В мире незримого

Новые методы, новые вакцины

Поиски методов получения новых живых вакцин проводятся на основе современных научных данных об изменчивости микроорганизмов. Раскрывая тончайшее строение и химический состав микробной клетки и вирусной частички, изучая их физиологию и биохимические свойства, выясняя роль и значение рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот (РНК и ДНК), ученые раскрыли тайны передачи наследственных свойств микроорганизмов.

Генетика микроорганизмов за последние десятилетия достигла колоссальных успехов, имеющих огромное теоретическое и вместе с тем практическое значение. Для получения полноценных культур микроорганизмов в производстве вакцин открылись новые перспективы.

Направление и характер исследований по генетике микроорганизмов, как пишет академик В. Д. Тимаков, существенным образом изменились после того, как Эвери Мак-Леод, Мак-Карти установили, что причиной феномена трансформации пневмококков, который наблюдал Грифит, является ДНК. Эти исследования явились новым революционизирующим этапом в изучении закономерностей наследственности и изменчивости, роли нуклеиновых кислот, их структуры и функции, в познании природы гена и его функционирования, в создании основ молекулярной биологии.

Идеи Пастера и созданные на основе принципов аттенуации микробов живые вакцины против сибирской язвы и бешенства стали историческими вехами в развитии вакцинопрофилактики инфекций.

Шли годы, десятилетия. Иммунология и практика здравоохранения обогатились новыми препаратами, но, несмотря на усиленные поиски иммунологов во всем мире, живых вакцин против холеры, дизентерии и сыпного тифа получить не удавалось. Исследователи столкнулись с трудностями в создании методов ослабления микробов, которые вытекали из своеобразия биологических особенностей возбудителей этих инфекций.

В отношении возбудителей сыпного тифа (риккетсий) и других заболеваний (риккетсиозов) были дополнительные преграды, связанные с трудностями культивирования этих микроорганизмов.

Что же касается дизентерии и холеры, необходимо было искать или создавать такие разновидности возбудителей, которые, вызывая легкие (субклинические) формы инфекции, были бы безопасными для вакцинируемых и окружающих их людей.

Создание живых вакцин против холеры и дизентерии также было весьма трудным из-за обилия видов и типов микробов — возбудителей этих инфекций. Приведем некоторые примеры: в дизентерийной группе существуют бактерии Григорьева-Шига, Флекснера, Зонне, Шмитц-Штуцера и ряд других. Среди холерных: вибрионы азиатской холеры (классические биотипы), вибрионы Эль-Тор, известна группа холероподобных вибрионов. Сложными оказались механизмы возникновения и развития таких заболеваний, как дизентерия и холера, места локализации возбудителей в организме, особенности поражения, в частности в кишечнике.

На этом фоне особенно значительны успехи иммунологов, сумевших преодолеть многочисленные трудности, найти новые методы создания живых вакцин и способы введения их в организм. И хотя новые живые вакцины еще во многом являются достоянием эксперимента, но то, что сегодня имеет большое научно-теоретическое значение, завтра войдет в практику здравоохранения и принесет свои плоды.

Живая вакцина против дизентерии. Возбудители дизентерии попадают в организм через рот с загрязненными ими пищевыми продуктами и водой. Проникая в толстый кишечник, они оседают там, размножаются в клетках слизистой оболочки и вызывают острый воспалительный процесс, сопровождающийся местным кровоизлиянием. Следовательно, дизентерия — это кишечная инфекция, где дизентерийные бактерии ведут себя в толстом кишечнике как внутриклеточные паразиты. Все эти соображения оказались важными для разработки способов вакцинации против дизентерии.

Перед исследователями возникли многие вопросы. Как создавать вакцину? Из каких бактерий? Как иммунизировать? Подкожно вводить вакцину или внутрь через рот? Конечно, иммунитет — это особое состояние всего организма, которое создается многими гуморальными и клеточными факторами защиты, а каково значение местных механизмов защиты, имеющих непосредственное отношение к кишечнику? В последние годы — ученые стали придавать большое значение местным факторам защиты кишечника. Профессор Н. Н. Гинсбург, ссылаясь на мнение ряда советских ученых, пишет: «…способность возбудителя дизентерии к внутриклеточному паразитизму позволила сформулировать новые представления о патогенезе[14] этой инфекции. Изменились соответственно и взгляды на иммунитет при ней: местным механизмам защиты придается теперь первостепенное значение». Исходя из этого укрепились и взгляды известного микробиолога А. М. Безредка, обосновавшего в свое время принцип введения вакцин внутрь через рот. Правда, Безредка создавал свои вакцины из убитых микробов. Более перспективными, сулящими вместе с тем и большую эффективность были бы живые вакцины, и, хотя это несравненно более трудный путь, ученые взялись за осуществление этой идеи.

Прежде всего начались поиски бактерий, из которых можно было бы готовить живую вакцину. Хотя цель была одна — создание живых вакцин, пути и методы ослабления вирулентности дизентерийных бактерий оказались разными. Исследования проводились в СССР, США, Югославии, Румынии.

Остановимся на методах исследования, они введут нас в сложный мир творческих поисков ученых разных стран. Американские ученые, наблюдая за изменчивостью свойств дизентерийных бактерий под влиянием физических и химических воздействий, обратили внимание на то, что один из измененных вариантов потерял способность проникать в клетки слизистой оболочки кишечника у экспериментальных животных, вызывать поражение кишечника и смерть. Иначе говоря, полученная разновидность резко отличалась от исходной («родительской»), которая была вирулентной и вызывала смерть морских свинок. Стали проверять стойкость новых свойств у бактерий, а самое главное, возможность с помощью таких невирулентных бактерий создавать иммунитет.

Опыты, поставленные на морских свинках и обезьянах, дали обнадеживающие результаты. Во-первых, микробы оказались стойко невирулентными; во-вторых, введение через рот морским свинкам и обезьянам создавало иммунитет, защищающий их от заражения вирулентными дизентерийными бактериями, но… Выявилась важная подробность. Иммунитет создавался только против того типа дизентерийных бактерий, из которого состояли вакцины.

Полученные результаты потребовали поисков других вариантов бактерий. Исследования привели к новым успехам. Понадобилось применение лишь новых методов. Как прав был великий русский ученый И. П. Павлов, который говорил, что метод определяет прогресс науки. В чем же заключались новые методы? Ученые на основе достижений генетики[15] и, в частности, изучения хромосомного ^[16] аппарата болезнетворных дизентерийных бактерий и безвредных кишечных палочек путем скрещивания получили микроб-гибрид. И вот при указанном скрещивании дизентерийные бактерии потеряли способность вызывать дизентерию, но оказались в состоянии создавать иммунитет. Опыты на морских свинках и обезьянах доказали это. Выяснилось, что при введении внутрь (через рот) микробы-гибриды проникали в толстый кишечник, вызывая быстро проходившую легкую воспалительную реакцию. Видимо, эта специфическая реакция, вызванная ослабленными дизентерийными бактериями, и создавала невосприимчивость (иммунитет) к дизентерии. Углубленное, изучение этого процесса показало, что в организме иммунизированных обезьян вирулентные дизентерийные бактерии не способны проникать в клетки слизистой оболочки кишечника и вызывать в них поражения.

Это было большим успехом иммунологии, использовавшей новейшие достижения генетики микробов. На строго научную основу были поставлены дальнейшие исследования по получению новых гибридов дизентерийных бактерий. Ведь существует много различных дизентерийных бактерий, а иммунитет нужно создавать против важнейших из них. За последние годы ученые получили гибриды дизентерийных бактерий Флекснера и Зонне. В наше время именно эти представители группы дизентерийных бактерий играют наиболее важную роль в распространении дизентерии. Так были созданы сложные поливакцины («поли» — по-гречески много) из различных вариантов дизентерийных бактерий, показавшие большую эффективность в опытах на обезьянах.

В Советском Союзе и Румынии успешно были проведены опыты культивирования вирулентных дизентерийных культур Флекснера и Зонне на искусственных питательных средах. Из микробов, утративших вирулентность, были приготовлены вакцины в сухом виде и, в частности, в виде драже, которые вводятся через рот. Опыты, проведенные на экспериментальных животных, показали их безвредность и способность вызывать иммунитет.

Поиски продолжаются

Заглянем в лаборатории других исследователей и познакомимся с их творческими устремлениями. То, о чем было рассказано, касалось создания живых вакцин из микробов, ослабленных теми или иными путями, потерявших способность вызывать заболевания, но сохранивших свойства создавать иммунитет.

Но горизонты науки поистине безграничны. Нередко факты, получаемые при изучении одних свойств микробов, оказываются полезными для решения совершенно других вопросов. В науке уже давно было установлено, что микробы привыкают к антибиотикам; одни становятся устойчивыми к ним (это сказалось, например, на снижении лечебной эффективности таких замечательных антибиотиков, как пенициллин или стрептомицин); другие микробы без этих антибиотиков ни в искусственных питательных средах, ни в организме человека и животных размножаться не могут. Это привело ученых к мысли изучить такие культуры дизентерийных бактерий в качестве вакцин для профилактики дизентерии. В сущности, антибиотикозависимые культуры микробов, это не живые ослабленные вакцины, а лишь микробы, потерявшие способность размножаться без того или иного антибиотика.

Итак, у исследователей появились принципиально новые пути и методы для решения проблемы создания иммунитета против дизентерии (а быть может, и других инфекций). То, что сегодня получено в эксперименте, завтра, быть может, станет достоянием практики. Только суровая проверка в жизни докажет, какой из методов окажется более приемлемым и какая живая вакцина более перспективной для профилактики дизентерии.

Живая вакцина против холеры. Грозное заболевание — азиатская холера — в прошлом не раз угрожала человечеству. До настоящего времени на земном шаре в ряде стран еще сохранились постоянные очаги холеры, откуда эпидемии распространяются на другие страны. Борьба с холерой и поиски эффективных мер профилактики, в частности вакцинации, остаются неотложными до наших времен.

Попытки использовать живую культуру холерных вибрионов в качестве вакцины сделал в конце XIX столетия в Испании ученый X. Ферран. Это был смелый опыт введения под кожу живых вибрионов, но методика приготовления такой живой вакцины ничего общего не имела с пастеровскими принципами ослабления вирулентности возбудителей. Технология приготовления вакцины была несовершенной и имела серьезные недостатки. Хотя Ферран вакцинировал в Испании 50 000 человек, признания его вакцина не получила и имеет лишь историческое значение как первая попытка прививок против холеры живыми вибрионами.

Отечественный микробиолог В. А. Хавкин создал на принципах Пастера более современную вакцину для тех времен (1888 г.). Вакцина вводилась подкожно дважды: первая прививка производилась ослабленными вибрионами, вторая — вирулентными. Благодаря первой прививке организм приобретал уже достаточной силы иммунитет, чтобы без опасений вводить живые вирулентные холерные вибрионы.

На новой научной основе уже в наше время (1963 г.) живую вакцину создал индийский ученый Мукерджи. Выделив из воды невирулентные штаммы (разновидности) вибрионов Эль-Тор[17], сходные по важнейшим свойствам с холерными вибрионами, Мукерджи использовал эти культуры в качестве вакцины. Будучи убежденным сторонником взглядов на холеру как заболевание кишечного тракта и желая создавать иммунитет кишечника, ученый предложил вводить свою вакцину через рот. Мукерджи полагал, что введенная таким образом вакцина из живых слабовирулентных вибрионов сможет вызвать легкий процесс в кишечнике, который создаст как местный, так и общий иммунитет.

В 1965 г. ученый ввел свою вакцину десяти добровольцам. Вакцина оказалась безопасной, ни один из них не заболел. Открылись перспективы для более массовых наблюдений. Будущее покажет, будет ли вакцина Мукерджи тем препаратом, которого ожидает медицина.

Вакцина против сыпного тифа. История сыпного тифа богата драматическими событиями. Эпидемии сыпного тифа в дореволюционной России были страшным народным бедствием. Особенно широкие масштабы эпидемия сыпного тифа приняла в годы гражданской войны. Жертвы были и среди ученых, часто ставивших на себе опыты самозаражения во имя спасения человеческих жизней. В этих условиях шла напряженная работа по созданию вакцины для профилактики сыпного тифа.

Вакцины создавались одна за другой. Это большая страница истории иммунологии. Поиски давали удачи и разочарования. Последних было гораздо больше, слишком уж сложна была проблема. Чтобы хоть в некоторой степени представить трудности, стоявшие перед учеными на пути их исследований, кратко остановимся на ряде идей и методов их осуществления.

Большим событием в микробиологии начала XX столетия (1909–1916 гг.) было открытие возбудителей сыпного тифа — риккетсий Провачека[18]. Это важное открытие омрачила лишь смерть ученых Риккетса и Провачека, погибших на эпидемии сыпного тифа. В их честь микробы — возбудители сыпного тифа получили название «риккетсии Провачека». С этого времени начались многолетние поиски вакцин против сыпного тифа. Проследим эти важнейшие вехи.

Так как риккетсии на искусственных питательных средах не росли (методы культивирования были созданы позже), поиски, естественно, пошли по пути использования органов зараженных животных. Применение мозга зараженных морских свинок для приготовления вакцины казалось весьма заманчивым. У этих животных легко было вызвать сыпнотифозную лихорадку. В мозгу заболевших морских свинок (да и во внутренних органах) скапливалось много риккетсий. Следовательно, думали ученые, если взять мозг заболевших свинок, обработать его химическими и физическими способами, чтобы убить риккетсии, то можно получить вакцину. Но чем бы ни убивали возбудителей в мозгу, убитая нейровакцина не создавала иммунитета. От этой идеи пришлось отказаться.

Когда советским ученым М. К. Кронтовской и М. М. Маевскому и французскому ученому П. Дюрану удалось заразить через дыхательные пути белых мышей и вызвать у них сыпнотифозный процесс с обильным накоплением риккетсий в легких, создание вакцины получило более успешное завершение. Вакцину стали готовить из растертых и обработанных формалином легких зараженных мышей. В Советском Союзе вакцины Кронтовской и Маевского применялись на практике как важнейшее вспомогательное средство в борьбе с сыпным тифом. Особенно важно это было в годы Великой Отечественной войны. Вакцинация против сыпного тифа стала важным дополнением к другим общегосударственным гигиеническим и оздоровительным мероприятиям.

Фантастические опыты

Ученые никогда не останавливаются на достигнутом. Поиски новых более эффективных вакцин продолжались. Профессор В. А. Барыкин решил культивировать возбудителей в желточных мешочках куриных эмбрионов (зародышей). Идея заключалась в том, чтобы вместо экспериментальных животных использовать яйца кур. Задачу эту блестяще разрешил английский микробиолог X. Кока Действительно, в желточном мешке куриного зародыша, богатом естественными питательными веществами, представилась возможность культивировать и получать в неограниченных количествах риккетсии, а затем так называемую яичную вакцину. И действительно, вакцина оказалась более эффективной.

Рассказывая об этих замечательных экспериментах, мы не придерживаемся хронологического порядка. Нам хотелось раскрыть перед читателями лишь развитие идей ученых и воплощение этих идей в эксперименте.

С поисками вакцин против сыпного тифа связаны удивительные исследования. Для эксперимента ученые выбирали не только животных, но и насекомых, например вшей, которых надо было искусственно заражать риккетсиями и придумывать для этого совершенно фантастическую методику и технику.

Итак, ученые уже хорошо знали, что риккетсии могут находиться не только в организме больных людей и животных, но также в кишечнике зараженных вшей. Так не использовать ли их для приготовления вакцин? Не воспользоваться ли этой естественной «биологической пробиркой», в которой можно накапливать множество риккетсий? Мысль совершенно фантастическая. Многих отталкивала в этом неэстетичность экспериментов со вшами, но энтузиасты преодолели и трудности, и насмешливые улыбки коллег. А трудности были совершенно исключительными. Как, например, заражать вшей, чтобы получить массы риккетсий? Польский микробиолог Р. Вейгль решил эту проблему весьма своеобразно. Он создал специальный станочек с капиллярной стеклянной трубочкой, с помощью которой взвесь риккетсий вводится в виде микроклизмы в анальное отверстие. Эта тонкая работа проводилась с помощью пинцетов и под контролем увеличительных луп. Через несколько дней после такой микроклизмы в кишечнике вшей происходило такое накопление риккетсий, что несколько десятков кишечников вшей хватало на три прививки человеку. Как ни тонка и своеобразна была методика заражения вшей, но дальше требовалась подлинно филигранная работа по выделению кишечников, и это тоже было сделано. Кишечники собирались в ступку и растирались, а затем обрабатывались фенолом для умерщвления риккетсий. Хотя вакцина Вейгля обладала несомненной эффективностью и ею было привито около миллиона человек, сложность техники приготовления ограничила более широкое ее применение на практике.

Теперь вакцина Вейгля имеет лишь научно-историческое значение. Однако дело заключалось не только в сложности технологии приготовления вакцины. Для массового приготовления вакцины Вейгля нужно было очень большое количество вшей. Надо было обеспечить их размножение и кормить человеческой кровью. И вот кормление было организовано на людях — донорах. Для этого десятки и даже сотни вшей помещали в специальные камеры-кормилки, похожие на футляры часов на ремешке (с одной стороны камеры имели сетки). Камеры прикрепляли к коже рук или ног людей, причем сторона с сеткой была обращена к коже. Через отверстия в сетке вши набрасывались на кожу донора и сосали кровь. На эту мучительную процедуру массового кормления вшей ради заработка шли безработные, которых в капиталистической стране, где работал Вейгль в те годы, было всегда много.

Совершенно иную методику кормления вшей предложил советский микробиолог профессор А. В. Пшеничное. Кормление и вместе с тем заражение производили либо кровью сыпнотифозных больных, либо кровью здоровых людей, к которой добавляли риккетсии. Используя естественный инстинкт вшей кусать кожу, на камеры-кормилки натягивали тонкую биологическую перепонку (мембрану) из кожи трупа. Эта биологическая мембрана получила название «эпидермомембрана», так как для создания перепонки брался эпидермис, т. е. тонкий наружный поверхностный слой кожи. Через эту оболочку, которую вши прокалывали, и происходило сосание крови. Из нимф (стадия развития вшей) зараженных вшей готовили вакцину.

Методика советских ученых не только значительно упрощала технологию Вейгля. Самое главное заключалось в том, что для кормления вшей были не нужны люди-доноры. Так в разных социальных условиях по-разному решалась одна и та же научная проблема.

Со времен классических работ Пастера по аттенуации (ослаблению) микробов в иммунологии прочно установилось мнение, что живые вакцины лучше убитых. Так не пойти ли по этому пути и в создании живых сыпнотифозных вакцин. Ученые избрали этот трудный путь и были вознаграждены большими научными успехами.

В настоящее время живая вакцина получена и проходит успешное изучение на практике. Готовится живая вакцина из разновидности риккетсий Провачека, получившей название штамма Е, потерявшего свою вирулентность. Как же был получен такой безвредный штамм (разновидность) риккетсий? Испанские ученые Г. Клаверо и П. Галлардо выделили из крови сыпнотифозного больного риккетсии. Для культивирования и изучения их пассировали, т. е. перевивали через куриные эмбрионы, в которых размножались риккетсии. Ими снова заражались свежие куриные зародыши. Так длительное время можно сохранять риккетсии. Ученые обратили внимание на то, что в результате пассажа риккетсии потеряли свою вирулентность (способность заражать) и не вызывали экспериментальный сыпной тиф у чувствительных животных. Но самое важное заключалось в том, что вирулентные свойства риккетсий снизились, а способность вызывать иммунитет сохранилась. Это именно то замечательное свойство, которым должны обладать живые вакцины. Началось изучение живой вакцины в эксперименте на животных и проверка эффективности на людях в разных странах. Большая и разносторонняя работа проведена в СССР в лаборатории лауреата Ленинской премии академика АМН СССР П. Ф. Здродовского с сотрудниками Е. М. Голиневич и В. А. Яблонской. В результате был сделан вывод: живая вакцина может быть рекомендована для применения по специальным показаниям.

Современная живая сыпнотифозная вакцина является комбинированной и состоит из штамма Е в смеси с растворимым антигеном вирулентного штамма Брейнль риккетсий Провачека.

Итак, иммунология, «смотрящая в завтра», стоит на пороге получения вакцин и против других инфекций.