Краткая история биологии. От алхимии до генетики

Глава 13 Молекулярная биология. протеин

XX в. открывал все новые и новые детали метаболизма клетки. Каждая метаболическая реакция, как выяснилось, катализируется каким-то определенным энзимом. Для того чтобы понять природу метаболизма, нужно исследовать данный энзим. Хэрден в своих исследованиях клеточного метаболизма также приоткрыл завесу тайны над энзимами.

Он и еще несколько ученых пришли к заключению, что энзим — очень большая молекула, включающая еще и маленькую молекулу, способную открепиться от большой и пройти через молекулярную мембрану. Эта малая, свободно связанная с большой, молекула была названа коэнзим.

Структуру коэнзима исследовал в 1920-х годах немецкий химик Ганс Карл фон Элер-Челпин. По мере выяснения молекулярной структуры витаминов стало совершенно очевидным, что многие коэнзимы содержат витаминоподобные структуры.

Было установлено, что витамины представляют собой те части коэнзимов, которые организм сам не вырабатывает и поэтому должен потреблять с пищей. Без витаминов коэнзимы не формируются; без коэнзимов, в свою очередь, энзимы бывают неэффективны, и метаболизм расстраивается. В результате возникают авитаминоз и болезнь дефицита витаминов.

Поскольку энзимы представляют собой катализаторы, необходимые организму лишь в небольших количествах, коэнзимы (и витамины) также нужны в небольших количествах. Вот почему следовые количества витаминов бывают насущно необходимы. Легко было установить, что организму необходимы следовые количества таких элементов, как медь, кобальт, молибден, цинк.

Но что же сам энзим? Ранее, при недостатке методического инструментария, ученым была видна только его работа.

Немецкий ученый Леонор Михаэлис (1875—1949) приложил к изучению энзимов правила химической кинетики и в 1913 г. вывел уравнение, описывающее изменение количества продуктов каталитической реакции в разных условиях, подтвердив, что энзимы подчиняются физико-химическим законам, которым подчинены и другие молекулы.

Но какова молекула энзима? Была известна хрупкость молекулы протеина, а энзимы теряют свою активность уже при осторожном нагревании. Был сделан вывод, что энзим — это протеин.

Доказать обратное взялся авторитетный немецкий химик Ричард Вилстеер (1872 — 1942), и его мнение убедило многих.

В 1926 г. вновь поднялся вопрос о протеиновой природе энзимов. Американский биохимик Джеймс Батчелор Самнер экстрагировал энзимы из бобов и назвал энзим уреазой: он катализировал разложение мочи на аммиак и двуокись углерода.

Выполняя экстракцию, Самнер получил на одном из этапов крошечные кристаллы. Он растворил их и получил раствор с концентрированной уреазной активностью. Эти кристаллы были энзимом и удовлетворяли всем тестам на протеин. Уреаза оказалась первым энзимом, доступным в кристаллической форме.

Американский биохимик Джон Хауарт Нортроп (1891 — 1987) в 1930 г. выделил из желудочного сока кристаллический пепсин, протеинрасщепляющий энзим; в 1932 г. он кристаллизовал трипсин, а в 1935 г. — химотрипсин. Оба энзима — протеинрасщепляющие, из поджелудочной железы. Все энзимы доказали свою протеиновую природу.

Развитие новых химических и физических инструментов биологических исследований в первой половине XX в. сделало возможным выявление тонких деталей больших протеиновых молекул, которые являются сущностью жизни.

По сути, возникла новая наука на грани физики, химии и биологии, которая исследовала механизм функционирования органических молекул.

Эта наука — молекулярная биология — стала особо важной после Второй мировой войны.

В 1923 г. шведский химик Теодор Сведберг (1884 — 1971) представил новый метод определения размера протеиновых молекул. Этот метод назывался ультрацентрифугированием. Термическое движение молекул воды поддерживает молекулы протеина в суспензии: на них не действует сила гравитации; однако при центростремительных силах, создаваемых в центрифуге, молекулы протеина оседают. По скорости оседания можно определить молекулярный вес протеина.

Протеин средней массы, например, гемоглобин, имеет молекулярную массу 67 000. Другие протеиновые молекулы еще тяжелее.

Размеры и сложность протеиновых молекул определяют их электрический заряд. Каждый протеин имеет свой положительный или отрицательный заряд, который меняется в зависимости от изменения кислотности среды.

Если протеиновый раствор поместить в электрическое поле, индивидуальные молекулы протеина движутся либо к положительному, либо к отрицательному электроду с определенной скоростью, заданной силой тока, размерами и формой молекулы и т. д. Скорость у каждого протеина строго своя.

В 1937 г. шведский биохимик Арне Вильгельм Каурин Тиселиус (1902 — 1971) изобрел метод электрофоретического и хроматографического анализа. Поскольку каждый компонент раствора движется строго со своей скоростью, их можно разделить. Более того, определенные цилиндрические линзы позволяют видеть изменения дифрагируемого света при прохождении его через раствор. Изменения в рефракции раствора можно сфотографировать. По интенсивности волны света можно подсчитать количество протеина каждого вида в данной смеси.

Были подвергнуты электрофорезу и сфотографированы протеины плазмы крови. Их разделили на фракции, включая альбумин, три группы глобулинов. Оказалось, что фракция гаммаглобулина содержит антитела.

Ультрацентрифугирование и электрофорез зависят от свойств протеиновой молекулы. Но наиболее эффективен способ рентгеновской дифракции. Когда рентгеновский луч проходит через вещество, создается определенное распределение частиц. Х-луч фиксируется на фотопленке, и по рассеянию луча можно идентифицировать протеин.

В 1951 г. американский химик Лайнус Полинг (1901—-1994) показал, что цепь аминокислот в белке имеет форму спирали.

По виду рентгеновской дифракции можно делать математические просчеты. В помощь биохимикам как раз в эти годы были разработаны компьютеры. Первой была обсчитана молекула не протеина, но витамина.

С использованием рентгеновской дифракции и компьютерной обработки впервые в 1960 г. английские ученые Макс Фердинанд Перутц и Джон Коудери Кендрю показали миру трехмерную молекулу миоглобина со всеми наличествующими аминокислотами в ее составе.

Использование физических методов исследования, например дифракции рентгеновских лучей, очень помогает в работе химикам, если предварительно исследована химическая природа составляющих молекулы и получена ее цельная картина. В таком случае физический метод будет направлен на практическое измерение и уточнение.

В случае с протеинами химический прогресс был неспешен. В XIX в. было лишь показано, что молекула протеина состоит из аминокислот. В начале XX в. немецкий химик Эмиль Херманн Фишер (1852 — 1919) определил, как именно аминокислоты соединены между собой в молекуле протеина. В 1907 г. он собрал вместе 15 молекул аминокислот и 3 других в весьма простую молекулу протеиновой субстанции из 18 звеньев.

Но какова структура гораздо более сложных молекул, встречающихся в природе? Какова точная численность каждого типа аминокислот в- данной протеиновой молекуле? Прямого ответа на этот вопрос не последовало, поскольку для него предстояло разбить молекулу протеина на смесь индивидуальных аминокислот и определить относительные количества каждого компонента методами химического анализа.

Для времени, в котором жил Фишер, это было невыполнимо. Некоторые из аминокислот достаточно схожи по структуре между собой, а методы не были столь тонкими, чтобы определить их избирательно.

Ответ на проблему пришел с методикой, впервые увидевшей свет в 1906 г. и основанной на трудах русского ботаника Михаила Цвета (1872 — 1919). Он работал с растительными пигментами и нашел способ отделять один от другого нехимически. Ему пришло в голову дать смеси стекать по трубке, опудренной окисью алюминия. Разные субстанции в смеси пигментов прилипали к частицам порошка с различной силой. По мере промывания смеси свежим растворителем компоненты разделялись, осаждаясь; те, которые притягивались с меньшей силой, промылись вниз первыми; в конце концов смесь была разделена на компоненты, каждый со своим оттенком. Ответ был как бы «написан цветом», поэтому автор назвал методику греческим термином «хроматография» (буквально: «написано цветом»),

Работа Цвета в то время не вызвала интереса, но в 1920-х годах Вилштеер сделал методику популярной. Хроматография стала широко использоваться для разделения смесей.

Необходимая модификация к методике Цвета пришла в 1944 г. и совершила буквально революцию в биохимии. Английские биохимики Арчер Джон Портер Мартин (род. 1910) и Ричард Лоуренс Миллингтон Синг (1914—1994) разработали методику хроматографии на простой фильтровальной бумаге.

Капля смеси аминокислот стекала до конца бумажной полоски, а затем по полоске способом капилляров поднимался специальный растворитель. По мере того как растворитель смачивал высохшие следы смеси, аминокислоты по очереди «поднимались» по бумажной полоске, каждая со своей скоростью. Их положение на полоске определялось наиболее подходящим химическим или физическим методом. Количественный анализ содержания аминокислот можно было провести без особого труда.

Бумажная хроматография завоевала немедленную популярность. Без дорогостоящего оборудования, просто и быстро она позволяла точно разделять сложнейшие смеси. Методика стала приложимой к любой ветви биохимии: в частности, к фотосинтезу по Калвину.

В особенности хроматография позволила определять точные количества аминокислот в молекуле данного протеина, будто то была простая молекула обычного вещества.

Но этого было недостаточно. Химиков интересовало не просто число аминокислот в молекуле протеина, но их последовательность. Число вероятных последовательностей — астрономическое; а, например, в средней по сложности молекуле гемоглобина число разных аминокислот — 500. Число вероятностей положения здесь выражается шестизначной цифрой.

Но и тут пришла на помощь бумажная хроматография. Работая с инсулином, состоящим из 50 аминокислот, английский биохимик Фредерик Сенгер (род. 1918) восемь лет разрабатывал специфичный метод. Он разбил молекулу инсулина, оставив нетронутыми короткие цепочки аминокислот. Их он разделил хроматографически и идентифицировал как их состав, так и порядок соединения. Медленно, но верно Сенгер соединял короткие цепи в более длинные. К 1953 г. был установлен точный порядок аминокислот в молекуле инсулина.

Ценность методики продемонстрировал американский биохимик Винсент дю Виньо (род. 1901). Он применил методику к простой молекуле окситоцина, гормону с восемью аминокислотами в составе. Это было проделано в 1954 г., и полученный синтетический окситоцин по свойствам в точности повторял натуральный.

В 1960 г. была разработана молекула рибонуклеазы с точной последовательностью аминокислот в этом энзиме. На этот раз молекула состояла из 124 аминокислот. Более того, фрагменты молекулы рибонуклеазы могли быть синтезированы отдельно и показали энзиматическую активность. К 1963 г. было обнаружено, что аминокислоты под номерами 12 и 13 (гистидин и метионин) были существенны для энзиматической активности. Это был шаг навстречу точному анализу функций компонентов сложных молекул.

Так была «приручена» молекула протеина.