Биологическая защита растений

6.1. МИКРООРГАНИЗМЫ — АНТАГОНИСТЫ ФИТОПАТОГЕНОВ

6.1.1. ГРИБЫ

Важную роль в подавлении развития болезней растений играют грибы-антагонисты. Причем по сравнению со всеми другими группами микроорганизмов грибы обладают наиболее широким спектром антагонистических свойств — гиперпаразитизмом, конкуренцией за питательный субстрат, кроме того, они продуцируют антибиотики и другие вещества, угнетающие жизнедеятельность фитопатогенов. Большинство грибов, способных подавлять развитие возбудителей болезней растений, относится к несовершенным грибам.

Грибы рода Trichoderma (отдел Deuteromycota, пор. Hypho-mycetes). Антагонистические свойства грибов этого рода хорошо изучены. Его представители могут подавлять развитие других микроорганизмов, в том числе фитопатогенов, и путем прямого паразитирования, но превалирует антагонизм. Они продуцируют целый ряд антибиотиков (виридин, глиотоксин и др.). Виды трихо-дермы подавляют развитие преимущественно почвенных фитопатогенов — грибов из родов Fusarium, Pythium, Phoma, Phytophthora, Altemaria, Botrytis и других возбудителей болезней растений.

В процессе взаимодействия паразитических штаммов грибов рода Trichoderma и гриба-хозяина выделяют три фазы (Lorito, Woo, 1998).

1. Первоначальное взаимодействие и узнавание хозяина. Штаммы Trichoderma обладают хорошо выраженным хемотаксисом, т. е. они растут по направлению к гифам гриба-хозяина, реагируя на метаболиты, выделяемые из их клеток под действием экзоферментов триходермы, способных к разрушению клеточной стенки.

2. Физическое и молекулярное взаимодействие с хозяином.В этот период штаммы триходермы выделяют комплекс антигрибных веществ, ферментов, антибиотиков. Затем паразит оплетает гифы гриба-хозяина, формирует структуры, сходные с аппрессориями, и перфорирует клеточную стенку (Chet, 1997). Причем одни штаммы способны атаковать хозяина антибиотиками и ферментами до физического контакта, а затем сапротрофно колонизировать мертвые клетки, другим для активизации ферментов, разрушающих клеточные стенки, необходим физический контакт гиф с мицелием хозяина

3. Полная колонизация хозяина. Микопаразити-ческие штаммы Trichoderma проникают в мицелий хозяина и активно растут внутри клеток, приводя их к гибели. Ферменты паразита (хитиназы, целлюлазы, глюканазы) размягчают клеточную стенку хозяина, способствуя проникновению через нее гиф и антибиотиков.

В биологической защите растений используют разные виды триходермы.

Trichoderma viride (lignorum) (Fr.) Pers. Грибница хорошо развита, сначала белого, затем зеленого цвета, с желтыми участками. Конидиеносцы разветвленные, септированные. Фиалиды размером 8...14х2,4...3 мкм, внизу расширенные. Споры овальные, мелкошиповатые, длиной 3,5...4,5 мкм. Хламидоспоры длиной до 14 мкм (рис. 24, а).

Trichoderma hardanum Rif. На сусло-агаре колонии быстрорастущие, зональные, опушенные хлопьевидным воздушным мицелием. Оборотная сторона неокрашенная. Хламидоспоры шаровидные, бесцветные, интеркалярные, диаметром 6...12 мкм. Фиалиды ампуловидные, размером 5...7хЗ...З,5 мкм. Споры гладкие, зеленые, размером 2,8...3,2 х 2,8...5 мкм. На среде Чапека колонии зональные, светло-зеленые, затем буровато-зеленые.

Trichoderma koningii Oud. Колонии мощные, темно-зеленые. Хламидоспоры интеркалярные и терминальные, шаровидные или эллиптические, длиной до 12 мкм. Конидиеносцы до 4 мкм в сечении, с зонами компактного и рассеянного ветвления. Фиалиды ампуловидные, размером 7,5...12 х2,5...3,5 мкм. Споры эллиптические, размером 3...4,8 х 1,9...2,8 мкм, в массе желто-зеленые (рис. 24, б).

Грибы рода Trichoderma улучшают структуру и плодородие почвы. Штаммы этих грибов гетерогенны по устойчивости к низким температурам. Во многих странах отобраны холодостойкие антагонистические штаммы, которые используют для защиты овощей и плодов от гнилей при температуре хранения 2...4 °С. Для видов триходермы благоприятны почвы с кислой реакцией, оптимальное значение pH 4...6.

Благодаря высокой пластичности грибы рода Trichoderma широко распространены в почвах на различных континентах. Отдельные штаммы триходермы колонизируют поверхности корней и листьев. Некоторые из них вызывают системную индуцированную устойчивость, а также стимулируют рост растений.

Использование антагонистических штаммов этих грибов направлено в основном на подавление грибов-фитопатогенов, которые в своем развитии связаны с почвой (т. е. возбудителей корневых гнилей и болезней увядания). Есть данные об успешном использовании триходермы против аэрогенной инфекции, например, на основе мицелия Т. harzianum Rif готовят пасту для обмазывания стеблей огурца, пораженных аскохитозом.

В последние годы круг грибных антагонистов, используемых в защите растений, значительно расширился. Показана высокая эффективность использования гриба Gliocladium virens Miller et al., a также грибов рода Chaetomium против корневых гнилей. Против белой гнили подсолнечника применяют Penicillium vermiculatum Dangeard.

Gliocladium virens Miller et al. (отдел Deuteromycota). Перспективный гриб-антагонист. Обладает комплексным действием: является антагонистом возбудителей болезней растений, а также улучшает питание растений, стимулирует их рост. На основе этого

гриба в ИБЗР АН Молдавии создан опытный образец биопрепарата глиок-ладина.

Грибы рода Chaetomium. Грибы этого рода — строгие сапрофиты, разлагающие целлюлозу. Некоторые из них обладают как фунгицидной, так и ростактивирую-щей активностью в отношении многих растений, что обусловлено выделением антибиотиков и других метаболитов, улучшающих гумусный слой почвы и повышающих ее плодородие.

а — плодовое тело; б — сумка со спорами

Chaetomium cochlioides Kunz, Ch. glo-bosum Kunz и др. (отдел Ascomycota, пор. Sphaeriales). Образуют крупные шарообразные или яйцевидные перитеции на рыхлом мицелиальном сером или буром сплетении гиф. Оболочка перитеция перепончатая, непрозрачная, на вершине выводное отверстие. Отличительный признак рода — наличие на перитециях пучков прямых или изогнутых, простых или разветвленных придатков, устройство которых характерно для каждого вида, например, у Ch. globosum Kunz перитеции с волнистыми не-разветвленными волосками (рис. 25). Сумки булавовидные или цилиндрические. Споры одноклеточные, эллиптические или лимоновидные, зрелые — всегда темноокрашенные.

6.1.2. БАКТЕРИИ

Использование бактериальных антагонистов основано главным образом на механизме антибиоза, регулирующем взаимоотношения полезных и вредных (с точки зрения производителя сельскохозяйственной продукции) микроорганизмов. Как указывает М. С. Соколов (1990), антибиоз играет наиболее важную роль в зоне ризопланы (зона ризосферы, окружающая корни и корневые волоски растений в пределах до 100 мкм). Использование регуляторных механизмов направлено не на полное уничтожение популяции фитопатогена, а на существенное ограничение ее развития и снижение вредоносности. Источником получения штаммов бак-терий-антагонистов служат супрессивные почвы, в которых фитопатогены либо угнетены, либо элиминированы. В настоящее время бактериальные препараты против болезней растений в основном производятся на основе бактерий двух родов — Pseudomonas и Bacillus.

Бактерии рода Pseudomonas. В одной из предыдущих глав псевдомонады были описаны как потенциальные возбудители болезней насекомых. Однако наиболее распространены сапротрофные псевдомонады, заселяющие ризосферу как естественные регуляторы фитопатогенных микроорганизмов. К ним относятся Pseudomonas fluorescens Mig., P.putida (Trevisan) Mig., P. aureofaciens Kluyver и другие виды.

Благодаря наличию в ризоплане растений Р. fluorescens Mig. и других флуоресцирующих псевдомонад нейтральные или слабощелочные почвы обладают супрессивными свойствами. Бактерии хорошо усваивают различные органические субстраты, характеризуются быстрым ростом, продуцируют антибиотики, бактериоци-ны и сидерофоры, а также стимуляторы роста. Благодаря этим свойствам псевдомонады оказывают защитное действие от фитопатогенов и стимулируют рост растений.

Среди антибиотиков, продуцируемых псевдомонадами, обнаружены феназин-1-карбоновая кислота, производные флороглю-цина (пирролнитрин и др.). В настоящее время гены или кластеры генов, ответственных за синтез антибиотиков у псевдомонад, клонированы, благодаря этому их можно переносить в другие штаммы. Такие штаммы как агенты биологической защиты должны успешно конкурировать с другими микроорганизмами ризосферы и выживать в течение длительного периода. Это в значительной мере обеспечивает способность к синтезу разнообразных антибиотиков. Следует отметить, что пирролнитрин, выделенный из Р. pyrrocinia, в 1964 г. использовался в защите растений. К сожалению, это вещество оказалось нефотостабильным. Однако его искусственно синтезированные фотостабильные аналоги — фенп-риклонил (препарат группы БЕРЕТ) и флудиоксонил (препарат группы МАКСИМ) широко используются в качестве фунгицидов.

Важную роль в ограничении численности фитопатогенных микроорганизмов играют синтезируемые псевдомонадами сидерофоры — соединения, осуществляющие транспорт железа. Их отличительная способность — образование стабильных комплексов с трехвалентным железом. Связывая ионы трехвалентного железа в почве, сидерофоры лишают многие виды фитопатогенных грибов необходимого элемента питания, что приводит к остановке развития последних. К сидерофорам относится псевдобактин (пиовер-дин), полученный из разных видов Pseudomonas, желто-зеленый пигмент с м. м. около 1500 Да.

Показано, что псевдобактин ингибирует рост Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Phytophthora megasperme и других грибов, a также некоторых бактерий, например Erwinia carotovora. Псевдомонады продуцируют сидерофоры лишь в условиях дефицита железа, поэтому использование штаммов с высокой сидерофорной активностью не всегда оказывает защитное действие.

Установлено, что подавление прорастания хламидоспор Fusarium oxysporum сидерофорами происходит при концентрации железа в почве 10^_22...10~²⁷ М. Препараты на основе сидерофоров (псевдобактин, агробактин и др.) не только снижают численность популяции патогенов, но и стимулируют рост растений (Соколов и др., 1994).

На возможность использования бактерий рода Pseudomonas для подавления возбудителей болезней растений обратили внимание еще в 1939 г. Е. Ф. Березова и А. Н. Наумова. Выделенные ими штаммы Р. fluorescens Mig. лизировали мицелий фитопатогенных грибов. В 60-е годы XX в. А. А. Пантелеевым изучен вид Р. mycophaga, обладающий не литическим, а фунгицидным и фун-гистатическим действием. Изучение антигрибных свойств этого вида дало положительные результаты в опытах с Altemaria solani, F. solani, Юг. solani и другими фитопатогенами. А. А. Пантелеев предложил предпосевное замачивание корней рассады трматов в культуральной жидкости Р. mycophaga для повышения устойчивости к фузариозному увяданию.

Pseudomonas fluorescens Mig. Палочки размером 0,7...0,8х х 2,3...2,8 мкм. Колонии на МПА круглые, плоские, приподнятые или выпуклые, цельные, гладкие, светопроницаемые, иногда шероховатые. Культуры продуцируют флуоресцирующий пигмент (голубой или слабо-коричневый). Встречаются апигментные штаммы. Этот вид псевдомонад, особенно биовар V, распространен в ризоплане пшеницы, кукурузы, подсолнечника, люцерны и других растений. Разными авторами показана возможность подавления этой бактерией таких фитопатогенных организмов, как Septoria tritici (Levy et al., 1992), Xanthomonas campestris pv. campestris, Erwinia carotovora subsp. carotovora (Джалилов и др., 1994), Agrobacterium tumefaciens (Khmel et al., 1998). Эти данные свидетельствуют о перспективности создания биопрепаратов на основе флуоресцирующих псевдомонад.

Бактерии рода Bacillus. Из аэробных спорообразующих бактерий наибольшее значение как биологический агент подавления численности фитопатогенов имеет Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn. В последние годы получены данные о возможности использования в защите растений от болезней также Bacillus mycoides FI. и Bacillus cereus Frankl.

Например, установлено, что бактерия Bt подавляет рост и вызывает лизис мицелия у Pythium ultimum и F. oxysporum f.sp. lycopersici (Amer et al., 1997). Эти данные представляют большой интерес в связи с перспективой использования бактериальных агентов для одновременного подавления насекомых и фитопатогенов.

Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn. Бактерия известна под названием сенной палочки. Распространена в почве, воде, воздухе. Фрэнсис Крик, выдвинувший теорию панспермии, считал, что эта бактерия благодаря необычайно устойчивым спорам могла выполнять функцию «семян жизни». При расшифровке генома В. subtilis был обнаружен многочисленный набор транспортных белков, что свидетельствует о гибкости взаимодействия этой бактерии с окружающей средой.

Как правило, В. subtilis (Ehrenberg) Cohn, образует на питательной среде выпуклые колонии ризоидной формы. Хорошо растет на МПА, пептонно-кукурузном агаре и других средах. Размер клеток 0,7...0,8 х 2...3 мкм. В почве бациллы находятся в виде спор, или вегетативных клеток. При температурах почвы, близких к 0 °С, большая часть бацилл образует споры. Чем выше pH (щелочные почвы), тем больше процент спор В. subtilis. Бациллы хорошо развиваются в ризосфере ячменя, кукурузы, риса (Смирнов, Кип-рианова, 1990). Они обнаружены также в морской воде и в составе эпифитной микрофлоры.

Бактерии В. subtilis — наиболее продуктивные представители рода Bacillus по синтезу антибиотиков (более 70). Некоторые из этих антибиотиков подавляют рост фитопатогенных микроорганизмов. Например, сотрудниками ГНЦ прикладной микробиологии изучены антибиотики В. subtilis штамма ИПМ 215 (основы препарата бактофит). Методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Силуфол» с последующей оценкой на тест-культуре Verticillium dahlie было установлено, что антигрибным действием обладает вещество с Rf=0,55. Минимальная концентрация, подавляющая рост возбудителя вилта, составляет 10 мкг/мл. По данным спектроскопии ядерного магнитного резонанса, это вещество относится к антибиотикам аминогликозидного ряда.

Рядом авторов выделены разные штаммы культуры этой бактерии, подавляющие фитопатогенные микроорганизмы. Так, в ВИЗР выявлен штамм В. subtilis — 10-ВИЗР, активно ингибирующий прорастание и развитие мицелия фузариевых грибов, что обусловлено синтезом как биологически активных веществ, так и других факторов конкуренции. Другой штамм В. subtilis — М-22-ВИЗР эффективен для защиты томатов от возбудителей бактериозов (Павлюшин, 1998).

В. А. Амбросов с соавторами (1997) получили путем селекции штамм В. subtilis В-40, проявляющий антагонистическое действие по отношению к грибам Verticillium dahliae, Fusarium graminearum, Sclerotinia sclerotiorum, Phytophthora infestans и др.

Другие бактерии. В последние годы отечественными и зарубежными учеными были получены данные об антагонистической активности ряда других бактерий по отношению к возбудителям болезней растений. Так, было показано, что бактерия Serratia marcescens Bizio, известная ранее как возбудитель болезней насекомых, обладает антагонистическими свойствами по отношению к фитопатогенам. Кроме того, установлена антигрибная активность бактерий — симбионтов энтомопатогенных нематод. Так, некоторые изоляты Xenorhabdus nematophilis Thomas et Poinar (из Steinernema carpocapsae) и Xenorabdus bovienii Akhurst et Boemare (из

S.feltiae) полностью ингибировали рост и развитие таких фитопатогенов, как Botrytis cinerea, Pythium colorathum, P. ultimum и др. (Chen, Dunphy, 1994).

6.2. ГИПЕРПАРАЗИТЫ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

В настоящее время известно около 40 видов специализированных гиперпаразитов фитопатогенных грибов. В практике защиты растений используют лишь несколько видов (не считая грибов рода Trichoderma, обладающих комплексным действием): Ampelo-myces quisqualis Ces., Coniothyrium minitans Campb. и др.

завершается достаточно быстро — первые признаки заражения заметны уже через 3...4 дня, на 5...6-й день формируются новые пикниды.

Ampetomyces quisqualis Ces. (= Cicinnobolus cesatii). Пикнидиаль-ный гриб, в естественных условиях паразитирует на мицелии, конидиях и клейстотециях мучнисто-росяных грибов — Erysiphe spp., Sphaerotheca spp., Podosphaera spp. Он заражает структуры хозяина путем прорастания конидий, образования ростковых трубок, которые разрушают клеточную оболочку и проникают в клетку. Пораженная клетка раздувается. Через 3...5 дней в ней закладываются пикниды гиперпаразита, которые постепенно темнеют, придавая мицелию мучнистой росы серый цвет (рис. 26). На поверхности мицелия также образуются пикниды, в которых формируются одноклеточные, бесцветные, одноядерные пикноспоры. С каплями дождя, ветром, насекомыми они разносятся и вызывают новые заражения. Для прорастания пикноспор необходима капельно-жидкая влага. Цикл развития гиперпаразита на хозяине

Coniothyrium minitans Campb.

Darluca filum Cast. Относится к сферопсидальным грибам и пара-

Относится к сферопсидальным грибам, но в отличие от Ampelomyces обычно встречается в почвенной среде, на растительных остатках, склероциях и микро-склероциях различных грибов (Sclerotinia, Claviceps, Botrytis, Sclerotium и др.). Этот гриб разрушает зимующие склероции, существенно снижая запас инфекции фитопатогенов в почве и на ее поверхности.

зитирует на ржавчинных грибах. На пустулах ржавчины гиперпаразит формирует белый мицелий с мелкими темными пикнидами. Поражает фитопатогена в эцио-, телио- и урединостадиях (преимущественно в последней). Для развития этого гриба благоприятна высокая относительная влажность воздуха.

Trichothecium roseum Link, (отдел Deuteromycota, пор. Hypho-mycdales). Часто встречается как сапротроф на растительных субстратах и на спороношениях многих грибов. Развитие грибов-фитопатогенов существенно ограничивается, и на их мицелии образуется ярко-розовый порошащий налет конидиального спороно-шения гиперпаразита. Способность к паразитированию у Т. roseum обусловлена выделением антигрибного антибиотика трихотецина. Антибиотик убивает гифы грибов, что позволяет гиперпаразиту питаться их содержимым.

6.3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕПАТОГЕННЫХ И СЛАБОПАТОГЕННЫХ ВИДОВ И ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ

6.3.1. ВАКЦИНАЦИЯ

Суть вакцинации заключается в том, что предварительная обработка растений авирулентными или слабовирулентными штаммами вируса вызывает повышение устойчивости к вирулентным штаммам. При такой инокуляции развивается латентная (бессимптомная) инфекция, иногда проявляются едва заметные симптомы заболевания.

Вакцинация растений принципиально не отличается от вакцинации человека и животных. В обоих случаях организм приобретает защитные свойства, т. е. иммунитет к инфекции. Однако механизмы иммунитета у животных и растений различны. У первых в крови вырабатываются защитные антитела, подавляющие возбудителя болезни, у вторых эффект вакцинации основан на интерференции вирусов: размножение первоначально введенного вируса служит препятствием для размножения патогенного штамма, проникшего в растение позже.

У вирусов интерференция наблюдается как между видами, так и между разными штаммами одного вируса. Ослабленные штаммы патогенов могут быть выделены из природных источников или получены путем экспериментального мутагенеза.

Механизм интерференции штаммов вирусов, лежащий в основе вакцинации, до сих пор до конца не выяснен, но возможность практически полной защиты вакцинированных растений, например томатов, от наиболее вредоносных заболеваний — деформирующей мозаики и некротических поражений листьев и плодов — в настоящее время не вызывает сомнений. Так, урожай с вакцинированных растений томата обычно на 20...30 % выше, чем с невак-цинированных, пораженных вирусной болезнью. Успеха удалось достичь при вакцинации не только томатов, но и картофеля. Для вакцинации необходимо использовать безвирусные клубни. В фазе двух настоящих листьев проводят вакцинацию слабовирулентным штаммом вируса X картофеля. На 4-й год после заражения слабовирулентным штаммом урожайность вакцинированного картофеля была на 40 % выше, чем у пораженного патогенным штаммом (Романова, Рейфман, 1978).

Этапы технологии вакцинации:

• накопление «вакцинного» штамма вируса на восприимчивых растениях. Так, для накопления вакцинного штамма ВТМ используют турецкий табак, некоторые сорта томата. Растения инокулиру-ют вакцинным штаммом в возрасте 4...6 настоящих листьев и выращивают в течение 30...35 дней в условиях строгой изоляции от случайных источников инфекции;

• получение вакцины. Листья растений-накопителей срезают и используют для приготовления препарата. Вакцинные препараты могут быть представлены тремя формами: сухая вакцина в виде засушенных листьев растений-накопителей; сырые листья растений-накопителей; очищенные препараты самого вируса. Эффективность этих форм приблизительно одинакова;

• вакцинирование. Проводят однократное опрыскивание рассады томатов в фазе семядольных листьев или появления 1 -го настоящего листа. Вакцинируемые растения должны быть свободны от вирулентных штаммов ВТМ. Опрыскивание проводят с помощью различных распылителей (лучше под давлением

3- 10⁵...5 • 10⁵Па) с расстояния 10...15 см. Как правило, рабочие растворы вакцины из сухих листьев готовят из расчета 1 г листьев на 1 л воды; сок из сырых листьев разбавляют из расчета 2 мл сока на 1 л воды. Ампулы с очищенным препаратом разводят водой в зависимости от концентрации вируса в препарате согласно сопроводительной инструкции.

Большое значение для успешной вакцинации имеет не форма вакцинного препарата, а его концентрация, поэтому следует строго соблюдать рекомендации по применению препарата. Инокули-рованные растения необходимо после инфицирования в течение 2...3 сут держать в тени при температуре 18...25 °С.

Ограничения метода вакцинации связаны с опасностью нежелательных мутаций вакцинного штамма, сложностью эффективной инокуляции авирулентной формой патогена, возможностью некоторого снижения продуктивности растений в результате вакцинации, а также с рядом технологических трудностей.

6.3.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ГРИБОВ

В 70-е годы XX в. во Франции на некоторых полях было отмечено явление супрессивности почвы по отношению к возбудителю фузариозного увядания огурца. Другими словами, при наличии патогена в почве и условий, благоприятствующих заболеванию, развитие болезни практически отсутствовало. В опытных условиях было установлено, что это свойство почв утрачивалось при пропаривании и могло быть передано в кондуктивные (т. е. поддерживающие заболевание) почвы путем внесения в них супрессивной почвы примерно 10 % объема. Детальными исследованиями было доказано, что в этом случае супрессивность была обусловлена наличием в почве непатогенных штаммов F. oxysporum.

Биопрепараты Fusaclean и Biophox С, созданные на основе этих штаммов во Франции и Италии, защищают широкий круг растений от фузариозного увядания. Эти штаммы не проявляют антагонистическую активность in vitro, а индуцируют в растениях системную неспецифическую устойчивость. Работа с подобными штаммами ведется и в России, но созданные биопрепараты пока не зарегистрированы.

Агентами биологической защиты растений от болезней служат также продукты жизнедеятельности микроорганизмов, растений и животных, которые будут рассмотрены в следующих главах.