Просто о ферментах. Почему они так полезны?

XVII век, Нидерланды. Страна проживает период расцвета, который потом получит название «Золотой век». Бурно развивается промышленность. Творят знаменитые художники – Рембрандт, Вермеер, Халс. В то же время в Нидерландах работают многие выдающиеся ученые своего времени.

Среди них Ян Баптист ван Гельмонт, врач и испытатель живой природы. После смерти ван Гельмонта его сын объединяет работы в собрание сочинений Ortus Medicinae и публикует их в 1648 году в издательстве семьи Эльзивир. Спустя столетия оно, кстати, остается ведущим научным издательством, публикующим научные работы высокого уровня.

В Ortus Medicinae Ян Баптист ван Гельмонт задается вопросом о природе пищеварения и предполагает, что есть некоторое вещество – фермент (от лат. fermentum – закваска), которое способствует перевариванию еды. Это было смелое предложение по тем временам, когда полагалось, что пищеварение происходит за счет тепла тела живых существ.

Спустя почти два столетия великий французский ученый – естествоиспытатель Луи Пастер исследовал, как дрожжи влияют на процесс спиртового брожения. Он предположил, что все протекает под действием некоторой «жизненной силы» – «фермента», содержащегося только в живом организме. Здесь он, пожалуй, немного ошибся – как потом выяснится, ферменты все же можно выделить из организмов и использовать самостоятельно.

Возможность брожения в отсутствии живых клеток была продемонстрирована немецким химиком Эдуардом Бухнером уже после смерти Луи Пастера. Стало известно, что спиртовое брожение можно осуществить с помощью дрожжевого сока, очищенного от клеток. Такие системы, обладающие ферментативной активностью в отсутствие живых клеток, в то время называли энзимы (от греч. ζύµη – закваска).

Красивым финалом этой дискуссии стало выделение высокочистого образца фермента – уреазы – химиком Джеймсом Самнером в 1926 году. К 1935 году было выделено еще несколько ферментов белковой природы, и научная общественность окончательно убедилась, что ферменты – белки.

Не прошло и пятидесяти лет, как биокаталитические свойства обнаружились у некоторых рибонуклеиновых кислот (РНК), которые были названы рибозимы. Это очень интересное и неожиданное открытие совершили Томас Чек и Синди Олтмен. До этого считалось, что только белки могут иметь каталитическую функцию, а открытие Чека и Олтмена изменило это представление. В 1989 году они были удостоены Нобелевской премии по химии. В пищевой промышленности рибозимы играют опосредованную роль, и здесь мы лишь упомянем их для поддержания справедливости. Вернемся же к ферментам – белкам.

На данный момент только в организме человека описаны тысячи ферментов, и их классифицируют в первую очередь по типу катализируемой реакции (см Таблицу 1). Почти все они, за исключением редких случаев типа лизоцима и пепсина, оканчиваются на – аза. Например, формиатдегидрогеназа, которая ускоряет реакцию превращения иона муравьиной кислоты (формиата) в углекислый газ. Реакция кажется очень простой, а для биотехнологии фермент очень важный, участвует, например, в синтезе особо чистых веществ для производства лекарств!

Согласно решению Международного союза биохимии и молекулярной биологии 2018 года, существуют 7 классов ферментов. Каждый класс делится на подклассы и подподклассы, которые уточняют нюансы конкретных реакций.

Каждый фермент получает собственный классификационный номер, состоящий из четырех цифр. Например, ЕС 1.1.1.1 – это фермент класса оксидоредуктаз (класс 1), который окисляет спирт в присутствии производного витамина В₃ и имеет порядковый номер в этом подподклассе 1. Это алкогольдегидрогенеза, фермент, ускоряющий реакцию окисления этанола до ацетальдегида.

Если вам интересно покопаться в классификации ферментов или получить больше информации про какой-то особенный фермент, рекомендуем базу данных BRENDA, доступную по QR-коду ниже.

Таблица 1. Классы ферментов

Несмотря на такое огромное разнообразие ферментов, классов и подклассов, главной общей особенностью ферментов является их способность невообразимо ускорять реакции в живых системах. Например, фермент с трудновыговариваемым названием оротидин‑5’-фосфатдекарбоксилаза относится к классу лиаз и участвует в синтезе важного предшественника РНК – уридинмонофосфата. Этот фермент ускоряет реакцию в 10¹⁸ раз! Трудно даже осознать эту скорость. Без фермента эта реакция шла бы 32 миллиарда лет, а с ферментом – всего 1 секунду. Вдумайтесь, нашей Вселенной «всегонавсего» 26 миллиардов лет – о какой жизни на Земле шла бы речь без ферментов!

Попробуем разобраться в причинах такого ускорения и начнем с обсуждения структуры ферментов. Большинство ферментов представляют собой глобулярные белки, то есть полипептидные цепи в них свернуты в оптимальные «клубочки» – глобулы. За счет пространственной организации рядом могут оказаться аминокислотные остатки, которые в первичной цепочке находятся очень далеко друг от друга. Это позволяет образовывать настоящий «ландшафт» глобулы с впадинами и настоящими расщелинами, а также формировать сердце фермента – его активный центр.

Строение фермента

Активный центр – это пространственная часть фермента, в которой происходит взаимодействие с реагентом (здесь и далее мы будем называть его субстратом) и его превращение в продукт. В активном центре выделяют два подцентра: непосредственно каталитический (тот, в котором и происходит превращение) и сорбционный, роль которого состоит в «удержании» субстрата, чтобы тот не «сбежал» в процессе.

Высокая каталитическая активность ферментов сочетается с исключительной специфичностью, то есть каждый фермент связывается со своим определенным субстратом, игнорируя (в идеальном случае) все остальные вещества. Еще в 1890‑х годах Эмиль Фишер предположил, что специфичность строения ферментов заключается в том, что активный центр и субстрат идеально подходят друг другу, как ключ к замку. Дальнейшие исследования позволили американскому биохимику Дэниелу Кошланду спустя почти полстолетия сформулировать гипотезу «Рука-перчатка». Которая гласит, что активный центр может подстраиваться под субстрат, «обнимая» его, как тонкая лайковая перчатка.

Можно подумать, что активный центр представляет собой самую главную часть фермента. Такое мнение разделили бы биохимики середины XX века, которые пытались «отсечь» все остальные части белка, надеясь получить самый компактный и совершенный биокатализатор. Но увы, так лихо оптимизировать природное творение не удалось – активный центр, не поддерживаемый всей остальной глобулой, терял свою способность к катализу[5].

В дальнейшем был обнаружен эффект так называемой аллостерической регуляции, когда на активность фермента оказывали влияние вещества, связывающиеся вне активного центра.

Но высокая специфичность строение и эффективное связывание субстрата в активном центре еще не окончательно объясняет колоссальное ускорение реакций в присутствии ферментов.

Три эффекта, ответственных за ускорение химических реакций

Долгие годы исследований этой загадки привели к элегантному ответу, который, как и все великие теории, базируется на трех китах. Исследования в этой области заложили основу отдельного научного направления – физической химии ферментов, где с помощью строгих математических расчетов фиксировались рекордные эффекты ускорения. Мы же ограничимся базовым обсуждением этих «китов», на которых стоит наука о ферментах – энзимология.

Три эффекта, ответственных за ускорение химических реакций в присутствии ферментов:

• эффект сближения;

• эффект ориентации;

• эффекты среды.

Начнем с эффекта сближения. Представьте, что вам необходимо встретиться со одноклассником в Москве, притом вы оба забыли телефоны дома и не условились ни о месте, ни о времени встречи. Как думаете, долго будете искать друг друга? Фермент выступает в роли назначенного места, где обязательно встретятся два реагента. Как одноклассники часто знают, что друг с другом можно встретиться на излюбленном с юных лет месте, так и реагенты обязательно свяжутся с ферментом (за это отвечает особое строение белка, но об этом позже). Эффект сближения позволяет существенно ускорить реакцию.

Второй эффект – это эффект ориентации. Бывало ли у вас, что вы долго пытаетесь поймать взгляд человека, чтобы с ним переговорить, – вроде и стоите рядом, а провзаимодействовать – никак? В ферментативном катализе «собеседники» всегда «лицом к лицу». Переходя на более научный язык, молекула реагента связывается с ферментом в оптимальной геометрии и ориентации так, что дальнейшим процессам не препятствуют пространственные ограничения.

Третий эффект связан с особыми условиями, которые созданы для реагентов в участке связывания – а именно в активном центре. Вновь обратимся к аналогии с межличностными отношениями. Для наиболее эффективного общения с важным человеком, например, в рамках деловой встречи, вы наверняка предпочтете создать благоприятную обстановку. Вы забронируете переговорный кабинет в офисе, напомните секретарю, что будет нужен кофе, проветрите помещение да и сами настроитесь на рабочий лад. Даже если за окнами будет ежедневная суета, вы будете поддерживать оптимальную обстановку, чтобы ускорить положительный итог встречи. Как вы понимаете, в активном центре фермента реализуется та же стратегия, только не на основе психологии, а на основе физико-химических законов. В активном центре может быть другая полярность среды и другой уровень кислотности. Функциональные группы, которые при обычных условиях малореакционноспособны, начинают демонстрировать чудеса химической «прыти».

Коферменты и кофакторы

Помимо полипептидной цепи в состав активного центра ферментов могут входить различные вещества, необходимые для их функционирования. Условно их разделяют на коферменты и кофакторы, хоть и граница между ними достаточно условная. Более того, среди ученых – специалистов в области исследования ферментов (энзимологов) до сих пор ведутся дискуссии о точности того или иного определения. По наиболее распространенной версии, кофактор – это небелковая часть в ферменте, которая необходима для катализа. Если эта часть представляет собой органическую молекулу, например производное витамина (как уже упомянутый выше NAD+ – производное витамина В₃), ее называют еще коферментом. Под кофакторами часто подразумевают ионы металлов, например таких «экзотических», как молибдена или ванадия. В витаминно-минеральных комплексах присутствие таких микроэлементов связано именно с поддержанием активности соответствующих металл-зависимых ферментов.

Многие коферменты не «прикованы» к активному центру и могут свободно «приходить и уходить», выступая как бы вторым субстратом. Но если кофермент связан с активным центром сильными взаимодействиями (иногда даже настоящей полноценной химической связью), его удобно выделить специальным названием – простетическая группа, подчеркивая ее важность для существования сколь бы то ни было активного фермента.

Например, именно к простетическим группам относятся производные витамина В₂ – флавин мононуклеотид и флавин аденин динуклеотид. Белки, в состав которых входят данные простетические группы, имеют специальное название «флавопротеины», в человеческом организме их более 90! Многие ферменты с флавиновыми простетическими группами действуют в митохондриях клеток, обеспечивая энергетический баланс клеток.

Так, (электронпереносящий флавопротеин) – дегидрогеназа (или сокращенно ETF-дегидрогеназа) относится к классу оксидоредуктаз и помогает «посадить» электроны из матрикса (внутренности) митохондрий на специальный «корабль» – мембранный переносчик электронов убихинон (тоже кофермент, о нем поговорим ниже). Если в гене, кодирующем ETF-дегидрогеназу, случается поломка, развивается генетическое заболевание – глутаровая ацидимия второго типа, которая в легких случаях может приводить к низкому уровню глюкозы в крови, а в тяжелых – к грубым порокам развития.

Помимо флавинадениндинуклеотида ETF-дегидрогеназа содержит еще один кофактор – железосерные кластеры. Эти конструкции, состоящие из нескольких атомов от самого простого, в котором есть всего лишь 1 атом железа [1Fe – 0S] к наиболее распространенным кластерам на 4, 7 и 8 атомов – [2Fe – 2S], [3Fe – 4S], [4Fe – 4S] соответственно, вероятно, были первыми из всех известных коферментов и поддерживали жизнь на заре ее зарождения. Железосерные кластеры принимают участие во многих базовых биологических процессах. Помимо окислительно-восстановительных процессов в митохондриях, рассмотренных выше, кластеры задействованы в метаболизме ДНК. Многие ферменты, такие как праймазы, лигазы, полимеразы, нуждаются в железосерных кластерах для поддержания активности.

Возвращаясь к простетическим группам, отметим, что и производные витамина В₁ (а именно тиаминпирофосфат), и В₆ (пиридоксаль фосфат), и витамин В₇ (биотин) тоже выступают в энзимологии как простетические группы.

А как же известные коферменты, которые «приходят и уходят»? Один из самых известных коферментов – это, конечно, производное витамина В₃ никотинамид аденин динуклеотид, или сокращенно НАД. Это, без ложной скромности, один из центральных коферментов всего метаболизма, который задействован в сотнях процессов по всему организму, преимущественно в реакциях обмена углеводов, белков и жиров.

Другой значимый кофермент – кофермент А, производное витамина В₅ (пантотеновой кислоты), задействован в самом главном цикле метаболизма – цикле Креббса (мы его немного упоминали в главе про витамины). Кроме этого он задействован в биосинтезе жиров. Во всех случаях кофермент А помогает переносить кислотные остатки с одной молекулы на другую.

Благодаря массовой маркетинговой компании вы также можете быть знакомы с коэнзимом Q10 – или, если выражаться на русском языке, коферментом Q10. Ему приписывают буквально чудотворные средства при приеме в виде БАД, но на самом деле Q10 – лишь один из представителей большой группы коферментов убихинонов, которые присутствуют в митохондриях. Вы с ними уже частично познакомились при обсуждении флавопротеинов.

Помимо поддержания энергетического баланса клетки убихиноны являются антиоксидантами, то есть препятствуют окислительному стрессу. Так что да, молекула безусловно полезная, она широко представлена в пищевых продуктах, особенно в мясе и рыбе (например, в скумбрии).

Использование ферментов в практических задачах, будь то крупные производства или отдельные эксперименты, требуют от белков сколь бы то ни было удовлетворительной стабильности, то есть неизменности строения и свойств во времени. И вот здесь возникают определенные проблемы. Ферменты функционируют в живых системах и не предназначены изначально для работы в условиях завода. Потеря стабильности приводит к необратимой инактивации фермента, то есть потери способности ускорять реакции.

Исследователи выделяют различные типы стабильности белков. В первую очередь мы говорим о стабильности ферментов внутри самой клетки. Глобулярные белки существенно различаются по времени жизни в организмах (обычно от 2 до 200 часов), и когда час пробил, все они подвергаются процессу протеолиза, то есть расщепления полипептидной цепи на части. К настоящему времени не выявлено корреляции между стабильностью белков в клетках и их молекулярными параметрами, например массой молекулы или структуры.

Зато было обнаружено, что в короткоживущих белках часто присутствуют специальные «метки» – так называемые сигнальные аминокислотные последовательности. По смыслу они напоминают наклейки «съешь меня» и передают сигнал специальным ферментам-«убийцам» – протеазам – о необходимости скорейшего расщепления «меченого» белка. Некоторые сигнальные последовательности обуславливают очень короткую жизнь белка, до 3 минут, в то время как другие последовательности служат «оберегом» от расщепления на долгие часы.

Если же мы вернемся из живой системы в реальный технологический процесс, то потеря активности фермента может подразумевать различные механизмы, среди которых:

1) агрегация;

2) нарушение сети химических связей (разрывы или наоборот образование новых связей);

3) потеря простетической группы или кофактора;

4) и даже «налипание», то есть сорбция[6] на стенках реактора!

Рассмотрим этот процесс на примере одного из самых распространенных механизмов – агрегации. На бытовом уровне агрегацию наблюдал всякий, кто решил сварить пельмени, не помешивая их как следует. Незадачливого повара ждет настоящий «ком» из слипшихся пельменей, и вид такого блюда вряд ли кого-либо обрадует. Для белков все примерно так же. На первом этапе под действием какого-то агрессивного внешнего фактора из нативной глобулы белка образуется промежуточный «развернутый» белок с искаженной структурой. На втором этапе «развернутые» молекулы образуют агрегаты, «слипшиеся» за счет слабых межмолекулярных взаимодействий. В агрегате могут присутствовать десятки, сотни и даже тысячи молекул. Да уж, представьте только ком из тысячи пельмешек… Лучше на себе не проверять!

Решение проблемы стабильности ферментов в технологических процессах остается актуальной задачей для многих исследователей. Здесь еще много пространства для открытий и достижений.