтите что температура внутри банки на несколько градусов выше температуры окружающего её воздуха.

2. Старение культуры; слишком долгий период инкубации.

3. Недостаток воздухообмена способствующий развитию анаэробных бактерий.

Инфицированные банки должны уничтожаться стерилизацией и не храниться дольше недели. Не вскрывайте банки заражённые плесенью, если они не были автоклавированы или источник заражения не был определён как неопасный. Некоторые контаминанты свойственные грибной культуре являются патогенными для человека и могут вызывать разнообразные кожные и респираторные заболевания. (См. Главу XIII о заболеваниях грибной культуры). Автоклавируйте заражённые банки 30 минут при 1,05 атм (15 psi) и затем сразу очищайте их. Во многих автоклавированных банках инфекция появляется снова, если их содержимое не уничтожить в течении нескольких дней.

Если существует исключительно высокий уровень заражения, проверьте все вероятные источники заражения и особенно качество изначальной культуры в мастер-банках (в частности влажность зерна) и общую гигиену непосредственного окружения. Как только культура полностью покроет мицелием зерно и её качество не будет вызывать сомнений полученную грибницу можно будет использовать для инокуляции бедных субстратов или выкладывать в лотки, наносить покровный слой для плодоношения.