Очерки из жизни пресноводных животных

Краткие сведения о методике микроскопического исследования пресноводных животных

Нельзя ограничиваться только визуальными наблюдениями пресноводных животных, сколь бы ни был терпелив наблюдатель и остр его глаз. Основное изучение добытых животных производится в лаборатории при помощи оптических инструментов; таковыми являются: штативная препаровальная лупа, бинокулярный препаровальный микроскоп и микроскоп обычного типа.

Бинокулярный микроскоп особенно полезен для изучения животных объектов в целом.

Добываемый материал исследуется:

в живом виде;

на сырых, не обработанных ничем препаратах в воде (части тела, мертвое мелкое животное);

на живых объектах, заключенных в гуммиарабиковую смесь в период умирания наблюдаемого организма;

на фиксированных или консервированных препаратах или в разнятом на части виде - в воде или на препаратах, заключенных в гуммиарабиковую смесь, в глицерин-желатину или в канадский бальзам;

то же, но с предварительной окраской препарата;

на выпрепарированных из свежего животного органах, окрашенных, наклеенных на предметное стекло по методу Е. Н. Павловского и заключенных в указанные выше вещества;

на гистологических срезах животного в целом, фаз его развития или отдельных органов, фиксированных соответственными смесями, залитых в парафин (или в целлоидин) и окрашенных различными способами.

Наблюдение цельных (тотальных) объектов в живом виде

Многие пресноводные животные прозрачны и потому являются весьма удобными для микроскопирования в живом состоянии; у мелких рачков (дафнии) и других животных можно наблюдать биение сердца, движения кишечника, работу конечностей, процедуру принятия пищи, работу жабр и многое другое, но для этого объект наблюдения необходимо лишить подвижности, дабы он во все время работы оставался в поле зрения микроскопа. В зависимости от величины объекта это достигается разными способами.

Объект помещают под покровное стекло на восковых ножках; осторожным давлением на углы стекло опускают до соприкосновения с поверхностью тела наблюдаемого животного; если последнее толсто, то его кладут на предметное стекло с углублением или приготовляют особую стеклянную камеру, наклеивая канадским бальзамом отрезки стекла требуемой толщины на предметное стекло.

Для наблюдения простейших их движения замедляют давлением покровного стекла на ножках или же на предметное стекло кладут несколько переплетающихся волокон ваты, наносят каплю воды с объектами и наблюдают их в камерах, образованных перекрещивающимися волокнами ваты.

Приготовление тотальных препаратов без предварительной подготовки

Для сохранения мелких животных (например, членистоногих) и различных стадий их развития в целях последующего изучения изготовляют постоянные микроскопические препараты, без какой-либо особой обработки, по схеме: обезвоживание объекта и заключение его в канадский бальзам.

Объект фиксируется 70% спиртом (если он уже был законсервирован в водном растворе формалина, то его с час промывают водой и потом переносят часа на 2-3 в 70% спирт). Препарат прокалывают где-нибудь острой иглой, чтобы дать возможность спирту проникнуть через отверстие в хитине внутрь объекта.

Препарат переносят последовательно в 85% и затем в 95% спирт, выдерживая в каждом из них, в зависимости от величины объекта, часов по 6 (в 95% спирту можно оставить препарат на ночь).

Препарат переносят на сутки в абсолютный алкоголь для обезвоживания. Для заключения в канадский бальзам препарат необходимо пропитать насквозь маслом; такое "просветление" производится гвоздичным или кедровым маслом.

В узкую короткую пробирку с плоским дном наливают гвоздичного или кедрового масла на 1 см, осторожно приливают сверху абсолютного спирта, так чтобы обе жидкости не смешивались друг с другом. В спирт опускают обезвоженные препараты, которые задерживаются в зоне соприкосновения спирта с маслом. Пробирку оставляют стоять в покое до тех пор, пока препараты не опустятся на самое дно, что совершается медленно в связи с диффузией в пограничной зоне. Пипеткой отсасывают спирт и перекладывают препараты на несколько часов в чистое масло в часовом стекле.

По окончании описанных процедур контролируют прозрачность препарата. Часовое стекло ставят на черную доску стола. Препарат должен быть невидимым; если на нем видны белесоватые пятна, значит обезвоживание было неполное, и препарат необходимо вернуть обратно в абсолютный спирт.

Если препарат прозрачный, то его на шпателе переносят на середину предметного стекла и поливают несколькими каплями ксилола из капельницы, чтобы смыть масло.

Сообразуясь с толщиной препарата, вырезают две узкие полоски белого картона или берут кусочки спичек или обламывают кусочки вытянутой стеклянной трубочки и кладут их но бокам препарата так, чтобы они пришлись к самым краям покровлого стекла.

Не давая препарату высохнуть, наносят на него палочкой канадский бальзам и накрывают препарат начисто вытертым покровным стеклом. Если бальзама взято мало, то прибавляют каплю его с краю покровного стекла, под которое он втягивается в силу капиллярности.

Поправляют иглами положение сдвинувшихся опорных полосок ("ножек") и оставляют препарат на долгое время сохнуть в горизонтальном положении, подбавляя канадский бальзам по мере его усыхания с краев.

Такие заключенные в толстый слой канадского бальзама препараты целесообразнее хранить в горизонтальном положении, так как при долгом держании их на боку объект опускается к нижнему краю покровного стекла даже спустя несколько месяцев после его изготовления.

Вследствие толщины препарата, его можно изучать только при слабых увеличениях микроскопа.

Если препарат в канадском бальзаме был совершенно прозрачен, а через некоторое время он частично или полностью почернел, при рассматривании в проходящем свете микроскопа, значит он не был достаточно проколот перед обезвоживанием (см. выше § 1), из него испарился ксилол, а бальзам внутрь не прошел. Ценные препараты можно попытаться исправить по следующей схеме:

растворить бальзам ксилолом и выдержать препарат в чистом ксилоле;

перенести (осторожно, препарат очень хрупок) в 100% спирт для обезвоживания;

проколоть осторожно препарат иглой; после суточного пребывания в 100% спирту повторяют последовательно § 4-9 настоящей главы.

Если весь препарат потерял прозрачность, то его с успехом (и с некоторой выгодой) можно рассматривать при сильном падающем свете у светлого окна, близ сильной лампы и т. п. В таком случае с особенной ясностью видима поверхность препарата (волоски, чешуйки, бугорки и т. п.).

Стойкие, хотя и не так долго сохраняющиеся препараты можно приготовить, заключая объект в глицерин-желатин. Если объект хранится в формалине, то его хорошо промывают сменяемой водой (несколько часов); затем переносят в смесь глицерина пополам с водой для пропитывания. Спиртовые препараты также предварительно переносят в воду. Препарат в глицерине держат несколько часов или сутки до полного пропитывания.

Далее препарат кладут на предметное стекло и отсасывают лишнюю жидкость фильтровальной бумагой. На покровное стекло берут кусочек глицерин-желатина и нагревают его на стекле, чтобы желатин расплавился. Полезно слегка нагреть (но не высушить) объект на предметном стекле. Затем покровное стекло быстро переворачивают и висящей каплей желатину опускают на объект так, чтобы масса растеклась между предметным и покровным стеклами и покрыла собою объект. Для прочности препарат с краев покровного стекла обводят железным лаком или жидким канадским бальзамом, чтобы предупредить высыхание массы. Препарат хранится долго. Его преимущество - меньшая прозрачность, чем бальзамного, что иногда бывает нужно.

Глицерин-желатин приготовляют: растворив в 100 см³ на водяной бане или в горячей воде 10 г желатина в листах, к раствору добавляют 25 см³ глицерина и 0,1 г тимола (растворив последний в воде) или несколько капель карболовой кислоты (против плесени). Все перемешивают и сливают в баночку с пробкой.

Особо следует рекомендовать заключение ценных объектов (мелкие личинки насекомых, рачки) и их частей в гуммиарабиковую смесь. Живой или убитый хлороформом объект кладут во влажном состоянии на предметное стекло, наносят каплю гуммиарабиковой смеси требуемой величины и накрывают покровным стеклом с ножками. Следует помнить, что живой объект может иногда выползти из-под стекла. Этот способ выгоден, благодаря быстроте приготовления препарата, заключаемого непосредственно из воды. Просветление умеренное; у насекомых великолепно выступает трахейная система (особенно в жабрах), но наблюдать ее вплоть до капилляров необходимо в ближайшее время по изготовлении препарата, так как с течением времени она теряет резкую видимость в своих мелких частях. Высыхание гуммиарабика прочно укрепляет покровное стекло; в случае необходимости можно добавочно укрепить его кантом из канадского бальзама или менделеевской замазки. Недостатком гуммиарабиковых смесей является то, что в них (в противоположность канадскому бальзаму) не рассасываются случайно попавшие пузырьки воздуха (также и в глицерин-желатине).

Существует несколько гуммиарабиковых смесей.

Фаррантовская смесь, содержит гуммиарабика 36,0 г, дестиллированной воды 350,0 см³, глицерина 350,0 см³. Приготовлять ее надо в холодной воде, перед употреблением должна стоять несколько месяцев. Смесь Букетана содержит: дестиллированной воды 50,0 г, глицерина 20,0 см³, гуммиарабика 40,0 г, хлоралгидрата 50,0 см³ и кокаина 0,5 г. Её приготовляют следующим образом: сначала растворяют в воде гуммиарабик, прибавляют хлоралгидрат и кокаии; по растворении добавляют глицерин; дают отстояться: если нужно, то фильтруют.

Спиртовые препараты перед заключением их в гуммиарабиковые смеси выдерживают сначала в воде. Описанная среда умеренно просветляет препарат, все детали которого выступают весьма ясно.

Полезна также лактофеноловая смесь: кристаллического фенола 1,0 г, мо-лочной кислоты 1,0 г, глицерина 2,0 г, воды 1,0 г. Препарат переносится в эту смесь или из воды или из спирта. Однако смесь не затвердевает.

Расчленение свежего, а также спиртового материала можно производить в воде препаровальными иглами, копьевидной и лопатовидной. Мелкие объекты безопаснее, расчленять на том же предметном стекле, на котором будет приготовлен постоянный препарат. Необходимо только убрать все посторонние частицы и оставить только то, что нужно. Всю излишнюю жидкость убирают фильтровальной бумагой (необходимо остерегаться, чтобы с током воды к фильтровальной бумаге не пристал бы самый объект), поправляют иглой положение объекта и наносят на него каплю гуммиарабиковой смеси или заключают в глицерин-желатин, как указано выше.

Если требуется приготовить бальзамный препарат или иметь полную гарантию сохранности мелкого объекта во время приготовления препарата, то применяют способ автора (Е. Н. Павловского) наклейки объекта на стекло (см. ниже) с последующим заключением препарата в канадский бальзам или в гуммиарабиковую смесь.

Вываривание объекта в едком кали

В некоторых случаях желательно изготовить препарат из одних только хитиновых или известковых частей. Для этого поступают следующим образом.

Отрезают соответствующую часть объекта и кладут ее в химическую пробирку, куда налит раствор едкого кали или натра (кусочек с горошину растворяют в 5-6 см³ воды).

Препарат кипятят на спиртовой лампочке, пока не будут разрушены его мягкие части.

Препарат переносят в чистую воду (можно с прибавлением уксусной кислоты) для удаления едкого кали.

После основательной промывки препарат переносят последовательно в 70%, 95% и в абсолютный спирт, просветляют кедровым маслом и заключают в канадский бальзам.

Покрывая объект покровным стеклом, подкладывают под его углы ножки, сделанные из воска или из кусочков спички, чтобы давление покровного стекла не изменило формы объекта.

Если изолируемые части многочисленны и мелки, то их центрифугируют и отсасывают пипеткой со дна пробирки.

Наклейка тотальных препаратов на предметное стекло по способу Е. Н. Павловского

Выпрепарованный орган (например, половой аппарат или мальпигиевы сосуды) на шпателе переносится в каплю физиологического раствора на предметное стекло, где тщательно расправляется иглами и приводится в желательное положение.

Узкой полоской фильтровальной бумаги осторожно отсасывают физиологический раствор и иглой приводят сдвинувшиеся части органов в их прежнее положение.

Наносят на объект капля по капле из пипетки жидкость Карнуа (Рецепт см. ниже), следя за тем, чтобы не сдвинуть части органов.

Покачивают препарат из стороны в сторону, чтобы лучше профиксировать ткани.

Через 1-5 минут (в зависимости от толщины препарата) жидкость Карнуа сливают; взамен её прибавляют 95°/о спирта, которым промывают препарат.

Сливши спирт, наносят на препарат несколько капель 1/4-1/2% раствора фотоксилина, коллоксилина, целлоидина или коллодия; все эти вещества (к ним можно добавить фотографическую плёнку со смытой эмульсией) растворяют в смеси равных частей абсолютного спирта и серного эфира. Препарат покачивают, чтобы коллодий покрыл его сверху.

Излишний раствор коллодия сливают, наклонив стекло; препарат 1/4-1/2 минуты держат на воздухе, чтобы коллодийная пленка чуть загустела (но не высохла).

Препарат кладут в 85% спирт на полчаса или на час, затем перемещают его в 70% спирт, в коем он может храниться неограниченно долгое время до окончательной обработки.

Если наклеивают препарат, бывший в спирту, то начинают прямо с пункта 6.

Окраска и окончательная обработка наклеенных тотальных препаратов

Из 70% спирта препарат, наклеенный на предметное стекло, переносят в воду на 10-60 минут (в зависимости от толщины и проницаемости объекта для воды).

На 5-10-30 минут (установить опытом) препарат погружают в квасцовый кармин (Квасцовый кармин приготовляют прибавлением к 100,0 см³ дистиллированной воды, 2,0 г калийных квасцов и 1,0 г кармина (сорт Nacarat). Кипятить 15 минут, остудить, отфильтровать и положить в раствор несколько кусочков тимола или камфары (против плесени)) или в гемалаун.

Препарат переносят последовательно в несколько порций чистой воды и в последней оставляют его на 1-2 часа.

На несколько часов стекло с препаратом погружают в 75% и в 95% спирт.

Обезвоживают препарат в 100% спирту от получаса до двух часов (в зависимости от препарата). При более долгом держании спирт растворит коллодий, и препарат сползёт.

Окраска ненаклеенных тотальных препаратов

Из 70% спирта препарат переносят в 50% спирт, а затем в дистиллированную воду.

Препарат кладут в квасцовый кармин, длительность окраски определяют на опыте (от нескольких минут до нескольких часов).

Промывают в свежих порциях воды несколько часов.

Переносят на шпателе в 50, 75, 85% спирт.

Обезвоживают в 100% спирте и заключают в канадский бальзам, как было указано выше.

При отсутствии абсолютного спирта, из 96% спирта препарат переносят в карболксилол, затем в чистый ксилол и после просветления в канадский бальзам.

Иногда объекты, подлежащие резанию на микротоме, окрашивают сразу целым куском, затем заливают в парафин.

Для этой цели обычно применяется борный кармин (К 100 см³ 4% водного раствора буры при кипячении прибавляют 2-3 г кармина. Затем добавляют 100 см³ 70% спирта и оставляют на несколько недель, потом жидкость сливают и фильтруют), которым можно так же хорошо окрасить и тотальный препарат.

Из 70% спирта препарат переносят в борный кармин на несколько часов.

Из краски препарат перекладывают в 70% спирт с 1% соляной кислоты. Кислый спирт вытягивает лишнюю краску из протоплазмы (дифференциация окраски); спирт сменяют по мере его окрашивания.

Выдерживают препарат в свежих порциях 75% спирта для удаления кислоты. Далее объект или заключают в канадский бальзам, как уже указано, или заливают в парафин.

Вскрытие мелких членистоногих

Вскрытие производится под контролем каких-либо оптических приборов. Наилучшим инструментом является бинокулярный препаровальный штатив. В случае отсутствия бинокуляра можно пользоваться любой препаровальной лупой с увеличением от 10 до 20 раз, но препаровка под лупой является технически менее удобной.

Вскрываемый объект должен быть хорошо освещен падающим дневным светом, ибо при таком нормальном освещении легче уловить "физиономию" того или иного органа или ткани. При искусственном освещении требуется большая наметанность глаза для быстрого отличия, скажем, слюнной железы вши от комочка ее жирового тела.

Для вскрытия необходимы некоторые инструменты, в первую очередь препаровальные иглы различных сортов, а именно: обыкновенные швейные иглы, предложенная нами модель "лопатовидной препаровальной иглы" и копьевидная игла; нужен также пинцет с возможно более тонкими концами и тонкие ножницы.

Швейные иглы вставляются в металлические иглодержатели. Все иглы должны быть чисты и остры. Перед работой их необходимо отточить, лучше всего на ножном точильном станке. Швейные иглы стачивают с боков так, чтобы исчезла боковая округлая выпуклость у конца иглы, и последняя походила на тонкий шпиц. Лучше заготовить сразу запас отточенных игл, чтобы во время работы немедленно заменить легко ломающиеся на концах острые иглы. После отточки игл их протирают 95% спиртом для очистки. При отсутствии точильного станка можно с успехом пользоваться тонким крепким точильным камнем (например, арканзас) или различными сортами наждачной бумаги.

Из других принадлежностей необходимы: узкий шпатель, пипетка с круглым резиновым шариком и шарообразным вздутием и пипетка глазная; посуда для вскрытия (часовые стекла 5-7 см диаметром с уплощенным дном, предметные толстые стекла с вышлифованным углублением, чашечки Петри 7,5 см диаметром); физиологический раствор (прочие химикалии - см. ниже).

Для вскрытия берется живой или только что убитый эфиром объект и пинцетом опускается на 1 сек. в 96° спирт. Затем объект тотчас переносят в чашку с физиологическим раствором и держат его в жидкости, пока не утихнут диффузные токи. Этой манипуляцией обычно достигается смачиваемость хитиновой кутикулы водой, благодаря чему объект тонет в физиологическом растворе. Если это почему-либо не достигнуто, то повторяют ту же процедуру.

После этого объект переносят в препаровальную ванночку (часовое стекло) с физиологическим раствором поваренной соли. Самое вскрытие производится при помощи лопатовидной иглы. Наша модель (Е. Н. Павловского) имеет широкий конец с полукруглым свободным краем, в профиль же игла имеет обычный вид. Она удобна для работы именно в округлых углублениях (часовое стекло и т. п.), поверхность дна которых имеет кривизну. Надавив иглой на край вскрываемого объекта сверху и покачивая иглой из стороны в сторону, можно отсекать края тела, не производя влекующего движения, что для успеха вскрытия весьма важно. Копьевидная игла мало здесь поможет делу, ибо ею нужно резать, как ножом, или же вспарывать кожицу сбоку. При первом приеме насекомое будет смято, при втором - работа тянется долго и кропотливо.

С помощью лопатовидной иглы дело идет следующим образом. Вскрываемое насекомое придерживают препаровальной иглой (левой рукой) под физиологическим раствором у самого дна часового стекла. Правой рукой берут лопатовидную иглу и, держа ее отвесно, придавливают ею постепенна переднегрудъ, чтобы оттеснить внутренние органы кзади. Когда последнее достигнуто, сильно нажимают иглой и покачивают ею из стороны в сторону, чтобы своим полукруглым острым краем она отсекла голову и часть переднегруди. Затем, перевернув насекомое, таким же способом отсекают боковой кант тела с одной и с другой стороны, подобно тому, как машинкой отсекают край конверта при вскрытии. Потом двумя препаровальными иглами раздвигают кожные покровы спинки и брюшной стороны тела, отсекают их той же лопатовидной иглой и приступают к препаровке клубка внутренних органов. Последняя состоит в разрывании трахей, удалении долек жирового тела и расправлении сложенных или спутанных частей органов и др. Лопатовидную иглу можно изготовить, сточив острый край копьевидной иглы.

Окраска и дальнейшая обработка препарата указана выше.

Фиксирование объектов для гистологических целей

Фиксирование различных животных для дальнейшего их исследования путем срезов производится или целиком или по отдельным частям тела и органам. Применяются следующие фиксирующие жидкости.

Простейшей фиксирующей жидкостью является 70% спирт, в котором объект выдерживают несколько часов, после чего его перекладывают в свежую порцию спирта для хранения.

70% спирт с прибавлением 5% продажного формалина.

Жидкость Этке: 96% спирта 60 частей, 40% формалина 45 частей, уксусной кислоты 2 части.

Жидкость Фрейлинга: воды 120 частей, 96% спирта 60 частей, формалина 24 части, ледяной уксусной кислоты 4 части.

Насыщенный водный раствор сулемы: отвешивают по 8 г сулемы на 100 см³ воды и кипятят в колбе. Теплый раствор фильтруют в склянку, где он окончательно остывает. При охлаждении из раствора выпадают кристаллы, над которыми жидкость остается всегда насыщенной сулемой. Для фиксирования необходимо прибавить ко взятой порции сулемы 1-2 капли ледяной уксусной кислоты. Сулема плохо проникает вглубь тканей и через хитин, поэтому необходимо фиксировать разрезанное животное. Фиксировать надо не долее 4-6 часов. Эффект действия усиливается, если предварительно подогреть раствор до 60-70°. Когда фиксирование закончено, отсасывают сулему пипеткой и на препарат наливают 50% спирта на 1/2 часа, после чего спирт заменяют 60%. К последнему прибавляют йодной тинктуры до цвета мадеры. Сулема объекта соединяется с иодом., вследствие чего спирт обесцвечивается. К цему снова прибавляют иод до тех пор, пока спирт не перестанет обесцвечиваться. После этого препарат переносят, в 70% спирт. В раствор сулемы нельзя опускать никаких металлических инструментов, которые покрываются матовым налетом и портятся. В случае необходимости пользуются стеклянным или роговым шпателем, или же металлическими инструментами, покрытыми тонким слоем парафина.

Жидкость Карнуа: 60 частей абсолютного спирта, 30 частей хлороформа и 10 частей ледяной уксусной кислоты. Фиксируют от 5 минут до 1/2 часа. После фиксирования препарат выдерживают в 100 или 95% спирту, который сменяют несколько раз.

Жидкость Дюбоска приготовляется перед употреблением смешиванием трех основных растворов: 15 частей 1% раствора пикриновой кислоты в 90% спирту, 6 частей формола и 3 части ледяной уксусной кислоты. Полезно добавить еще 10% хлороформа. Фиксируют от получаса до четырех часов, после чего препарат переносят в 85% спирт, который сменяют после того, как он заметно окрасится в желтый цвет. Такую смену спирта приходится повторять. Если препараты не идут сразу в заливку в парафин, то для хранения их перекладывают в 75% спирт.

Жидкость Левена: 1% пикриновой кислоты в абсолютном или 96% спирту 12 частей, хлороформа 2 части, формалина 2 части, уксусной кислоты 1 часть.

Фиксирование производят в широких чашечках или баночках. Фиксирующая жидкость по объёму должна раз в 30-50 превышать объём объекта. При фиксировании жидкость вытягивает из объекта воду и разжижается; поэтому её время от времени перемешивают или заменяют новой, что приходится делать повторно с крупными объектами. Бывшую в употреблении жидкость выливают вон.

После жидкости Карнуа препараты выдерживают в 95% спирте, который сменяют несколько раз для вытягивания уксусной кислоты. Если материал не идет сразу в заливку, то его через 90% и 85% спирты переносят на хранение в 75% спирт.

После жидкости Левена и Дюбоска препараты переносят в 85% спирт, который сменяют несколько раз по мере его пожелтения. После жидкости Этке и Фрейлинга препараты переносят в 85% спирт, который сменяют несколько раз по мере его пожелтения. После жидкости Этке и Фрейлинга препараты промывают в 90% спирте.

Сведения об изготовлении срезов и о гистологической обработке препаратов можно получить в специальной литературе, указанной ниже.