Физико-химические факторы биологической эволюции (1979)

_{Представленная на рис. 12 схема энергетического сопряже­ния идеально высокоэффективна. Малая добавка вещества А приведет к образованию соответствующего числа (от добавлен­ного Л) молекул у (Af°=0), т. е.:}

_{_ Ml [х] [у]} ^р _'

_{Такое высокоэффективное сопряжение может быть чисто хи­мическим, т. е. не требовать осуществления процесса посредст­вом механических или электрических механизмов.}

_{Менее совершенно сопряжение двух химических реакций по­средством немакроэргического промежуточного состояния си­стемы. Представим себе, что А сначала превращается в В, а затем В реагирует с х (см. рис. 12). Как показал Л. А. Блюмен- фельд [30], такой механизм сопряжения в нестационарном ре­жиме малоэффективен, «импульс» увеличения концентрации А почти не дойдет до увеличения концентрации х~г/ — синтезиру­ется лишь очень немного макроэргических молекул — в соот­ветствии с величиной К„ реакции В + х+-В~х. Однако в стацио­нарном режиме, при поддержании постоянной сверхравновесной концентрации А, сопряженный синтез х~у и по этому механизму может быть вполне эффективен, как эффективно перетекание жидкости в сифоне (см. схему, рис. 12).}

_{Макроэргические соединения х~у могут служить источником энергии во всех процессах, где возможно их специфическое хими­ческое реагирование. Этим и достигается «векторизация» траты термодинамического потенциала экзэргонических реакций.}

_{Так, например, добавление х~у к В может привести к обра­зованию в реакции В + х ~у^В~х + у, что никак не уда­лось бы при попытке провести реакцию В+х-^В~х. Таков энер­гетический механизм химических сопряженных реакций, откры­тых в начале нашего века Н. А. Шиловым [331].}

_{Нужно специально подчеркнуть, что «макроэргичность» — это не характеристика свойств связи х и у самой по себе, а мера из­менения свободной энергии в процессе превращения распада, гидролиза вещества х~у. Ясно, что величина изменения свобод­ной энергии процесса (и даже знак этой величины) зависит от условий проведения процесса. Таким образом, микроэргическими называются соединения, распад которых (обычно гидролиз) сопровождается существенным уменьшением свободной энергии системы (ДF° около 10—20 ккал/моль) в данных условиях.}

_{Макроэргические соединения должны образовываться за счет энергии, внешней по отношению к системе, например, за счет энергии света. Кроме того, они должны быть универсальными, т. е. годиться для энергетического обеспечения разных синтезов.}

_{Биохимикам ясно, что сейчас речь пойдет в основном о пиро}­_{фосфатах. Установление такой роли пирофосфатов — одно и. главных достижений биохимии XX в. (см. [37, 135, 157, 176, 265- 268, 297, 407, 420, 436]). Пирофосфаты представляют собой ан гидриды ортофосфорной кислоты. Неорганический пирофосфа образуется при нагревании, при прокаливании солей ортофос- форной кислоты:}

_{О О 0 0}

_{II II '|° I! II Т}

_{НО-Р-ОН + НО + Р-ОНА НО-Р-О ~ Р-ОН + н2о.}

_{I II}

_{0~Na+ 0~Na+ 0'Na+ 0~Na+}

_{Ангидридная пирофосфатная связь может образоваться между большим числом остатков ортофосфорной кислоты, тогд; возникают молеь^лы полифосфатов:}

_{Пирофосфатная связь макроэргична в указанном смысле — при ее гидролизе в стандартных условиях свободная энергия си­стемы уменьшается на 7—10 ккал/моль, т. е. гидролиз идет прак­тически до конца. За счет уменьшения свободной энергии при гидролизе макроэргических связей и может осуществляться сое­динение, например, нуклеотидов в поликлеотидную цепь. Так, в реакции с участием пирофосфатаденозина (АДФ) происходит (за счет энергии, выделяющейся при расщеплении пирофосфатной связи) присоединение аденозинмонофосфорной кислоты АМФ к другому нуклеотиду, например ГМФ (реакция Грюнберг-Мона- го, Очоа):}

_{АДФ + (ГМФ)П^: АМФ- (ГМФ)„ + Н3Р04.}

_{Аналогичным образом можно сместить равновесие в случае синтеза пептидных связей при сопряженном расщеплении пиро- фосфатных связей в АТФ, образовании активированной, макро- эргической формы аминокислоты — аминоациладенилата. Пиро}­_{фосфаты при нейтральном и щелочном значениях pH среды слу­жат универсальными посредниками в превращениях энергии, необходимой для биохимических процессов. Однако создание больших концентраций пирофосфатных производных нуклеоти­дов невозможно: нуклеотидпирофосфаты активно участвуют в синтезе полинуклеотидов и их высокие концентрации могут по­влиять на неконтролируемый синтез полинуклеотидов. Необхо­димы склады для хранения запасов термодинамического потен­циала в менее активной форме.}

_{Наиболее простой выход из создавшейся ситуации — хранение энергии в виде минерального пирофосфата или полифосфатов. Это и реализуется в клетках некоторых низших грибов и ряда бактерий (см. работы И. С. Кулаева [162]). В таких организмах хранилищем энергии оказываются минеральные полифосфаты (при числе ортсфоефатных остатков в цепи, достигающем 200— 300). От компактных осмотически (а, значит, и кинетически) не­активных частиц по мере надобности «откусываются» посредст­вом специальных ферментов пирофосфатные группы для энерге­тического обеспечения биохимических процессов.}

_{Однако эти «питательные камни» все же не очень удобны: мала поверхность взаимодействия со средой, мала предельная скорость вовлечения в метаболизм содержащейся в них энергии. Необходимы относительно мелкие, биохимически узко специа­лизированные хранилища термодинамического потенциала.}

_{В организмах животных эти функции выполняют гуанидин- фосфаты: креатинфосфат и (у беспозвоночных) аргининфосфат.}

_{Ясно, однако, что хранение больших количеств энергии в виде гуанидинфосфатных и прочих макроэргических соединений так­же невозможно: на самом-то деле количество энергии, освобож­даемой при гидролизе каждой связи, очень мало (всего около 10—20 ккал!моль). Таким образом, мы приходим к вполне три­виальному выводу — наиболее удобно хранить энергию в виде запасов пищи: жиров, углеводов, белков (см. с. 131).}

_{Тем не менее, и в данном случае по кинетическим соображе­ниям именно макроэргические соединения служат непосредст­венным источником энергии для эндэргонических биохимиче- ких процессов: свободную энергию из них можно получить в оп­тимальных дозах наиболее быстрым образом.}

_{Универсальным в процессах превращения энергии в живых организмах на Земле веществом является аденозинтрифосфор- ная кислота АТФ *:}

_{Представляется очень интересным установить причины, кото­рые привели к выбору в процессе эволюции именно АТФ в ка­честве универсального посредника для подавляющего большин­ства видов превращения энергии в биохимических процессах. Возможно, что и в этом случае дело не столько в существенном, «деловом» превосходстве АТФ по сравнению, например, с ГТФ или ЦТФ, сколько в легкости спонтанного возникновения фос­форных производных именно аденина.}

_{В соответствии с эволюционной логикой нашего анализа мы должны допустить, что образование АТФ сопряжено с поглоще­нием света. Верность такого допущения можно оценить лишь при осуществлении в эксперименте синтеза пирофосфатных свя­зей АТФ в относительно простой модельной системе при погло­щении света.}

_{Прежде, чем приступить к оценке возможностей такого экспе­римента, попытаемся выяснить физико-химические причины макроэргичности пирофосфатных связей.}

_{Вопросы эволюции биохимических механизмов преобразования энергии (см.}

_{[37, 152, 268]).}

_{О причинах макроэргичности пирофосфатов. Большая вели­чина изменения свободной энергии при гидролизе пирофосфатов, т. е. их макроэргичность, проявляется в сильном сдвиге равно­весия реакции гидролиза:}

_АТФ⁴_{" + Н20 ^ АДФ}³_{- + HPOf- + н+}

_{в сторону продуктов. Как известно, связь константы равновесия реакции К с величиной сопровождающего реакцию стандартного изменения в ней свободной энергии AF}⁰ _{имеет вид:}

_{AF° = — ЯГ In К,}

_{где К — константа равновесия. Следовательно, для гидролиза АТФ можно написать:}

_[АДФ³_{-] [НРСЯ- [Н+]}

_{AF = — RT In [АТФ}^4-_{] [Н20]}

_{Однако в написанной выше реакции не отражена нейтрализа­ция образующихся ионов водорода ионами гидроксила среды, т. е. реакция:}

_{н++он-^н2о,}

_{сопровождающаяся очень большим стандартным (AF°) измене­нием свободной энергии, равным примерно 20 ккал/моль. К со­жалению (или к счастью), в биохимических системах отсутству­ют сильные щелочи и кислоты — скрытые резервы ОН}^- _{и Н}⁺ _{ионов представлены какой-либо буферной системой, т. е. обычно слабыми кислотами и их солями.}

_{Мы уже видели, что в молекуле ортофосфата содержатся три группы, способные диссоциировать с образованием иона во­дорода. Однако соответствующие рК резко различны. Первый гидроксил (тот, который успевает диссоциировать первым), дис­социирует на 50% при pH около 2,0 (т. е. его рК равна 2). рК для второго гидроксила составляет 7,0, для третьего — около 13. Таким образом, при pH около 7 полностью диссоциирован пер­вый гидроксил, наполовину — второй и совсем недиссоциирован третий. Ниже приведены структурные формулы орто-, мета- и пирофосфата:}

_О

_И

_н⁺_о-рч

_{п ©} ^Ч_{° о о 'jj' Метафостфат ^ ||}

_{н-о-р-о" н-о-р-о-р-о^}

_{© I .Ф © I ® I Р}

_{^ сгн}⁺ _{о~ СГН}⁺

_{© © (D}

_{Ортофосфат Пирофосфат}

_{Стандартное изменение свободной энергии ДF}⁰_{, т. е. при единичных концен­трациях исходных реагентов, нормальном давлении, £=25°, рН=7.}

_{В пирофосфате «не хватает» второго гидроксила — он несет 2,5 отрицательных заряда вместо 3,0, как было бы в двух орто}­_{фосфатах. При гидролизе появляется недостающая половина за­ряда и соответствующее количество ионов водорода нейтрализу­ется ионами гидроксила среды. Возьмем для конкретности преж­нюю карбонат-бикарбонатную буферную систему и запишем ре­акцию гидролиза АТФ подробнее, с учетом нейтрализации об­разующихся ионов водорода в буферной системе. При гидролизе пирофосфатной связи появляется новая кислотная группа — второй гидроксил ортофосфорной кислоты:}

_{оо о о}

_{RO-P-0-P-Cr +H305=2-R0-P-0 + H}⁺_+H-0-P-Cr

_{®i-®i-® ®£-о © i-®}

_{® © ® ®}

_{Выпишем отдельные стадии процесса гидролиза и найдем для каждой константу равновесия.}

_{Первая стадия записывается в виде:}

_АТФ⁴_{- Н20 ^ ЛДФ}³_{- + Н2Р04 ;}

_{_ [АДФ»~] [Н2Р07]}

^Kl _{~ [АТФ}⁴_{-] [Н20] ■}

_{Во второй стадии образовавшийся ортофосфат диссоциирует:}

_[Н⁺_{] [НРОП}

_{H2POJ ^ Н++ HPOf; Кг}

_[Н2Р04]

_{[СОГ] [Н}⁺_{] [НСО-]}

_{В третьей ион Н+ реагирует с ионами С03}²_{~ карбонат-бикарбо- натной буферной системы:}

_С0²_{~ + Н+ ^ НСО;; К3 =}

_{Поскольку [С03}^2-_{] значительно больше [НР04}^2-_{], концентрация Н}⁺ _{определяется лишь свойствами буферной системы и равна:}

_{К3 [HCOJ]}

_{[НЧ - -}

_[С03²_~]

_{Учитывая приведенные выше соотношения для [Н}⁺_{] и [Н2Р04}^__{], получим ДЛЯ Ki\}

_{К3 [НСО-] [НРО}²_{'] [АДФ}³_~]

_К1

_{х, [СО}²_{-] [АТФ}⁴_{-] [Н20]}

_{Поскольку концентрация воды в водных растворах постоянна и равна 55,5 М, имеем для константы равновесия R суммарного}

_{кг [ЧСО~] [HTOJ-] [АДФ*-]}

_{К = Кх[ Н20]^-}^{2 4}

_{К9 [СО®}^-_{] [АТФ}⁴_-]

_{Из справочников находим /С2 = 1,6-10}^_7 _{и /С3}^г_{= 5,6• 10~}^и_{, откуда в данных условиях}

_{К = К,-1,6-10}⁵_.

_{Иными словами, для AF получаем:}

_{AF = - 2,3RT lg Ki — 2,3RT lg (1,6 • 10}⁵_{) =}

_{= — (2,3RTlgKi-t 7,3 ккал/мэль).}

_{Как мы видим, изменение свободной энергии, вызванное нейтра­лизацией продуктов гидролиза и наличием воды в большой кон­центрации, весьма заметно. Правда, мы взяли буферную систе­му, поддерживающую сильно щелочную реакцию среды.}

_{Для реакции нейтрализации ионов водорода, например, в фосфатном буфере, где в наших обозначениях Кг=К3, имеем:}

_{^ = K,[HsO].}

_{Нейтрализация продуктов гидролиза в этом буфере не дает выигрыша в энергии, но становится очевидной роль высокой концентрации воды}

_{AFHs0 = - 2,3RT lg [Н20] = - 1,4 ■ 1,74 ж — 2,4 ккал/моль.}

_{Для того, чтобы оценить R, нужно знать Л’,. Величина Ki зави­сит от различий свойств молекул соответствующего пирофосфата и продуктов его гидролиза. Рассмотрим поэтому еще раз про­цесс гидролиза пирофосфатов}

_{О О о о}

_{[I II II II}

_{Н—О—Р-0 ~Р—О- 4 н2о -> Н-О—Р—О- + Н-О-Р—о- + н+.}

_{! I I I}

_{О- О- о- о}

_{При гидролизе пирофосфата рвутся связи Р—О (пирофосфат- ная связь) в пирофосфате и О—Н в воде и образуются снова те же связи Р—О и О—Н, но уже в ортофосфате. Для того, что­бы судить об энергетических изменениях при таком гидролизе, нужно знать различия в энергиях этих связей в пиро- и орто}­_{фосфате, т. е. знать эффекты, обусловленные влиянием третьих атомов на энергию связи двух. Эффекты эти невелики и оцени­ваются 2—3 ккал/моль.}

_{Связь Р~0 в пирофосфате менее прочна, чем связь Р—О в ортофосфате, т. е. термодинамически менее выгодна; при ее об­разовании выделяется меньше энергии, чем при образовании такой же связи в ортофосфате. Причины ее меньшей прочности, меньшей стабильности были рассмотрены в 1939 г. Г. Калька-}

_{ром (см. [407]), в 1941 г. Ф. Липманном >[420], в 1950 г.— П. Оспером [438] и т. д. В пирофосфатной связи атом кисло­рода, соединяющий (или, если угодно, разделяющий) два фос­фатных радикала, препятствует резонансному усреднению л-электронной структуры ортофосфата и возникает ситуация «Беспрепятственного резонанса» (opposite resonance). Кванто­вомеханический резонанс сопровождается выделением энергии, он термодинамически выгоден [233, 279]. Нарушение резонанса обусловливает термодинамическую нестабильность: гидролиз устраняет препятствия для резонанса и возникают более выгод­ные связи Р—О в ортофосфате. Приведенная схема иллюстри­рует сказанное:}

_о

_/и

_/\\

_о

_{НО—Р^;о-Н}

_{В ортофосфате я-электроны двойной связи растекаются па всем четырем связям фосфор-кислород в результате резонанса структур, что выгодно термодинамически. В пирофосфате резо­нансное растекание л-электронов нарушено на кислородном мо­стике. Поэтому при гидролизе пирофосфата уменьшается сво­бодная энергия, образуются более стабильные продукты. Все эти эффекты, насколько мне известно, не были до сих пор оценены с достаточной точностью — о их величине можно судить лишь на основании косвенных, главным образом экспериментальных, данных.}

_{Из экспериментальных данных ДF гидролиза пирофосфатных связей оценивается в 5—8 ккал1моль в зависимости от условий [362], и поэтому на долю ДF}^a _{(т. е. К\) остается около 2 ккал[ /моль.}

_{Таким образом, нейтрализация продуктов гидролиза и высо­кая «концентрация воды в воде» обусловливают основной вклад в изменение свободной энергии гидролиза пирофосфатной связи}

_[455].

_{Макроэргичность пирофосфатов определяется в значительной степени значением pH, поддерживаемым в среде, т. е. величиной буферной емкости. Расход свободной энергии, накопленной в рН-буферной системе векторизуется, т. е. направляется в нуж}­_{ную реакцию посредством сопряжения гидролиза пирофосфата с тем или иным эндэргоническим процессом.}

_{Рассмотренные выше причины макроэргичности нельзя счи­тать единственно возможными.}

_{Так, основной вклад в изменение свободной энергии при гид­ролизе гуанидинфосфатов (креатинфосфат, аргининфосфат), по-видимому, вносит протонирование освобождающейся NH2- группы гуанидина и снятие запрета на резонанс структур:}

_{NH H 0 NH О}

_{I II II II}

_{C-N ~ P—0~ 4- H20+ H+ C-N+H3 -1- HO-P-O-.}

_II

_{R O' R O-}

_{Естественно, что изменение свободной энергии при гидролизе этих соединений больше в кислой среде (а не в щелочной, как при гидролизе пирофосфатов).}

_{Особым примером макроэргического соединения, рассмотрен­ным еще Калькаром и Липманном, является фосфоенолпируват. При его гидролизе образующиеся продукты дополнительно не ионизируются:}

_{соон о соон о}

_{II I II}

_{С—О-Р-О- + Н20 С-ОН + H0-P-0-.}

_{Н I I! I}

_{СН2 О- СН2 О-}

_{Основной вклад в макроэргичность вносит превращение тер­модинамически нестабильной енольной формы пирувата в ста­бильную кетоформу.}

_{В этом случае макроэргичность молекулы не проявляется в ее физических свойствах. Термодинамическая невыгодность су­ществования молекулы выявляется лишь в процессе ее разру­шения при гидролизе. Макроэргичность такого типа, характер­ная для пирофосфата, фосфоенолпирувата и гуанидинфосфатов особенно привлекательна для биохимических целей. Перечислен­ные выше молекулы кинетически устойчивы, запас энергии, со­держащийся в них, выделяется лишь при катализе — специфиче­ском ускорении реакции их гидролиза. Вероятно, именно в силу особой кинетической стабильности и достаточной макроэргич- ности пирофосфаты и заняли столь выдающееся место в процес­сах превращения энергии в биологических системах.}

_{Мне здесь хочется особенно подчеркнуть, что запасания энер­гии в виде одних только пирофосфатов невозможно — нужно еще располагать соответствующей буферной системой, поддержива­ющей pH на должном уровне.}

_{Фотохимический синтез АТФ. Займемся теперь поисками спо­собов запасания энергии, например, света, посредством сопря­женного с поглощением света синтеза пирофосфатных связей н образования буферных систем.}

_{Из рассмотренных выше соображений очевидно, что сами молекулы ортофосфата или пирофосфата не пригодны для фото­химического сопряженного синтеза: они не поглощают свет в не­обходимом для этих целей диапазоне. Вообще-то здесь нужны вещества окрашенные, поглощающие видимый свет. Однако для начяля эволюционного совершенствования пригодились бы и мо­лекулы, поглощающие в ближнем ультрафиолете. Естественно предположить, что такими поглощающими свет -молекуламимогут быть спонтанно возникающие в первичном бульоне моле­кулы нуклеиновых оснований и нуклеотидов. Уже удалось осу­ществить синтез фосфорных производных аденозина за счет энер­гии ультрафиолетового излучения, но в присутствии этилмета- фосфата и метафосфата [447, 448].}

_{Каким образом энергию, поглощенную нуклеиновым основа­нием, можно направить на синтез нирофосфатной связи? Мне представляется чрезвычайно привлекательной гипотеза о меха}­_{низме фосфоршшрования АДФ в АТФ, выдвинутая много лет на­зад Л. А. Блюменфельдом и М. И. Темкиным [28].}

_{Эта гипотеза основывается на том, что при нарушении сопря жения в пиримидиновом кольце 6-аминопурина (аденина) резк< возрастает способность азота аминогруппы переходить в поло жительно заряженное четырехвалентное состояние (четвертич ный азот):}

_NH2

_!

_{С N}

_/\/Ч

_{N С СН}

_{| || | +1е- + 2Н+}

_{С С N}

_{/Ч/ I}

_{Н N R}

_{Изменение рК-аминогруппы, например, в результате нар? шения сопряжения, как изображено выше, при восстановлен!! азота пуринового кольца с образованием свободнорадикально1 состояния углерода, соответствует изменению свободной энерги примерно на 10 ккал/моль, т. е. приблизительно на столью сколько нужно для синтеза пирофосфатной связи из ортофосфг тов. Мы видим здесь яркий пример преобразования энерги, окислительно-восстановительного превращения в энергию ион­ных взаимодействий.}

_{Нарушение сопряжения в пуриновом кольце может возник­нуть в результате фотохимического восстановления кольца. Для этого нужен довольно большой квант энергии света. Во всяком случае поглощение излучения с длиной волны 260 нм (энергия около 100 ккал!моль), характерное для пуриновых и пиримиди}­_{новых колец, заведомо обеспечивает возможность нарушения со­пряжения в кольце — величина этих квантов даже излишне ве­лика.}

_{Однако самое главное здесь — представить себе, каким же образом осуществляется сопряжение, т. е. синтез пирофосфат­ной связи, наступающий вслед за восстановлением пуринового кольца аденина. Согласно Блюменфельду и Темкину, дело об­стоит следующим образом.}

_{Возникновение положительного заряда в аминогруппе пури­нового кольца должно способствовать фиксации отрицательнозаряженного неорганического фосфата и, вероятно, также фос­фатного конца молекулы АДФ или АМФ. При этом соответст­вующие нуклеотиды приобретают скорпионоподобную конфигу­рацию:}

_О

_It

₊

₀

₁

_0-

₁

_о

_X

_сг

_{1 +}

_{О NH,}

_{1 *}

_{I °-}

_О

_{1 II}

_{\ О}

_.р'

_о

_/

_о

_{-сн2-Хн н}

_N

_сн

_N

_н

_\

_н

_{он он}

_{Перенос водорода от свободнорадикальной формы аденозин- ;рифосфата на какой-либо подходящий акцептор должен сопро­вождаться значительным уменьшением свободной энергии — вы}­_{делением энергии, способной превратиться в работу. При этом восстанавливается сопряжение в пуриновом кольце (свободно- радикальное состояние исчезает) и за счет выделяющейся сво­бодной энергии синтезируется нормальная молекула АТФ:}

_{t н Ф}

^h_{l I i}

_{АДФ + фосфат -\- Н = донор ^ (АДФ)’ -)- (окисл.) донор,}

_{Н (АДФ)}^- _{фосфат + акцептор -» АТФ + Н = акцептор.}

_{Таким образом, синтез АТФ, сопряженный с поглощением света, оказывается двухтактным, двухстадийным; в первой ста­дии поглощение света приводит к возникновению свободноради­кальной формы АДФ, восстановленной водородом, поставляемым неким донором, и к образованию комплекса этой активной АДФ с молекулой ортофосфата; во второй стадии происходит реком­бинация свободнорадикальной формы пуринового кольца с со­пряженным замыканием пирофосфатной связи, сопровождаю­щемся отдачей лишнего водорода некоему акцептору.}

_{Фантастична ли нарисованная нами картина? Выглядит она весьма привлекательно и термодинамически, по-видимому без­упречна. Однако термодинамике угодить легко: ей безразличны пути реализации ее предначертаний. А что происходит на самом деле? Исчерпывающего ответа еще нет. Однако уже много лет назад Л. П. Каюшин и его сотрудники {36, 1316] обнаружили свободнорадикальную форму промежуточного продукта при гид­ролизе АТФ (а это делает вероятным появление такой формы и при синтезе).}

_{Вскоре после опубликования гипотезы Блюменфельда и Тем}­_{кина были проведены исследования, показавшие реальность окислительно-восстановительных превращений аденина (в част­ности, входящего в состав АТФ) [153, 270, 170]. Возможность сопряжения окислительно-восстановительных превращений аде­нина и синтеза АТФ была рассмотрена и в книге В. П. Скулаче- ва [266],}

_{Таким образом, можно ожидать в близком будущем осуще­ствления фотохимического или электрохимического модельного синтеза АТФ из АДФ и ортофосфата в присутствии подходящих доноров и акцепторов водорода (электронов) [267]. Мне кажет­ся полезным попытаться теперь соединить две наших гипотети­ческих схемы — схему процессов фотохимического разложения воды и создания буферной емкости при посредстве каких-либо соединений железа типа красной и желтой кровяной соли и схе­му фотохимического синтеза АТФ.}

_{Выше уже отмечалось, что осуществление фотохимических реакций за счет энергии относительно короткого ультрафиолета биологически нецелесообразно; в самом деле, при таком облу­чении легко наступает разрушение уже синтезированных моле­кул и естественно ожидать возникновения в ходе естественного отбора биосистем, использующих энергию видимого света. По­этому синтез пирофосфатов, сопряженный с поглощением света непосредственно пуриновым или пиримидиновым кольцом, дол­жен вытесняться синтезом за счет энергии света, поглощаемого какими-либо окрашенными веществами — пигментами. Простей­шими, способными к необходимому преобразованию энергии ок­рашенными молекулами являются соединения железа. Поэтому имеет смысл выяснить, вероятно ли образование свободноради­кальной формы активной АДФ, сопряженное с фотохимическими превращениями соединений железа. Мы видели выше, что пере­ход Fe}²⁺ _{в Fe}³⁺ _{может происходить с передачей электрона иону водорода с образованием свободнорадикального водорода. Мы считали, что акцептором этого водорода служит молекула кис­лорода и образуется перекись водорода.}

_{Представим себе теперь, что акцептором Н оказывается пу­риновое кольцо АДФ, т. е. идет реакция Н +АДФ-v (АДФ)" и образуется активная АДФ. Соединяясь с ортофосфатом она дол­жна отдать лишний водород и вернуться в нормальное, а не сво­боднорадикальное состояние. Для этого необходим соответству­ющий акцептор водорода. Им может быть тот же кислород и тогда образуется перекись водорода:}

_{2Н (АДФ)' + 2Н3Р04 + 02 -» 24ТФ + Н202.}

_{Объединив две наши схемы, мы получим следующее. Соеди­нение трехвалентного железа (например, красная кровяная соль), поглощая свет, разлагает за счет поглощенной энергии воду и образуются двухвалентное железо (желтая кровянаясоль), ионы водорода, (наполняющие буферную емкость) и кис­лород. Двухвалентное железо при поглощении света (или спон­танно, в темноте), окисляется в трехвалентное железо при взаи­модействии с водой (разлагая при этом воду на ионы гидроксила,, наполняющие соответственную буферную емкость) и реализует сопряженный синтез АТФ из АДФ и фосфата.}

_{Мы получили комплексную систему, осуществляющую и ре­акции фотосинтеза (разложение воды на водород и кислород, образование восстановленного акцептора водорода) и сопряжен­ное (быть может, темновое) образование АТФ при «обратном» транспорте электронов. Примечательно обязательное наличие перекиси водорода по крайней мере в одной половине цикла. Важно еще подчеркнуть, что наш цикл отнюдь не сводится к транспорту электронов — мы имеем здесь и транспорт протонов, и процесс образования и распада перекиси водорода, и процесс разложения воды.}

_{Я подчеркиваю последние обстоятельства потому, что и для биохимических систем фотосинтеза и окислительного фосфори- лирования у ныне живущих организмов на Земле, также веро­ятны все перечисленные выше особенности — и участие воды, и перенос протонов *, и существенная роль следов кислорода и перекиси водорода.}

_{Выше неоднократно подчеркивалась необходимость наличия Н202 и 02 в качестве участников многоэтапных превращений энергии в биохимических системах. Такое участие кислорода п перекиси водорода представляется очень вероятным из самых общих соображений. Нужно отметить здесь, что проблема роли Н202 в биохимических процессах — одна из основных и старей­ших в биохимии. Огромный вклад в ее исследование внес А. Н. Бах. Однако в течение многих лет после его смерти в биохимии господствовало мнение о Н202 лишь как о нежела­тельном побочном продукте в процессах биологического окис­ления.}

_{Сейчас положение изменяется. Появляются публикации, в со­ответствии с которыми и Н202, и 02 (часто в очень небольших концентрациях) служат необходимыми участниками основных процессов превращения энергии.}

_{Становится все более вероятной картина, в соответствии с которой Н202 и 02 являются ключевыми веществами в процессах синтеза и использования макроэргических фосфатных соедине­ний. Большой материал по этому вопросу опубликован С. Е. Ма- нойловым [195, 196]. Особенно существенно в связи с обсуж­даемым здесь обнаружение синтеза АТФ сопряжено с разложе­нием перекиси водорода под действием каталазы в модельной системе. В растворе, содержащем АДФ, глюкозу, фосфат, гексо-}

_{Об этом свидетельствуют значительные изотопные эффекты в системе мито­хондриального транспорта электронов при замене Н20 на D20 [125, 1816].}

_{киназу, при pH 7, после добавления перекиси водорода и ката- лазы наблюдалась убыль неорганического фосфата (25% от ис­ходного) и синтез АТФ.}

_{Следует отметить также, что в работах М. Н. Кондрашовой и Г. Д. Мироновой [147] показано, что Н202 и 02 обязательно нужны для осуществления и окислительного фосфорилирования, и АТФ-азной реакции в митохондриях. Важность этих фактов как самих по себе, так и для подкрепления изложенных мною общих соображений очевидна.}

_{Мне хочется еще раз подчеркнуть очевидную мысль — ничто в ходе эволюции не может возникнуть внезапно, без связи с уже существующими механизмами. Не может появиться . аппарат энергетического обеспечения синтезов полинуклеотидов и поли­пептидов, не родственный уже отобранным в ходе эволюции хи­мическим системам. Поэтому нам следует искать механизмы пре­образования энергии, механизмы сопряжения эндэргонических процессов с реакциями превращения молекул, уже существовав­ших на ранних стадиях эволюции. Вот почему мое внимание и привлекает фотохимическое превращение именно фосфорных про­изводных исходных матричных молекул — нуклеотидов.}

_{В дальнейшем всемогущая эволюция шаг за шагом усовер­шенствовала древние механизмы. В фотохимические процессы вовлекутся уже рассмотренные кратко пигменты (скорее всего, порфирины). Отбор каталитических активных полипептидных цепей приведет к возникновению высоко совершенных фермен­тов. Самое трудное (и, может быть, самое важное) найти нача­ло. Таким началом и представляется мне фотохимическое со­пряжение, синтез пирофосфатов аденозина, сопряженный с по­глощением света пуриновым кольцом \ Весьма вероятно, что для такого синтеза абсолютно необходимы ионы тяжелых металлов, железа, кобальта, меди, цинка. Установить это можно лишь экспериментально, что и было выполнено недавно при изучении первичного синтеза аминокислот и нуклеотидов из первичного бульона.}

_{В соответствии с таким подходом следующим шагом после использования непосредственного сопряжения поглощения ульт­рафиолета пуриновым кольцом и синтеза АТФ должно быть со­здание в ходе эволюции аппарата синтеза АТФ, сопряженного с поглощением света комплексными соединениями железа, пор- фириновыми или иными пигментами и лишь затем создание биохимической системы сопряжения синтеза АТФ с реакциями окисления углеводов и т. п. При этом вполне возможно, что фото­химические механизмы сохраняются и в темновых процессах, например, при сопряженном фосфорилировании в митохондриях (см. ниже).}

_{Эта мысль давно высказывалась в ряде работ. Она лежит в основе экспери­ментов Пониамперумы и его сотрудников по синтезу АТФ [447, 448].}

_{Таким образом, следуя логике нашего изложения, следует признать, что фотосинтез должен был появиться в процессе эво­люции раньше, чем темновые процессы биохимического преоб­разования энергии.}

_{Утверждению о первичности фотосинтеза, как я думаю, не противоречит ничто из известного ныне. Мы почему-то связыва­ем относительно позднее в эволюции биосферы Земли образова­ние атмосферного кислорода (см. [49, 126, 1276, 228, 240, 250, 367, 452]) с эволюционным возникновением фотосинтеза. Это неверно. Кислород выделяется при фотосинтезе лишь у высших растений и водорослей. Выделение кислорода в значительных ко­личествах отнюдь не было обусловлено тем, что этот газ столь нужен нам для дыхания. Кислород образовывался первоначаль­но как неизбежный побочный продукт, «экскрет», при радиацион­ном фоторазложении воды. Лишь затем, по мере выработки ме­ханизмов запасания энергии в виде энергии связи органических молекул жиров, углеводов, белков возникла необходимость и стало возможным образование макроэргических пирофосфатов, сопряженное с процессами деградации пищевых молекул, т. е. процессами дыхания и брожения.}

_{Необходимо напомнить, что степень макроэргичности суще­ственно зависит от концентрации воды. Поэтому фотохимический сопряженный синтез макроэргических пирофосфатов значитель­но легче осуществлялся бы в неводной среде. Эти вопросы мы обсудим ниже.}

_{Ожидание осуществления фотохимического синтеза АТФ в простых модельных системах оправдались уже во время завер­шения в 1975 г. работы над текстом этой главы (см. с. 124). В се­рии работ Н. В. Гончарова и В. Б. Евстигнеев осуществили синтез АТФ за счет энергии света, поглощаемого хлорофиллом, а также (!) p-каротином или феофитином, адсорбированными на окиси алюминия [72, 74]. Кроме того эти авторы вслед за С. Е. Манойловым осуществили синтез АТФ за счет энергии, выделяющейся при разложении Н202 под действием каталазы [71] и за счет энергии, получаемой при измерении pH в суспен­зии частиц окиси алюминия с адсорбированными пигментами- хлорофиллами, каротином, феофином в темноте [73]. Ввиду большого принципиального значения достижений Н. В. Гон}­_{чаровой и В. Б. Евстигнеева рассмотрим их работы по­дробнее.}

_{На основании собственных экспериментов на бесклеточных препаратах анаэробных серобактерий и давних результатов хи­миков, изучавших образование перфосфатов и пирофосфатов при электролизе в щелочной среде растворов ортофосфатов, авторы пришли к очень существенному предположению. Они допустили, что в определенных условиях за счет различных эндэргоничных процессов может происходить превращение ортофосфата в мета}­_{фосфат, который далее легко образует пирофосфатную связь при}

_{реакции с молекулами свободных или замещенных ортофосфатов:}

_{HPOJ' -> РО3 + он-}

_О

_II

_{R-0-P0J- + РО~ -» R-0-P-0-P-0-.}

⁴³ _II

_{о- о-}

_{Превращение ортофосфата в метафосфат в водных растворах при средних значениях pH существенно эндэргонично и может быть осуществлено лишь за счет свободной энергии, выделяю­щейся в сопряженных энзэргонических процессах. Сами авторы полагают вероятным механизм превращения ортофосфата в ме-' тафосфат, основанный на промежуточном образовании свободно радикальных форм: фосфорила, гидроксила атомарного кисло­рода. Мне не кажутся эти допущения вполне вероятными. Но это и не важно. Важен сам факт осуществления сопряженного фосфорилирования в очень простых системах, например, сопря­женно с реакцией разложения перекиси водорода, катализируе­мой каталазой! [71]:}

_{2Н202— -АДФ + Н3Р04}

_{2Н20 + 02<- АТФ + Н20}

_{Реакция разложения перекиси водорода резко экзэргонична: ДF° 59 ккал/моль Н202 {436], поэтому в принципе при разложе- йии моля Н202 могло бы образоваться из АДФ и ортофосфата 6-=-8 молей АТФ. Однако количественная характеристика этого процесса явно преждевременна. Само осуществление его явля­ется большим событием в биохимии. Синтез АТФ сопряженно с каталазной реакцией осуществлен в очень простой модельной системе — в растворе 7-10~}² _{М Н202, ЫО}^-2 _{М КН2Р04; 0,3- • 10}^-2 _{М АДФ в присутствии — 1 -10}^—6 _{М каталазы. Примерно 30% АДФ превращалось в АТФ (что было установлено прямым анализом при помощи хроматографии на бумаге).}

_{Затем был осуществлен синтез АТФ за счет энергии света, поглощаемого хлорофиллом, адсорбированным на частицах суспензии окиси алюминия [72]. В 1977 г. эти же авторы опуб­ликовали результаты опытов [74], в которых наблюдали синтез макроэргических фосфатов за счет энергии света, поглощаемого не только хлорофиллами а и Ь, но феофитином (хлорофиллом без атома Mg в центре порфиринового кольца и p-каротином). Модельное фотофосфорилирование было осуществлено также в очень простой системе — суспензии соответствующих пигментов в частицах окиси алюминия в водных растворах КН2Р04 и АДФ. В том же 1977 г. Н. В. Гончаров и В. Б. Евстигнеев сообщили [73] о синтезе АТФ, сопряженном с быстрым изменением pH в суспензии адсорбированных на частицах окиси алюминия хло­рофилла в водном растворе КН2Р04 и АДФ и измененным pH от 4,0 до 7,8—8,4. Наблюдалось образование 0,4 мкмолей АТФ}

_{-из 10 бывших исходно мкмолей АДФ, т. е. около 4% —выход продукта нельзя считать большим, но сам факт синтеза АГФ в этих условиях представляется чрезвычайно важным.}

_{ЗАПАСАНИЕ ЭНЕРГИИ ДЛЯ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ.}

_{БИОСИНТЕЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И УГЛЕВОДОВ.}

_{ВОЗНИКНОВЕНИЕ ГЕТЕРОТРОФОВ. АНАЭРОБНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ}

_{Макроэргические соединения даже в случае предельно эффек­тивного сопряженного с экзэргоническими реакциями их синтеза мало пригодны для длительного запасания больших количеств энергии — очень уж мала их удельная энергетическая емкость. Свободная энергия гидролиза макроэргических соединений рав­на 10—20 ккал/моль. Для синтеза макромолекулы среднего раз­мера из нескольких сотен мономеров нужно соответственно в 2— 3 раза большее число сотен молекул типа АТФ (или креатинфос- фата). Накопление высоких концентраций макроэргических со­единений физико-химически невозможно: высокая ионная сила, большое осмотическое давление и т. д. затрудняют сохранение необходимой конфигурации макромолекул. Нужны более ком­пактные хранилища энергии. Один из видов таких хранилищ (уже упоминавшиеся выше полифосфаты) — полимеры ортофос- форной кислоты, остатки которой соединены ангидридными пи- рофосфатными связями. Однако эти «питательные камни», по- видимому, имеют принципиальный недостаток — при использо­вании накопленной в них энергии образуются те же высокие концентрации кинетически активных молекул фосфорной кисло­ты и множество катионов, связанных на полифосфате, как на поликатионите. И самое главное как мы видели, макроэргич­ность макроэргических соединений обусловлена в основном ем­костью рН-буферных систем. Запасание больших количеств энергии в макроэргических соединениях возможно лишь при вы­сокой концентрации рН-буфера, т. е. при высокой ионной силе большом осмотическом давлении и других «неприятных» физи­ко-химических условиях. Таким образом, по самой своей природе макроэргические соединения не пригодны для запасания значи­тельных количеств энергии. Процесс запасания энергии должен происходить не в результате ионных превращений, а вследствие превращений электрически нейтральных молекул.}

_{Направление эволюционных поисков в связи со сказанным ясно — энергия должна запасаться в молекулах, окислительная деградация которых сопровождается освобождением большого количества энергии. Наиболее экзотермичны реакции полного окисления углеводородов:}

^С_П^Н_{2П+2 + V2 (Зп + 1) 02 - п С02 + (п + 1) Н20.}

_{Изменение энтальпии АН при таком полном окислении (сжи­гании) углеводородов составляет примерно 106 ккал на 1 мольизрасходованного кислорода. Синтез углеводородов, сопряжен­ный с поглощением энергии, излучаемой Солнцем, можно счи­тать пределом термодинамического совершенства запасания энергии. Кислород, необходимый для освобождения энергии, на­копленной в синтезированных углеводородах, образуется в том же процессе их фотосинтеза (нужно, правда, удержать 02 до момента темнового окисления).}

_{Однако углеводороды гидрофобны и, следовательно, сечение взаимодействия, т. е. поверхность, доступная действию фермен­тов, оказывается очень малым. Кинетика использования углево­дородов весьма несовершенна (мы снова убеждаемся здесь в несоответствии термодинамического и кинетического критериев биологического совершенства). Для запасания энергии нужны гидрофильные вещества. Среди них на первом месте — жирные кислоты (особенно ди- и трикарбоновые) и углеводы. Синтез углеводов, сопряженный с фотохимическим разложением воды (аналогичным выдуманному нами процессу разложения воды при превращении Fe}²⁺_^=Fe³⁺_{), представляет наиболее рацио­нальный способ запасания легко мобилизуемой энергии и ве­щества. Когда быстрое использование энергии не требуется, а нужно запасти ее и отправить на длительное хранение, может происходить фотосинтез жирных кислот с длинной цепью (их триглицеридов — жиров и масел) полисахаридов, белков (как, например, в семенах, клубнях ныне существующих растений).}

_{Фотосинтезирующие первичные автотрофы казалось бы рас­полагают всем необходимым для достижения предельного (пока лишь биохимического) совершенства. Каков же биологический смысл возникновения гетеротрофов, зачем они появились? И не просто возникли, а еще достигли столь высокого совершенства. В сущности и автотрофы—химеры; их вполне можно (мысленно, а иногда и в действительности) разделить на две части — фото­синтезирующую и потребляющую. Потребляющая часть авто- трофа и есть гетеротроф, еще неотделенный от автотрофа. (Зе­леную эвглену можно заставить разделиться так, что хлоропласт останется лишь в одной дочерней клетке. Другая, бесхлоро- пластная клетка — это гетеротроф, нуждающийся в органической пище).}

_{Итак, что же позволяет гетеротрофной части первичного ав}­_{тотрофа отделиться и перейти к самостоятельному, хотя и зави­симому от автотрофа существованию?}

_{Я думаю главное здесь — возможность завоевания ареалов, недоступных автотрофам. В самом деле, фотосинтезирующие автотрофы могут расселяться по лику планеты в местах с до­статочно интенсивным потоком солнечного света. Гетеротрофы способны существовать всюду, куда поступают тем или иным способом питательные продукты жизнедеятельности автотрофов. Возможность почти неограниченного расселения гетеротрофов особенно широко реализуется при возникновении в ходе эволю-}

_{РИС. 13. Общая схема аэроб­ных превращений энергии в биосфере}

_{Ei— энергия солнечного света; £2 — низкокачественная тепловая энер­гия; А— акцептор водорода; ~Р— макроэргические фосфаты}

_{ции аппаратов перемещения в пространстве, о чем мы специаль­но будем говорить в следующих главах. Разделение живых существ на две группы — автотрофов и гетеротрофов — обуслов­ливает разветвление дальнейшего пути эволюционного совер­шенствования биохимических процессов — на одном пути про­исходит биохимическое совершенствование автотрофов, на вто­ром — биохимическое совершенствование гетеротрофов (сначала гетеротрофной части холотрофа — первичного автотрофа).}

_{При достижении предельного совершенства и автотрофов и гетеротрофов устанавливается замкнутый цикл преобразования веществ и энергии в масштабах биосферы планеты. Автотрофы за счет энергии поглощаемого ими света разлагают воду на во­дород и кислород. Водород соединяется с какими-либо акцепто­рами — в основном с С02 с образованием, сохраняющих энер­гию молекул пищи (фотосинтез). Кислород уходит в атмосферу. Гетеротрофы осуществляют обратный процесс — образуют воду, освобождая законсервированную ранее энергию при соединении кислорода с водородом органических молекул (дыхание) (рис. 13). Прохождение этого термодинамического цикла, есте­ственно сопровождается деградацией энергии — «высококачест­венное» видимое и ультрафиолетовое излучение Е, в конце кон­цов превращается в «низкокачественное» тепловое излучениеЕ2, т. е. в относительно низкотемпературный белый шум (см. рис. 13). При осуществлении такого цикла, реализующегося со­пряженно с процессами деградации солнечной энергии, совер­шаются все процессы жизнедеятельности, вызванные к жизни (в буквальном смысле этого словосочетания) биологической эволюцией. Сведение всех весьма сложных биохимических про­цессов превращения энергии к разложению и образованию во­ды— вероятно, одно из самых сильных научных обобщений на­шего века.}

_{Нефть, уголь и кислород}[10]_{. К счастью (для нас — дышащих кислородом), этот цикл замкнулся не сразу. Сначала фотосин- тетическое разложение воды преобладало над образованием во}­_{ды в процессах дыхания. Гетеротрофы могут использовать кисло­род при его не очень низкой концентрации в атмосфере.}

_{Замечательно, что стационарный уровень концентрации кис­лорода в атмосфере соответствует количеству необратимо раз­ложенной при фотосинтезе воды.}

_{Следовательно, количество биогенных углеводородов (и дру­гих органических веществ), накопленных в истории развития аэробной атмосферы Земли, должно быть эквивалентно коли­честву кислорода в атмосфере (которое, согласно оценке, со­ставляет 1,5-10}¹⁵ _т).

_{Нефть и другие каустобиолиты являются «зеркальными ана­логами» кислорода. Нефть, уголь, торф и другие образуются в результате фоторазложения воды и накапливаются по мере уве­личения концентрации кислорода в атмосфере. Отсюда следует, что, если верна теория биогенного образования кислорода атмо­сферы, то полное окисление всех каустобиолитов приведет к поглощению всего кислорода атмосферы. Кроме того, их полное окисление приведет к образованию воды, и уровень воды в Мировом океане может повыситься примерно на 3 м. Эти рас­суждения позволяют оценить запас по всей Земле органического вещества в каустобиолитах примерно в 1 • 10}¹⁵ _т.

_{Таким образом, до накопления в атмосфере достаточного ко­личества кислорода гетеротрофы могли получать энергию лишь в анаэробных процессах (бескислородных). Анаэробные условия сохраняются в ряде мест и после установления стационарной концентрации кислорода в атмосфере. Это объясняется все теми же диффузионными ограничениями — в толще воды, при отсут­ствии перемешивания концентрация кислорода быстро падает — там могут жить лишь гетеротрофы, способные к добыванию энергии в анаэробных процессах. Практически анаэробные усло­вия легко возникают и в «толще» многоклеточных организмов. Этим объясняется странное, на первый взгляд, обстоятельство. Широкое распространение анаэробных биохимических превра­щений веществ и энергии на протяжении многих сотен миллио­нов лет после установления стационарного уровня концентрации кислорода, а странным это могло бы показаться, поскольку анаэробные превращения во много раз менее энергетически эффективны, чем аэробное окисление (дыхание). Итак, высоко}­_{совершенные анаэробные процессы деградации пищевых ве­ществ — условие существования гетеротрофов (и фото-автотро- фов в темноте). Анаэробные биохимические процессы типа гли­колиза или брожения настолько совершенны и неожиданно сложны, что почти невозможно использовать метод их дедуктив­ного, «умозрительного» построения. В этом случае правильнее сразу посмотреть их действительные свойства. Гликолиз и бро­жение — прекрасный пример предельно совершенного решения конкретной эволюционно-биохимической задачи. Энергетический и химический смысл этих процессов — выделение свободной}

_{энергии в результате внутримолекулярных перегруппировок и расщепления исходных молекул. При гликолизе молекула глю­козы превращается в две молекулы молочной кислоты и свобод­ная энергия системы уменьшается на 50 ккал/моль:}

_{С.Н120. -» 2QHe03, AF° = — 50 ккал/моль.}

_{При полном окислении глюкозы в стандартных условиях имеем:}

_{С„Н120„ + 602 -» 6С02 + 6Н20, AF* = — 688 ккал/моль}

_{Сущность анаэробного процесса гликолиза состоит в пере­группировке атомов. Составляя баланс разрываемых и образу­ющихся связей, находим, что превращение состоит в образова­нии одной связи С=0 и одной С—Н вместо одной связи С—О, одной О—Н и одной С—С.}

_{Изменение энтальпии при таком превращении можно оценить по таблицам энергии связей (см. например, книгу Я. К- Сыркина и М. Е. Дяткиной [279]. Результаты оценки дают, что при раз­рыве связей расходуется 248 ккал/моль, а при образовании но­вых связей выделяется 240 ккал/моль. Учитывая неточность таб­личных данных, можно сказать, что при гликолизе изменение энтальпии молекул АН, равное 8 ккал/моль, пренебрежимо мало. Нас, однако, интересует изменение свободной энергии. По-види­мому, главной причиной энергетической выгодности превраще­ния глюкозы в молочную кислоту являются изменения энтропии (образование двух частиц из одной), диссоциация (рН=буфер!) и сольватация образовавшихся ионов карбоксила.}

_{Процесс брожения аналогичен гликолизу и отличается от него лишь на последних стадиях. В итоге молекула глюкозы рас­падается на две молекулы этилового спирта и две молекулы С02:}

_{CeH12Oe -» 2CsH6OH + 2С02, AF}⁰ _{= — 54 ккал/моль.}

_{Существенным отличием брожения от гликолиза является улету­чивание углекислого газа. С02 выходит из реакции, в результате чего происходит еще больший (чем при гликолизе) сдвиг равно­весия слева направо, и «бродящие» гетеротрофы могут осуще­ствлять такой расточительный процесс и дальше. (Это в сущно}­_{сти, возмутительная расточительность—при образовании спирта теряется большая часть энергии молекулы глюкозы, которую можно было бы получить при полном сжигании до С02 и Н20).}

_{Ясно, что брожение эффективно лишь в условиях, позволяю­щих улетучиваться углекислому газу. Поэтому оно осуществля­ется лишь микроорганизмами, живущими в относительно откры­тых средах — в мелких водоемах, на поверхности питательных субстратов; если же сосуд закрыт, то С02 насыщает раствор, и брожение останавливается. Так происходит при изготовлении шампанского и других шипучих вин. Может показаться, что и второй продукт брожения — этиловый спирт улетучивается, и равновесие еще больше сдвигается вправо. Недаром же этило}­_{вый спирт называется по латыни spiritus vini — винный дух. Однако, как это ни удивительно, спирт, образующийся при бро­жении, не улетучивается из водного раствора: скорость его испа­рения при умеренных температурах (15—20°) только приближа­ется (снизу) к скорости испарения воды}[11]_{. Так достигается пре­дельная концентрация спирта в сусле (около 16%), останавли­вающая жизнедеятельность дрожжей и превращающая его в сухое вино.}

_{Второе весьма важное преимущество брожения (в тех случа­ях, когда оно возможно) перед гликолизом состоит в том, что молочная кислота очень сильная, а угольная — слабая. Физио­логически допустимая концентрация молочной кислоты при обыч­ных запасах рН-буферов порядка 10}^-2 _{М, предельная концентра­ция спирта около 2—3 М, т. е. примерно в 50 раз выше.}

_{Следует все же отметить, что речь идет о предельной кон­центрации для дрожжевых клеток. В клетках животных даже очень небольшие концентрации спирта вызывают нарушение дея­тельности поверхностных и иных мембран. Клетки теряют спо­собность создавать ионные градиенты, генерировать нервные импульсы и т. д. Поэтому животные не могут воспользоваться некоторыми энергетическими преимуществами брожения еще и из-за устройства мембран своих клеток. Следовательно, процесс брожения все равно остается неприемлемым для животных. По­этому достойна всяческого осуждения привычка иных гетеро­трофов сохранять образующийся при брожении спирт и потреб­лять в чрезмерных количествах конечный продукт анаэробного катаболизма.}

_{Так или иначе, но эти, пусть и энергетически малоэффектив­ные превращения углеводов виртуозно совершенны с точки зре­ния химика.}

_{В их совершенстве легко убедиться, рассмотрев даже про­стую схему гликолиза или брожения [176] (т. е. схему, не учиты­вающую своеобразия кинетического поведения системы, динами­ки взаимной регуляции отдельных этапов и т. п.). Ясно, что осуществление таких процессов, как брожение или гликолиз, тре­бует решения в процессе эволюции ряда сложных задач. Главная задача — обеспечение возможно быстрого, однозначного и стро­го последовательного превращения веществ. Строгий порядок, точное выдерживание последовательности стадий в многоэтап­ных превращениях достигаются посредством строгой специфич­ности ферментов к своим субстратам. Из множества броунирую- щих в среде молекул фермент выбирает молекулу своего суб­страта. Поэтому эволюция первичных гетеротрофов в основном состояла в совершенствовании специфичности ферментов. Итак, длительное, сотни миллионов лет сохраняемое, существование}

_{анаэробных процессов объясняется диффузионными ограниче­ниями доставки кислорода. Одним из способов функционирова­ния в таких условиях свободноживущих организмов, как было показано в гл. 5, является ограничение размеров клеток. Обли}­_{гатные анаэробы (т. е. живущие только в анаэробных условиях) и факультативные анаэробы по-необходимости — мелкие 1— 3 мк — клетки. Поскольку в анаэробных условиях, в процессах}¹ _{гликолиза в многоклеточных организмах в особенности, лимити­рующим является процесс отвода конечных продуктов. Кинети­чески выгодно иметь возможно большую поверхность выхода этих продуктов из клеток. Поэтому, вероятно, образование ка­ких-либо надмолекулярных комплексов полиферментных систем для гликолиза не дает физико-химических преимуществ — гли­колиз осуществляется в гомогенных растворах ферментов и суб­стратов. Однако до сих пор точно неизвестно, имеется ли струк­турная организация процессов гликолиза и брожения у ныне живущих организмов.}

_{ПРЕВРАЩЕНИЕ ЭНЕРГИИ ПОСРЕДСТВОМ АСИММЕТРИЧНЫХ МЕМБРАН. КОНЦЕПЦИЯ МИТЧЕЛЛА}

_{Из изложенного ясно, что степень совершенства функционирова­ния системы преобразования термодинамического потенциала экзэргонических реакций в термодинамический потенциал макро­эргических соединений становится на ранних стадиях развития жизни фактором эволюции, критерием естественного отбора.}

_{Совершенство образования и использование макроэргических фосфатов слагается из двух компонентов: кинетического — ско­рости соответствующих реакций, разнообразие и концентрации необходимых ферментов и термодинамического — эффективности (КПД) сопряженного преобразования энергии.}

_{Кинетика этих как и других биохимических процессов опре­деляется совершенством соответствующих ферментов и величи­ной диффузионных ограничений.}

_{Термодинамическая эффективность сопряженных преобразо­ваний, хотя это и кажется на первый взгляд странным, опреде­ляется реальными путями, механизмами перехода системы из одного состояния в другое. В самом деле, мы видели, что Л мо­жет быть превращено в В при полном рассеянии — превращении в тепло выделяющейся энергии. Эта энергия до тепловой дегра­дации может быть направлена на выполнение какой-либо работы! Таким образом, качество использования термодинамического потенциала, КПД его преобразования в полезную работу}^- _{Пол­ностью определяется (до теоретического предела) реальным ide}^: _{ханизмом преобразования энергии. Таким образом биолбгиче* ская эволюция должна быть направлена на выработку предельно совершенных механизмов сопряженного образования и-иёпользО- вание макроэргических фосфатов. ...v.. ..v.zi:}

_т

_{Рассмотрим «а-приорные» свойства таких механизмов.}

_{В сущности сам переход от накопления энергии в простых буферных емкостях к биохимии макроэргических соединений был решающим шагом к такому совершенству. Он, как мы видим, состоял в векторизации потока энергии от безадресного измене­ния pH к точно направленному переносу термодинамического потенциала к строго определенным молекулам и процессам по­средством молекул АТФ.}

_{От чего зависит эффективность сопряженного синтеза АТФ?}

_{Вероятно, более всего эффективность сопряжения зависит от соответствия квантов энергии, поступающей в систему синтеза АТФ и порций энергии, необходимых для синтеза одной макро- эргической связи. В самом деле, при фотохимическом сопряже­нии кванты света относительно очень велики 100—40 ккал/моль, а для синтеза ~Р связей нужно около 10 ккал/моль. Следова­тельно, фотохимическое «одноактное» сопряжение не может быть эффективным. Такая же картина наблюдается при фосфорилиро- вании, сопряженном с поглощением кислорода и окислением, на­пример, водорода. Эта реакция «гремучего газа» сопровожда­ется выделением 55 ккал/моль образующейся воды. Общеизве­стен выход из этого затруднения, найденный в ходе эволюции— Замена одноэтапных превращений — многоэтапными, в которых энергия выделяется относительно небольшими порциями. В ре­зультате процесс окисления водорода органических молекул до воды осуществляется посредством последовательной цепи «транс­порта электронов» — системы окислительно-восстановительных переносчиков. Теперь возникает новая сложная задача — обеспе­чения синтеза АТФ сопряженно с окислительно-восстановитель- ными переходами разных переносчиков. Кроме того, создание си­стемы переносчиков с идеальными перепадами термодинамиче­ского (окислительно-восстановительного) потенциала очень сложно — эффективность энергетических преобразований может быть низкой. Как мы видели, синтез АТФ из АДФ и Н3Р04 при нормальных pH сопровождается образованием ОН}^- _{— защела- чиванием среды.}

_{АДФ»~ + HPOJ- -> АТФ}⁴_{- + ОН-.}

_{Процесс синтеза АТФ может быть продуктивным лишь при сопряженной нейтрализации образующихся ионов гидроксила в реакции нейтрализации: он- + н+^н2о,}

_{Эта реакция экзэргонична. Величина АР ее вполне приемлема (~20 ккал/моль) для энергетического сопряжения с синтезом макроэргических фосфатов (AF}⁰_{'~ 10 ккал/моль).}

_{Мы видели, однако, что в реальных буферных системах с рК близким к рКг фосфатных групп нельзя обеспечить сопряженное изменение свободной энергии более чем на 3—5 ккал/моль.}

_{MEMИРАНА Окзэргоннческие процессы (фотосинтез, дыхание), создающие градиент рН(}

_{ПРАВАЯ СТОРОНА}

_{ЛЕВАЯ СТОРОНА}

_-ч

_АДФ

₊

_н3ро,

_II

_АТФ

_ГТ20

_{I \}

_{НО ^ И + он"}

_Н^т _{+ ОН}

_{: Н,0}

_{ОН - \ •}

_{РИС. 14. Схема синтеза АТФ в асимметричной мембране за счет энер­гии градиента pH, созда­ваемого в процессах фо­тосинтеза, дыхания и т. д. в соответствии с концеп}­_{цией П. Митчелла Из активного центра Н+— АТФ-азы, локализованной в асимметричной мембране, ио- иы Н+ могут диффундиро}­_{вать только направо; ионы ОН}^- _{только налево. Неиони- зоваиные молекулы АДФ, АТФ, Н3РО4 растворяются в гидрофобной зоне мембраны. Синтез АТФ в этих услови­ях из АДФ и НэР04 происхо­дит почти изоэнергетически. В целом процесс осуществля­ется за счет изменеиня сво­бодной энергии при образо­вании двух молекул воды: слева при нейтрализации иона ОН- в кислой среде, справа — иона Н+ в щелоч}­_{ной среде}

_{Выход из этого, непреодолимого для биохимических реакций в гомогенных растворах затруднения, состоит в механизме, пред­ложенном П. Митчеллом [426—428]. Сущность этого механизма состоит в проведении синтеза АТФ посредством асимметричной мембраны, обеспечивающей при синтезе каждой молекулы АТФ расход вместо одного иона Н}⁺ _{— двух, что приводит к большему сдвигу равновесия в сторону синтеза и, соответственно к боль­шей эффективности сопряжения.}

_{Представим себе асимметричную фосфолипопротеидную мем­брану, по разные стороны которой существенно различна кон­центрация ионов водорода (рис. 14). Пусть например, слева от мембраны раствор имеет рН=4, а справа рН = 8. Слева в рас­творе имеются АДФ и ортофосфат. В кислой среде они в замет­ной концентрации будут находиться в недиссоциированном, неза}­_{ряженном состоянии. В таком виде АДФ и Н3Р04 легко раство­ряются в мембране и попадают в гидрофобный активный центр АТФ-синтетазы. Так, в гидрофобном окружении АТФ не макро- эргична, и мы примем, что синтез ее из АДФ и H3POt идет изо- энергетично (ДР^О).}

_{АДФ + Н8Р04 ^ АТФ + Н20.}

_{Мембрана асимметрична — из активного центра образовавшаяся АТФ может диффундировать только обратно, налево. Образовав}­_{шаяся вода из активного центра может диффундировать лишьпосле диссоциации — налево ионы ОН}^- _{(левая сторона мембра­ны, омываемая кислым раствором с избытком Н}⁺ _{ионов заряже­на положительно), направо — ионы Н}⁺ _{(правая сторона мембра­ны, омываемая щелочным раствором с избытком ОН" ионов за­ряжена отрицательно). Н}⁺ _{и ОН- из образовавшейся в активном центре АТФ — синтетазы воды вступают, соответственно слева и справа в две реакции нейтрализации. Запишем теперь весь про­чесе:}

_{й шаг НР04}²_-+АДФ³_{- + 5Н+^Н3Р04+АДФ}

_{й шаг Н3Р04+АДФ->в мембрану}

_{й шаг Н3Р04+АДФ^АТФ + Н20 в мембране}

_{й шаг в мембране АТФ->АТФ}⁴_~-)-4Н⁺ _{в среду слева}

_{в мембране Н20->-Н}⁺ _{в среду направо \}

_ОН^- _{в среду налево}

_{й шаг слева ОН}^_ _{+ Н}⁺ _^Н20

_{справа Н}⁺ _{+ 0Н-^Н20}

_{Сравним теперь процессы синтеза АТФ в гомогенном буфер­ном растворе и в асимметричной мембране при наличии гради­ента pH:}

_{в растворе: НР04}^2_ _{+АДФ3 + Н}⁺_^АТФ⁴_{~ + Н20;}

_{в мембране: НР04}²_-+АДФ³⁺_+2Н⁺_+0Н^АТФ⁴_{-+2Н20. Видно, что в механизме Митчелла за счет асимметричного рас­пределения Н}⁺_{, т. е. градиента pH, синтез АТФ сопрягается с образованием вместо одной двух молекул воды, тем самым до­стигается существенный сдвиг реакции в сторону синтеза АТФ.}

_{В самом общем виде смысл механизма Митчелла — дополни­тельная векторизация потока энергии, обеспечиваемая строго ориентированной переносом веществ соответственно простран­ственному градиенту pH.}

_{Таким образом, к рассмотренным ранее аспектам кинетиче­ских достоинств структурной организации биохимических процес­сов (гл. 5, с. 87) следует добавить увеличение термодинамиче­ской эффективности преобразования энергий. Синтез АТФ в со­ответствии с механизмом Митчелла, посредством специальной структурной организации осуществляется с высокой эффектив­ностью, поскольку он сопрягается с двумя относительно «низко}­_{потенциальными» реакциями — нейтрализацией 2Н}⁺ _{за счет 20Н~ при относительно малых перепадах pH.}

_{В асимметричную мембрану могут быть встроены переносчи­ки электронов, пигменты, ферменты-синтетазы. Энергия света, поглощаемого пигментами (фотосинтез), или энергия, выделяю­щаяся при транспорте электронов от водорода субстратов к кис­лороду (дыхание), тратится в соответствии с механизмом Мит­челла на создание градиента концентрации ионов водорода (или других ионов), что проявляется в возникновении разности pH (или электрических зарядов) по обе стороны мембраны.}

_{Синтез АТФ сопрягается не с отдельными разнообразными}

_{реакциями, а с одной и той же на всех этапах реакцией нейтра­лизации— образовании воды из ионов водорода и гидроксила. Это сопряжение катализируется универсальным ферментом: мембранной Н}⁺_{АТФ-азой [271]. Разность электрического потен­циала, создаваемая градиентом концентрации отличных от Н}⁺ _{и ОН}^-_{, катионов и анионов, например, К}⁺ _{и С1~ легко преобра­зуются в разность концентраций Н}⁺ _{и ОН}^-_:

_К⁺ _{СГ ^к+он- СГН+}

_{Н20 Н20 ^ н+ ОН-.}

_{Накопление энергии в виде градиента концентраций «иных» ка­тионов и анионов может быть очень удобным ввиду больших запасов этих ионов в протоплазме. Энергетическая эквивалент­ность градиентов концентраций ионов водорода и гидроксила и разных катионов и анионов создает особо совершенную кинети­ку включения и выключения сопряженного фосфорилирования— градиенты электрических зарядов в отличие от градиентов кон­центраций— относится к дальнодействующим — это особенно существенно при трансмембранной передаче энергии — диффу­зия через мембрану процесс относительно медленный. Диэлек­трическая постоянная гидрофобной мембраны мала — соответ­ственно велика напряженность трансмембранного электрического поля и высокоэффективна трансмембранная передача энергии электростатических взаимодействий. Электростатический меха­низм накопления свободной энергии экзэргонических реакций в силу дальнодействия градиентов электрических зарядов позво­ляет сопрягающей мембране функционировать как единое целое, эффективно используется все, в том числе весьма малые сами по себе вклады в создание разности электрохимического потенциа­ла по обе стороны мембраны.}

_{Верность термодинамической схемы, т. е. самого общего ме­ханизма, предложенной П. Митчеллом в 1961 г. неоднократно иллюстрировалась экспериментально. Одной из наиболее ярких иллюстраций является опыт Ягендорфа и Урайба, осуществив­ших в 1966 г. синтез АТФ в изолированных хлоропластах за счет искусственно созданного градиента pH [404]. С тех пор число экспериментальных работ, подтверждающих концепцию Митчел­ла, значительно увеличилось. Замечательным примером осуще­ствления фосфорилирования за счет энергии света, преобразуе­мой в энергию градиента pH, являются процессы в пурпурных, солелюбивых бактериях [374]. В мембранах этих клеток содер­жится зрительный пигмент — родопсин. Поглощаемая им свето­вая энергия используется для работы «протонного насоса», со­здающего градиент pH. АХ'Ф синтезируется за счет этого гради­ента. Большой вклад в выяснение общих механизмов сопряжен­ного фосфорилирования и особенно идущего при посредстве асимметричных мембран внесен В. П. Скулачевым и его сотруд­никами, [266—271]. (См. также [360, 360а, 415,418,419,463,470]).}

_{Глава 8}

_{ПРОБЛЕМЫ МОРФОГЕНЕЗА}

_{Диффузионные ограничения скорости биосинтезов — предел биохимического этапа эволюции.}

_{Их преодоление посредством формирования все более совершенной морфологии живых организмов и (или) посредством аппаратов активного перемещения в пространстве.}

_{Отсутствие необходимости в предположении об особом морфогенном поле.}

_{Достаточность кодирования на всех уровнях сложности синтеза определенных молекул и времени их синтеза (временная организация).}

_{Цветковые растения — пример морфологического совершенства.}

_{Первый макроэтап биологической эволюции завершается при образовании предельно совершенной системы матричного воспро­изведения, предельно совершенных катализаторов системы пре­образования энергии и механизмов отграничения дискретных организмов от внешней среды.}

_{С некоторого времени скорость все более совершенных про­цессов биосинтеза начинает лимитировать диффузия (см. гл. 5, с. 81).}

_{Некоторый эволюционный потенциал, т. е. возможность уве­личения кинетического совершенства, содержится в ускорении диффузии посредством создания более резких градиентов кон­центрации. Эту возможность мы уже рассматривали. Она реали­зуется при образовании структурно-организованных ансамблей ферментов, например, в митохондриях и хлоропластах. Однако таким способом, посредством «игры на градиенте», достигается скорее экономия материалов, чем макроскопический выигрыш в суммарной скорости процессов. Поэтому показателем дальней­шего прогресса становится скорость диффузии, скорость потока метаболитов, превращаемых в вещество данного вида. Прогресс можно теперь измерять в см/сек. «Диффузионный барьер» не может быть преодолен чисто химическим путем. Дальнейшее со­вершенствование биохимических механизмов (катализа, маршру­тов реакций) оказывается бесполезным.}

_{Ясно, что суммарный поток можно увеличить, увеличивая по}­_{верхность, через которую осуществляется диффузия. Предметом отбора становится форма организма, его геометрические харак­теристики. Наименее выгодной формой организма данной массы является шар, так как его поверхность минимальна, наиболее выгодной — нить. Следовательно, первый шаг эволюции в на­правлении морфологического прогресса должен состоять в вы­работке механизмов построения нитевидных организмов вместо шарообразных. Эта задача уже довольно сложна. Ведь нить не может быть длинной — из-за медленности диффузии нарушатся связи между ее частями. По-видимому, пределом совершенства в данном эволюционном направлении является многолучевой еж, организм типа известных из зоологии беспозвоночных сол­нечников. Но такая сферически симметричная многолучевая мор­фология предельно совершенна лишь в отсутствие градиентов пищевых веществ и энергии. Равномерно питательная во всех направлениях среда окружает лишь планктонные организмы (и то, если пренебречь, например, градиентами света). В боль­шинстве же случаев существует строгая направленность потоков пищи и энергии, что приводит к более сложным морфологиче­ским задачам. Их можно решить путем выработки геометриче­ских структур типа ветвей, стволов, листьев. Этот путь, путь морфологического прогресса для преодоления диффузионных ограничений, привел к возникновению сложной и рациональной геометрии растений (деревьев, трав) и животных, ведущих при­крепленный образ жизни (кораллы, актинии).}

_{Совершенно ясно, что морфологические задачи возникают в дальнейшем и в связи с другими эволюционными проблемами. Однако именно вследствие необходимости преодоления диффу­зионных ограничений должны выработаться все основные мор­фогенные механизмы. Понятно, что естественный отбор наиболее совершенных геометрических форм организмов может осуще­ствляться лишь при наследственном закреплении сведений о наи­более удачных морфологических конструкциях. Следовательно, в матричных текстах должны быть записаны не только сведения о строении (свойствах) ферментов, структурных белков, биоде­тергентов и т. д., но и инструкции для построения данных мор­фологических, геометрических конструкций, форм. Способ коди­рования все тот же — посредством определенной последователь­ности нуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Проблема перевода нуклеотидного текста в пространственное взаиморасположение частей организма, его морфологию—центральная проблема со­временной биологии. Однако прежде чем перейти к этой увлека­тельной проблеме, нужно все же сказать, что морфологический прогресс — не единственный способ преодоления диффузионных ограничений. И даже не лучший. Значительно большим эволюци­онным потенциалом характеризуется совершенствование путем создания аппаратов активного перемещения в пространстве. Этим направлением мы займемся в следующей главе, а сейчас продолжим рассмотрение проблем морфогенеза *.}

_{ФИС. 15. Гигантские однокле}­_{точные водоросли [163]}

_{a— Caulerpa prolifera; 6 — Botridium granulatum; в — Acetobularia medi- terrianea (/) и A. wettsteini (2) и вегетативный гибрид (1+2) — реге­нерация стебля (}), посаженного на ризонд (2). Видно, что форма зонта определяется ядром, находящимся в основании ризонда}

_{Когда говорят о морфологии организмов, невольно возникает образ многоклеточного организма сложной формы. В многокле­точном организме морфология обусловлена главным образом пространственным расположением клеток друг около друга.}

_{Однако некоторые вопросы преобразования наследственной ин­формации в морфологические особенности можно сформулиро­вать уже для одноклеточных организмов и даже для неклеточ­ных— вирусов и фагов. В самом деле, многие одноклеточные организмы имеют весьма сложную морфологию. На рис. 15 изо­бражены гигантские (для клеток) одноклеточные (точнее, не­клеточные) водоросли каулерпа, ботридиум и ацетабулярия, на рис. 16 — сложнейшие из одноклеточных животных — инфузории разных родов и жгутиконосцы, замечательные своей уникальной морфологией. Уникальная и очень сложная морфология свойст­венна и отдельным органеллам одноклеточных животных, (рис. 17), а также изученным Н. К. Кольцовым сперматозоидам насекомых, пауков и ракообразных (рис. 18). О сложности мор­фологии вирусов и фагов можно судить по рис. 19.}

_{Таким образом основные механизмы морфогенеза, вероятно,, в наиболее чистом виде можно надеяться выявить уже для одно­клеточных и даже неклеточных форм жизни.}

_{Морфологические структуры могут возникать в результате самосборки из соответствующих макромолекул. В последние годы было выполнено очень много исследований по самосборке био­логических структур (см. [303]). Правда, основные данные были получены при изучении самосборки вирусов и их частей («дета­лей»), Большой обзор интересных сведений приведен в книге Б. Ф. Поглазова [237]).}

_{Попробуем опять подойти к этому вопросу на основании об­щих эволюционных положений. Речь идет, следовательно, об от­боре в процессе эволюции молекул, агрегация которых автома­тически приводила бы к построению все более биологически целесообразных структур. Наиболее естественно было бы вы­брать с этой целью белки-—вариация их аминокислотного соста­ва и последовательности аминокислот заведомо обеспечивает любое необходимое разнообразие свойств молекул. Свойства молекул, синтезируемых нематричным путем (например, липидов или полисахаридов), могут варьировать в процессе эволюции лишь посредством значительно более громоздких механизмов. Для синтеза любой новой молекулы типа моносахарида или фос­фолипида необходимо большое число строго специфичных фер}­_{ментов. Таким образом, кажется вероятным, что когда потребо­валось не просто отграничить клетку от внешней среды, но при­дать ей уникальную форму, для ее построения понадобились специальные структурные белки. Мысль эта находит подтверж­дение во всех случаях биоморфогенеза. Определяющая роль бел­ков в морфогенезе на молекулярном уровне была выяснена в замечательных исследованиях самосборки вирусов ([см. 237]). Начало было положено при изучении вируса табачной мозаики (ВТМ). Этот вирус состоит из РНК (около 5% по весу) и белка. Частица ВТМ распадается на составные части под влиянием различных воздействий: разбавленной щелочи, концентрирован-}

_{- В}

_{РИС. 16. Одноклеточные — инфузории, жгутиконосцы, радиолярии а — Euplotes patella (инфузория); б — Poludlnium mysozeum (инфузория из кишечника слона); в —скелет Cycladopora pantheon (радиолярия); г — Heteronema spirale (жгутико­носец, эвглеиовые); д — Ceratium longlpes (жгутиконосец, перидиниевые); е — Gonyaulax polyedra (жгутиконосец, перидиниевые); а, б, в заимствованы из книги [921, остальные — ■из книги [163]}

_{РИС. 17. Стрекательная капсула одноклеточного организма-споровика Nasema}

_{Капсула имеет двойную оболочку и ввернутую в капсулу полную нить. Выстреливание обусловлено быстрым развертыванием нити}

_{РИС. 18. Спермий длиннохвостого рака Galathea squamifera [144]}

_{РИС. 19. Иллюстрация сложной морфологии вирусов и фагов [237]}

_{а—модель строения вируса табачной мо-}

_{мой уксусной кислоты, мочевины, додецилсульфата и других агентов. При защелачивании среды до pH 10,5 происходит дез­агрегация белковой оболочки ВТМ на небольшие субчастицы — А-белки. При подкислении щелочного раствора А-белка начина­ется упорядоченная агрегация, самосборка — образуются длин­ные палочкообразные структуры, внешне не отличающиеся от ВТМ. Чрезвычайное волнение вызвало в 1955 г. сообщение Френ- кель-Конрата о самосборке, реконструкции целого инфекцион­ного вируса при агрегации А-белка в присутствии РНК, выде­ленной из ВТМ. Это было первое искусственное воссоздание (почти создание) живого организма. (Вирусы вполне подходят иод определение живого организма — объект биологической эво­люции, находящийся или способный находиться в процессе био- .логической эволюции. А то, что вирусы в ходе эволюции облени­лись и разучились самостоятельно добывать, готовить, перевари­вать и использовать пищу — просто характеризует их очень ллохо...) И это воссоздание осуществилось посредством само­сборки. Строение ВТМ показано на рис. 19, а. Видно, что само­сборка структурных элементов может происходить и при не очень •сложных белковых субчастицах, субъединицах — они должны иметь специфические контакты, определяющие их соединение как друг с другом по спирали, так и с РНК. Успех искусствен­ного осуществления самосборки ВТМ вызвал интенсивные иссле­дования этого процесса на других вирусах. Было установлено, что в результате самосборки из белковых молекул образуются большей частью или полые цилиндры, или плоские мембраны, способные образовывать замкнутые сферы. Большие успехи были достигнуты при изучении самосборки мембраны малых сфериче­ских вирусов (237, с. 29], в частности, вирусов, вызывающих рост незлокачественной опухоли папилломы. Крик и Уотсон предполо­жили в 1956 г., что из идентичных белковых молекул (морфоло­гических единиц) могут возникать плоские мембраны, полые сфе­ры, эллипсоиды, полые цилиндры (трубы) и их комбинации. Каспар и Клуг подтвердили их предположение посредством гео­метрического анализа (см. [237]).}

_{Характер автоматически возникающей структуры зависит в основном от числа контактов, которые способны осуществлять имеющиеся в системе морфологические единицы. Число таких контактных точек в них в свою очередь зависит от числа обра­зующих их белковых субъединиц.}

_{Так, морфологические единицы, имеющие по шесть контакт­ных точек и состоящие из шести субъединиц, образуют плоскую однослойную мембрану (рис. 20, а). Для образования из такой мембраны замкнутой поверхности многогранника она должна быть перегнута во многих местах. Образующиеся ребра делят поверхность на серию треугольников. Для этого наряду с шести­контактными морфологическими единицами в системе должны находиться и пятиконтактные, состоящие из пяти субъединиц}

_{РИС. 20. Модели, иллюстрирующие принципы самосборки надмолекулярных структур [237]}

_{а — шестиконтактиые морфологические единицы, образуют плоские мембраны (одиа из единиц зачернена; б — пятикоитактные морфологические единицы (одиа из иих зачерне­на) образуют вершниы в ограненных мембранах}

_{(см. рис. 20, б). Пятиконтактные морфологические единицы встраиваются в вершины многогранников, не нарушая непрерыв­ной упаковки [237]. Наименьший многогранник состоит лишь из двенадцати пятиконтактных морфологических единиц. Различные сочетания пяти- и шестиконтактных морфологических единиц обеспечивают решение сложных морфологических задач.}

_{Модель вируса папилломы, предложенная Финчем и Клугом (см. [237]), представляет собой икосаэдр из 72 морфологических единиц, образованных 420 субъединицами первого порядка. Если морфологические единицы образованы не только шестью п пятью субъединицами молекул белка, но и меньшим их числом, то при участии в построении надмолекулярных структур и не­ассоциированных субъединиц первого порядка мо^ут автомати- чески возникать разнообразные геометрические формы — трубы, эллипсоиды, икосаэдры (см. рис. 20). Еще более сложные мор­фологические структуры получаются при самосборке отдельных блоков Т-четных фагов (см. рис. 19, б). Самосборка этих фагов определяется большим числом генов — синтез белковых субъ}­_{единиц контролируется 17 генами, около 30 генов регулируют самосборку образующихся белковых субъединиц и отдельных блоков фага [237].}

_{Для наших целей совершенная экскурсия в область изучения самосборки вирусов достаточна. Мы видим, что морфология ви­русов является следствием структуры, морфологии специфиче}­_{ских белковых молекул. Теперь нужно попробовать выяснить, могут ли по тому же принципу строиться значительно более круп­ные образования типа клеток инфузорий, сперматозоидов или водорослей?}

_{Интересующий нас вопрос можно сформулировать и иначе: является ли морфология клеток прямым следствием морфологии молекул белков? В таком виде этот вопрос эквивалентен вопро­су о возможности многократного увеличения молекул с сохране­нием их морфологических особенностей. Подобная возможность кажется сомнительной. Форма и морфологические особенности зерен серебра никак не связаны с формой фотографического изо­бражения. Ситуация с клеткой, ее морфологией и формой бел­ковых макромолекул представляется сходной. Диаметр субъеди­ницы белка порядка 10 А, диаметр клетки порядка 10 мк, т. е. их диаметры различаются на 4 порядка. (В фотографии диаметр зерна серебра тоже отличается от линейного размера детали изображения на 4 порядка.) Однако мы не удивляемся тому, что форма даже гигантских монокристаллов является следствием прямого увеличения элементарной кристаллической ячейки ато­марно-молекулярных размеров. Но теперь взглянем на рисунки, на которых изображены инфузории, неклеточные гигантские во­доросли— вошерия, ацетабулярия, ботридиум и др. (см. рис. 15, 20) уж очень их морфология отличается от морфологии кри­сталла. Очень уж эта морфология «неправильна» и «причудли-за». Однако на примере вирусов мы видели, что в зависимости •от строения морфологических единиц, а, следовательно, от набо­ра не очень разнообразных субъединиц, автоматически образу­ются разные достаточно сложные морфологические структуры — полые сферы, эллипсоиды, трубки. Поэтому, если последователь­ность появления (биосинтеза) тех или иных субъединиц зало­жена в генетической программе, то можно представить себе по­следовательность образования очень сложных морфологических структур непосредственно из макромолекул белка.}

_{Следовательно, морфология клетки и ее частей может быть .записана в нуклеотидном коде в виде текстов (генов), опреде­ляющих синтез в необходимой последовательности полипептид- лых цепей с определенной последовательностью аминокислот. Естественно, мы говорим сейчас лишь о принципиальной возмож­ности такого механизма морфогенеза клетки. Весьма привлека­телен и другой принцип морфогенеза на этом уровне. В самом деле, мы по существу рассматривали следующую модель. Набор разных кубиков разной формы с липкими гранями насыпают в ящик и какое-то время трясут (тепловое движение); кубики сли­паются так, чтобы суммарная свободная поверхность, смазанная .клеем, была минимальной, т. е. образуется сложная морфологи­ческая структура (эта модель была реализована Ферстером [303]. Затем в ящик добавляют кубики другой формы и снова трясут— прежняя морфологическая структура достраивается, превраща­ясь в структуру нового типа, и т. д. В этом случае реализуются структурные особенности морфологических единиц и их субъ­единиц, причем их реализация происходит при стохастическом взаимодействии структурных единиц.}

_{Никаких кинетических особенностей, никакой кинетической организации пространства нам не требовалось. Дело в том, что кинетические особенности вполне могут приводить к простран­ственным геометрическим эффектам. Это обязывает нас поста­вить вопрос — не используются ли в биологических морфоген- яых процессах и кинетические механизмы? А если нет, то почему эволюция прошла мимо столь замечательных явлений?}

_{По-видимому, первым изученным примером кинетического образования структуры были кольца Лизеганга. Они представ­ляют собой правильные периодические структуры, возникающие при образовании осадка в результате реакции равномерно рас­пределенного вещества с другим реагентом, диффундирующим в зону реакции. Кольца Лизеганга легко получить, если пропитать желатиновый слой фотопластинки хроматом калия, а затем кап­нуть на него раствор азотнокислого серебра. По-видимому, для образования кристаллического осадка хромата серебра необхо­димо наличие затравки, появляющейся лишь при некоторой по­роговой концентрации хромата калия. Поэтому при диффузии ионов серебра через область, обедненную (в результате предыду­щего осаждения и диффузии) хроматом калия, осадок не обра­зуется. При достижении некоторого критического соотношения ионов серебра и хромата лавинообразно развивается процесс кристаллизации, с избытком ионов серебра реагируют ионы хро­мата из прилежащих областей (последние обедняются этим анионом). И вновь, при продолжающейся диффузии серебра в этих обедненных зонах не появляется осадок. Так образуются концентрические кольца — пустые кольца чередуются с кольца­ми осадка хромата серебра. Получение колец Лизеганга произ}­_{вело большое впечатление на минералогов — концентрические структуры в яшме, малахите и т. п. стали рассматриваться как результат сочетания процессов диффузии и осаждения в период образования этих минералов. Позже, особенно после открытия (методом электронной микроскопии) тонкой структуры миелино- вого волокна с его концентрическими слоями миелина [417], стали высказываться мнения о возможном участии механизмов, анало­гичных рассмотренным выше, и в образовании морфологических структур в биологических системах (например, структуры миели- нового волокна). Но мне кажется это очень сомнительным — нельзя «доверять» сферически симметричной диффузии тонкую морфологическую работу. Кроме того давно и точно установле­но, что концентрическая структура миелинового волокна возни­кает при многократном наворачивании тонких блиноподобных клеток на аксон.}

_{Одним из наиболее интересных примеров кинетического ме­ханизма организации пространства является возникновение про­странственных структур в процессе распространения химической колебательной реакции. Такие реакции были капитально иссле­дованы в нашей лаборатории [101, 102]. При реакциях, изучен­ных А. М. Жаботинским и А. Н. Заикиным, образуются подчас весьма сложные узоры, обусловленные распределением в про­странстве окисленных и восстановленных форм соответствующих катализаторов. Таким образом возможны кинетические по про­исхождению структуры, кинетическая организация простран­ства. Пространственные характеристики определяются в данном случае кинетическими параметрами — скоростями реакций, со­отношением положительных (активация) и отрицательных (угнетение) обратных связей в реакционной цепи. Следователь}­_{но, пространственная организация структуры легко поддается регулированию. А это именно то, что совсем не нужно в морфо­логии (вернее, обычно не нужно). Морфология должна быть до­статочно консервативной, инвариантной относительно не сильных модификаций условий ее возникновения. Мне кажется, что кине­тический морфогенез не мог устроить эволюцию.}

_{До сих пор мы говорили о морфологических (морфогенных) процессах на уровне клетки. Наиболее сложны, вероятно, про­блемы морфогенеза многоклеточных организмов.}

_{Многоклеточные организмы возникают из одной клетки — ?иготы. Морфология на этом уровне определяется взаимным рас­}

_{положением и взаимодействием клеток в пространстве. Значит, и в данном случае должен существовать однозначный механизм перевода нуклеотидного текста в план, чертеж постройки из кле­ток. В самом деле, что определяет соединение клеток друг с другом в строго определенных положениях? Можно представить себе несколько ответов на этот вопрос. Проще всего предполо­жить аналогию в механизме образования морфологических струк­тур из клеток и из макромолекул. Геометрия построек из клеток может определяться геометрией клеток — числом возможных контактов каждой клетки и ориентировкой контактных участков, их расположением на «шкуре» клетки. Как мы видели, сочета­ние гексамерных и пентамерных морфологических единиц при­водит к возникновению разнообразных структур. Гексамерные, шестиконтактные клетки должны образовывать плоские структу­ры, двухконтактные — нити.}

_{Другим возможным способом морфогенеза мог бы быть такой процесс дробления яйца (или любой клетки на поздней стадии морфогенеза), при котором взаимное расположение клеток опре­деляется направлением митотического веретена и тем самым границы, разделяющей дочерние клетки. Последовательная пере­ориентация митотического веретена в последовательных актах клеточного деления могла бы приводить к образованию любых сложных морфологических структур (такая возможность каза­лась особенно привлекательной А. Г. Гурвичу (76]). Однако ука­зание на такой способ морфогенеза лишь видоизменяет задачу— все равно нужно выяснить причины той или иной ориентации ми­тотического веретена при очередном делении клеток. Но самое •сильное возражение против подобного механизма, как я думаю, состоит в том, что морфология многоклеточных образований не определяется процессом размножения клеток. Это следует из замечательных опытов по реагрегации клеток после дезагрега­ции органов и тканей (и даже организмов)!}

_{Такие исследования начались на губках. В начале нашего века было обнаружено, что если нарушить связи между клетка­ми, «слегка помяв» кусок губки в морской воде, то происходит мацерация, и свободные клетки начинают плавать в морской воде. Однако очень быстро наступает реагрегация клеток — они собираются и вновь восстанавливается исходная типичная для тубок структура [215]. Аналогичный процесс реагрегации можно наблюдать при мацерации печени или почек эмбриона мыши или цыпленка. Реагрегация почки с ее сложной морфологией особен­но впечатляюща — клетки разных типов располагаются в нужных местах, образуя характерные морфологические структуры. Сле­довательно, в этих случаях взаимное расположение клеток не •определяется ориентацией митотического веретена. В процессе реагрегации клетки активно перемещаются друг около друга, а их мембраны совершают волнообразные движения. Как только жлетки оказываются в «правильном» положения, их движенияи колебания резко прекращаются; такая реакция остановки явля­ется существенным элементом формообразования в многокле}­_{точных постройках [47, 190, 191]. Вполне возможно, что клетки останавливаются тогда, когда совпадают их контактные участки. Отличие самосборки макромолекул в надмолекулярные структу­ры от самосборки многоклеточных построек, быть может, и со­стоит лишь в способе перемешивания — в первом случае мы име­ем стохастическое тепловое движение, а во втором — целена­правленное или случайное активное перемещение клеток. А геометрия построек в обоих случаях определяется геометрией морфологических единиц — макромолекулярных комплексов или; целых клеток.}

_{Так может быть все уже ясно? И можно допустить, что счи­тывание генетических текстов — записей инструкций о морфоло}­_{гии многоклеточных организмов-—происходит посредством воз}­_{никновения в нужной последовательности во времени клеток, необходимой формы с нужным числом контактов на поверхности? Но в ряде случаев клетки образуют структуры без непосредст­венных контактов и находятся друг около друга на расстоянии около 200 А. Промежуток же между клетками заполнен колла- геновыми волокнами или иными контактными веществами. Это- первое затруднение. Второе заключается в том, что при формо}­_{образовательных процессах в эмбриогенезе наблюдается пере­стройка структур; например, превращение бластулы в гаструлу происходит посредством изменения взаимного расположения уже образовавшихся ранее клеток, а именно, клетки некоторой зоны, (полюса) сферической бластулы вдавливаются, инвагинируются и образуют гаструлу. Трудно (трудно, но все же можно) пред­ставить себе детерминированное изменение морфологии клетки,, такое изменение числа контактных участков, ори котором из- сферы автоматически образовалась бы двуслойная гаструла.. Третье затруднение состоит в том, что одни и те же клетки в разных условиях дают разные структуры. При пересадке клеток эмбриона они образуют структуры, как правило, соответствую­щие тому месту, в которое их пересадили. Данная морфологиче­ская структура индуцируется окружающими клетками и тка}­_{нями. Явление индукции — предмет многих замечательных исследований в экспериментальной эмбриологии (см. [35, 291 ^ 295а, б]). Пожалуй, наиболее ярким, убедительным примером индуцированного морфогенеза является формирование оптиче­ской системы глаза. Глаз развивается в ходе эмбриогенеза из 'двух источников: передний мозг образует вырост—глазной бо­кал (превращающийся впоследствии в светочувствительную' ткань — сетчатку и в зрительный нерв), который индуцирует в ближайшей прикрывающей его эктодерме развитие оптической системы глаза — хрусталика и роговицы. Глазной бокал можно пересадить в разные места зародыша [182] и в этих местах в эктодерме будет индуцироваться развитие хрусталика и рогови}­_{цы. Природа агентов, вызывающих индукцию данной структуры, не ясна. Вопрос этот очень сложен. Индуцирующим действием могут, например, обладать и заведомо неспецифические повреж­дающие воздействия, что когда-то поразило исследователей и заставило их надолго отказаться от поисков эндогенных специ­фических индукторов. С сожалением должен признаться, что и в данном случае наиболее вероятна доминирующая роль химии (конечно, биохимии), а не физики; определенные вещества, ве­роятно, индуцируют определенные структуры, а неспецифические повреждающие агенты способствуют выработке или освобожде­нию таких веществ. Эти специфические индукторы, по-видимому, представляют собой факторы, снимающие репрессию определен­ного белкового синтеза.}