Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов

Глава 10 Вот они, ядра

Тем временем дела в лаборатории под моим руководством продвигались вперед, медленно, но верно. И все-таки, стоило мне остаться одному, например отгородившись от мира ремнем самолетного кресла или слушая в затемненном зале не слишком интересную лекцию, как прежняя досада возвращалась: ядерную ДНК неандертальцев так и не удалось выделить. Но я знал, я чувствовал, что она там есть, должна быть, и пусть ПЦР хоть сто раз отрицает это. Просто нужно как-то исхитриться достать эту ядерную ДНК.

Очередную попытку в этом направлении предпринял Хендрик Пойнар. Исчерпав терпение в бесплодных попытках отыскать ДНК флоры и фауны, заключенной миллионы лет назад в янтарь, он решил приложить силы к задаче более перспективной. Нам с ним в некотором смысле повезло: я попал на скучную конференцию и от нечего делать обдумывал наши разработки касательно выделения ДНК из помета животных. Например, мы изучали вымершего гигантского наземного ленивца из ледникового периода. Гигантские ленивцы оставили большое количество помета, который археологи окрестили милым научным термином “копролиты”. Даже больше — например, пол в некоторых пещерах в Неваде почти целиком состоит из окаменевших экскрементов гигантского ленивца. В статье 1998 года в Science Хендрик уже обозначил присутствие и сохранность в подобном материале мтДНК. Мы описали процесс реконструирования растительной ДНК из одного такого комка и показали, как с помощью копролитов можно воссоздать меню ленивца, пообедавшего незадолго до своей гибели 20 тысяч лет назад^[43]. Такой прекрасный результат позволял предположить, что окаменевший помет содержит большое количество ДНК, в том числе и ядерной. Я предложил Хендрику попробовать это выяснить.

Хендрик начал с того, что применил наши прошлогодние химические уловки. Еще в 1985-м, когда занимался анализом мумий из Берлина, я заметил, что почти все вытяжки содержат некий компонент, который под ультрафиолетом светится голубым, и что если видишь голубое свечение, то ДНК в экстракте нет. Я не знал, что это за компонент, но наблюдение болезненно врезалось в память из-за тогдашнего разочарования: голубое свечение появлялось вместо розового, на которое я надеялся. По ходу изучения химических процессов, происходящих в тканях тела после смерти и в следующие десятки тысяч лет, мне попалась информация о явлении, известном как реакция Майяра. Этой химической реакцией занимается в основном пищевая индустрия. Так совпало, что моя мать была химиком-пищевиком, и она прислала мне кипу литературы на эту тему. Реакция Майяра происходит, когда нагревают обычные формы сахара или же подвергают их длительному воздействию сравнительно невысоких температур. В результате сахар образует связи с аминогруппами из белков и ДНК, и получаются длинные, спутанные молекулярные комплексы. Эта реакция запускается в разных процессах приготовления пищи; например, цвет и приятный запах свежеиспеченного хлеба являются ее побочными эффектами. Но меня интересовал не запах и цвет, а то, что продукты реакции в ультрафиолете светились голубым. Я подумал: а не происходит ли нечто подобное в химическом плане и с мумиями? В моей голове реакция Майяра ассоциировалась (наверное, неправильно) не только с голубым свечением, но и с характерным коричневым цветом мумий и их сладковатым запахом, вполне для меня приемлемым. И у меня возникло подозрение, что неудачи с выделением ДНК из мумий сопряжены с тем, что реакции Майяра связали древнюю ДНК с другими молекулами.

Ну что же, эту догадку можно проверить. В 1996 году в Nature вышла статья, описывающая химический реагент N-фенацил тиазолиум бромид, сокращенно PTB, разлагающий молекулярные комплексы, образованные реакцией Майяра^[44]. Если добавить РТВ в испеченный хлеб, то он превратится обратно в тесто (правда в такое, которое уже никому не захочется испечь снова). Так как в готовом виде РТВ не продавался, Хендрик синтезировал его в лаборатории. Когда мы добавляли реагент в вытяжки из костей пещерных медведей или неандертальцев, то иногда действительно получалась более высококачественная амплификация. И когда Хендрик добавил РТВ в копролит из Невады возрастом в 20 тысяч лет, ему удалось амплифицировать и фрагменты vWF гена, того, который Алекс секвенировал из замороженного мамонта, а еще фрагменты двух других ядерных генов — все это к моему величайшему удивлению. Мы опубликовали результаты в июле 2003 года^[45]. Наконец-то у нас получилось продемонстрировать, что ядерный геном сохраняется не только в условиях замораживания.

Вдохновленный результатами, я уже решил, будто все идет к тому, чтобы возобновить эксперименты по выделению ядерной ДНК из пещерных медведей, теперь с помощью РТВ. Печально, но ничего не вышло. Химические ухищрения не помогли. На самом деле в какой-то момент стало понятно, что копролит из Невады — это редчайшее исключение, где РТВ срабатывает. Исследования копролитов тем не менее укрепили меня во мнении, что ядерная ДНК в остатках есть, нужно только придумать новый способ ее найти.

Я спрашивал всех, кого только можно, о способах секвенирования небольших количеств ДНК. В числе прочих я подверг “допросу” шведского биохимика Матиаса Улена, неутомимого изобретателя и предпринимателя от биотехнологий. Матиас обладал безграничной энергией и с детским восторгом относился к новым идеям, заражая своим энтузиазмом творческих людей, неизменно собиравшихся вокруг него. После встреч с ним я всегда возвращался в приподнятом настроении. Одной из творческих личностей в его окружении был Поль Нюрен. Десять лет назад он, несмотря на всеобщий скептицизм, изобрел и разработал новый метод секвенирования ДНК. Матиас тотчас же разглядел научный потенциал изобретения Поля. Еще он осознавал, что технологии секвенирования ДНК пора уже обновлять: мы до сих пор использовали методики, разработанные Фредом Сэнгером в Англии, за что он и получил в 1980 году свою вторую Нобелевскую премию по химии.

Метод секвенирования Сэнгера основан на прикреплении нуклеотидов поочередно друг за другом ДНК-полимеразой, ферментом, который выстраивает новую цепочку ДНК на матрице имеющейся цепочки. В реакции секвенирования ДНК-полимераза берет старт от праймера в назначенном месте ДНК. Далее небольшие порции каждого из четырех нуклеотидов метят разными флуоресцентными красителями и, кроме того, немного изменяют их химически. В результате после встраивания такого измененного нуклеотида реакция секвенирования останавливается именно в месте его прикрепления. Получаются цепочки ДНК разной длины, и концы таких фрагментов раскрашены разными цветами. По этим цветам можно понять, что за нуклеотид сидит на конце. Эти фрагменты — а они разной длины — подвергают процедуре электрофореза. При электрофорезе кусочки ДНК распределяются в геле соответственно своим размерам (длинам, молекулярным весам). И тогда можно посмотреть, как цветные метки и, следовательно, нуклеотиды в этом геле расположены: например, метка и нуклеотид в 10-й позиции от места старта, в 11-й позиции, в 12-й и т. д. На самом лучшем оборудовании для считывания, какое использовалось, к примеру, в проекте “Геном человека”, можно анализировать сразу сотни фрагментов ДНК длиной до 800 нуклеотидов. И что же проделал Поль Нюрен в лаборатории Матиаса? А вот что: он изобрел новый метод секвенирования, так называемый метод пиросеквенирования. И хотя пиросеквенированию предстояло еще хорошенько повзрослеть, но в перспективе оно обещало стать и быстрее, и проще метода Сэнгера.

При пиросеквенировании тоже используется ДНК-полимераза; она так же выстраивает комплементарные цепочки ДНК на матрице, но определение череды новоприкрепленных нуклеотидов устроено по-другому, в обход трудоемкого процесса разделения фрагментов по размеру. В этом случае нуклеотиды определяются по световым вспышкам, которые испускаются в момент присоединения нуклеотида к цепочке ДНК. Поль придумал, что можно добавлять в реакционную камеру по одному из четырех типов нуклеотидов по очереди. И тогда при добавлении, например, А (аденина) к исходной цепочке с концевым Т (тимином) ДНК-полимераза пристроит аденин к тимину, и в этот момент в результате химических реакций произойдет световая вспышка. Эту вспышку можно зафиксировать мощной камерой и передать на компьютер. А если в концевой позиции стоит не тимин, а любой другой нуклеотид — что же, тогда реакции не произойдет и светового импульса не будет. Поль добавлял в реакционную камеру по очереди нуклеотид за нуклеотидом, повторяя цикл за циклом. По вспышкам света он мог прочитать всю нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК. Прекрасный метод: требуется только своевременно добавлять нуклеотиды и другие компоненты в реакционную камеру и следить за отснятыми картинками. Но что еще лучше — этот процесс можно легко автоматизировать. И когда Матиас обо всем этом рассказывал, я воодушевился не меньше, чем он.

Спустя некоторое время Матиас пригласил меня поучаствовать в экспертном совете компании “Пиросеквенирование”, которую они с Полем учредили для разработки коммерческого продукта на основе новой технологии. Я с удовольствием согласился: это давало мне возможность быть в курсе развития замечательной технологии, которая, как я считал, могла здорово изменить наши методы изучения палео-ДНК. Я стал членом экспертного совета в 2000 году, спустя год после запуска в производство первого коммерческого аппарата. Он секвенировал одновременно девяносто шесть фрагментов ДНК, каждый в отдельной лунке пластикового планшета. Однако этот аппарат мог прочитать подряд только тридцать последовательных нуклеотидов или около того. По сравнению с современными машинами, работающими на принципе Сэнгера, “тридцать нуклеотидов” звучало довольно жалко, но ведь пиросеквенирование делало первые шаги и еще не достигло предела своих возможностей. На самом деле, хотя тогда я и не понимал этого, Нюрен положил начало революции в секвенировании, известной теперь как секвенирование второго поколения, которая в конце концов фундаментально изменила не только подход к изучению ископаемой ДНК, но и множество направлений в биологии.

Я очень хотел опробовать пиросеквенирование и поэтому уговорил Хенрика Кессманна отправиться в стокгольмскую лабораторию Матиаса в Королевский технологический институт. Хенрик ухватился за возможность полюбоваться на вытянутые от удивления лица стокгольмцев, когда он поприветствует их на безупречном шведском; хоть он и вырос в Германии, мать его была шведкой, и он прекрасно говорил на ее языке. Кроме того, он лихо управлялся с данными о современном народонаселении Европы и Азии и на их основе мог реконструировать возможные генетические связи между популяциями. Что же до новых технологий — он их отлично освоил, хотя не обошлось без трудностей.

В августе 2003 года совет компании “Пиросеквенирование” подписал разрешение на использование нового инструмента американской компанией 454 Life Sciences, основанной предпринимателем-биотехнологом Джонатаном Ротбергом. 454 Life Sciences намеревалась улучшить методы пиросеквенирования с помощью ультрасовременной струйной автоматики. Их нововведения базировались на присоединении коротких синтетических ДНК к концам фрагментов изучаемой ДНК. С помощью этих коротких кусочков одноцепочечные нити ДНК прицеплялись к микрошарикам, и затем в жировых капельках на шариках проходила массированная амплификация присоединенных фрагментов. В результате этого гениального хода в капельках жировой эмульсии синтезировались одновременно, но по отдельности, каждая в своей капельке, сотни тысяч нитей ДНК. Затем шарики разделялись на планшетке теперь уже с тысячами лунок, и далее начинался собственно пирофосфатный этап. И наконец (и это такое серьезное “наконец”!), составлялись таблицы вспышек для каждой лунки в каждом цикле. Для этого компания позаимствовала методику регистрации световых импульсов у астрономов — ведь астрономам приходится наблюдать миллионы ночных звезд и как-то регистрировать свои наблюдения. И все это вместе позволило секвенировать за раз не девятосто шесть, а двести тысяч фрагментов ДНК!

С такими мощностями, подумал я, мы могли бы просто секвенировать все подряд фрагменты палео-ДНК из вытяжек, все, что попадется, а потом проверять, что в них содержится. Метод “массированной атаки”, по сути, прямо противоположен тем техникам, когда приходится вылавливать каждый тщательно выбранный заранее кусочек ДНК. По сравнению с пиросеквенированием метод, основанный на выискивании отдельных сегментов с помощью ПЦР, не только ужасно трудоемок, но и решительно ограничивает поле зрения только одним, заранее заданным фрагментом, лишает возможности посмотреть, какие же еще ДНК содержатся в вытяжке. И хотя с помощью тогдашнего инструментария 454 Life Science нельзя было прочитать фрагмент длиннее ста нуклеотидов, но ведь цепочки, секвенированные Алексом из мамонта и Хендриком из гигантского ленивца, все равно получались не больше ста нуклеотидов. Мне не терпелось опробовать технику 454.

О новых методиках я советовался не только с Матиасом и остальными “пиросеквенистами”. В июле 2005 года нашу лабораторию в Лейпциге посетил Эдвард Рубин, генетик, человек кипучей, неукротимой энергии. Встречи с ним я ждал с нетерпением. Он занимал должность профессора в Лоуренсовской лаборатории в Беркли, в Калифорнии, и еще являлся директором Объединенного института генома при министерстве энергетики США. Эдди считал, что будущее за клонированием ДНК в бактериях, то есть примерно за тем, с чего я сам начинал работу с мумиями еще в 1980-х в Упсале. Эти методы, убеждал он меня, стали теперь намного более эффективными, чем в те давние времена. Я согласился проверить эффективность новых методик и отправил ему в лабораторию в Беркли экстракты двух костей пещерных медведей, содержавшие, как мы уже знали, большое количество мтДНК. В его лаборатории к молекулам ДНК из этих вытяжек присоединили молекулы-транспортеры и с их помощью внедрили ДНК в бактерий. По ходу роста и деления каждой бактерии получается клон, содержащий тысячи копий уникальной ДНК из костной вытяжки. Остается взять и прочитать ДНК каждого из получившихся клонов, словно книги из обширной библиотеки. Команда Эдди использовала традиционную химию Сэнгера для секвенирования 14 тысяч случайным образом выбранных клонов из двух библиотек — о таких цифрах в 1984-м можно было только мечтать. Из 14 тысяч клонов только 389, то есть 2,7 процента, содержали цепочки ДНК, похожие на те, что имеются у собак, и, таким образом, с большой вероятностью принадлежавшие пещерным медведям. Остальное пришло от бактерий и плесени, поселившихся на костях после смерти животного. И хотя пропорция собственной медвежьей ДНК была до смешного мала, но все же результат вдохновлял: значит, ядерная ДНК все-таки есть в костях из пещер Европы!

Результаты мы опубликовали в 2005 году в Science, Эдди и его группа значились основными авторами^[46]. Статья несколько претенциозно утверждала, что прочитать древний геном — да, возможно. Но уже после публикации некоторые члены моей лаборатории, рассмотрев результаты более взвешенно и произведя дополнительные расчеты, пришли к неутешительным выводам. Группа из Беркли секвенировала каждый фрагмент ДНК из библиотек, которые мы им переслали, и выявила в сумме 26 861 нуклеотид из генома пещерного медведя. Если принять во внимание, что мы использовали десятую часть грамма костной ткани для составления библиотек и что геном состоит примерно из трех миллиардов нуклеотидов, нам придется увеличить количество исследуемой ткани в сотню тысяч раз — то есть понадобится больше десяти килограммов костей. Только так нам удастся хотя бы приблизительно составить геном пещерного медведя. Предположим, мы справились с немыслимо трудоемкой задачей перемолоть такое количество костей и получить из порошка вытяжки, но секвенирование в таких масштабах обойдется в баснословную сумму. И даже если с пещерным медведем как-то можно получить результат, то в случае действительно интересных ископаемых, от которых для исследования остаются в прямом смысле крохи, количественный, “массированный” подход просто бесполезен. Я лично считал, что секвенирование неандертальского генома с помощью клонирования в бактериях — это тупик. Просто невозможно, и все. По моим представлениям, большая часть ДНК должна была потеряться при получении бактериальных библиотек: ведь ДНК может просто не попасть в бактерию или, все же попав, деградировать под действием бактериальных ферментов. Эдди, однако, энтузиазма не терял и утверждал, что мы получили нехарактерно низкий процент продукта секвенирования. Он даже говорил, что следующие попытки потребуют меньше материала и наверняка окажутся более успешными.

Несмотря на все воодушевление Эдди, я был уверен, что необходимо попробовать и пиросеквенирование: неправильно полагаться только на один метод. Вариант с пиросеквенированием, казалось, прямо создан для нашего материала: мы могли избежать потерь, неизбежных, когда имеешь дело с капризной бактерией. К тому же Джонатан Ротберг вместе с 454 запустил установку, способную секвенировать сотни тысяч молекул ДНК за день. До самого Джонатана просто так было не добраться: он очень мудро забаррикадировался от одержимых ученых, которым во что бы то ни стало нужна была новая технология и которые по самую макушку завалили бы его запросами и требованиями. Я попытался до него дотянуться, но ничего не вышло. В какой-то момент я посетовал на это Джину Майерсу — тому самому гению биоинформатики, который помог знаменитому Крейгу Вентеру сложить геном человека в 2000 году. Я познакомился с Джином на съезде биоинформатиков в Бразилии в 2001 году, и его шутливое отношение к любой проблеме немедленно завоевало мою симпатию. Нас окончательно сблизил общий интерес к горным лыжам и дайвингу. К моменту нашего рассказа Джин занимал должность профессора в Беркли и выступал советником в организации Ротберга, так что в июле 2005-го он составил мне протекцию и помог связаться с Джонатаном.

И вот я говорю с Джонатаном и с Майклом Эгхольмом, датским ученым, менеджером 454, по трехсторонней электронной связи, — и волнуюсь. Да, Джонатан энергичен и напорист, как и следовало ожидать от предпринимателя такого масштаба, но его явно интересует только одно — прочитать геном динозавра! Как же мне быть и как себя вести? Ведь я всегда во всеуслышание заявлял, что секвенировать ДНК динозавра невозможно ни сейчас, ни в будущем. Я попытался как-то помягче, чтобы Джонатан не занес меня сразу в черный список, еще раз пройтись на эту тему и одновременно намекнуть на существование других презанятных геномов, особенно — продолжал намекать я — неандертальского. К счастью, Джонатана сразу же заинтриговала идея выяснить с помощью его аппарата, что делает человека человеком. Мне даже удалось убедить их с Эгхольмом, что начинать нужно с пещерных медведей и мамонтов.

И уже через неделю почта доставила экстракты мамонтовой и медвежьей кости в 454 Life Sciences. В это же время к нам в лабораторию поступил на работу трудолюбивый и талантливый молодой специалист — биоинформатик Ричард Эд Грин. Он только что защитил диссертацию в Калифорнийском университете в Беркли. Эд выиграл очень престижную и к тому же щедро финансируемую стипендию от Национального научного фонда США: он должен был выполнить проект по сравнению РНК-сплайсинга у человека и обезьян. Сплайсинг — это процесс, при котором из копий РНК, считанных с ДНК, вырезаются ненужные кусочки, разрезанные концы соединяются и превращаются в зрелую матричную (или, по-другому, информационную) РНК, и она уже непосредственно используется в белковом синтезе. По предположениям Эда, разница в схемах соединения разрезанных концов РНК могла объяснить многие человеческие и обезьяньи особенности. Он как раз этим занимался, когда пришли первые результаты из 454.

Команда из 454 составила сотни тысяч последовательностей ДНК из костей мамонта и пещерного медведя. Я поручил Эду разобраться с первоочередной проблемой: разделить медвежьи цепочки нуклеотидов и те, что принадлежали занесенным бактериям и другим организмам. Задача была не из простых. Он сравнивал последовательности геномов мамонта и пещерного медведя с геномами собаки и слона, то есть с самыми близкими из их живущих ныне родичей. Но цепочки палео-ДНК были короткими и к тому же с большой вероятностью химически видоизменились за прошедшие тысячелетия. Плюс к этому плесень и бактерии на костях определялись не слишком хорошо. Эда так захватила эта задача — распознать эндогенные последовательности, — что он совсем забросил свой сплайсинг. В конце концов он написал письмо в администрацию Национального научного фонда, ведавшую его стипендией. Он честно сообщил, что задачи его проекта изменились и теперь его интересует другое. К сожалению, в фонде мыслили недостаточно широко, чтобы понять, какие прекрасные возможности для информационной биологии открывает проект по неандертальскому геному, и попросту закрыли финансирование Эда. Хорошо, что наш бюджет позволял оставить его с нами.

Тем временем Эд подсчитал, что 2,9 процента ДНК, выделенных из костей мамонта, и 3,1 процента из костей пещерного медведя — эндогенные, то есть их собственные, а не привнесенные извне. Это значило, что результаты нашей работы с Эдди Рубином, когда клонирование ДНК в бактериях показало 5 процентов эндогенных ДНК от пещерного медведя, в действительности очень хороши. На первый взгляд 3 или даже 5 процентов не слишком впечатляют, но в абсолютных цифрах это 73 172 разных фрагментов ДНК мамонта и 61 667 фрагментов ДНК пещерного медведя. То есть всего лишь один эксперимент по новой методике 454, в котором участвовала только часть экстракта, выдал в десять раз больше информации, чем мы получили от бактериального клонирования в лаборатории Беркли. Казалось бы, вот он, настоящий прорыв, но я видел проблемы, сопряженные с новым методом. Наш обычный путь ПЦР позволял повторить эксперимент много раз и, таким образом, проверить результат и выявить возможные ошибки. Новый же метод показывал определенную последовательность только один раз: так как геномы — и мамонта, и медведя — были очень большими, то вероятность поймать один и тот же сегмент второй раз сводилась к минимуму. И в результате мы лишались возможности определить, какие отклонения могут появиться в результате химических модификаций молекул, неизбежных из-за долгого “хранения”, а также выявить ошибки собственно секвенирования.

Определение подобных ошибок — задача не новая, и у нас уже были кое-какие наработки. Вот, например, Михаэль Хофрайтер, дипломник из моей лаборатории, в 2001 году вместе с другими коллегами показал, что самый распространенный дефект древних ДНК — потеря аминогруппы в цитозинах. Это получается неизбежно само собой, если в материале присутствует хоть капелька воды. Теряя аминогруппу, цитозин превращается в урацил, обычный нуклеотид РНК. ДНК-полимераза считает его тимином. Так вот, нужно сравнить число тиминов в мамонтовой или медвежьей ДНК с современной слоновьей или собачьей, в особенности в тех местах, где подозреваются цитозины. И мы увидим резкое преобладание тиминов. Так оно и вышло, но, к нашему удивлению, еще обнаружилось некоторое превышение гуанинов по сравнению с аденинами. Это означало, что древний аденин, как и цитозин, может по ходу дела потерять свою аминогруппу. Мы, конечно, проверили это предположение: синтезировали ДНК с цитозинами и аденинами, лишенными своих аминогрупп, и потом посмотрели, как с такой последовательностью справится ДНК-полимераза. ДНК-полимеразу взяли ту же, которую использовала 454 для пиросеквенирования. И в результате ДНК-полимераза прочитывала Ц как Т, но и вместо А она читала Г. Мы написали об этом статью^[47] и опубликовали ее в PNAS в сентябре 2006 года: не только цитозины могут терять аминогруппы, но и аденины — вот как. Однако довольно скоро мы обнаружили, что ошиблись.

Между тем в отношениях с группой Эдди Рубина в Беркли наметилась некоторая напряженность. Нам в Лейпциге уже стало ясно, что пиросеквенирование по крайней мере в десять раз эффективнее, чем бактериальное клонирование. Еще раньше у нас создалось впечатление, что в процессе клонирования большое количество ДНК теряется и происходит это, когда бактерию “вынуждают” присоединить к себе чужую ДНК. Но Эдди спорил, что низкая эффективность опытов с пещерными медведями не более чем случайное стечение обстоятельств. Он, как всегда, был полон энтузиазма во время регулярных телефонных конференций между нашими группами. Я разрывался. С одной стороны, после многолетнего топтания на месте мы не только сможем прочитать неандертальский геном, но даже сделать это несколькими способами. А с другой — мы скорее примем на вооружение методики, требующие граммов исходного материала, а не килограммов, как у Эдди. Пиросеквенирование 454 отвечало всем требованиям эксперимента, но Эдди в конце концов убедил меня еще раз попробовать клонирование. И я решил параллельно провести два эксперимента по двум разным методикам на материале — да-да — реальной неандертальской ДНК.

Мы приготовили два экстракта из неандертальской кости самой лучшей сохранности, из образца, известного как Vi-80. Из него в 2004 году Давид Серр секвенировал высокополиморфную часть мтДНК. В середине октября 2005-го мы отправили вытяжки в 454 Майклу Эгхольму для прямого секвенирования и в лабораторию Эдди Рубина для клонирования в бактериях и последующего секвенирования. Вытяжки готовил Йоханнес Краузе в нашей “чистой комнате”. Мы все очень волновались, не занесут ли инородные ДНК в наши “чистые” экстракты при работе в “чужих” лабораториях в Калифорнии и Коннектикуте. Ведь предстоящие эксперименты должны показать, какая из методик лучше, и ее-то мы и развернем в наших “чистых” помещениях.

А в это время в лабораторию прибывает новый дипломник, Эдриан Бриггс. Приехал он прямиком из Оксфорда, где оканчивал начальные курсы, а дядя его, Ричард Рэнгем, был известным приматологом в Гарварде. Учитывая семейные связи и оксфордское образование, я ожидал появления высокомерного сноба, но все мои страхи оказались совершенно необоснованными. И даже больше: Эдриан обладал уникальной способностью мыслить в количественных категориях, не свойственной ни одному из членов моей команды. Но самым удивительным в его характере было то, что при нем человек никогда не чувствовал себя глупым, хотя Эдриан мыслил быстрее и объемнее, чем любой из нас. Например, если я опирался только лишь на экспертное чутье, когда говорил о потерях ДНК при клонировании в бактериях и при создании библиотек ДНК пещерного медведя, то Эдриан представил расчеты. Он определил, что в бактериальных библиотеках Эдди Рубина в конечном итоге оказывалось только около полпроцента ДНК из вытяжек костей пещерных медведей. Еще Эдриан посчитал, что для секвенирования трех миллиардов с гаком нуклеотидов из медвежьего или неандертальского генома нам понадобится выделить и секвенировать 600 миллионов бактериальных клонов. А это непосильная задача даже для всего Объединенного института генома Эдди. С этими расчетами мои сомнения обрели весомую базу: процесс клонирования по эффективности не отвечал задаче составления неандертальского генома. В январе 2006-го последовал трудный и напряженный телефонный разговор с группой Эдди. Эдриан тогда доложил результаты своих расчетов. Эдди продолжал настаивать, что в экспериментах с пещерным медведем и при составлении библиотек просто что-то пошло не так. Но мы не должны забывать, что тем временем наши параллельные опыты в 454 и у Эдди шли полным ходом.

Пиросеквенированием палео-ДНК занимались не мы одни. В начале 2006-го, пока Эд Грин анализировал информацию по пещерным медведям и мамонтам, в Science вышла статья, написанная Хендриком Пойнаром, моим бывшим студентом, работавшим к тому моменту в Университете Макмастера в Онтарио, и Стивеном Шустером из Пенсильванского университета. Они применили методику пиросеквенирования, прочитав все молекулярные цепочки из вытяжек, то есть сделали то же, что и мы в 454 Life Sciences. У них были мамонты из вечной мерзлоты, и эти образцы дали 28 миллионов нуклеотидов^[48]. Я, конечно, обрадовался, что мой бывший студент подхватил тему, хотя моя группа и выражала недовольство, что не мы первые опубликовали результаты секвенирования древней ДНК по новой методике. Да, результаты пиросеквенирования уже лежали у нас на столе, но мы не спешили с публикацией, так как считали необходимым — а статья в Science как раз не считала — ответить на два возникших вопроса. Нам важно было выяснить, как наилучшим образом соотнести прочитанные последовательности с эталонными геномами и как определить влияние ошибок в последовательностях на конечный результат. Но все равно статья Хендрика — это очко в пользу пиросеквенирования. И вдобавок она еще раз показала, как хорошо сохраняются ткани в вечной мерзлоте. В образцах Хендрика примерно половина ДНК принадлежала мамонту. С нашими неандертальцами мы и мечтать о таком не могли: и то счастье, если получалось 1–2 процента ДНК в вытяжках. Еще статья Хендрика высветила серьезную научную дилемму. Можно провести большую работу, затратить время и усилия, чтобы постараться представить картину полнее, а тем временем кто-то другой, не заботясь о деталях и сосредоточившись только на самом главном, обойдет вас с публикацией. И даже если после этого вы опубликуете лучшую работу, научная общественность все равно будет считать, что вы подбираете крохи за теми, кто сделал настоящее открытие. Наша группа очень серьезно обсуждала эту дилемму после выхода статьи Хендрика. Многие считали, что нужно было публиковать раньше. Наконец в сентябре 2006-го, в Proceedings, мы выпустили работу с анализом нуклеотидных последовательностей пещерного медведя и мамонта. В той работе мы — как назло! — сделали ошибочный вывод о потере аминогруппы аденинами и, соответственно, появлении ошибок в последовательностях^[49].

Каждый год в мае в Колд-Спринг-Харбор на Лонг-Айленде проводится конференция по биологии генома. Эта встреча неофициально считается самой главной среди геномной братии. От выступающих ожидаются доклады о новейших, еще не опубликованных достижениях. Дискуссии там напряженные, часто пронизанные духом соперничества между исследовательскими центрами, подогретые конфликтами и ссорами на фоне гонки за прочтение генома человека.

Очередная встреча в 2006 году обещала быть даже более насыщенной, чем обычно. Мы получили результаты секвенирования и из 454 Life Sciences, и от Эдди Рубина и сделали предварительный анализ. Мой доклад преследовал две цели. Во-первых, я хотел представить сравнение двух методик по секвенированию древней ДНК. Во-вторых, мне предстояло разметить принципиальные пути по составлению полного генома неандертальцев и вообще полного генома вымерших организмов. Результаты наших экспериментов подтвердили, что будущее за пиросеквенированием, так что упор я делал именно на него.

В Колд-Спринг я приехал необычно нервным и взвинченным. Меня поселили в крошечную, по-спартански обставленную комнатку в общежитии; этой чести я удостоился как постоянный докладчик, тогда как остальные тряслись каждый день в автобусе, добираясь из дальних гостиниц. Весь путь в самолете из Нью-Йорка и потом весь вечер и ночь я готовился к докладу. На следующий день я собрал всех своих людей, приехавших на конференцию, в каком-то пустом зале, чтобы перед ними отрепетировать выступление. Меня не отпускало предчувствие, что этот доклад целиком определит нашу деятельность на следующие несколько лет.

Редко когда удается полностью завладеть вниманием на научной лекции. Конференция в Колд-Спринг ничем в этом смысле не отличается. Я прочитал здесь множество докладов и привык видеть со сцены, как большинство из шести сотен слушателей что-то такое делают в компьютерах — может быть, правят свои презентации или проверяют почту, — а то и просто дремлют, утомленные сменой часового пояса и множеством специальных подробностей. Но сегодня все было по-другому. Я постепенно вел рассказ от мамонтов и пещерных медведей к результатам по неандертальцам и физически чувствовал напряженное, безраздельное внимание всех и каждого в зале. Я показал последний слайд со схемой человеческих хромосом. Маленькие стрелочки на схеме указывали расположение тех десятков тысяч фрагментов неандертальской ДНК, которые мы прочитали. Когда этот слайд появился, зал ахнул. Мы составили всего 0,0003 процента от неандертальского генома, но каждому сидящему в зале стало ясно, что теперь возможно — хотя бы теоретически — прочитать геном целиком.