Путешествие в каменный век. Среди племен Новой Гвинеи

Куру, «бешенство» коров и другие прионные патологии

Обзор

Готье Неимущий

_{Принятые сокращения}

_{ЦНС — центральная нервная система}

_{ГЭ КРС — губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота («бешенство» коров)}

_{БКЯ — болезнь Крейтцфельдта-Якоба}

_{PrP^sen — нормальный прион, чувствительный (sensitive) к протеолитическим ферментам}

_{PrP^res — аномальный, инфекционный прион, устойчивый (resistant) к протеолитическим ферментам}

Так называемое «бешенство» коров, или ГЭ КРС, которое передается людям, в настоящее время вызывает столь большую тревогу во всем мире, что, по-моему, забыли даже о ВИЧ. ГЭ КРС входит в группу так называемых «прионных патологий», возбудитель которых имеет экстраординарную природу применительно к законам биологической материи: это белковое образование без всяких следов нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), названное «прионом». Непосредственно не занимаясь прионами, я в 1998 гг. заинтересовался этим вопросом и ознакомился «по верхам» с некоторым количеством специальных обзоров и статей (преимущественно англоязычных). Составилось определенное представление. Но за прошедший срок исследования, конечно, не стояли на месте. И вот, осуществляя в январе 2003 г. OCR весьма интересной и информативной книги А. Фальк-Рённе «Путешествие в каменный век. Среди племен Новой Гвинеи» я снова столкнулся на примере таинственной во времена похода Фальк-Рённе болезни папуасов кýру с прионными патологиями. Это снова стало мне любопытно, и я решил освежить имеющуюся информацию.

Если раньше я смотрел непосредственно научную литературу (хотя и «по верхам»), то теперь поступил проще: взял в Сети соответствующие данные на самых разных русскоязычных сайтах. Отдельные из них представляли собой электронные версии почти научных исследований и обзоров (сайт ВНИИ мясной промышленности — лаборатория микробиологии и гигиены производства; Медицинская газета; Русский медицинский журнал; Архив патологии и др.). Остальные являлись популярным изложением более или менее грамотными авторами того, о чем им поведали научные работники.

Анализ сведений, которые я раздобыл в Сети, продемонстрировал наличие информационных пробелов, в частности, для диагностики и терапии прионных патологий. На эти темы я взял непосредственно научные источники последних лет (рефераты). Они, конечно, англоязычные. Следует отметить, что всего публикаций, в которых в той или иной мере затрагивается тема прионов, в мире к 2003 г. накопилось около 4500. Понятно, что просмотреть все или большинство из них не способен никто. Но выбрать необходимые исследования последних лет по ключевыми словам можно. И — вот они, недостающие данные.

Вначале из всего добытого я хотел написать краткий миниобзор. Однако так не вышло: слишком много проблем надо было затронуть. Получился не только практически полноценный обзор, но даже такой, объем которого чуть не вдвое превышает допустимый в научных журналах. Однако нам бумаги не жалко: компьютер не журнал, а урезающей все и вся редакции над нами нет (правда, нет и рецензентов, что нехорошо).

Конечно, множество из представленных мною в «Литературе» ссылок для научных работ недопустимы: это ссылки на сайты и странички Сети. Да и форма представления ссылок недопустима для нормальной публикации. Но, во-первых, среди них имеются и научные работы и, во-вторых, я попытался подходить к материалам, взятым из Сети, критически. Данные, вызывающие сомнения, или не приводил, или указал на их проблематичность. От формы же ссылок суть не меняется. Сначала я не хотел приводить их номера в тексте, а дать только «Список использованной литературы» (как в школьных рефератах), однако потом все-таки решил потрудиться.

Обзор написан в январе 2003 г. и вряд ли скоро устареет.

Думаю, что я затронул все ключевые вопросы и не слишком сильно углублялся «в науку». Написано по-русски: прочти, товарищ, и будешь иметь представление и о «бешенстве» коров, и о прионах, и о том, надо ли нам их бояться (по моему мнению, разумеется). Писал я во многом для себя (чтобы знать и самому), но формировал темы и редактировал написанное, безусловно, для тебя, друг. Для читателя интереснейшей книги А. Фальк-Рённе, а, значит, в чем-то моего единомышленника.

1.1. Скрепи — первое описанное прионное заболевание

Издавна для овец была известна такая болезнь, как «трясучка» [1] (в некоторых источниках — «почесуха» [2]) — скрепи (scrapie). Она развивалась медленно и заключалась в постепенном формировании фатальных нарушений в работе ЦНС. Такие патологии называются «энцефалопатиями». Болезнь была инфекционна и передавалась от животного к животному (трансмиссивное заболевание). Все заболевшие овцы погибали. Сходные энцефалопатии были описаны для диких жвачных, для кошек, норок и др. животных.

Долго не могли выделить инфицирующий агент и полагали, что трансмиссивные энцефалопатии имеют вирусную природу и таким образом передаются от одного животного к другому, а инфекционный агент может реплицироваться. Иными словами, если это вирус, то он имеет в качестве хранилища генетической информации нуклеиновую кислоту — ДНК или РНК. Вот она-то и реплицируется в клетках организма-хозяина. Как и у всех вирусов.

Но инфекционный агент при скрепи был резистентен (устойчив) к облучению в высоких дозах, к повышенной температуре и к различным химическим обработкам. Все такие воздействия инактивируют вирусы, поскольку их «сердце» — нуклеиновая кислота, весьма лабильная молекула. Обнаружили также, что инфицирующая фракция, выделенная из мозга погибших от скрепи овец, не содержит ни ДНК, ни РНК. В 1967 г. T. Alper показала, что репликация (воспроизведение) агента скрепи не зависит от нуклеиновых кислот. Был выделен соответствующий инфицирующий фактор — липидный фрагмент клеточных мембран мозга, но оставалось не ясным, как такое вещество может реплицироваться без ДНК или РНК [1, 3, 4].

Через несколько лет (конец 1960-х гг.) англичане I.H. Pattison и K.M. Jones продемонстрировали, что инфекционный агент скрепи является белком относительно малого размера, а англичанин J.S. Griffits обнаружил, что именно этот белок способен передавать болезнь и «воспроизводиться» [3].

Казалось бы, упомянутыми англичанами были заложены основы понимания механизмов возникновения скрепи. Однако, как мы увидим ниже, все лавры достались (и ныне достаются) американцу Стэнли Прузинеру (S.B. Prusner) (правда, он расставил окончательные акценты).

1.2. «Самовоспроизводящийся» белок — «аргумент» в пользу гипотезы о «самозарождении» жизни на Земле

Здесь нам уместно немного отвлечься от собственно прионных патологий и рассказать, какие кажущиеся аргументы это открытие дало в 1960–1970-х гг. в пользу теории биогенеза — теории о «самозарождении» жизни.

Если ты, друг, хорошо учил биологию в старших классах, то, наверное, помнишь всякие «первичные бульоны» Опарина, всякие «коацерватные капли» а также опыты Стэнли Миллера (правильнее их называть опытами С. Миллера — Г. Юри, поскольку и ученик Миллера Г. Юри принял в них весьма активное участие [1]).

Моделируя условия на первобытной Земле, Миллер помещал в закрытую колбу немного воды и заполнял ее смесью газов, которые, по мнению Юри, должны были составлять примитивную атмосферу: водорода, метана и аммиака. Затем через газовую смесь при 80^°С пропускались электрические разряды, имитирующие грозовые разряды. С помощью химического холодильника собирали продукты реакции. Через неделю в газовой фазе были обнаружены окись углерода, двуокись углерода и азот, а в охлажденном конденсате — биологически важные соединения, среди которых — некоторые аминокислоты, входящие в состав белков и ряд простых органических кислот.

В течение последующих двух десятков лет опыт был повторен с использованием самых различных газовых смесей, которые, как полагали экспериментаторы, могли бы существовать в составе примитивной атмосферы. Варьировали температуру (до 1000 °C), добавляли облучение, кварцевый песок и т. п. Изощрялись как могли. В результате получили чуть менее 20 аминокислот и ряд других простых органических соединений [1].

Недавно вполне современные нам исследователи — немцы Клаудия Хюбер (Claudia Huber) и Гюнтер Ватерхаузер (Günter Wächterhäuser) взяли уже смеси аминокислот и подвергли их столь же жестким и длительным воздействиям разной вонючей и ядовитой дряни при высоких температурах и высоковольтных разрядах. И вот, они поимели чуть-чуть дипептидов (соединения двух аминокислот) и совсем слезки трипептидов [5]. Крайне мало.

Но все радостно завопили: сами собой получились «биологически важные молекулы» — аминокислоты и даже какие-то «предшественники белков» (забыв, правда, что белки — это не дипептиды и не трипептиды, в белках от десятков до многих сотен остатков аминокислот). Газеты всего мира широко оповещали об этом эксперименте. Некоторые зашли столь далеко, что заявили следующее: «Немецкие химики создали живые клетки из комбинации аминокислот…» (цитировано по [5]). Каждому ясно, что аминокислоты с мелкими пептидами, с одной стороны, и белки клетки, с другой, это две большие разницы.

Однако вернемся к Миллеру — Юри. Получили аминокислоты и еще кое-то (в том числе некоторые нуклеотиды, из которых, как из кирпичей, построена ДНК). Параллельно в СССР функционировал престарелый, давно покойный ныне А.И. Опарин со своим Институтом по биогенезу и коацерватными каплями. В этих каплях, как он полагал, на первобытной Земле находились аминокислоты, которые превращались в белки. Все ломали себе голову, как же могла сама собой образоваться матрица информации — ДНК. Ведь если самовоспроизводящейся матрицы нет, то синтезированные путем драконовских опытов аминокислоты и даже пептиды ни к чему: как они могли реплицироваться сами собой? Даже если они и образовывались на «первичной Земле», то так и оставались там одинокими.

Тогда придумали гипотезу «жизнь без нуклеиновых кислот» — коацерватные капли и микросферы. Согласно ей, первыми информационными молекулами были белки и первые примитивные клетки функционировали без нуклеиновых кислот и без генетических систем. А.И. Опарин (и вместе с ним некоторые биогенетисты-эволюционисты Запада) предположил, что первые «клетки» появились в тот момент, когда вокруг одной или нескольких макромолекул белков, обладавших ферментативной (каталитической) активностью, возникла некая отгораживающая их от среды граница, или мембрана. Одно из следствий этой гипотезы состояло в том, что генетический аппарат, обеспечивающий точное воспроизведение клеточных катализаторов, возник на более поздних стадиях биологической эволюции. Эта гипотеза о возникновении «жизни без нуклеиновых кислот» до сих пор все еще поддерживается некоторыми сторонниками самозарождения живого [5].

Понятно, что приведенный бред, не имеющий никаких оснований ни в законах природы, ни в свойствах живой материи, не поддерживался даже большинством биогенетистов, которые стали придумывать, как лучше объяснить «самозарождение» матрицы ДНК.

Но тут-то и подоспела «самореплицирующаяся» белковая частица скрепи. Биогенетисты ухватились за нее: вот, де, белок, а самовоспроизводится. Радостно оповещали об этом (см., например, старую, но исчерпывающую монографию [1]).

Время показало, что они, мягко говоря, не правы. Стэнли Прузинером было обнаружено, что эта частица вовсе не «самовоспроизводится». Эта частица — просто измененный белок, который в норме присутствует в клетках. И инфицирующий агент просто трансформирует такие же, но нормальные белки, в подобные ему, инфицирующему (подробно будет в разделе 2.3).

1.3. Исследования С. Прузинера

В научной статье [3] (“Chem. and Eng. News”) сказано следующее: «В 1982 г. Стэнли Прузинер — профессор нейрохимии Калифорнийского университета в Сан-Франциско, показал, что нуклеиновые кислоты не связаны с инфекционным агентом скрепи». Это статья 1998 г. [3]. Да, забыли, забыли на Западе, что все это показали еще англичане в 1960-х гг. (см. выше). Вот так-то друг…

Прузинер назвал инфекционный агент «Прион» (“Prions”), что расшифровывается как “proteinaceous infection particles” — белковоподобные инфекционные частицы. Затем он выделил этот белок (что, конечно, похвально и трудоемко весьма) и клонировал кодирующий его ген (и это крайне сложно и важно) [3, 4].

Далее С. Прузинер исследовал причины возникновения не только скрепи, но и так называемого «бешенства» коров (ГЭ КРС), появившегося в 1980-х гг. в Великобритании и передававшегося людям (см. главу 3). И пошло, и поехало его исследование. Короче, прионные заболевания стоили человечеству двух Нобелевских премий: одну в 1976 г. получил Дэниэл Карлтон Гайдушек (D.C. Gajdusek) из США за то, что обнаружил причины болезни папуасов кýру (см. главу 3), а другую, в 1997 г. — С. Прузинер за «открытие принципиально нового типа инфекций» — прионных [2–4].

Вот основные положения прионной гипотезы С. Прузинера:

Прионы представляют собой «мелкие белковые инфекционные частицы, резистентные к инактивирующим и модифицирующим нуклеиновые кислоты процедурам и содержащие аномальную изоформу клеточного белка, который является основным и необходимым компонентом клетки» [3, 4, 6].

В настоящее время С. Прузинер активно разрабатывает способы лечения БКЯ — прионного заболевания людей, связанного с употреблением в пищу «бешеных» коров. Про БКЯ и про то, насколько он преуспел в этом, мы расскажем ниже в главах 3 и 6.

2.1. Прионы — нормальные белки в нормальных клетках

Первоначально введенный С. Прузинером термин «прион», как мы уже видели, относился именно к инфекционной частице. Позже оказалось, что собственно инфекционная частица является широко распространенным в клетках белком, однако с измененной вторичной структурой. И, поэтому, термин дифференцировали на два, согласно чувствительности к обработке протеолитическими ферментами: PrP^sen — нормальный прион (чувствительный к протеазам), и PrP^res — инфекционный, измененный прион, резистентный к протеазам [3, 4].

Чем же они отличаются? Сначала надо вспомнить школьный курс биологии старших классов, а именно: структуру белка.

Молекулы белка представляют собой длинные цепочки из остатков аминокислот, соединенных пептидной связью; они имеют определенную пространственную организацию. Различают четыре уровня такой организации.

Первичная структура белка — это его аминокислотная последовательность, т. е. порядок чередования аминокислотных остатков в молекуле.

Вторичная структура белка отражает конформацию молекулы: скручивание в пространстве. Одна из наиболее распространенных форм — a-спираль. Это спираль, удерживаемая водородными связями между витками (по 3,7 аминокислоты на виток). Помимо этого в молекуле встречаются участки с жесткими β-структурами (или β-слоями), также характеризующиеся образованием связей между остатками аминокислот. Представить себе в воображении, как формируются β-структуры, трудно и не нужно. Скажем только, что такие структуры («параллельные» и «антипараллельные» слои) ответственны за изгибы и жесткость молекулы.

Третичная структура белка связана с трехмерной конфигурацией уже скрученной (спирализованной) молекулы в пространстве. Она обусловлена связями между находящимися вдали друг от друга остатками аминокислот и формирует доменную структуру (все те же спирали, но изогнутые или запутанные на еще более высоком уровне).

Четвертичная структура белка образуется за счет взаимодействия между разными молекулами, являющимися частями белка (его субъединицами) и характерна для сложных больших белков — гемоглобина, альбумина и др.

Каждый белок имеет свою постоянную неизменную структуру [7].

Нормальный прион есть нормальный белок клеток. Это гликопротеин (т. е., с фрагментом углевода). Идентифицированы и кодирующие его гены, причем для самых разных биологических объектов — от мышей до человека. PrP^sen обнаружен во многих тканях организма [3, 4, 8, 9]. Однако нормальная функция его так до конца и не известна. Предполагают следующее:

1) Участии в транспорте и депонировании ионов меди (кофакторов ряда ферментов), поскольку прион имеет связывающий участок для Cu²⁺. У мышей с делецией в соответствующем гене (иными словами, с дырой в ДНК в месте гена приона) наблюдается снижение уровня меди в организме [3].

2) На культурах клеток (in vitro) показано, что прион может участвовать в регуляции и уровня кальция [8, 9].

3) Множество молекул прионов находится на поверхности нервных клеток и есть гипотеза, что прионы необходимы для выполнения указанными клетками своих функций.

Данные литературы, однако, на этот счет противоречивы. Так, в одной из работ при исследовании линии мышей с заблокированным геном приона (то есть, у которых не вырабатывается этот белок) никаких отклонений от нормы при развитии животных не обнаружено [3]. Это научное исследование 1998 г. В другом же источнике (из Сети) указывается, что у мышей, дефицитных по гену приона, наблюдается гибель клеток Пуркинье в мозжечке, гибель нейронов и, соответственно, нарушение координации и нервные патологии [10].

Сразу скажем, что изучение особенностей выведенных линий мышей, которые дефицитны по тому или иному гену, ныне — обычный подход при изучении функций кодируемого этими генами белка. И то, что мыши способны нормально развиваться без синтеза кодируемого белка отнюдь не значит, конечно, что белок «не нужен» организму. Просто термин «нормальное развитие» не совсем верен. Надо говорить «нормальное» по таким-то использованным критериям (все учесть невозможно). Однако если бы у мышей, дефицитных по гену приона, действительно отмирал бы мозжечок, то, конечно, это не укрылось бы от внимания ни одного исследователя. И нам, все-таки, остается более доверять работе [3], чем сведениям, полученным на сайте интернета [10].

Исходя из изложенного, делаем следующие выводы:

1) Прионы присутствуют во многих клетках организма и в особенности распространены в нервных тканях;

2) Функция нормальных прионов не ясна.

Поговорим о свойствах нормального приона. Есть ли отличия от других клеточных белков? Нет, он ничем не замечателен. Прион гидролизуется протеазами (ферментами, переваривающими белки), денатурирует при нагревании, инактивируется глутаровым альдегидом, формалином и т. п. Пространственная конфигурация молекулы приона на 42 % представлена нормальной a-спиралью и только на 3 % — β-структурами (изогнутые зигзагообразные участки молекулы). Наличие значительного количества участков с a-структурами делает прион (как и подавляющее большинство других белков) легко растворимым в водной среде (коей и является среда клетки) [3, 4, 8, 11].

2.2. Инфекционный прион

Молекула такого приона, ничем не отличаясь от нормальной по аминокислотной последовательности (т. е., по первичной структуре), характеризуется аномальной конформацией. В ней несколько меньше участков с a-спиралью — не 42 %, а 30 %, но много больше β-структур — не 3 %, а целых 43 % [3, 8, 11].

Такая конформация белковой молекулы ведет к приобретению прионом совершенно чудовищных свойств, если сравнивать его с другими биологическими молекулами. PrP^res нерастворим, резистентен к гидролизу протеазами, не поддается ни формалину, ни глутаровому альдегиду, не инактивируется ни ультрафиолетом, ни ионизирующей радиацией в больших дозах [3, 4, 8, 12]. Кажется удивительным, но аномальный прион не инактивируется в течение 4-х месяцев и более в 20 % растворе формалина [13].

Но самое ужасное — крайне аномальная термостабильность. Подавляющее большинство белков организма денатурируют не более чем при 60 °C в течение нескольких минут. Прион же с измененной конформацией сохраняет инфекционность при 110 °C, причем сообщали, что удалось воспроизводить заболевание у подопытных животных, которым инъецировали зараженные ткани, подвергавшиеся обработке при очень высоких температурах (300 °C и более) [13]. Как сохраняется белок-прион в подобных условиях — загадка. Лично мне, все-таки, в 300 °C не сильно верится, но в намного больше чем 100 °C поверить можно.

Вот почему столь страшны прионные патологии: чтобы обеззаразить тушу, необходима, как отмечалось, обработка при очень высоких температурах. Собственно, никто и не пытается обеззараживать тушу павшей от «бешенства» коровы, чтобы использовать ее по назначению. Никто не хочет рисковать, и тушу просто сжигают при температурах порядка 1000–1200 °C [14, 15].

2.3. Что происходит, если в клетке появляется аномальный прион

С этим, собственно, и связан основной молекулярный механизм прионных заболеваний. Происходит страшное: постепенно все нормальные прионы внутри клетки превращаются в аномальные. Иными словами, их конформация изменяется так, что появляются столь же значительные участки β-структур, как и у инфекционного приона [3, 4, 16]. Как это происходит, до сих пор до конца не выяснено. Имеются следующие предположения [3]:

1) Гетеродимерный механизм.

При смешивании мономеров (молекул) PrP^sen (нормального) с PrP^res (инфекционным) вследствие взаимодействия β-структур происходит формирование сначала гетеродимера (то есть, комбинации из двух различных молекул), который затем превращается в гомодимер из двух одинаковых инфекционных прионов. Потом следует их диссоциация (расхождение) и — вот вам, вместо одного инфекционного приона их стало два. Затем из двух — четыре и т. д.

2) Механизм, обусловленный полимерной инициацией.

Вначале молекулы инфекционных прионов связываются между собой, формируя как бы «повреждающую основу» — олигомеры (короткие полимеры) или длинные полимеры. И вот с ними-то, с этими «ядрами инфекции», и происходит взаимодействие отдельных молекул нормальных прионов PrP^sen, что приводит к превращению последних в инфекционные.

Можно видеть, что, по сути, оба гипотетических механизма не слишком отличны друг от друга [3]. Главное же то, что реакция превращения нормальных прионов в аномальные развивается по цепному лавинообразному механизму: один инфекционный прион превращается в два, два — в четыре и т. д. И, в итоге, рано или поздно все прионы становятся аномальными.

Но такие прионы нерастворимы в жидкой среде клетки; они выпадают в осадок, образуя между собой агрегаты — так называемые нерастворимые волокнистые амилоидные (гликопротеиновые: вспомним, что прионы — гликопротеины) отложения, или бляшки [3, 8, 11, 17]. Поскольку, все-таки, прионов много больше на поверхности и внутри клеток именно нейронов (мозг), то именно там картина наиболее выражена. Фибриллярные (из длинных палочкообразных образований) амилоидные отложения наблюдаются и вне клеток, забивая межклеточное пространство. Внутреннее же «засорение» обусловливает формирование в нервной ткани совсем не нужных вакуолей (окруженных мембраной пузырьков). Наконец, клетки погибают, на их месте образуется пустое пространство («дырки») и, в итоге, постепенно формируется своеобразное губчатое строение ткани пораженного мозга («губчатая дегенерация») [2, 3, 8, 11, 17].

2.4. Как в клетке может появиться аномальный прион

2.4.1. Спонтанное образование

Допускают, что вследствие каких-то процессов молекула нормального приона в нервной клетке способна приобретать аномальную конформацию, заключающуюся в большом количестве участков с β-структурами. Мало ли отчего такое может произойти? Ну, а дальше — лавинообразная трансформация остальных нормальных прионов в аномальные и, как результат — дегенерация мозга и соответствующие патологии. Возможно, этим объясняется редкая болезнь Альцгеймера, также характеризующаяся атрофией головного мозга и слабоумием. В основном болезнь Альцгеймера поражает людей в старшем возрасте (после 50-ти лет) [4, 18, 19]. В частности, эту патологию диагностировали у бывшего президента США Р. Рейгана, который заранее, еще не впав в маразм, попрощался с нацией.

Напрямую с генетической детерминированностью спонтанное образование в данном случае связать нельзя. По-видимому, можно говорить только о генетической предрасположенности, заключающейся в том, что соответствующий (наследуемый) обмен веществ облегчает случайное формирование аномального приона. Заметим, что болезнь Альцгеймера, также связанная с образованием амилоидных бляшек, развивается как правило в старшем возрасте, т. е. тогда, когда защитные механизмы клетки и организма ослабевают.

2.4.2. Генетически обусловленное образование

Здесь все непосредственно связано с наследуемыми мутациями по гену приона. Нормальный прион человека кодируется единственным геном на коротком плече хромосомы 20 [19]. Аномальности в его гене приводят к синтезу приона с аномальной структурой. Например, при синдроме Гертсманна-Штраусслера-Шейнкера и так называемой фатальной семейной бессоннице (подробнее см. в главе 3), которые передаются «по наследству», патогенез связан как раз с мутациями в гене приона. Также обстоит дело и в случае спорадической формы БКЯ (т. е., не связанной с употреблением в пищу инфицированного материала от коров) [8, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 20]. Однако все подобные заболевания (как и другие генетически обусловленные патологии) в популяции человека встречаются крайне редко и, если бы не «бешенство» коров, то мы бы о них и знать не знали.

2.4.3. Инфицирование

Именно этот путь появления приона в клетке ныне наиболее актуален. Именно вследствие него бьют тревогу по всему миру. Он заключается в попадании тем или иным путем экзогенного (внешнего) аномального приона в клетку. Способ подобного попадания, как считают, преимущественно алиментарный (через пищу), но предполагаются и другие. Подробно инфицирование прионом рассмотрено в главе 4.

2.5. Могут ли клетки и организм инактивировать аномальный прион?

Сразу скажем, что здесь ясно не все. С одной стороны, длительный инкубационный период, характерный, как правило, для всех прионных патологий, указывает, что все-таки какие-то защитные механизмы имеются, однако они не способны полностью предотвратить патологию. Они только, по-видимому, отсрочивают ее [16].

С другой стороны, аномальный прион не отличается по первичной структуре от аномальной формы. Более того, прион почти перешагивает межвидовой барьер: первичные структуры белка овец, коров и человека очень похожи [14]. Поэтому к попавшему извне экзогенному приону антитела если и вырабатываются, то не сразу, и он успевает сделать свое черное дело: трансформировать какое-то количество прионов хозяина в инфекционные. Ну, а к тем антитела точно не вырабатываются и иммунитет не формируется (ибо «свое»). Поэтому никакой антисыворотки для лечения прионных патологий (как для лечения оспы или чумы) не получить [2, 8, 12, 13, 14].

И, в то же время, для экспериментальных моделей в настоящее время используются специфические, полученные, грубо говоря, из культур клеток поликлональные или моноклональные антитела именно к инфекционному приону. Именно его они узнают дифференцировано [8, 14]. Правда, для таких антител наверняка характерно хотя и небольшое, но все-таки связывание и нормальных прионов. Это свойство, всегда присущее подобным антителам. Чтобы устранить их неспецифическое связывание, необходимы особые экспериментальные подходы и обработки образцов, что, конечно, невозможно осуществить, если вводить антитела в организм. Да и дорого это весьма: лечить полученными не в условиях организма чистыми антителами. Не напасешься их (организм — он большой). Поэтому использование крайне специфичных антител в настоящее время, насколько я знаю, остается прерогативой сугубо экспериментальных работ, причем на клеточном уровне (in vitro) — там их требуется много меньше. Сам же организм, повторим, не способен синтезировать антитела, специфичные именно к приону с аномальной вторичной структурой молекулы (лучше скажем осторожнее: по крайней мере, неспособен в достаточных количествах).

Делаем вывод: клетка и организм не имеют эффективной защиты от внедрившегося и тем более спонтанно образовавшегося инфекционного приона.

В Сети встретилось также наименование «прионовые». Эти патологии поражают как животных, так и человека. Их относительно немного. Следует отличать спонтанные (негенетические) и те, которые вызываются инфицирующим агентом.

1. Скрепи (трясучка, почесуха, scrapie) — инфекционная болезнь овец, впервые описанная в Исландии в XVIII в. Перенесена в Шотландию в 1940-х гг. Поражает и коз. Впервые детально описана в 1954 году Б. Сигурдсоном [13, 14, 20].

2. Инфекционная трансмиссивная губчатая энцефалопатия норок, кошачьих и обезьян [8, 13, 20].

3. Хроническое истощение диких жвачных (лосей и оленей) [13, 20]. По-видимому, также инфекционная болезнь.

4. Губчатая энцефалопатия некоторых зоопарковых животных [8, 13]. Вероятно, инфекционная.

5. ГЭ КРС («бешенство» коров) — инфекционная губчатая (spongiform) энцефалопатия крупного рогатого скота [8, 13, 20]. Первая известная жертва пала в 1985 г. на крестьянском дворе Суссекса (Англия) [18]. На конец 2000 г. ГЭ КРС в Великобритании была зарегистрирована у 179.257 голов, в Ирландии — у 540, в Португалии — у 473, в Швейцарии — у 364, во Франции — у 231. В ряде стран (Германия, Бельгия, Нидерланды, Испания, Дания) выявлено менее сотни или единичные случаи болезни. В 2001 г. в Германии и во Франции обнаружены добавочные случаи заболевания [15].

6. Кýру («смеющаяся смерть»). Эта инфекционная болезнь открыта в 1956 г. среди членов племени форе в Новой Гвинее. Д.К. Гайдушек (США) выяснил, что болезнь передается благодаря ритуалу погребения, в ходе которого аборигены съедали мозг умершего [8, 17, 20].

Наиболее вероятная гипотеза относительно происхождения и распространения куру среди изолированных племен Новой Гвинеи заключается в том, что это заболевание началось спонтанно у одного представителя племени как случай спорадической БКЯ (ниже), а затем трансмиссивно передалась другим членам племени в связи с ритуальным каннибализмом. С момента первого описания этой болезни Гайдушеком и Зигасом в 1957 году до настоящего времени от куру погибло более 2.500 человек (почти 10 % популяции некоторых деревень). В среднем она уносила ежегодно около 200 человеческих жизней. Болезнь фактически исчезла с прекращением ритуального каннибализма. В последние годы было выявлено только 5–10 новых случаев и то исключительно у лиц старше 35 лет.

Куру встречается во всех возрастных группах. В детском возрасте (27 % всех случаев) болеют оба пола с одинаковой частотой, в то время как среди взрослого населения (73 % всех случаев) женщины заболевают в 2–3 раза чаще, чем мужчины. Эта особенность болезни объясняется трансмиссией (способом передачи) инфицирующего агента, которая осуществляется при ритуалах погребения (расчленение и съедание трупов). Мозг и внутренние органы обычно достаются женщинам и детям, тогда как мышцы — символ силы — предназначаются мужчинам. Поэтому женщины и дети страдают чаще, чем мужчины. После прекращения ритуала поедания трупов покойников число больных значительно уменьшилось.

У соседних с форе племен, также практикующих обряд каннибализма, не наблюдается случаев куру, поскольку в поддержании болезни играет роль двойной детерминизм — инфекционный и генетический. Генотип племени форе играет исключительную роль в сенсибилизации (чувствительности) к этой болезни [8, 21, 22].

7. Прион-протеинцеребральная амилоидная ангиопатия [8]. Данные о характере (спонтанная или инфекционная) не найдены.

8. Синдром Гертсманна-Штраусслера-Шейнкера — наследственное заболевание, вызываемое мутацией гена, кодирующего нормальный прион белок человека. Выявлено примерно 50 семей с подобными мутациями. От появления первых симптомов до смерти проходит от 2 до 6 лет [8, 9, 13, 17, 20].

9. Фатальная семейная бессонница. Также спонтанная патология. Описана в середине 1980-х гг. итальянскими исследователями из Болонского университета. Она вызывается другой мутацией гена, кодирующего прион человека. Носители такой мутации обнаружены в 9 семьях. От первых симптомов до смерти проходит около одного года [10, 13, 17].

10. БКЯ (болезнь Крейтцфельдта-Якоба) [2, 8, 13, 16, 17, 18, 21, 22].

а) Классическая (спорадическая) форма

Описана Крейтцфельдтом (1920 г.) и Якобом (1921 г.). Заболеваемость в мире составляет 0,5–1 случай на 1 млн. человек в год; во Франции регистрируется 30–50 заболеваний в год. 70–95 % всех случаев БКЯ приходится именно на классическую форму. Патология обычно начинается в 55–75 лет; характерно постепенное прогрессирование симптомов поражения ЦНС, причем в 13 % случаев заболевание «разворачивается» в течение нескольких дней. Насколько можно понять из соответствующего материала в Сети, спорадическая форма не обусловлена непосредственно нарушениями в функционировании гена приона. Для нее важна генетическая предрасположенность к БКЯ (соответствующий обмен веществ приводит к повышению вероятности спонтанного формирования аномального приона).

б) Семейная (генетическая) форма.

В 5–15 % случаев БКЯ вызывается мутацией в гене, кодирующем прион. Понятно, что тогда БКЯ является наследственной и поражает несколько членов одной семьи. Известно около 100 семей — носителей мутаций, вызывающих эту болезнь. Она наследуется по аутосомно-доминантному механизму. Патология начинается на 5–10 лет раньше, чем при классической форме; течение заболевания такое же. Существуют изолированные этнические группы, где частота заболеваемости БКЯ в 30–100 раз выше, чем для населения в целом, что обусловлено особенностями генотипа и специфичностью мутаций. Это — ливийские евреи, а также словацкие и чилийские общины, в которых распространены внутрисемейные браки.

в) Инфекционная (приобретенная) форма.

Почему-то ее разделяют еще на три формы: собственно инфекционная (заражение от инфицированного мяса), ятрогенная (то есть, буквально, «занесенная хирургическим путем») и «британская». Как будет видно ниже (раздел 4.2), доказательств о «занесении хирургическим путем» пока не имеется. Как же тогда выделили специальную форму? Кроме того, непонятно, чем отличаются «собственно инфекционная» от «британской». Что ж, доктора есть доктора — в их писаниях кто угодно ногу сломит.

За 70 лет со времени первого описания БКЯ зарегистрировано 20 случаев патологии в молодом возрасте (16–40 лет), которые рассматриваются сейчас как британский вариант. Например, в 2000 году умерла 14-летняя З. Джеффри.

Получены некоторые данные, которые, как указывается, могут быть доказательством того, что новый вариант БКЯ вызывается возбудителем ГЭ КРС. С учетом длительности инкубационного периода, по прогнозам экспертов пик возможной эпидемии этой болезни в Англии придется на 2010 год. На нынешний момент в Великобритании от инфекционной формы БКЯ умерло 89 человек.

Возникает вопрос: имеется ли генетическая предрасположенность к заболеванию БКЯ в ее инфекционной форме? Поскольку, как мы только что видели, существует наследуемая (семейная) форма БКЯ, то, вероятно по аналогии, выдвинуто предположение и о генетической зависимости восприимчивости к приону «бешеных» коров. То есть о том, что существуют генетические детерминанты, определяющие либо чувствительность, либо потенциальную устойчивость (резистентность) человека к возбудителю БКЯ.

Еще недавно утверждали, что две трети человечества вообще резистентны к коровьим прионам и что восприимчивость к ним свойственна лишь людям с вполне определенными особенностями генной структуры. Теперь же стали полагать, что наследственными факторами определяется, прежде всего, продолжительность инкубационного периода болезни. Отсюда следует вывод, что человек, отведавший зараженной прионами говядины, обречен заболеть — вопрос лишь в том, когда это произойдет.

Как мы с тобой, друг, можем проанализировать приведенные утверждения? Все это только предположения. Ибо непонятно, как на людях можно поставить необходимые опыты и набрать нужную статистику. Во-первых, какие генетические детерминанты смотреть (их много)? Во-вторых, как формировать однородные генетически группы? И главное — мало случаев заболевания именно инфекционной формой БКЯ: с позиций генетики нечего изучать. Поэтому, на мой взгляд, о «генетической обусловленности предрасположенности к инфекционной БКЯ» пока можно забыть. Ведь не публикуют же данные о генетической обусловленности даже ВИЧ, которым болеют десятки миллионов людей в мире! Мне встретилась статья (не научная) врача из пункта переливания крови, в которой он заметил, что люди с такой-то группой крови СПИДом не болеют. Но официальных-то данных нет! Что уж говорить о какой-то редкой БКЯ…

Правда, для куру наличие генетических детерминант явно существует (болеет только племя форе, а жрущие рядом людей, например, асматы — нет). Но куру — не ГЭ КРС. Кушать человеческий прион, причем прион близких тебе людей, это, брат, все-таки не то, что кушать коровий, как бы схожи по структуре они ни были. Да и сугубо эндемична куру, а инфекционная форма БКЯ — нет.

Наверное, шараханье исследующих БКЯ от «генетически обусловлена» к «генетически не обусловлена» объясняются чистой конъюнктурой. Про первую говорят английские защитники своего мяса, а про вторую их конкуренты, в том числе американцы, желающие обрушить евро. Вот и все пока с этим вопросом.

4.1. Алиментарное заражение (через пищу)

Это — самым распространенный способ. Для куру, разных энцефалопатий хищных животных и приобретенной формы БКЯ с ним, полагаю, все ясно, однако применительно к заболеваниям травоядных животных механизм заражения явно сложнее. Допустим, травоядных в зоопарке, как и крупный рогатый скот, кормили мясокостной мукой от «бешеных» коров (подробно ниже), но как с дикими жвачными («истощение» лосей и оленей — см. главу 3)?

Или вот скрепи. Я не обнаружил данных, как же все-таки овцы заражаются скрепи друг от друга. Болезнь известна с XVIII в. [13, 14, 20], когда никакой костной муки не было. По-видимому, необходимо углубленное исследование узкой специальной литературы именно по данной патологии, чего, конечно, я не делал.

Однако что касается появившейся в середине 1980-х гг. [18] ГЭ КРС, то выдвинута довольно правдоподобная теория о рукотворном творении этого заболевания. Полагают, что коровам, чтобы они лучше набирали вес, скармливали белковый продукт — мясокостную муку, которую изготовляли в том числе и из овец, павших от скрепи [14, 15, 18].

Прион скрепи овец и коз не вирулентен для человека. Иначе мы бы из глубины столетий имели массу сведений о слабоумии и последующей мучительной смерти любителей бараньих мозгов. Если скармливание костной муки действительно является причиной возникновения ГЭ КРС, то придется признать, что не вирулентный для человека прион скрепи «подошел» к нормальным прионам крупного рогатого скота, перевел их в патогенные, а те, в свою очередь, «подошли» к нормальным прионам человека, что и вызвало появление новой формы БКЯ.

Тут, правда, имеется несколько нестыковок.

В многочисленных опытах показана возможность межвидового инфицирования прионами (даже для весьма далеких видов — от человека и овец до мышей) [8, 16, 13, 19]. Конечно, экспериментальные методики не ограничиваются скармливанием материала: его обычно инъецируют в ткани, поэтому «приживается» он лучше [23]. И тем не менее непонятно, как это ни один человек не заразился от овец за сотни лет их поедания, но сразу же заразился патогенными прионами при использовании в пищу соответствующего коровьего материала.

На данный скользкий момент явно обратили внимание защитники британской говядины. Они отмечают, что пока не существует четких доказательств прямой передачи агента скрепи от овец коровам. В доступной литературе отсутствуют также сведения об опытах по воспроизведению заболевания у коров путем скармливания им мясокостной муки. Сделано даже предположение, опровергающее гипотезу «мясокостного» происхождения ГЭ КРС. Согласно ему, прион — возбудитель этой патологии, появился у коров самостоятельно и не связан со скрепи овец, причем первичный очаг, источник и механизм передачи возбудителя до конца не установлен [13].

Другие исследователи указывают, кроме того, что доверие к гипотезе о передаче особой формы БКЯ через мясо коров подрывается тремя фактами:

1) Мясо вообще не содержит прионов (см. ниже), а их главные источники — мозги — в пищу практически не употребляются (противники отвечают, что мясо может быть загрязнено прионами при разделке туш).

2) Говядину едят миллионы людей, а заболели лишь десятки (противники говорят, что «все впереди»).

3) Среди заболевших новой формой БКЯ были вегетарианцы [24].

Какой мы можем сделать вывод? К сожалению, если аргумент со странным отсутствием вирулентности для людей у приона скрепи весьма весом, то три перечисленных «факта» отнюдь нет.

Во-первых, действительно нельзя исключить попадания прионов в мясо при разделке туш. Никто не знает, сколько прионов надо, чтобы заразить одного человека. Для коров минимальная эффективная доза составляет всего 0,1 грамма инфицированного мозга [18]. Вполне вероятно, что и тех крох, которые попадают в мясо при разделке, хватает, чтобы заразить человека, которому «не повезло». Это, кстати, может быть одним из объяснений малого числа больных БКЯ, вызванной прионами ГЭ КРС, на настоящее время. Далеко не всем попадается загрязненное мясо.

Во-вторых, инкубационный период прионных патологий может длиться очень долго. Это известно и для скрепи. В 2000 г. от куру умер некий абориген в Новой Гвинеи, который в последний раз ел человеческий мозг в 1956-м году [16]. Источник [16] отмечает: «доказано, что позднее он заразиться не мог…». Мы, конечно, подвергнем сомнению предсмертные уверения аборигена. Мог сказать неправду, чтобы, например, не повредить своим детям (иначе — «плохое общественное мнение» среди «цивилизованных» папуасов). Мог и забыть. Но, как бы там ни было, этот папуас занимался каннибализмом явно в давние времена. То есть, явно прошли десятки лет.

Даже при искусственном заражении в жестких условиях инкубационный период весьма длителен. Так, введение инфицированных тканей в мозг животных приводит к кратчайшему инкубационному периоду — от 15 до 20 месяцев. Инъекция же материала в мышцу влечет за собой период гораздо более длительный — от 5 до 30 лет [25]. Понятно, что через пищу будет еще дольше.

В-третьих. Насчет заболевания БКЯ вегетарианцев. Насколько видно из использованных источников, ныне известен всего один такой случай. Прямо процитируем:

«В госпитале св. Марии в Лондоне три года назад в тяжелейшем состоянии с диагнозом „болезнь Крейтцфельдта-Якоба“ лежала двадцатичетырехлетняя Клэр Томкинз. Конечно, она была далеко не первой пострадавшей от коровьего бешенства, однако история болезни дочери фермера из графства Кент привлекла особое внимание ученых. Дело в том, что Клэр — вегетарианка, к тому времени она не ела мяса уже двенадцать лет. Как же тогда она могла подхватить инфекцию?» [19].

Заметим: не ела всего 12 лет. И в работе [19] сделан правильный вывод: «Профессор Джон Пэтисон… считает, что все дело в длительном инкубационном периоде болезни. Скорее всего, Клэр заразилась мясом, съеденным задолго до начала ее вегетарианства».

Вот пока и весь сказ о заразившихся вегетарианцах.

Так что, друг, как рукотворное «мясокостное» происхождение ГЭ КРС, так и алиментарное заражение особой формой БКЯ при употреблении в пищу коровьих тканей весьма вероятно. Я думаю, что, несмотря на неувязку со скрепи, так оно все и есть.

Это понимают и ответственные санитарно-эпидемиологические органы во всем мире. В 1997 г. принята следующая классификация органов и тканей животных в зависимости от степени риска заразиться ими [17]:

1) Высокий риск: головной и спинной мозг, спинальные ганглии, глаза, голова (без языка), гипофиз, позвоночник, легкие.

2) Средний риск: кишечник, миндалины, селезенка, матка, плацента, спинномозговая жидкость, лимфатические узлы.

3) Малый риск: печень, поджелудочная железа, вилочковая железа (тимус), костный мозг, другие кости (трубчатые кости), слизистые оболочки носа, нервные ткани за пределами центральной нервной системы и головного мозга.

4) Отсутствие подтвержденной вероятной опасности: скелетная мускулатура, сердце, почки, молоко, молочные железы, семенники, хрящевые ткани, жировые ткани, соединительная ткань, кожа, волосы, слюна и слюнные железы, сыворотка крови, моча, желчь, испражнения.

4.2. Заражение при плохой дезинфекции хирургического инструментария

Есть гипотеза о возможности заражения БКЯ при недостаточном обеззараживании хирургических инструментов [25], в частности, при нейрохирургических вмешательствах [19]. Это, конечно, весьма серьезно, поскольку прион крайне устойчив (см. главу 2). Прион вам не вирус ВИЧ (последний быстро погибает на воздухе, не выдерживает 60–70° спирта, какой-либо дезинфекции и т. п.). Но конкретных данных нет и, я думаю, никогда не будет: инструмент через много лет не проверишь. Кроме того, любой хирург может сказать: «Да Вы, голубчик, ели ведь когда-нибудь коровок? Вот от них-то все и идет, а мы тут ни при чем…». Если же пытаться провести соответствующие опыты на животных, то абсолютной уверенности все равно не будет (животное — не человек). Исходя из таких опытов можно будет говорить только о вероятности заражения человека нерадивыми хирургами, которых, опять-таки, не проверить.

4.3. Заражение через кровь

И такое предположение имеется [25]. Оно подкрепляется тем, что, как указано в [18], удалось заразить кровью инфицированной овцы здоровую ярочку. Кроме того, недавно у 22-летней матери, которая потом умерла от БКЯ, родилась девочка, страдающая тяжелой нервной болезнью: она слепа и почти не проявляет признаков жизни [18].

Последние данные взяты из интернетовской статьи некой В. Богомоловой [18], однако веру к ней подрывает ерунда, идущая далее: «Малышка родилась при помощи кесарева сечения. Может, заразу передали при помощи инструментов?». Ерунда не в предположении о передаче через инструменты, а в том, что сама же Богомолова указывает, что девочка уже имеет тяжелую форму нервного заболевания (да и что это за заболевание?). Когда же оно успело развиться, если ребенка только что заразили во время родов хирурги? Не поела ли сама В. Богомолова мяса от бешеной коровки? А то налицо первые клинические признаки…

Словом, насчет заражения через кровь пока далеко не ясно. Тем не менее, американский Федеральный резервный банк крови на всякий «пожарный» случай отказался от закупки донорского материала в Европе [19]. Кроме того, в Германии, США и Канаде всем, кто с 1980 по 1996 годы бывал в Великобритании, запрещено сдавать кровь [18].

4.4. Заражение через трансплантированные ткани

В английской глазной клинике трем пациентам сделали операции по пересадке тканей роговицы и склеры, взятой у женщины, умершей от рака легких (перед смертью она оставила соответствующее письменное согласие). Как показало вскрытие, помимо рака женщина страдала также БКЯ [19]. Но это только факт пересадки, а относительно того, заболел ли кто-нибудь, данных пока нет. Есть гипотезы типа: «Человек подвергается опасности быть зараженным при имплантации тканей в участок, близкий к мозгу» [25]. Логично, конечно, но не доказано, хотя если данных о заболевших после пересадок тканей и органов от больных БКЯ накопится достаточно много, то никаких сомнений не останется (это вам не «через хирургические инструменты» — см. 4.2).

Подведем итог разделу. Все-таки прион как инфекционный агент при имеющихся привычках к питанию мясом и молоком, а отнюдь не мозгами, не сильно активен. Переливание крови как способ заражения надо еще доказать. Да и пока от новой формы БКЯ во всем мире умерло менее 100 человек (почти все в Великобритании) [16, 18]. Правда, нет сведений об инфицированных, но еще живых людях.

5.1. Проблематичность постановки однозначного диагноза при жизни зараженного

Диагностика прионных патологий основана на выявлении патогенного белка PrP^res и тех изменений в головном и спинном мозге, которые связаны с его накоплением. Прион не содержит нуклеиновых кислот; оба белка (нормальный и патогенный) идентичны с иммунологической точки зрения, вследствие чего организм, по-видимому, принимает патогенный белок за свой и не отвечает на него выработкой антител (во всяком случае, пока данных о них нет). Вот почему разработка прижизненных методов диагностики прионных болезней является сложной проблемой [13].

В настоящее время нет методов, использование которых позволило бы уверенно утверждать, что вот эта пока еще не павшая овца заражена именно скрепи, вот эта еще не околевшая корова — ГЭ КРС, вот тот еще не отдавший Богу душу европеец — БКЯ, а вот тот еще живой папуас — куру [13, 14, 15, 18, 19, 24]. Прижизненный диагноз ставят на основании клинических признаков, отражающих расстройства ЦНС. Как у животных, так и у человека [13, 15, 19, 24]. Этих признаков достаточно много, и они красочно описаны на соответствующих сайтах (расстройства координации, тремор, слабоумие, недержание мочи и кала, агрессивность животных и т. п.). Мы не будем на них останавливаться, поскольку это не столь важно (мало ли что может быть, когда мозг отмирает), скажем только, что А. Фальк-Рённе весьма подробно описал клинические проявления болезни папуасов куру [3]. Однако клинические признаки других прионных патологий малоспецифичны. Например, БКЯ вполне можно спутать с болезнью Альцгеймера [8, 19], также характеризующейся атрофией головного мозга и слабоумием. Хотя болезнь Альцгеймера поражает в основном людей в старшем возрасте, иногда встречаются и молодые заболевшие [4].

Можно предположить также, что и другие заболевания ЦНС (как эндогенные, так и обусловленные внешними агентами — инфекциями, хроническими интоксикациями и др.) имеют признаки, сходные с прионными энцефалопатиями. Указывают, что для дифференциальной диагностики имеет значение длительный инкубационный период последних [13]. Но и болезнь Альцгеймера развивается в течение 8–10 лет [4].

Словом, корректный прижизненный диагноз прионным патологиям пока уверенно не поставить. Дело в том, что необходима биопсия (взятие кусочка ткани на анализ) именно головного мозга (в остальных тканях или в биологических жидкостях прионов мало). Пишут, что при жизни ни животного, ни человека подобного не осуществить [24]. Вообще-то осуществить (просверлив череп), но операция столь жестока, что ни один доктор не решится ее делать. Во-первых, вдруг это просто слабоумие или что-то другое мозговое. А тут череп просверлили… И во-вторых — зачем, все равно пока не помочь (лечение практически отсутствует — см. раздел 6). Вот когда разработают эффективные методы лечения, то тогда, конечно, станут сверлить черепа для постановки точного диагноза.

В последние годы промелькнуло обнадеживающее сообщение, что прионы накапливаются, помимо прочего, и в лимфоидных органах (в том числе и в миндалинах) и там их можно обнаружить [8, 14, 26]. В Англии начали анализировать удаленные у пациентов миндалины, которые там почему-то не уничтожают, а замораживают [14]. Однако есть экспериментальное исследование, в котором продемонстрировано, что при энцефалопатии кошек прионной этиологии иммуногистохимические методы не показали наличия прионов в лимфоидных органах [17]. По-видимому необходимы дальнейшие работы в данном направлении.

5.2. Методы посмертной диагностики

5.2.1. Гистология

Основана на детекции изменений, наиболее характерным из которых является вакуолизация серого вещества и цитоплазмы нейронов [13]. Характерен специфический «губчатый» вид срезов головного мозга [14, 15].

5.2.2. Биопроба

Прионы характеризуются малой видоспецифичностью. Показана возможность заражения ГЭ КРС овец, коз, свиней, мышей, морских свинок и домашней птицы. Можно заразить прионами человека или хомячка мышей [16, 13, 19]. Можно — человеческими прионами шимпанзе [8, 22] и т. д. [13]. Исходя из этого разработана следующая тест-система: экстракт головного мозга инъецируют лабораторным животным (мышам и хомячкам), наблюдая за результатом. Если животные заболевают, следовательно, проба положительна. Однако инкубационный период у мышей довольно длителен — месяцы [14], что, конечно, ограничивает применение данной тест-системы. В последние годы разрабатываются методики, позволяющие наиболее успешно инфицировать лабораторных животных. Так, оказалось, что введение хомячкам тестируемых проб прямо в язык заражает их в 1000 раз более эффективно, чем введение в другие части ротовой полости (при поедании зараженного материала прионы поступают через определенные нервные окончания во рту в мозг). И инкубационный период снижается до 1–2 недель [23]. И все-таки биопробы для тестирования мяса сейчас используются, по-видимому, редко.

5.2.3. Иммунохимические методы

Типы антител. Иммунохимические методы основаны на реакции биологического материала с антителами, специфичными к прионам.

Во-первых, используют антитела, которые реагируют с любыми прионами (как с нормальными, так и с патогенными). Как тогда различить нормальные и аномальные белки? Поскольку патогенный прион чрезвычайно устойчив к жестким воздействиям, то пробы предварительно подвергают им. Например, их обрабатывают протеазами, после чего нормальные белки расщепляются, а устойчивые аномальные формы — нет. И, как можно догадаться, если обнаружена положительная реакция с антителами, то она будет обусловлена именно патогенными прионами [14].

Во-вторых, получены и более специфичные как поли- [8], так и моноклональные антитела [8, 14], которые связываются только с белком, имеющим патогенную конформацию. Реакция с такими антителами указывает на наличие измененных прионов даже без предварительного устранения нормальных форм этих белков.

На наш взгляд, первый подход более корректен по двум причинам. Первая заключается в том, что даже полученные искусственно чистые антитела дают неспецифическую реакцию как с нормальными прионами, которые могут присутствовать в гораздо бóльших количествах, чем патогенные, так и с другими белками (хотя и в малой степени). Это обычное явление для антител; чтобы избежать его, необходимо использование дополнительных методических подходов. И все равно, поскольку результат очень важен, вряд ли можно добиться для массы проб полного отсутствия неспецифических реакций. Расщепление же протеазами всех белков, кроме патогенных прионов (первый подход), конечно, устранит данную проблему.

Вторая причина связана с гораздо большей стоимостью полученных на клеточных культурах искусственных антител по сравнению с антисывороткой, вырабатываемой организмом. В полупопулярных источниках из Сети указано, что, де, одна иммунологическая проба мяса на прионы стоит 7 тысяч долларов [27]. Откуда взята данная сумма, непонятно: за нее можно не только накупить антител на много проб, но и приобрести, думаю, почти все соответствующее оборудование. Разве что на холодильник глубокого холода не хватит. На мой взгляд, стоимость одного анализа завышена минимум раз в триста (считая зарплату начальникам). Тем не менее следует понимать, что указанные иммунохимические тесты, которые аналогичны тестам на ВИЧ, все же достаточно дороги. Они даже дороже, чем анализ на ВИЧ: по крайней мере, там нужно отбирать только кровь, а здесь надо готовить экстракты или срезы мозга [15].

Иммуноферментный анализ (ELISA). Это обычный ныне иммунохимический метод, который принят европейскими органами санитарного контроля мяса [15]. В его тонкости вдаваться не станем, скажем только, что реакция с антителами идет как бы в растворе, а пробы инкубируют в специальных пластиковых плашках (на много-много проб: как соты). Используются экстракты мозга (головного и спинного). Также определяют и ВИЧ-инфицирование (только антитела другие).

Иммуноблоттинг. Здесь реакцию с антителами проводят после фиксации белков на специальных мембранах [19, 28]. Этот метод более используется при экспериментальных исследованиях, чем при скриннинговых обследованиях десятков и сотен проб от туш забитых коров.

Иммуногистохимические методы. Срезы мозга обрабатывают специфическими к патогенному приону антителами в особых условиях, что обеспечивает характерное окрашивание (иной раз — флуоресценцию), обусловленное связыванием антител с детектируемыми в ткани белками [19, 28]. Вероятно, некоторые фирмы начали выпускать наборы реактивов, предназначенных именно для этого. Так, упоминается фирма “Prionics” [15].

Независимо от представленных выше иммунохимических методов, во всех случаях анализируют либо головной, либо спинной мозг, поскольку в остальных тканях прионы детектируются слабо. Исходя из этого становится весьма проблематичным упомянутое разрекламированное определение их в миндалинах.

5.3. Проверка на инфицированность прионами туш животных в России

Перечисленные иммунохимические методы (в особенности, ELISA) в настоящее время являются достаточно рутинными процедурами. Закупи необходимое оборудование (его не так много), закупи антитела, плашки и пипетки-дозаторы, да начинай. Правда, все указанное импортного производства. Отечественные пипетки не годятся, да и стоят почти столько же; специального спектрофотометра же, насколько мне известно, в России не выпускают (впрочем, сейчас в ней вообще ничего кроме пива и «Газелей», чтобы это пиво развозить, не выпускают). Практически все аналогично тест-лабораториям на ВИЧ. Экспресс-анализ мозга забитого животного занимает всего десять часов, а окончательный анализ срезов мозга — шестнадцать часов. То есть ровно столько, сколько необходимо для разделывания туши и заморозки мяса [19].

Поскольку случаев ГЭ КРС в России, как пишут, пока не зафиксировано (как и однозначно диагностированных смертей от БКЯ) [15, 27], проблема у нас остро не стоит. Во Владимирской области, в ВНИИ защиты животных, анализируют импортное мясо, и к 2001 г. проверено 1000 партий. Пока ничего не обнаружено [25, 27].

До последнего времени никаких даже предпосылок, позволяющих надеяться на лечение прионных патологий, не имелось [19]. Но сейчас появились некоторые обнадеживающие подвижки.

На культуре клеток нейробластомы (исходно выведена из клеток опухоли мозга), зараженных прионом скрепи, продемонстрировано, что специфические к этим прионам антитела подавляют «размножение» аномальных прионов и их взаимодействие с нормальными [29].

Также на инфицированной прионами культуре клеток показан сходный эффект трициклических производных акридина и фенотиазина [30]. Авторы работы [30] отмечают, что другие производные указанных соединений — квинакрин и хлорпромазин, являются широко распространенными лекарствами (противомалярийное и психотропное соответственно), вследствие чего применение трициклических соединений для терапии прионных патологий может быть весьма доступным.

И третья работа выполнена на клетках нейробластомы. Обнаружено, что полиамины, выделенные из мозга, а именно полимер полиамидоамид, полипропиленимин и полиэтиленимин способны удалять с поверхности клеток патогенную изоформу приона скрепи [31].

Но пока обольщаться не следует: от работ на клеточных культурах не только до создания лекарственных форм, но, порой, даже до успешного воспроизведения эффекта in vivo (на уровне целого организма) пролегает целая пропасть. Когда ее удастся одолеть? Правда, на сайте http://www.jewish.ru/7069.asp в конце января 2003 г. гордо значилось следующее:

«Как сообщает британская радиостанция ВВС, калифорнийский ученый, лауреат Нобелевской премии Стэнли Прузинер создал препарат для лечения болезни Крейтцфельда-Якоба — одной из форм коровьего бешенства. Он назначил своей пациентке лекарство, которое еще не применялось у людей, и уже через 19 дней обреченная на смерть больная начала ходить, разговаривать, пользоваться ножом и вилкой и выполнять пробы на координацию движений, которые были ей недоступны до лечения».

Что-то подобное, помнится, недавно промелькнуло и по ТВ.

Насколько удачно лечение и, к тому же, насколько вообще сообщение соответствует действительности, сказать пока нельзя. Попытки найти соответствующую научную публикацию S. Prusinera не увенчались успехом. Был осуществлен поиск в специальной базе MedLine по следующим комбинациям ключевых слов: “prion” + “drug” и “prion” + “therapy”. Кроме того, просмотрены работы на “Prusiner S.” за 2002 и 2003 гг.

Вполне вероятно, что даже если С. Прузинер и нашел какой-то антиприонный препарат (скорее всего, из перечисленных выше, давших успех на клетках), публиковать данные он не стал. Успех в этом деле (даже самый малый) пахнет огромными деньгами. И в подобных случаях фармацевтические фирмы засекречивают свои разработки [17].

Итак, мы рассмотрели прионы и прионные патологии. Видим, что прион действительно чудовищный по устойчивости инфекционный агент, выходящий за рамки большинства биологических закономерностей. Видим, что имеется десять соответствующих заболеваний. Одни из них эндогенны, то есть, не обусловлены внешней инфекцией. В подобных случаях нормальный прион превращается в аномальный патогенный спонтанно: или от не выясненных причин, или же вследствие мутаций в соответствующем гене. Нам такие болезни малоинтересны: болеют единицы из миллионов.

Но вот другие, вызываемые внешней инфекцией, кажутся актуальными. Правда, на куру папуасов нам наплевать (да и нынешним папуасам племени форе, прекратившим заниматься каннибализмом, тоже). А вот на ГЭ КРС (бешенство коров), которое, вроде, может передаваться людям и реализовываться в одну из форм БКЯ, не совсем. За последние лет двадцать инфицированы и погибли сотни тысяч голов крупного рогатого скота по всей Европе. Забиты и сожжены, «на всякий случай», наверное, миллионы. В СМИ и Сети интернета мелькают леденящие душу рассказы о мучениях зараженных от коров людей, которые обречены. Страны Европы вводят санкции против мяса друг друга. США запретили ввоз донорской крови из Европы. Докторские журналы пишут о возможности заражения бешенством коров ятрогенно (через хирургические инструменты) и через трансплантируемые органы и ткани.

Словом, весь «цивилизованный» мир «стоит на ушах» (иной раз забывают даже про Бен-Ладена). Некоторые специалисты зловеще предсказывают к 2010 г. сотни тысяч смертей любителей говядины. И т. д., и т. п.

Что нам с этого?

С одной стороны, большинство потребляемого в России мяса — импортное, причем много из Европы. Потеряла Россия, понимаешь, «продовольственную независимость» (как и остальную тоже). С другой стороны, имеющаяся специализированная именно на анализе прионов лаборатория ветеринарного контроля во Владимирской области (единственная в России), обследовав к настоящему времени порядка 1000 проб импортного мяса, ничего не обнаружила. Нет сведений также и о том, что кто-то в России болеет БКЯ или умер от нее. И, наконец, с «третьей стороны»: по многим данным, в мясе нет прионов. Говорят, правда, что они могут попасть туда как загрязнение из мозга при разделке туш. Наверное, пока в продающееся в России мясо не попало.

Да и в Европе умерло от инфекционной формы БКЯ немного — менее 100 человек (в России же убивают за день больше, и больше погибает при транспортных катастрофах).

Можно сделать вывод, что проблема коровьего бешенства сильно раздута и более связана с «экономической войной» как между государствами Европы, так и между Европой и Америкой. Между долларом и евро. Даже на Западе имеются гораздо более животрепещущие проблемы.

Для нас же это, полагаю, ныне малоактуально. Для нас дóроги и не нужны (во всяком случае — пока) работы как по поиску антиприонных препаратов, так и по созданию методов прижизненной диагностики БКЯ. Сомневаюсь также, что оставшиеся жалкие огрызки от биологического мира России способны сделать в данном направлении что-то значимое. Оставшиеся опущенные кадры будут только требовать деньги (что вполне понятно и простительно) и раздувать щеки, оповещая в СМИ о «больших успехах» (не будет их, успехов этих).

Гораздо актуальнее для России наркомания, ВИЧ, пьянство (в особенности пивное), загрязнение окружающей среды автомобилями, экономическая нестабильность, моральное уродование молодежи и другие нехорошие вещички.

Понятно, что всего 1000 партий импортного мяса, обследованных лабораторией во Владимирской области, это капля в море, и, конечно, быть абсолютно уверенным в том, что мы не съели мясо или колбасу из Европы с патогенными прионами, нельзя. Но тут надо исходить из концепции приемлемости различных рисков. Думаю, что риск заболеть БКЯ тем, кто живет в стране, где каждый день происходит масса убийств, где взрывают дома и где сидят без тепла, должен казаться смехотворным. Да он и в самом деле невелик, как следует из представленных в обзоре данных на настоящий момент.

Однако, на мой взгляд, мозги и мозговые кости любых животных нам из рациона следует исключить. Языки тоже не есть. Несмотря на то, что трубчатые кости и языки относятся к категории продуктов «малого риска». И это — единственное, что мы можем сделать для профилактики коровьего бешенства. Тревожиться же о нем нам надо только в плане курсов доллара и евро.

1. Кеньон Д., Стейнман Г. Биохимическое предопределение / Пер. с англ. А.Л. Бочарова. М.: Мир. 1972. — 336 с.

2. http://www.krugosvet.ru/articles/39/1003914/1003914a1.htm

3. Stu. B. Prions Research ascelerates // Chem. and Eng. News. 1998. V. 76. № 6. P. 22–29.

4. Manfred E. Prions or the kinetic basis of prion diseases // Biophys. Chem. 1997. V. 63. № 1. P. 1–18.

5. Sarfati J. Origin of life: the polymerization problem // Creation ex Nihilo. 1998. V. 12. № 3. P. 281–284.

6. Prusiner S.В. // Science. 1982. V. 216. P. 136–144.

7. Мецлер Д. Биохимия. В 3-х томах. Т. 1. М.: Мир. 1980. — 408 с.

8. Рукосуев В.С., Жаворонков А.А. // Прионовые болезни и амилоидоз головного мозга. Архив патологии. 1999. № 2 (электронная версия).

9. Seilhen D., Lawrini P., Duyckaerts C. et al. Trans missible Subacute Spongioform Encephalopathies: Prion Diseases / Eds L. Court, B. Dodet. Paris, 1996. P. 421–423.

10. Лалянц И. Сайт «Знание — сила».

11. Pan K.-M., Baldwin M., Nguyen J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. V. 90. P. 10962–10966.

12. Gaydusek D.C., Gibbs C.J., Alpers M. // Nature. 996. V. 209. P. 794–796.

13. Петров Н.И. http://www.vetlab.spb.ru/stat_bse.html

14. Маркина Н.В. http://www.chem.msu.su/rus/journals/chemlife/2001/cow.html

15. Сайт ВНИИ мясной промышленности. Лаборатория микробиологии и гигиены производства. 2001 г. vniimp@mail.ru

16. 4. Немецкая волна. Архивы радиожурналов 1998–2000 гг. Наука и техника 11.12.00. http://www.dwelle.de/russian/archiv_2/w111200.html

17. Любарев А.Е. Причина многих болезней — неправильное сворачивание белка. http://lyubarev.narod.ru/science/MISFOLD.htm

18. Богомолова В. Газета «Комок». ttp://www.komok.ru/article.cfm?c=3&s_id=1395

19 Мастыкина И. Грозит ли нам коровье бешенство? ЗАО «Издательский дом Совершенно секретно». 2003. http://sovsekretno.ru/2001/03/10.html

20. Ryder S.J., Wells G.A., Bradshaw J.M., Pearson G.R. Inconsistent detection of PrP in extraneural tissues of cats with feline spongiform encephalopathy // Vet. Rec. 2001. V. 148. № 14. P. 437–441.

21. http://www.prions-ua.org/Ukr/Monographies/Prions_rus/Others.shtml

22. Gaydusek D.С. Fields Virology / Eds B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley. Philadelphia, 1995. P. 2851–2901.

23. Bartz J.C., Kincaid A.E., Bessen R.A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection // J. Virol. 2003. V. 77. № 1. P. 583–591.

24. Смирнов Ф. Доберется ли до России болезнь-призрак? Мед. газета) № 10, 2001 (электронная версия) http://www.rusmedserv.com/article/articleview/1092/1/251/

25. Эватт Б. Болезнь Крейцфелдта-Якоба и гемофилия: оценка степени риска. http://www.hemophilia.ru/medicine/kc.html

26. Hill A.F., Zeidler M.Z, Ironside J. et al. // Lancet. 1997. V. 349. P. 99–100.

27. Болдырева Е. http://www.vremya.ru/2001/49/2/10617.html

28. Lucker E., Hardt M., Groschup M., Berl H. Detection of CNS and PrPSc in meat products // Munch Tierarztl Wochenschr. 2002. V. 115. № 3–4. P. 111–117.

29. Peretz D, Williamson R.A., Kaneko K, et al. Antibodies inhibit prion propagation and clear cell cultures of prion infectivity // Nature, 2001. V. 412. № 6848. P. 739–743.

30. Korth C, May B.C., Cohen F.E., Prusiner S.B. Acridine and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion disease // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. V. 98. № 17. P. 9836–9841.

31. Supattapone S., Nguyen H.O., Cohen F.E., Prusiner S.B. et al. Elimination of prions by branched polyamines and implications for therapeutics // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. V. 96. № 25. P. 14529–14534.