Нейротон. Занимательные истории о нервном импульсе

После публикации модели Ходжкина – Хаксли и их мембранной теории, в направлении исследований нервного импульса не произошло почти ничего нового. Нет, конечно же, исследования продолжились, и были важные открытия, о некоторых я уже рассказывал и ещё расскажу. Но все они оказались как бы эхом того, что сделали Ходжкин и Хаксли. И даже сам Ходжкин оказался в тени собственной славы – остаток своей научной деятельности он посвятил доказательствам правильности своей же теории (хотя с ним никто особо и не спорил).

Исследования А. Ходжкина

Так, в 1961 году А. Ходжкин со своими помощниками Бекером и Шоу поставили очень красивый опыт. Ещё когда Джон Янг открыл гигантский аксон у кальмара, он заметил, что при надавливании на перерезанный аксон его содержимое выдавливается и остаётся пустая неповреждённая оболочка.

Важно, что вырезать гигантский аксон кальмара можно целиком, почти не повредив. Благодаря этому с ним можно проделать такую операцию – просто перерезать концы аксона, при этом его густая аксоплазма не вытекает наружу. Но если положить его на резиновую подложку и прокатать резиновым валиком, не трудно выдавить аксоплазму. При этом оболочка гигантского аксона (в том числе и мембрана) остаётся неповреждённой. Затем можно, вставив в отрезанный конец аксона стеклянную пипетку (канюлю), заполнить его раствором с заданным содержанием ионов. Потом можно заткнуть концы аксона «пробками» из густого масла, не проводящего ток.

Вот именно такие эксперименты начали ставить Ходжкин и его сотрудники. Оказалось, что при заполнении аксона искусственным раствором с концентрацией К+ аналогичной аксоплазме, на мембране возникал обычный потенциал покоя.

При одинаковой концентрации калия внутри волокна и в наружной среде, потенциал покоя в полном соответствии с формулой Нернста не возникал. Если же в аксон закачать обычную морскую воду, и поместить его в среду с высокой концентрацией калия, то полярность потенциала покоя меняется на противоположную; при этом величина потенциала соответствует формуле Нернста.

Эти эксперименты доказывали решающую роль мембраны в возникновении потенциала покоя – ведь протоплазма со всеми органеллами и белковыми молекулами попросту отсутствовала. Фактически подтверждена мембранная теория Бернштейна. Кстати, сегодня учёные научились создавать и искусственные мембраны. То есть можно исследовать ситуацию, в которой белковые насосы и каналы отсутствуют в мембране. Такая «искусственная клетка» продолжает вести себя как живая.

А в недалёком 1986 году Ходжкин продемонстрировал ещё один показательный эксперимент. Он искусственно создавал разрыв электролита в окружающей нервное волокно среде, что приводило к прерыванию нервного импульса.

Схема этого опыта такова. Средний участок нерва помещали в не проводящую электричество среду (наливали масло в среднее отделение ванночки). Как и ожидалось, возбуждение доходило только до этого участка и прерывалось.

Представляет интерес вторая часть опыта: жидкости в первом и третьем отделениях соединяли обыкновенной медной про́волочкой, при этом импульс, исчезнув на втором отрезке, появляется опять на конечном участке. Очевидно, что про́волочка служит проводником электрического тока замыкая электрическую цепь. (Хотелось бы увидеть продолжение эксперимента – не изолировать часть аксона в масле, а перерезать и соединить его части проводком.)

Рисунок 48. Эксперимент Ходжкина с разрывом электролита

Казалось бы, всё, этот опыт доказывает чисто электрический характер передачи сигнала вдоль волокна. Но…

Давайте заменим масло на другой хороший диэлектрик – воздух. Впервые ещё Н. Е. Введенский продемонстрировал, способность нерва сохранять способность к проведению возбуждений при длительном (около 8 часов) раздражении в атмосфере воздуха. Даже при помещении нерва в атмосферу азота способность нерва к проведению некоторое время сохраняется, хотя и быстро падает.

Что же касается масла, то теперь-то мы знаем, что мембрана нейрона состоит из липидов – жироподобных молекул, может в этом секрет описанного опыта?

Пейсмекерные нейроны

Кроме нейронов, суммирующих и передающих информацию к другим клеткам, описаны так называемые пейсмекерные нейроны, способные самостоятельно генерировать электрические импульсы (Alving, 1968). Активность таких нейронов характеризуется синусоидальными колебаниями частотой 0,1—10 Гц и амплитудой 5—10 мВ. Эти нейроны при отсутствии любого внешнего воздействия обеспечивают периодическую генерацию ПД и передачу возбуждения другим нейронам.

Эндогенные процессы подобных нейронов приводят к периодическому изменению ионной проницаемости мембраны и генерированию ПД. Предполагается, что, взаимодействуя с другими клетками, они синхронизируют их активность.

Дендритный спайк

С момента появления мембранно-ионной теории считалось, что потенциал действия проявляется исключительно в аксоне1, однако, со временем накопилось достаточно много аргументов в пользу того, что потенциалы действия присутствуют и в дендритах. Такие дендритные потенциалы, чтобы подчеркнуть их отличие от аксонных, стали называть «дендритными спайками».

Вплоть до 1950-х и ранних 1960-х годов господствующим было представление, что дендриты, вообще, являются пассивными отростками нейронов. При таком подходе интересная получалась схема – активными были только со́ма (тело) нервной клетки и аксон. Аксон, в свою очередь, может быть либо входом, либо выходом клетки как информационной единицы. То есть нервный импульс либо приходил ниоткуда, либо шёл в никуда.

В 1951 году впервые зафиксировал ПД в дендрите выдающийся китайский нейрофизиолог Чжан Сянтун (1907—2007). В опубликованной в том же году статье он сообщил о том, что и дендриты способны возбуждаться под воздействием электрической стимуляции и генерировать потенциалы действия, которые отличаются от аксонных тем, что не подчиняются правилу «всё или ничего». Поначалу, большинство нейробиологов отнеслись к его открытию критически, по-прежнему полагая, что аксоны являются исключительным участком нейрона способным к генерации потенциала действия.

Вскоре после Чжана, и другими учёными были получены доказательства относительно генерации дендритами спайков.

И только с конца 1980-х – начала 1990-х учёные начали повсеместно приходить к мысли, что дендриты не только передают информацию, но и меняют, и хранят.

Наиболее убедительно существование дендритных спайков было описано Грегом Стюартом и Бертом Закманом в период 1993—1998 годов, которые использовали для регистрации дендритного спайка цело-клеточные patch clamp электроды.

Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp)

Метод двухэлектродной фиксации потенциала (1947 г.), с помощью которого Ходжкин и Хаксли сделали своё открытие даёт представление лишь об усреднённой активности многих тысяч ионных каналов на поверхности одного аксона. Вот если бы можно было использовать один электрод, настолько маленький, чтобы записать ток с одиночного ионного канала? Эта фантазия воплотилась в методе patch clamp (дословно – зажим напряжения) – методе локальной фиксации потенциала.

Рождению этого метода предшествовали опыты Альфреда Стрикхольма, выполненные в начале 1960-х. В них он использовал в качестве микроэлектродов стеклянные канюли с диаметром отверстия в несколько микрометров

Прижимая кончик такого стеклянного капилляра к мембране мышечного волокна, Стрикхольму удалось обеспечить электрическую изоляцию участка мембраны, попадавшего внутрь кончика пипетки.

В конце семидесятых годов XX века Эрвин Неер (E.Neher) и Берт Закман (B.Sakmann) предложили метод patch clamp – в основе которого использование супертонких стеклянных микроэлектродов, диаметр концевого отверстия которых составляет 1—2 мкм. В такую пипетку, заполненную раствором электролита, помещается хлор-серебряный электрод, второй электрод размещается внеклеточно, в омывающей жидкости. Если кончик такой пипетки совершенно гладкий и чистый, он плотно прилипает к мембране при контакте с клеткой, образуя изолированное для электрических токов соединение так называемый «гигаомный контакт». Часть мембраны, покрытая таким капилляром, называется patch и имеет площадь менее 10 мкм². Значит велика вероятность, того что на нём может оказаться один единственный ионный канал. Подобная конфигурация называется cell-attached patch-clamp и позволяет записывать ионные токи, проходящие через конкретный канал, накрытый пипеткой.

1 Предполагалось, что преобразование постсинаптического потенциала нейрона в нервные импульсы происходит в аксонном холмике, но экспериментальные данные это не подтвердили. Регистрация электрических потенциалов выявила, что ПД генерируется в самом аксоне, а именно в начальном сегменте на расстоянии ~50 мкм от тела нейрона.

Рисунок 49. Принципиальная схема patch clamp в конфигурации Cell-attached.

Примечательно, в методе patch clamp используются не две пары электродов, как при двухэлектродной записи потенциала (два внутриклеточных и два внеклеточных), а лишь одна пара. При этом электронная начинка усилителя с высокой скоростью чередует измерение потенциала клетки и введение в неё ионного тока. При этом один электрод работает сразу за два, что уменьшает повреждение клеток во время измерения. Любопытной особенностью patch clamp является то, что в единственной оставшейся паре электродов невозможно однозначно идентифицировать внеклеточный и внутриклеточный потенциалы. Металлический опорный электрод погружен в ванну, в которой находятся исследуемые клетки. А вот единственный стеклянный электрод, который контактирует с клеткой, может работать как внеклеточно (cell-attache и inside-out), так и внутриклеточно (whole-cell и outside-out)1.

Микроскопические размеры электродов патч-зажима, и самих клеток вынуждают исследователей работать исключительно под микроскопом. Мало того, сам контакт микрокапилляра с мембраной клетки чрезвычайно чувствителен к вибрациям, поэтому микроскоп монтируется на антивибрационном столе, столешница которого плавает в потоке сжатого воздуха. А амплитуда токов, регистрируемых прибором, настолько мала, что электроды защищены от электрических наводок клеткой Фарадея.

Метод patch clamp открыл новую эру в электрофизиологии. А параллельное развитие молекулярной биологии привело к настоящему взрыву исследований ионных каналов в 1990-х годах.

1 Cell-attache, Inside-out, Whole-cell и Outside-out – четыре различные конфигурации схемы подключения patch-clamp

История биологических мембран

Любопытно, что одним из первых исследователей свойств липидов стал Бенджамин Франклин, который в 1773 году измерял площади масляных пятен на поверхности пруда, остающихся от ложки (5 мл) растекающегося оливкового масла: пятна неизменно оказывались размером ≈2000 м². Если бы любознательный сэр имел в те давние времена представление о молекулярном строении вещества, он без особого труда смог бы вычислить площадь, приходящуюся на одну молекулу (!) триглицерида олеиновой кислоты (основного компонента оливкового масла) в этом мономолекулярном пятне, и, причём, довольно точно:

где M_r – масса 1 моля триолеина, N_A – число Авогадро, S _пятна – площадь пятна, V _ложки – объем ложки, ρ _масла – плотность масла.

В результате значение площади S_мол оказалось бы примерно равным 1 нм². Следующим шагом могла быть вычислена и толщина мономолекулярного слоя, равная размеру одной молекулы триолеина, для чего достаточно разделить V_ложки на S_пятна ≈ 2,5 нм.

В более близкие нам времена Юлиуса Бернштейна, учёные только предполагали наличие у нервной клетки мембраны, не было экспериментальных доказательств существования таковой (её увидели в электронный микроскоп лишь в 1950 г.)

Но, несмотря на неопределённость, первая модель строения биологических мембран была предложена в 1902 году. Чарльз Овертон заметил, что через биологические мембраны лучше всего проникают вещества, хорошо растворимые в липидах, и на основании этого предположил, что они состоят из тонкого слоя фосфолипидов. И действительно, на поверхности раздела полярной и неполярной сред (например, воды и воздуха) молекулы фосфолипидов образуют мономолекулярный (одномолекулярный) слой. Их полярные «головы» погружены в полярную среду, а неполярные «хвосты» ориентированы в сторону неполярной.

В 1923 году Гортер и Грендел показали, что площадь монослоя липидов, выделенных из мембран эритроцитов, в два раза больше общей площади самих эритроцитов. На основе результатов этих исследований было сделано предположение, что липиды в мембране располагаются в два слоя.

Благодаря двойному фосфолипидному слою биологическая мембрана была уподоблена конденсатору, в котором слои играют роль обкладок. Это предположение использовали Кол и Кетртис в своих исследованиях электрических параметров биологических мембран в конце 1940-х. Тогда ими были вычислены и высокое электрическое сопротивление монослоя липидов – 10⁷ Ом/м², и его большая электрическая ёмкость С_уд = 10^—2 Ф/м².

Вместе с тем имелись экспериментальные данные, свидетельствовавшие, что биологическая мембрана содержит в своём составе и белковые молекулы. Например, было обнаружено, что значения коэффициента поверхностного натяжения клеточных мембран существенно ближе к коэффициенту поверхностного натяжения на границе раздела «белок – вода» (около 0,1 дин/см), нежели на границе раздела «липид – вода» (около 10 дин/см). Эти противоречия экспериментальных результатов были устранены Хью Дэвсоном и Джеймсом Даниелли, которые в 1935 году предложили так называемую «бутербродную» модель (сэндвич-модель) строения биологических мембран, которая претерпев несущественные изменения продержалась в мембранологии в течении почти сорока лет. Согласно этой модели, мембрана – трёхслойная: она образуется двумя слоями белковых молекул, с липидным бислоем посередине; образуется нечто вроде бутерброда – липиды, наподобие масла, между двумя «ломтиками» белка. Однако по мере накопления экспериментальных данных от этой модели мембранной структуры пришлось отказаться.

В 1972 году Джонатан Сингер и Гарт Николсон предложили жидкостно-мозаичную модель, объясняющую в общих чертах организацию биологических мембран. В соответствии с этой моделью, мембраны представляют собой двумерные растворы определённым образом ориентированных фосфолипидов, а белки пронизывают мембрану насквозь или погружены в неё.

Липиды в мембране находятся в жидком агрегатном состоянии, это позволяет сравнить её с фосфолипидным морем, по которому плавают «айсберги» белков. Подтверждением жидкостно-мозаичной модели является тот факт, что соотношение белков и фосфолипидов между мембранами сильно варьируется: например, количество белков в миелиновой мембране в 2,5 раза ниже, чем липидов, и, напротив, в митохондриях в 2,5 раза выше, чем липидов, тогда как согласно бутербродной модели, соотношение белков и липидов должно быть одинаковым во всех мембранах. Помимо фосфолипидов и белков, в биологических мембранах присутствуют и иные химические соединения, а количество холестерина вообще сопоставимо с количеством фосфолипидов и белков. Жидкостно-мозаичная модель строения мембраны в настоящее время общепринята.

Согласно этой модели, клетка окружена клеточной мембраной толщиной примерно 7,5—10,0 нм. Жирные кислоты, которые составляют большую часть клеточной мембраны, называются фосфоглицеридами.

Фосфоглицерид состоит из фосфорной кислоты и жирных кислот, называемых глицеридами. Голова такой молекулы гидрофильна (притягивается к воде), а хвосты, состоящие из гидрофобных углеводородных цепей, наоборот отталкивают воду.

Рисунок 50. Строение клеточной мембраны.

Если молекулы жирных кислот просто поместить в воду, они образуют небольшие сгустки с кислотными головками, которые притягиваются к воде снаружи, и углеводородными хвостами, которые отталкиваются водой изнутри. Если эти молекулы очень осторожно растянуть на поверхности воды, они сориентируются так, что все кислотные головы будут в воде, а все углеводородные хвосты на её поверхности. Если бы был добавлен ещё один слой молекул и наверху было бы больше воды, углеводородные хвосты выровнялись бы с таковыми из первого слоя, образуя двойной (толщиной в две молекулы) слой. Кислотные головки выступали бы в воду с каждой стороны, а углеводороды заполняли бы пространство между ними. Именно такой бислой является основной структурой клеточной мембраны.

Неоспоримое доказательство жидкостно-мозаичной модели даёт «метод замораживания-скалывания». Скол мембраны после низкотемпературного замораживания проходит по гидрофобной области липидных слоёв. В результате этого мембрана расщепляется на два слоя, обнаруживая внутреннее строение – с массой мелких глобул или углублений, соответствующих местам расположения белковых молекул, которые не раскалываются, а целиком остаются в одной из половинок мембран.

Жидкие кристаллы

Как это иногда случается, по удивительному стечению обстоятельств, описанная выше структура клеточной мембраны оказалась чрезвычайно схожей со структурой жидких кристаллов. А при более внимательном наблюдении оказалось, что некоторые типы ЖК схожи с биологическими мембранами и по своему составу на молекулярном уровне. Например, холестерические жидкие кристаллы, названные так поскольку наиболее распространённым кристаллом этого класса, является холестерин.

Жидкий кристалл – это такое агрегатное состояние, во время которого вещество одновременно обладает как свойствами жидкостей, так и свойствами кристаллов. То есть ЖК обладают текучестью, и вместе с тем им присуща анизотропия – различие свойств среды в зависимости от направления внутри неё (например, показатель преломления света, скорость звука или теплопроводность).

История открытия ЖК

В 1888-м году австрийский ботаник Фридрих Рейнитцер (Фридрих Рихард Корнелиус Рейнитцер,1857—1927) обнаружил, что у некоторых типов кристаллов может быть две точки плавления, что позволило ему предположить наличие двух различных жидких состояний, в одном из которых вещество прозрачное, а в другом – мутное.

Озадаченный этим странным явлением, Рейнитцер отправил свои препараты холестерилбензоата немецкому кристаллографу Отто Леманну с просьбой помочь понять суть открытия. Исследовав их с помощью поляризационного микроскопа, Леманн обнаружил, что мутная фаза, наблюдаемая Рейнитцером, является анизотропной. Поскольку свойства анизотропии присущи твёрдому кристаллу, а вещество в мутной фазе было жидким, Леманн назвал его жидким кристаллом.

И хотя в 1904-м году Отто Леманн предоставил достаточно научных доказательств в пользу возможности существования жидких кристаллов, ещё долгие годы научное сообщество не признавало жидкие кристаллы как отдельное состояние вещества, потому что их существование разрушало аксиому о трёх возможных состояниях вещества: твёрдом, жидком и газообразном. Открытию просто не нашлось применения.

Между тем, это состояние является термодинамически стабильным фазовым состоянием и по праву наряду с твёрдым, жидким и газообразным, может рассматриваться как четвёртое состояние вещества.

Лишь полвека спустя, в 1963-м году американским изобретателем Джеймсом Фергюсоном было найдено применение одному из свойств жидких кристаллов – изменение цвета в зависимости от температуры. Фергюсон получил патент на изобретение, которое позволяло обнаруживать невидимые для глаз тепловые поля. С этого момента популярность жидких кристаллов начала расти.

В 1973 году фирма Sharp выпустила первый ЖК-калькулятор c дисплеем на основе DSM-LCD. Жидкокристаллические дисплеи стали применяться в электронных часах, калькуляторах, измерительных приборах.

Сегодня самое популярное применение ЖК – жидкокристаллические дисплеи. Часто их называют LCD-дисплеи, что есть сокращение английского термина «liquid crystal display». В век гаджетов они присутствуют практически в любом электронном устройстве: телевизоры, мониторы компьютеров, электронные книги, планшеты, телефоны и др.

Но давайте вернёмся к главной теме нашего повествования – биологической мембране.

Сегодня не принято называть мембрану жидкокристаллической, но вполне допускается, что она может находиться в одном из двух состояний:

– гелеобразное состояние мембраны – состояние, при котором липиды лишены возможности свободно перемещаться («течь») в плоскости мембраны. Такое состояние можно представить, взглянув на маргарин.

– жидкое (жидкокристаллическое) состояние мембраны – отличается способностью липидов «течь» и перемешиваться в плоскости мембраны. Липидные молекулы при этом менее упорядочены, по сравнению с гелеобразным состоянием. Жидкое состояние может условно разделить на две взаимно несмешивающиеся микрофазы: жидкое неупорядоченное и жидкое упорядоченное состояния.

Традиционно, наибольшее внимание исследованиям мембран уделяют именно нейробиологи. (Всё-таки нет окончательной ясности с распространением нервного импульса.)

В 2005 году Томас Хаймбург и Андрю Д. Джексон предположили, что в момент прохождения нервного импульса происходит изменение фазового состояния клеточной мембраны с твёрдого (гелевого) на жидкокристаллическое. Именно этим фазовым переходом они объясняли и изменение оптических свойств мембраны, и выделение-поглощение тепла при возбуждении нервного импульса, обнаруженного Ичиджи Тасаки, а также и диффузию ионов через мембрану.

Эта гипотеза была в штыки воспринята большинством научного сообщества. А критика идеи фазового перехода утянула на дно и саму идею жидкокристаллического состояния биологической мембраны. Между тем мало кто обратил внимание на одно из главных свойств жидких кристаллов – анизотропию – различие свойств в зависимости от направления.

Сколько степеней свободы у молекулы в липидном слое? Три. Но в направлении перпендикулярном поверхности мембраны свободы гораздо больше. То есть мембрана, оставаясь достаточно жёсткой конструкцией для сохранения формы клетки, может быть чрезвычайно мягкой и упругой при распространении механической волны вдоль аксона.

Исследование каналов биологических мембран

В 1998 году Родерик Маккиннон (Roderick MacKinnon) с коллегами смог получить трёхмерную молекулярную структуру биологического калиевого канала с помощью кристаллографии и раскрыл селективность канала, а именно – почему в момент прохождения нервного импульса канал пропускает только ионы калия, а более мелкие ионы натрия, которые также имеют положительный заряд, не проходят.

Маккиннон с помощью выращенных им же кристаллов белка калиевого канала смог экспериментально объяснить этот феномен.

Рентгенограмма созданной им структуры показывала в мельчайших деталях, как работает калиевый канал, как он обеспечивает практически беспрепятственный перенос ионов калия, и в то же время задерживает более мелкие ионы натрия.

Вообще-то ещё со времён открытия теории диссоциации известно, что все ионы в растворах окружены толстым слоем воды, и нужны некоторые усилия, чтобы сбросить её. Напомним, что и калий, и натрий являются очень активными щелочными металлами, у каждого из атомов есть по одному валентному электрону, с которыми они легко расстаются и превращаются в ионы. Различие лишь в том, что у натрия этот электрон находится на 3-й орбите, а у калия на 4-й. Вследствие этого обстоятельства, калий сравнительно легко сбрасывает с себя окружающие его молекулы воды и проскакивает через мембранный канал. С натрием же дело обстоит иначе, он хотя и меньше калия, но не в состоянии скинуть водяную рубашку. А вместе с рубашкой натрий просто слишком велик, чтобы пройти канал.

В 2003 Родерику Маккиннону вместе с П. Эгром присуждена Нобелевская премия «за открытия, связанные с ионными каналами в клеточных мембранах: за изучение структуры и механизма действия ионных каналов».