Знание-сила, 2001 № 04 (886)

От зеленых вирусов к изумрудным овцам

В 1990-х годах российскими биологами было сделано важное открытие: исследованы белки, придающие яркую окраску некоторым животным, и разработаны способы внедрения их генов «нецветным» организмам.

Это значит, что через несколько десятилетий обычной картиной могут стать ярко-красные овцы, изумрудные кошки, кролики, окрашенные в цвета коралловых рыбок… Но куда важнее значение этих исследований для науки и медицины. Как сделать так, чтобы в экспериментах на животных клетки раковой опухоли резко отличались от других тканей по цвету?

Чтобы проникающие в клетку вирусы были видны «как на ладони» – за счет излучаемого ими света? Как сделать зримыми всевозможные биохимические процессы? Наш корреспондент Кирилл ЕФРЕМОВ записал беседу с одним из авторов открытия, Юлием Александровичем ЛАБАСОМ. Речь пойдет о значении светящихся белков – как для эволюции далекого прошлого, так и для технологии близкого будущего.

– Юлий Александрович! Известно, что млекопитающие не могут похвастать большой пестротой окраски. Кстати, самые цветные среди них – приматы. Человек, имеющий в палитре своего тела только черный и рыжий пигменты, научился украшать себя всевозможными цветами – примат, он и есть примат. Неужели в ближайшем будущем он сможет «покрасить» и своих спутников – домашних животных во все цвета радуги?

– Да, возможно, через несколько десятилетий будут выведены породы всем нам знакомых животных, окрашенные не хуже коралловых рыбок. Для этого надо научиться вводить в геном гены, кодирующие «цветные белки». Впрочем, не это главное. Использование «цветных белков» открывает дорогу целому направлению биотехнологии. В конце 1990-х российские ученые открыли новое семейство цветных и флуоресцирующих белков, которые можно широко применять в биотехнологии. Итоги этих работ названы президентом РАН одним из трех крупнейших открытий в биологии за последнее десятилетие.

А началась история этого открытия очень давно – еще в конце XVIII века* В то время датский ученый и путешественник Форскал описал небольшую медузу, «способную светиться внутри», которую он назвал «экворея». Прошло почти два столетия, прежде чем была установлена причина свечения: светится особый белок, названный экворином. С конца 1960-х его стали широко использовать для исследований как сверхчувствительный индикатор ионов кальция в живых структурах. В частности, при введении его в мышцы усоногих рачков удалось доказать, что в основе мышечного сокращения лежит выброс ионов кальция.

Однако, как оказалось, в свечении медуз участвует не только экворин, но и еще одно вещество, названное «зеленым флуоресцирующим белком». При попадании на него синих лучей он испускает яркий зеленый свет – флуоресцирует. Когда изучили его структуру оказалось, что это настоящее чудо природы. После синтеза в рибосоме «зеленый флуоресцирующий белок» сворачивается в виде причудливой «клетки», а внутри нее, словно попугай, располагается хромофорное кольцо, от которого и зависит свечение. Оказалось, что «клетка с попугаем» очень устойчива – сохраняет способность светиться в разных условиях, да и вообще «зеленый флуоресцирующий белок» – очень удобный объект для исследования. Начался шум. Было сделано более шести тысяч работ с применением этого белка в качестве генетического маркера.

В конце 1990-х вместе с сотрудниками лаборатории С.А. Лукьянова в Институте биоорганической химии РАН и с А.П. Савицким из Института биохимии РАН мы стали искать: нет ли других организмов (кроме медузы), обладающих подобными светящимися белками? Возникла идея поработать с одним из видов актиний, не проявляющим явного свечения. Первое время работа казалась безрезультатной. Мы были похожи на Балаганова, который пилит гири: «Пилите, Шура, они золотые» – вот о чем думалось. И поиск был успешным. Нам удалось клонировать гены, продукт которых представлял собой новую разновидность «зеленого белка». В конце концов, было обнаружено множество разноцветных оптически активных белков. Мы словно напали на золотую жилу, получив целое семейство генов, кодирующих экзотическую окраску морских животных. Кстати, за живностью не потребовалось ехать в тропики – все нашлось у московских аквариумистов. Вы знаете, что Москва – мировая столица морских аквариумов?

– Все же мы привыкли думать, что «цвета жизни» обусловлены пигментами, в первую очередь-растительными, которые заодно окрашивают многих морских животных (за счет обитающих в их тканях водорослей), и даже шерсть некоторых зверей (скажем, ленивцев или белых медведей).

– Действительно, долгое время считалось, что окраску задают пигменты – низкомолекулярные соединения. Но оказалось, что есть множество белков, то есть куда более сложных молекул, влияющих на окраску, например тех же стрекающих. Причем небольшие изменения в их структуре, вызванные мутацией гена, могут изменить оптические свойства. Тогда меняется цвет, усиливается или ослабевает свечение. Кстати, недавно сотрудники Института биоорганической химии РАН и Стэнфордского университета в США совместно открыли «мутант-таймер» – такую форму белка, которая после синтеза имеет зеленый цвет, а за 16 часов делается желтой и, наконец, красной (видимо, потому, что хромофорная группа «созревает» – окисляется). Вначале этот ген был «посажен» нами в кишечную палочку. А потом его перенесли в яйцеклетку лягушки. И уже можно увидеть воочию, как внутри эмбриона красными, желтыми и зелеными пятнами отображаются разные стадии развития тканей, видно, где экспрессия генов произошла раньше, а где – позже.

– Открываются широкие возможности.

– Наш успех в исследованиях «цветных белков» имеет не только биологическое значение: «Какие-то русские сделали открытие!» – так с удивлением отметил американец Роже Тсьен, один из мировых авторитетов в области клеточной биологии. Возможные перспективы наших исследований – выделить гены белков, которые светятся от свободных радикалов кислорода, и присоединить их к трансгенам (вирусам – переносчикам генов), что позволит прямо в нейронах, в мышцах и так далее наблюдать кинетику свободных радикалов кислорода в момент возбуждения клеток.

– Почему вы заговорили о кислороде?

– Потому что кислород – это ключ к пониманию роли «цветных белков» в эволюции. Сейчас я об этом расскажу.

– Итак, какова же роль оптически активных белков?

– Вообще, это открытие помог сделать эволюционный подход. Еще Чарльз Дарвин задумывался о том, как можно объяснить возникновение свечения под действием естественного отбора. У большинства морских тварей свечение предназначено для отпугивания хищников (скопление светящейся мелочи производит на них впечатление массивного чудовища) либо для привлечения брачного партнера. Но ведь светятся и древние организмы, особенно одноклеточные, которые возникли задолго до появления зрячих хищников. В частности, еще в 1970-х я обнаружил, что зеленая флуоресценция у гребневиков (это настоящие морские дирижабли – но только по отношению к планктону, которым они питаются) очень похожа на свечение «зеленого белка». То есть ее вызывает аналогичная система. А сейчас известно, что эволюционные пути гребневиков и стрекающих разошлись очень давно, еще в докембрийском «слепом» мире – до появления хищников с хорошо развитым зрением. Зачем же вообще яркие цвета слепым (или почти слепым) морским животным? Вероятно, у светящихся белков должна быть более древняя, универсальная функция.

Мы предположили, что эта функция – зашита от яркого света как причины образования активных форм кислорода. Дело в том, что для животных, например, кислород является источником жизни только в том случае, если он утилизируется митохондриями. В иных случаях кислород (а особенно его активные формы – свободные радикалы) предстает как мощный окислитель и разрушает молекулярные структуры жизни. Поэтому его надо нейтрализовать. Этим занимаются молекулы-антиоксиданты (к ним относится всем известная аскорбиновая кислота). Биолюминесцентные системы также участвуют в нейтрализации активных форм кислорода – именно при этом процессе и происходит излучение фотонов.

– То есть можно считать, что когда атмосфера насытилась кислородом, этим ядовитым продуктом фотосинтеза, эукариоты стали защищаться от него, в том числе люминесцентными белками?

– Это началось гораздо раньше. Уже в условиях бескислородной атмосферы живым клеткам приходилось защищаться от огромного количества активного кислорода. Вы спросите, откуда он брался? В то время Земля еще не имела защитной ионосферы и озонового слоя, поэтому мощное ультрафиолетовое излучение расщепляло молекулы воды (в которой сосредоточивалась жизнь) с образованием перекиси водорода и других активных соединений кислорода. Поэтому ко времени возникновения эукариот многие формы жизни (в том числе бактерии – предки митохондрий) были уже хорошо защищены от действия активного кислорода. Но, на самом деле, все еще сложнее: биолюминесцентньте комплексы оказались необходимы для защиты организма от активных форм кислорода, которые он же сам и производит!

– Для чего же производить столь опасный продукт ?

– Для зашиты от микробов, в первую очередь – от гнилостных бактерий. Вы никогда не задумывались, как организмам удается отражать их атаку при жизни? Иммунитет? Но ведь гуморальный иммунитет (когда во внутренней среде высока концентрация антител) хорошо развит только у теплокровных. А как защищаются беспозвоночные? Вот у Герберта Уэллса марсиане, легко одолевающие земные войска, были побеждены… гнилостными бактериями. А почему земные организмы не гниют при жизни? Оказывается, помимо работы специфического иммунитета действует поток свободных радикалов кислорода. Гнилостные бактерии его боятся. Если бы получили способность не бояться – съели бы все живое, а затем все мертвое, и их бы самих не стало. Поэтому в процессе эволюции они словно заключили соглашение: «пока живой – не гниет».

Активный кислород используют и наши белые кровяные тельца. Можно сказать, что фагоциты ползут, как танки, и временами сообща дают «залп» свободными радикалами, «сжигая» бактерии. В этот момент в их клетках происходит «дыхательный взрыв» – скачок потребления кислорода, причем не для дыхания, а для производства радикалов. При этом наблюдается их слабое свечение. Активно выделяют радикалы и клетки эпителия. Но производителям радикалов кислорода необходима защита от самоубийства – в этом качестве и выступают антиоксиданты, отдельные из которых дали начало биолюминесценции.

Кстати, у человека избыток радикалов возникает при таком заболевании, как серповидно-клеточная анемия. Такой человек легко может умереть от инфаркта или инсульта (избыток перекиси поражает стенки сосудов). Но эта же перекись убивает малярийный плазмодий, попавший в кровь. То есть эта болезнь в «малярийных» регионах оказывается средством выживания.

Так выглядят кораллы в ультрафиолетовых лучах. Их свечение вызвано особыми флуоресцирующими белками

– В ходе нашей работы мы узнали, что огромный и цветной мир кораллов и актиний (а также, как мы полагаем, многих других обитателей моря) окрашен с помощью белков, на которые распространяется принцип «один ген – один белок – один цвет». Все они родственны тому самому «зеленому флуоресцирующему белку» медузе-экворее. Их важная функция – светозащитная. То есть они создают световой экран, способный как бы притенять в их тканях теплицу с симбиотическими водорослями и тем самым ослаблять выделение ими кислорода, в том числе и его активных форм. Ведь избыточный фотосинтез на очень ярком свету (под тропическим солнцем) по-своему вреден, и «цветные белки» помогают уменьшать этот вред. Если же света недостаточно, те же оптически активные белки оказываются расположены под слоем водорослей, наоборот, и усиливают световой поток. Вообще морские животные довольно активно «руководят» эндосимбионтами, сокращаясь или расслабляясь при действии определенных лучей. «Цветные белки» тоже участвуют в такой регуляции.

– Это косвенная защита. А обладают ли изучаемые вами щцветные белки» собственной антиоксидантной активностью?

– Этого еще никто не проверял. Просто время не пришло. Сейчас предпринимаются попытки ответить на этот вопрос.

В генах этого детеныша уже есть код зеленого флуоресцентного белка. Это единственная удача из 224 попыток внедрения такого гена в яйцеклетки макак-резусов.

– Расскажите о возможностях практического применения «цветных белков».

– В биологии часто возникает необходимость следить за судьбой отдельных белков, клеточных клонов, бактерий и вирусов. Лучшей меткой здесь является флуоресценция (на внутриклеточном уровне) и цветная окраска (на уровне организма). Приведу такой пример: возникла необходимость проверить действие какого-то онкостатика – вещества, угнетающего раковую опухоль. Допустим, в ходе эксперимента организму прививают клетки опухоли. Но как же увидеть, растет она после действия онкостатика или нет? Рентген здесь помогает далеко не всегда. А вот если к генам опухоли «прицепить» ген белка-маркера, она будет выделяться оптическими свойствами.

Здесь еще очень важно получше узнать взаимодействие люминесцентных белков и активного кислорода. Дело в том, что клетки раковой опухоли производят его больше, чем другие ткани. Раковая опухоль «ползет», окутанная свободными радикалами, «не понимая», что ее окружают клетки своего организма Сама она имеет хороший антиоксидантный механизм, а соседние ткани разрушаются. Если же научиться подавлять антиокскдантные свойства опухолевых клеток, то с ними будет гораздо легче справиться.

Есть еще одна сфера возможного применения. У флуоресцирующих молекул есть «память», и поэтому из совокупности клеток можно создать массив, который будет вести себя как вычислительное устройство. То есть возможно их использование для создания биокомпьютеров. А вообще таких сфер – не перечесть. В иммунологии – можно связывать с антигеном один белок-маркер, с антителом – другой и узнавать по изменению спектра, когда произошло взаимодействие антиген-антитело. В эмбриологии – можно пометить клетки-предшественники и наблюдать за их дальнейшей судьбой: каким тканям они дают начало, куда мигрируют (ведь некоторые клетки совершают целые путешествия внутри организма). В одной из недавних работ в два бластомера лягушки ввели гены белков-маркеров разного цвета и получилась… половина головастика красная, половина – зеленая.

– А есть ли еще подобные результаты по окраске покровов?

– Да, их уже немало. Например, работы с генами белка кератина, который входит в состав шерсти. Ведутся работы по «получению» цветных зверей: уже можно было увидеть мышь и собаку, которые светятся ярко-зеленым в лучах синего света, и обезьяну такой же окраски. Могу сказать, как это сделали: в яйцеклетки ввели вирус, в который включен ген зеленого флуоресцирующего белка, затем их искусственно оплодотворили и имплантировали в матку самкам. Из двадцати особей у одной получилась зеленая окраска. Теперь ее потомки тоже будут зеленые.

– Результат немного жутковатый. Вспоминается Конан-Дойль с его собакой Баскервилей. У него еще было что-то о микробах, вызывающих синие пятна на коже, которыми чуть не отравили город… Но даже если отвлечься от детских страхов: не отразится ли все же такое вмешательство на жизнеспособности?

– Конечно, пока это не проверено, но можно предположить негативную реакцию на свет, под действием которого в клетках кожи будет вырабатываться излишек кислородных радикалов.

– Во все времена люди старались изменить свою внешность. Как только не травмировали тело, причем почти без асептики и анестезии. Мне кажется, что прогресс медицинских технологий может в недалеком будущем спровоцировать очередную моду на измененную внешность. Это будет похлеще пирсинга и татуировок. Не могут ли цветные белки стать одним из инструментов «,живого грима»?

– Это было бы очень неразумным шагом. Здесь как раз и существует опасность побочных эффектов, когда под действием света молекулы «цветных белков» возбуждаются и могут стимулировать в коже процессы разрушения тканей. Кроме того, этой технологией трудно управлять. В принципе, можно сконструировать такой ретровирус, который проникал бы в клетки и заставлял их синтезировать цветные белки. Но много ли найдется женщин, которые бы согласились, чтобы их яйцеклетки поразил вирус, вызывающий изменения в геноме ребенка? А ведь всегда есть немалый процент брака. Так что лучше оставаться «самим собой».

– Я вообще-то имел в виду другое. Представим себе, что человек будущего придет в «центр красоты» и заявит, что хочет иметь такие же полосы на лице, как у тигра (а лучше – как у мандрила). И его кожу уже не будут красить, а введут в клетки вирус (какой-нибудь вроде вируса папиллом), который заставляет клетки кожи выделять разноцветные белки. Мало ли до чего может дойти технология и мода. Украшают же сейчас себя цветными татуировками и силиконовыми протезами… А может появиться и такое применение: получение шерсти, окрашенной естественным путем (которая удовлетворит пристрастие к «натурпродукту»). И, тем не менее, в подобном вмешательстве в природу можно усмотреть повод для осуждения. Как вы думаете, не поднимется ли волна порицания со стороны общественности – аналогично ситуации с проблемой клонирования? Мол, «доктор Моро» со своими синими мышами опять творит монстров и вершит насилие над природой?

– Конечно, люди, воспитанные на триллерах об ученых-злодеях, могут воспринять нашу работу именно так. Но ведь, повторюсь еще раз, «окраска шкуры» остается совсем не главной задачей. Главное – научиться использовать цветные белки в медико-биологических исследованиях. Тогда будет большой прогресс в иммунологии, эмбриологии, прикладной медицине и во многих других областях.