Многие фламандские живописцы, в том числе и Вениус были убеждены, что «подлинный свет искусства идет только из Италии» и только там можно постичь его сокровенные тайны. Одержимый идеей попасть в сокровищницу живописи, скульптуры и архитектуры, в начале мая 1600 Рубенс отправился в путь навстречу к своей мечте.
В Италии художник много работал, копировал, изучал техникум живописи старых мастеров. Его покорило искусство Леонардо да Винчи, Микеланджело, Корреджо, но самое значительное влияние на него оказало творчество Тициана, а также современных мастеров: братьев Каррачи и Микеланджело да Караваджо. Он понимал: для того, чтобы стать «большим художником», недостаточно изучать одно лишь искусство. Мастер стремился погрузиться в самую жизнь народа, его быт.
В конце 1600 Рубенс поступил на службу в качестве придворного художника к мантуанскому герцогу Винченцо I Гонзаго, одному из крупнейших коллекционеров страны, страстному любителю науки и искусства. По его поручению художник копировал многие работы прославленных мастеров. Помимо прямых обязанностей живописца, Рубенс исполнял и некоторые дипломатические поручения герцога. Так, например, в 1603–1604 он ездил в Испанию с подарками для короля Филиппа III и премьер-министра герцога Лерма.
Дворец Гонзаго украшала коллекция портретов «красивейших дам в мире: как принцесс, так и женщин не титулованных». Известно, что Рубенс создал ряд портретов этой серии и, возможно, именно поэтому он был послан герцогом в Испанию. К сожалению, «галереи красавиц» не сохранились.
Живописец был очень недоволен тем, что Гонзаго использует его талант только для создания копий «чужих» картин. В некоторой степени это обусловлено тем, что метод написания заказных портретов являлся довольно простым: мастер в заранее заготовленную композиционную схему уже с натуры вписывал лицо модели. Рубенса такое положение дел не устраивало. Он умел к любому, даже неинтересному для себя жанру найти особый, часто неожиданный подход. Так, например, в строгие «каноничные» рамки придворного портрета художник вдохнул новую жизнь, освободив от жесткости письма, застылой композиции и отрешенности модели. Живописец внес в портрет движение и жизнь, богатство колорита, усилил значение пейзажного фона, сделав его тем самым достойным выражением монументального искусства.
За восемь лет пребывания в Италии Рубенс написал портреты многих аристократов, например, «Автопортрет в кругу друзей из Мантуи» (около 1606, Музей Вальраф-Рихартц, Кельн), «Маркиза Бриджида Спинола-Дориа» (1606–1607, Национальная галерея, Вашингтон), а так же своего покровителя — герцога Мантуанского. Благодаря превосходно развившейся визуальной памяти, строгой дисциплине и кропотливым тренировкам, в работах художнику удалось добиться такой твердости руки при создании рисунков и набросков, что, по существу, в этом ему не было равных.
В последние годы пребывания в Италии Рубенс получил крупный заказ на исполнение запрестольного образа для главного алтаря Кьеза Нуова. По его собственным словах! столь ответственное поручение было дано ему, «наперекор притязаниям всех лучших римских художников».
В самом конце лета 1608 Рубенс получил тревожное известие о смертельной болезни матери. Но как не спешил художник в Антверпен, ему не удалось застать ее живой. Мария Пейпелинс умерла 19 октября того же года. Живописец очень тяжело переживал ее смерть. В память о ней он установил на могиле «лучшей из матерей» запрестольную скульптуру, которую первоначально исполнял для Новой Церкви в Риме.
Несмотря на трагический повод для возвращения на родину, приезд художника совпал с моментом заключения двенадцатилетнего мира, что говорило о наступлении в стране долгожданного благополучия.