От оргазма до бессмертия. Записки драг-дизайнера

Самая интересная конформация

Вот уже несколько раз упоминалось, что у активных аналогов пептидов циклизация закрепляет «правильную» трехмерную структуру. Именно эта конформация узнается молекулами, с которыми пептиды связываются — рецепторами, — в результате чего запускается каскад биохимических реакций, который приводит к тому или иному физиологическому эффекту. Поэтому знание «правильной» конформации данного пептида очень важно для направленного драг-дизайна.

Драг-дизайнеры поняли это давно и даже заблаговременно дали название такой конформации: биологически активная, или конформация на рецепторе (receptor-bound). Выяснить пространственное строение биоактивной конформации данного пептида можно, сравнив наборы возможных трехмерных структур нескольких активных и неактивных аналогов: у всех активных аналогов в них найдется биоактивная конформация, а у неактивных она будет отсутствовать. Из-за гибкости коротких пептидных цепочек в растворе экспериментальные методы, дающие представление лишь об усредненных структурах аналогов, здесь не подойдут. Остаются методы теоретические — конформационные расчеты.

И поскольку такая технология в нашей группе была налажена, модели биологически активных конформаций энкефалина, ангиотензина и других пептидов не заставили себя ждать. Тогда мы базировались в основном в Риге, в Институте органического синтеза, и наши коллеги, пептидные химики активно использовали эти модели для синтеза новых аналогов. Во многих случаях — но не всегда — им сопутствовал успех. Расчетные модели с предсказаниями тех же конформаций для тех же пептидов появились и за рубежом; по большей части — но, опять-таки, не всегда — они совпадали с нашими.

Концепция концепцией — но прямого эксперимента, подтверждающего, что именно благодаря конформации пептид выбирает взаимодействие с тем или иным специфическим рецептором, поставлено не было. Мы провели его только через несколько лет, когда я работал уже в Сент-Луисе. Первые четыре аминокислоты заинтересовавшего нас линейного семичленного пептида напоминали последовательность энкефалина, а о фрагменте, состоящем из четырех последних аминокислот (фрагменты пересекались), было известно, что он обладает эффектом холецистокинина, пептида, регулирующего выброс желчи в кишечник. В положениях 2 и 5 этого пептида разместили неприродные аминокислоты; тем не менее он прочно связывался с рецепторами холецистокинина, не обращая внимания на опиоидные рецепторы, с которыми взаимодействует энкефалин. Но как только боковые цепи в положениях 2 и 5 чуть-чуть модифицировали и замкнули валентную связь между ними, получившееся циклическое соединение столь же прочно связалось с опиоидными рецепторами, игнорируя рецепторы холецистокинина. При этом по химическому строению линейный пептид от циклического отличался минимально: лишь одна функциональная группировка была заменена на другой атом.

Разумеется, до того как планировать синтез нового пептида, конформационные расчеты подтвердили, что цикл 2-5 способен принять пространственную структуру, подобную предсказанной ранее биологически активной конформации энкефалина. Вообще, эта работа еще раз продемонстрировала необходимость тесного сотрудничества расчетчиков, химиков и биологов из разных лабораторий и даже разных стран. Впрочем, слово «даже» тут неуместно: ведь нет науки белорусской, латышской, российской или американской — наука едина и только единой и может существовать. В данном случае расчеты и химический синтез были проведены у нас в Вашингтонском университете Сент-Луиса; там же, но на другой кафедре, прошла часть биологических испытаний; а остальные испытания осуществлялись в Канаде (Монреальский университет) и Франции (Университет в Монпелье). При этом участники руководствовались не меркантильными интересами — разве что возможностью опубликовать совместную статью, — а научным любопытством и, хотелось бы думать, взаимной симпатией.

К началу двадцать первого столетия представление о биологически активной конформации было центральным в драг-дизайне пептидов. Вновь синтезированные аналоги старались воспроизвести ее, поскольку считалось, что именно она реализуется на поверхности рецептора. Однако так ли это на самом деле, не знал никто: слишком мало было известно о второй половинке пары «пептид-рецептор» — о рецепторе. По существу, в силе оставались еще положения основателя фармакологии Пауля Эрлиха о том, что лекарство непосредственно действует лишь на некоторые вполне определенные точки на поверхности клетки, начиная с которых его эффект распространяется на всю клетку и далее — на весь организм. (В 1908 году Эрлих — совместно с Ильей Мечниковым — был удостоен Нобелевской премии за работы по иммунологии.) Такие точки и называли рецепторами — без особой детализации их химического состава и механизма действия. Примерно на таком же уровне использовался этот термин и в драг-дизайне XX века.

А когда стало, наконец, ясно, что рецепторы — это отдельные белковые молекулы или их комплексы, и когда удалось установить их пространственные особенности, драг-дизайн получил новый импульс к развитию.

Наконец-то рецепторы

Те, кто читал произведения писателя и публициста Александра Солженицына (тоже, между прочим, лауреата Нобелевской премии — никуда от нее не деться в нашем сочинении), опознали, быть может, заголовок одного из разделов его многотомного «Красного колеса»: восторженное восклицание «Наконец-то революция!». Действительно, сведения о пространственных структурах рецепторов означали революцию в драг-дизайне — ведь теперь появилась возможность направленного конструирования молекул лекарственных средств с учетом конформаций не только их самих, но и взаимодействующих с ними рецепторов.

Некоторые лекарства действуют в организме прямым способом — например, аспирин (ацетилсалициловая кислота), изменяющий кислотно-щелочной баланс крови, или некоторые антибиотики, буквально разъедающие мембрану бактерий. Но большинство лекарственных препаратов вызывает физиологическую реакцию, лишь связавшись предварительно с рецепторами. По оценкам 2018 года, около 35 процентов всех лекарств, разрешенных к применению в США и Европе (не менее семисот наименований), действуют через так называемые рецепторы, сопряженные с G-белками, — о них в дальнейшем будет говориться весьма подробно. Вторым по величине классом рецепторов для уже существующих лекарств являются ферменты киназы (30 процентов); за ними следуют ионные каналы (18 процентов) и так называемые ядерные рецепторы (16 процентов). Все это — белки или комплексы белков. Пространственные структуры их молекул — при условии, что они известны, — могут выполнять в драг-дизайне роль мишеней для поиска новых соединений-лигандов, предположительно взаимодействующих с ними.

Эта новая постановка задачи драг-дизайна в каком-то смысле напоминает ситуацию, возникшую с появлением пептидных библиотек, синтетических или фаговых. Если раньше драг-дизайнеры подбирали структуру соединения, оптимальную для данной биологической функции, то теперь они получили возможность находить биологические функции, свойственные (или нет) соединениям с данной структурой. Точно так же, если раньше оптимальная конформация пептидного лиганда определялась лишь по косвенным результатам биологического тестирования, теперь ее можно было подобрать по соответствию заранее известным моделям белковых мишеней.

Первыми были определены трехмерные структуры белков из семейства киназ — еще в конце семидесятых годов. Но настоящее их использование в драг-дизайне началось только в новом столетии. Знание пространственной структуры мишени позволило проводить процедуру молекулярного докинга — компьютерной стыковки молекул мишени и лиганда с расчетом энергии взаимодействий во всех возможных расположениях этой пары. Предполагалось, что реальная модель комплекса двух молекул должна соответствовать их расположению с наименьшей энергией.

С вычислительной точки зрения процедура докинга более сложна, чем обычные конформационные расчеты. Дело в том, что общая энергия взаимодействия двух молекул должна включать еще и внутримолекулярные энергии каждой из них. Но под воздействием первой молекулы конформация второй может измениться и, наоборот, вторая молекула будет влиять на первую. К тому же эти воздействия будут разными в зависимости от взаимного расположения молекул. Одним словом, снова оказалось невозможным обойтись без уже привычного средства — дальнейшего упрощения выражений для расчета энергии.

И их упростили — до такой степени, что рассчитывали уже не энергию, а некую условную скоринг-функцию, численную оценку стабильности комплекса «мишень-лиганд» при разных взаимных расположениях обеих молекул. Зато просмотр всех возможных расположений лиганда относительно мишени производился достаточно быстро, и можно было осуществить докинг большого количества потенциальных лигандов при сравнительно небольших затратах вычислительных ресурсов. Наилучшие значения скоринг-функций для каждого из лигандов затем, в свою очередь, ранжировались, и те лиганды, которые занимали первые места, рекомендовались химикам для синтеза. О скрининге — массовом тестировании большого количества химических соединений для отбора лучшего из них по физиологическому эффекту или по связыванию с рецептором — уже говорилось ранее. Описанную процедуру компьютерного докинга большого количества химических соединений с отбором наиболее перспективных лигандов для заданной мишени называют виртуальным скринингом. И докинг, и виртуальный скрининг сейчас прочно вошли в арсенал драг-дизайнеров, благо различные виды компьютерных программ для докинга легко найти на интернете. Последний по времени из известных мне примеров виртуального скрининга (февраль 2019 года) проанализировал ни много ни мало — сто семьдесят миллионов соединений.

А в научном русскоязычном жаргоне укоренились новые англоамериканизмы: скрининг, скоринг, докинг... И это объяснимо: краткий иноязычный термин использовать удобнее, чем многословное отечественное описание метода, ранее вовсе не существовавшего. Например, «скоринг», процесс присвоения каждому взаимному пространственному расположению лиганда и мишени цифровой характеристики, по которой и проводится в дальнейшем их классификация, — русский эквивалент этому слову вряд ли найдется. С другой стороны, «отбор» ничем не отличается от «скрининга», а «докинг» уже пытаются заменить выражением «молекулярная стыковка». Однако во времена, когда «товароведа» окончательно вытеснил «мерчандайзер», эти попытки вряд ли окажутся успешными — и можно долго дискутировать, хорошо это или плохо для языка российского научного сообщества.

Впрочем, не будем застревать на терминологии и вновь обратимся к основной задаче драг-дизайна в новую эру: подобрать лиганд, эффективно взаимодействующий с пространственной структурой белковой мишени. Рентгеноструктурный анализ, ядерный магнитный резонанс, криоэлектронная микроскопия — все эти экспериментальные подходы сегодня в распоряжении драг-дизайнера. Если же по каким-то причинам молекулярную модель мишени не удается установить экспериментально, можно воспользоваться вычислительными методами. Идея гомологичного (гомологического) моделирования (или моделирования по гомологии) белков предполагает, что молекулы белков, принадлежащие к родственным эволюционным семействам и имеющие схожие аминокислотные последовательности, будут обладать и похожими пространственными структурами. А раз так, то можно воспроизвести еще не определенную экспериментально конформацию белка, уложив его аминокислотную последовательность на трехмерный «шаблон» родственного белка с уже известной трехмерной структурой. Это не так легко, но многие компьютерные программы — опять-таки, доступные в интернете — с этой задачей справляются. Там же, в интернете, существует и обширная коллекция шаблонов: в Банке данных о белках (Protein Data Bank, PDB) на сегодняшний день (в феврале 2019 года) содержится более ста тридцати семи тысяч пространственных структур белков и их фрагментов.

Но белковых структур, имеющих отношение к самому большому классу мишеней для существующих лекарств — рецепторам, связанным с G-белками, — в Банке всего около трехсот. Между тем этот класс белков наиболее интересен для драг-дизайна: напомним, 35 процентов лекарственных препаратов связываются именно с ними. Огромные белковые молекулы (в их цепочках насчитывается от трех до пяти сотен звеньев) пронизывают толщу клеточной мембраны и служат как бы посредниками между тем, что происходит снаружи клетки, и тем, что происходит внутри. Лекарства связываются с той их частью, что расположена с внешней стороны мембраны, а части рецепторов, доступные с внутренней стороны, взаимодействуют с комплексами особых G-белков, которые и инициируют разнообразные биохимические реакции уже в самой клетке. Как именно функционирует весь этот молекулярный механизм, пока ясно не во всех деталях; но известно стало уже многое.

Опять семерка

Выражение «рецепторы, сопряженные с G-белками», как легко догадаться, еще одна калька — на сей раз с англоязычного G-protein-coupled receptors. В начале двухтысячных мне довелось выступать в московском академическом институте с докладом, где упоминались и эти рецепторы. Выступал я, естественно, по-русски, а надписи на слайдах были по-английски, и когда дело дошло до G-protein-coupled receptors, я запнулся — не знал соответствующего русского термина. Мне подсказали — и тут-то я и услышал впервые словосочетание «рецепторы, сопряженные с G-белками». Длинновато, подумал я, и после выступления спросил у коллег, нет ли общепринятого краткого обозначения данного семейства белков, наподобие английского GPCRs. Да нет, ответили мне, разве что «серпентины» или «семиспиральные» — но так ли уж нужно сокращенное название?

Слово «серпентины» ведет свое происхождение от «серпент» — змея по-французски и по-английски; серпантином словари называют узкую вьющуюся ленту или горную дорогу с резкими поворотами. Структура белков, о которых идет речь, в самом деле отдаленно напоминает такую дорогу: белковая цепочка пересекает мембрану, затем разворачивается на сто восемьдесят градусов и снова ее пересекает; так повторяется шесть раз.

Схематическое изображение семиспирального рецептора, встроенного в мембрану

Мембрана состоит из липидов, веществ, не растворимых в воде; поэтому в семи участках аминокислотной последовательности рецептора, внедренных в мембрану, преобладают аминокислоты гидрофобные, избегающие контактов с водой. Обычно длина этих участков около двадцати-тридцати аминокислот; чтобы полностью помститься в толще мембраны, им нужно принять конформацию уже знакомой нам альфа-спирали — цилиндра, в котором каждая четвертая аминокислота взаимодействует друг с другом. Семь спиралей-цилиндров, в свою очередь, формируют плотный пучок, пронизывающий мембрану насквозь — так называемый трансмембранный сегмент (ТМ-сегмент). Каждая последовательная пара цилиндров соединяется петлями — три петли торчат с наружной стороны мембраны и три с внутренней. Кроме того, мембраны выступают еще два фрагмента белковой цепочки — начальный (снаружи) и концевой (внутри). Эти фрагменты свободны от взаимодействий с мембраной, конформационные особенности различаются от рецептора к рецептору; структурный же мотив трансмембранного сегмента — упаковка из семи спиралей — повторяется для всех серпентинов, они же семиспиральные белки.

То, что спиралей именно семь и что они пересекают мембрану, можно было догадаться уже по аминокислотной последовательности этих рецепторов: в ней достаточно отчетливо выделялись семь гидрофобных участков. Но как они упакованы в пространственной структуре ТМ-сегмента, оставалось неясным. Для того чтобы использовать могучие методы рентгеноструктурного анализа, следовало сначала вырастить правильные кристаллы белков, а для этого выделить их молекулы в чистом виде. «Выделить» в представлении биохимиков догеномной эры означало вытащить молекулы рецепторов из мембраны и освободить их от прилипших к ним липидов. Останется ли после этой процедуры их пространственная структура той же, какой она была в липидном окружении, можно было лишь надеяться. Кроме того, кристаллизация требует высокой концентрации белка, а значит, надо переработать немалое количество исходного продукта — тканей из организмов животных.

Вот так и получилось, что первым 7-ТМ-рецептором (употребим и такой термин), трехмерная структура которого была установлена рентгеноструктурной кристаллографией, стал бычий родопсин, белок сетчатки глаза, — этих отходов на любом мясокомбинате сколько угодно. Для других рецепторов подобных источников не нашлось — и белковые химики провели несколько лет в попытках синтезировать их аминокислотные последовательности. Попытки не принесли успеха: гидрофобные участки последовательности плохо растворялись в воде, из-за чего процесс синтеза практически останавливался.

(Справедливости ради можно отметить, что первым семиспиральным белком, конформация которого была экспериментально установлена, был бактериородопсин, белок, выделенный из мембран бактерий. Но он не взаимодействует с G-белками и, соответственно, не может считаться полноценным ТМ-рецептором.)

Новый подход к получению мембранных белков появился с открытием семейства генов, в которых была закодирована последовательность семиспиральных рецепторов. Лаборатория Роберта Лефковица в Северной Каролине давно занималась мембранными рецепторами, в частности бета-2-адренергическим рецептором (β2AR), с которым связывается адреналин. Брайану Кобилке, молодому сотруднику Лефковица, удалось изолировать ген, кодирующий рецептор, и клонировать этот белок с его помощью. Вставив в аминокислотную последовательность рецептора дополнительный белок — лизоцим, — исследователи получили молекулу, достаточно устойчивую для кристаллизации и последующего изучения средствами рентгеноструктурного анализа. В отношении трехмерной структуры β2AR оказался весьма похожим на родопсин — те же семь цилиндров, упакованных в трансмембранный пучок; лишь конформации петель, соединяющих цилиндры, у двух рецепторов были разными.

Напрашивался следующий вывод: возможно, найден общий принцип структурной организации всего громадного семейства рецепторов, сопряженных с G-белками, — а в нем на сегодняшний день насчитывается уже около тысячи белков, и это только в организме человека. Ни одно из других семейств белков, закодированных в геноме, не достигает таких размеров. Рецепторы различаются как функционально, по лигандам, с которыми они связываются, так и по эволюционным подсемействам, к которым принадлежат. Но по структурным особенностям — по строению трансмембранного сегмента — они могут быть близки друг другу.

Это предположение не замедлило подтвердиться экспериментально. Путь, намеченный открытием трехмерной структуры β2AR, оказался плодотворным: на начало 2019 года были установлены пространственные структуры пятидесяти девяти рецепторов — и все они характеризовались семиспиральным трансмембранным пучком. В некоторых кристаллах содержались также лиганды, что позволило более подробно изучить факторы их взаимодействия с рецепторами. В двух-трех лабораториях этот процесс был поставлен на поток — но тем не менее причины, затруднявшие экспериментальное исследование конформационных свойств рецепторов ранее, остались теми же и теперь. Поэтому каждая новая структура давалась за счет кропотливого труда и немалой изобретательности — и публикации о ней, как правило, появлялись в самых престижных научных журналах.

Схематическое изображение комплекса β2AR с G-белком

Но статья в одном из июльских номеров журнала Nature за 2011 год выделялась даже на этом фоне. В ней группа Брайана Кобилки из Стэнфордского университета в Калифорнии сообщала об экспериментально установленной структуре целого агрегата: β2AR в комплексе со своим лигандом и, главное, вместе с соответствующим ему G-белком. Впервые удалось «увидеть» реальную картину того, как рецептор взаимодействует с G-белком с внутренней стороны клеточной мембраны и как G-белок в результате этого взаимодействия может перестроиться с изменением пространственного расположения отдельных его субъединиц. Молекулярный механизм действия лиганда — то есть, с точки зрения драг-дизайна, лекарства — прояснился в значительной степени.

Теоретики с топором

Для объяснения молекулярных механизмов действия мембранных рецепторов можно использовать и более простую аналогию «ключ — замок»: она лежит на поверхности. Действительно, молекула лиганда так же избирательна по отношению к своему специфическому рецептору, как ключ по отношению к замку. Далее, замок узнает свои ключ главным образом по форме; а рецептор узнает лиганд по его пространственной структуре. И наконец, в результате взаимодействия ключа и замка внутренняя организация замка изменяется: штифты и пружинки перемещаются, и замок отпирается. Что-то изменяется и внутри молекулы рецептора — но что именно?

Родопсин, рецептор зрения, для такой аналогии подходит лучше всего. К боковой цепи одной из аминокислот родопсина, расположенной в седьмой, последней спирали (ТМ7), прикреплено небольшое фоточувствительное соединение, называемое ретиналем. В темноте ретиналь в родопсине существует в компактной изогнутой форме, но, поглотив квант света — фотон, — он распрямляется (ключ в замке поворачивается) и отделяется от белка (ключ вынимается). Никаких других изменений в химической структуре родопсина не происходит — но его пространственная структура изменяется.

Рентгеноструктурный анализ сначала установил способ упаковки семи спиралей родопсина в темновом, неактивном состоянии. До такого же детального определения активной структуры родопсина прошло еще несколько лет — а тем временем было выдвинуто множество теоретических моделей этой структуры, призванных объяснить уже известные факты. Мы в Сент-Луисе тоже приняли участие в этом соревновании гипотез.

Как обычно, первым делом надо было упростить модель родопсина до предела, но так, чтобы не потерять самые важные его структурные особенности. Мы рассмотрели все возможные повороты каждой из семи спиралей вокруг их длинных осей, перпендикулярных мембране, в двух вариантах: с изогнутым и распрямившимся ретиналем. Расчеты энергии показали, что, когда ретиналь изогнут (родопсин неактивен), упаковка ТМ-сегмента, найденная рентгеноструктурным анализом, соответствует конформационному состоянию с наименьшей энергией. Но если он распрямлен (родопсин активен), лучшей оказывается упаковка, где одна из спиралей — шестая, ТМ6 — существенно повернута вокруг своей оси. При этом начальные и конечные фрагменты ТМ6 оказываются несколько отодвинуты в сторону от всего пучка спиралей.

Откровенно говоря, эта расчетная модель была довольно примитивной; но главную тенденцию конформационных изменений при активации родопсина сдвиг спирали ТМ6 — она уловила правильно. Последовавшая затем рентгеновская кристаллография активного родопсина обнаружила похожую картину: расположенные с внутренней стороны мембраны концы спиралей ТМ5 и ТМ6 изменили положение, отодвинувшись от семиспирального пучка, и открыли «карман» для взаимодействия с G-белком. Именно этот механизм, перемещение «внутренних» концов ТМ-спиралей при активации, был подтвержден и экспериментальными исследованиями других рецепторов, сопряженных с G-белками; Брайан Кобилка зафиксировал тот же эффект в β2AR.

Схематическое изображение ретиналя, встроенного в ТМ-сегмент родопсина, и перестройка молекулы ретиналя при поглощении фотона

Теоретик за работой

Сейчас, однако, очевидно другое. Рентгеноструктурная кристаллография, ядерный магнитный резонанс, криоэлектронная микроскопия, пептидные и фаговые библиотеки — с появлением каждого из этих экспериментальных методов открывались совершенно новые горизонты исследований. Эксперименты в молекулярной биофизике стали более сложными и тонкими, способными установить мельчайшие детали строения молекул, вплоть до точного измерения расстояний между тысячами атомов. Гипотезы же и модели, генерируемые теорией, остались по большей части грубыми, скорее качественными, чем количественными. Но зато теория по-прежнему обладает важным преимуществом — ее грубые и неточные предсказания иногда оказываются верными.

Таким образом, «теоретики с топором» вновь продемонстрировали жизнеспособность своих грубых моделей: от предсказаний активных аналогов пептидов удалось перейти к предсказаниям, относящимся к рецепторам. Под эти победные фанфары хорошо бы и завершить повествование о текущих достижениях науки драг-дизайна, но результаты самых последних лет вновь поколебали уже вроде бы устоявшиеся представления о молекулярных механизмах взаимодействий лигандов особенно пептидных — и рецепторов.

Концепция не сдается

Пептидные биорегуляторы: энкефалин, ангиотензин, соматостатин, нейротензин — связываются почти исключительно с рецепторами, сопряженными с G-белками. За последние полвека были синтезированы сотни, если не тысячи аналогов этих пептидов, активных и неактивных.

Для десятков из них конформационные расчеты предложили вероятные пространственные структуры и предсказали их биологически активные конформации — те, по которым рецептор узнает свой специфический пептидный лиганд. Внутримолекулярная циклизация закрепила эти конформации, и во многих случаях циклические аналоги оказались способными взаимодействовать с рецепторами. Затем появилась возможность работать с рецепторами на молекулярном уровне — определять их трехмерное строение. Следующим естественным этапом должно было бы стать экспериментальное изучение комплексов «пептидный лиганд-рецептор» — но здесь процесс застопорился.

Прежде всего кристаллизовать рецептор в комплексе с природным пептидом оказалось чрезвычайно сложно. До сих пор удавались лишь единичные попытки: была определена, например, структура комплекса нейротензина (или его активного шестичленного фрагмента) вместе с его рецептором. Две группы исследователей, независимо получивших этот результат, пришли к разноречивым выводам относительно строения трансмембранного сегмента рецептора. По одним данным, спирали в пучке располагались в соответствии с «активной» моделью β2AR со сдвигом внутренних концов спиралей ТМ6 и ТМ5, а по другим — были ближе к «неактивной» модели. И положение молекулы нейротензина в комплексах было различным: пептидная цепочка лиганда в одном случае располагалась параллельно плоскости мембраны с внешней стороны рецептора, а в другом — внедрялась в «щель» между спиралями перпендикулярно плоскости мембраны. В обоих случаях, однако, пептид обладал вытянутой конформацией, а не компактной, как предполагалось проведенными ранее конформационными расчетами.

Вычислительные методы тоже внесли вклад в изучение комплексов пептидов и рецепторов. Еще в 2001 году мы, в частности, провели докинг биологически активной конформации ангиотензина и трехмерной модели рецептора ангиотензина. Оказалось, что концевой четырехчленный фрагмент ангиотензина в этой конформации может внедриться в «щель» между спиралями, перпендикулярную плоскости мембраны. Очень похожая ситуация обнаружилась в расчетах наших коллег из Кливленда, опубликованных в 2019 году. Правда, ориентации молекулы ангиотензина в этих двух работах отличались. И обе они отличались от положения ангиотензина в комплексе с рецептором, установленного, наконец, средствами рентгеноструктурного анализа в июле 2018 года. Во всех случаях, однако, конформация ангиотензина была вытянутой.

Но ведь предсказанная расчетом биологически активная конформация ангиотензина была не вытянутой, а компактной. Она позволила предсказать активные циклические аналоги ангиотензина, которые никак не смогли бы взаимодействовать с рецептором таким же образом, как природный линейный пептид, — влезть в тесную «щель» можно, только разорвав цикл. При этом циклоаналоги связываются с рецептором не менее прочно, чем сам ангиотензин...

Это же соображение справедливо и для других пептидных биорегуляторов — их биологически активные конформации, предлагаемые расчетом, тоже не вытянутые, а компактные, квазициклические. Они тоже не поместятся в «щели» между спиралями трансмембранных сегментов. Каков же тогда механизм образования комплексов пептидов и рецепторов и какова роль биологически активных конформаций пептидов в этом процессе?

Короткий ответ на этот вопрос: пока не знаем. Молекулярная биофизика еще не накопила достаточного количества данных, как экспериментальных, так и расчетных, чтобы решить эту проблему однозначно. Но порассуждать о вариантах ее решения можно уже сейчас — не забывая, однако, что здесь мы вступаем на зыбкую почву спекуляций. Впрочем, в науке они называются более благозвучным словом — гипотезы.

Можно, например, предположить, что сама концепция биологически активных конформаций, выдвинутая на основе конформационных расчетов пептидов, попросту неверна — мало ли ошибочных догадок высказывали теоретики. Возможно, приближаясь к рецептору, гибкая цепочка пептида (или ее концевой фрагмент) распрямляется и уже в таком виде образует комплекс с трансмембранным сегментом. А активные циклические аналоги, в которых биологически активная конформация зафиксирована, подвергаются атакам ферментов, разрывающих цикл на подходе к рецептору.

Сразу же, однако, возникают возражения. Во-первых, эти гипотетические ферменты пока не обнаружены. А во-вторых, тогда не понятно, как объяснить результаты прямого эксперимента, в котором внутримолекулярная циклизация — помните? — заставила пептид переключиться на взаимодействие с опиоидными рецепторами, но не с рецепторами холецистокинина. И как быть с множеством косвенных экспериментов — биологических испытаний аналогов пептидов, — подтверждающих существование биологической активности именно у определенной конформации молекулы?

И еще: если спиральные трансмембранные сегменты (их пространственная организация примерно одинакова в разных рецепторах) отбирают вытянутые конформации гибких пептидов (тоже примерно одинаковые), а не их уникальные более сложные биологически активные структуры, в чем тогда молекулярные основы специфичности взаимодействия пептидов и рецепторов? Как пептид энкефалин узнает, например, что предназначенный ему партнер — рецептор опиоидов, а не холецистокинина?

Одним словом, отказываться от идеи биологически активной конформации рановато. Особенно тем, кто, как автор этой книги, был среди первых, ее предложивших и обосновавших. Но зарекаться тем не менее не стоит: в науке любое утверждение не вечно. Судьба всех гипотез одинакова: зародившись как интуитивные соображения, они обрастают подтверждающими их фактами и превращаются в теории, пригодность которых проверяется достоверностью их предсказаний. Но рано или поздно появляются факты, необъяснимые в рамках данной теории; тогда приходит время ее отбросить и предложить новую, иногда совершенно противоположную предыдущей. Для логики развития науки это естественный процесс; однако для психологии и эмоций его непосредственных участников он бывает очень болезненным.

Что же касается обсуждаемых противоречий, с которыми столкнулась гипотеза о роли биологически активной конформации пептидов, то их, как мне кажется, можно устранить. В рецепторах, сопряженных с G-белками, есть не только трансмембранные сегменты, но и петли, соединяющие спирали с внешней стороны мембраны. В отличие от схожих между собой пучков спиралей, пространственные структуры этих петель различны в разных рецепторах. Так свидетельствуют данные рентгеноструктурного анализа — но есть один нюанс. Петли — цепочки величиной от пяти-шести до двадцати-тридцати аминокислот — представляют собой, по существу, те же гибкие пептиды, пусть и с закрепленными с двух сторон концами. Эти пептиды обладают целым спектром возможных конформаций, переходящих друг в друга. Кристаллизация «вымораживает» какую-то одну из этих конформаций, и то не всегда — зачастую четкую картину отражений рентгеновских лучей от петель так и не удается получить. Поэтому нельзя утверждать, что именно эта единственная «замороженная» конформация петель и есть самая характерная для данного рецептора — есть и другие. Но обнаружить их экспериментально так же трудно, как и отдельные — не усредненные — структуры гибкого пептида в растворе.

Зато можно выявить возможные структуры этих петель счетными методами — так же, как это делалось ранее с другими пептидами, концы которых не были закреплены. И здесь обнаружилось любопытное обстоятельство: активация рецепторов действительно может зависеть от конформаций их внешних петель. А это дает основания предположить, что биологически активная уникальная конформация пептида на первом этапе узнается не трансмембранным сегментом рецептора, а его внешними петлями, структуры которых также уникальны для каждого рецептора. И не пептид «подстраивается» под структуру рецептора, а гибкие петли подстраиваются под пептид, чем и объясняется специфичность взаимодействия. Это объясняет также особые трудности получения рентгеноструктурных данных о комплексах природных пептидов и их рецепторов: вполне возможно, что кристаллизуется не та единственная конформация петель, в которой они взаимодействуют с пептидом, а одна из других, тоже допустимых.

Самые свежие результаты рентгеноструктурного и криомикроскопического анализа не то чтобы подтверждают такое предположение, но и не противоречат ему. За последние два года описаны пространственные структуры комплексов семиспиральных рецепторов с эндотелином-1 (двадцать одна аминокислота в цепочке) и глюкагоном (двадцать девять аминокислот). Оба пептида представлены в комплексах не в вытянутых конформациях: концы эндотелина сближены, а глюкагон свернут в конформацию альфа-спирали. И оба взаимодействуют не столько со «щелью» между спиралями, сколько с длинными внешними петлями и начальными фрагментами рецепторов; у рецептора глюкагона, например, начальный участок, выдающийся из толщи мембраны, состоит из более чем ста аминокислот.

Не стоит, однако, опережать события. Структурная биология рецепторов развивается быстро, и изложенный сценарий молекулярного механизма взаимодействия с пептидными лигандами может быть подтвержден или опровергнут очень скоро. И очередная волна конструирования лекарств будет использовать сведения об их взаимодействии с семиспиральными рецепторами, недоступные в наши дни. И не только лекарств.

Писатель, разумеется, волен придумывать все, что угодно, но в этом эпизоде его фантазия не противоречит известным фактам нейробиологии запаха. По современным представлениям, молекулы ароматических веществ взаимодействуют с рецепторами так называемых обонятельных нейронов, связанных с головным мозгом, который определяет ощущения, испытываемые при этом организмом, будь то дискомфорт из-за запаха сероводорода, сексуальное возбуждение, вызываемое женскими духами, или — почему бы и нет — благодать. Тем более если запах новый и не ассоциируется с какими-то прошлыми воспоминаниями. Порог чувствительности к пахучим веществам у человека очень низок - в случае, например, ванилина он соответствует концентрации в две десятимиллионные миллиграмма на кубический метр. Чтобы запах ванилина почувствовали все люди, заполняющие площадь, потребовалось бы только около одной десятитысячной грамма - а ведь искусный парфюмер мог отыскать еще более эффективное ароматическое соединение. И поскольку никаким другим способом, кроме обоняния, определить его присутствие в воздухе было бы невозможно, мистическое настроение толпы, не понимающей, что с ней происходит, не так уж удивительно.

Удивительно другое: как обонятельным рецепторам а они принадлежат все к тому же семейству семиспиральных мембранных рецепторов — удается обнаружить ароматические вещества в столь низких концентрациях. Если пересчитать справочные данные по тому же ванилину в единицы концентрации, принятые в фармакологии, окажется, что они на несколько порядков ниже концентраций, характерных, например, для пептидных биорегуляторов. И тем не менее даже эти сверхмалые концентрации лиганда позволяют обеспечить образование его комплекса со своими специфическими рецепторами. А их в носу человека около пяти миллионов; у собаки, впрочем, их более двухсот миллионов. Даже нетренированная собака может учуять резкий запах на расстоянии двух-трех километров от его источника. Сотни собаковладельцев подтвердят, что их питомцы начинают ждать у квартирных дверей и повизгивать, когда хозяева еще только подходят к подъезду. Собаки же, специально тренированные, способны выполнять такие задания, что их успехи иногда становятся легендарными.

Но если чувствительность семиспиральных рецепторов настолько велика, что с их помощью можно унюхать даже нечистую силу, отчего бы не использовать это их качество истолкования других непонятных явлений? Например лозоходства, поиска подземных источников воды — помощью рамки, которая изменяет положение в руках экспериментатора, когда он приближается к такому источнику. Здесь теоретически возможно такое объяснение: обонятельные рецепторы улавливают мельчайшие изменения концентрации воды (или сопутствующих ей веществ) в воздухе, что вызывает бессознательную реакцию лозоходца на уровне непроизвольной моторики мышц его рук, из-за чего рамка и начинает поворачиваться.

Однако это уже не гипотезы и даже не спекуляции, а скорее фантазии на темы о дальнейших возможных направлениях науки о структурных свойствах рецепторов, сопряженных с G-белками. Можно назвать их мечтами, игрой воображения, как будто не слишком уместной в естественных науках, называемых также точными. Хотя кто-то из великих ученых — не то Карл Гаусс, не то Давид Гильберт — заметил об одном из своих бывших учеников: «Он стал поэтом — для математики у него не хватило воображения». Будем считать это оправданием.