Эпигенетика

Глава 4. Жизнь, какой мы знаем ее теперь

До сих пор наше повествование было сосредоточено, главным образом, на результатах, на явлениях, которые мы можем наблюдать и на основании этого делать выводы, что они происходят по эпигенетическим причинам. Но любой биологический феномен имеет под собой физическую базу, и именно ее мы обсудим в этой главе. Все эпигенетические явления, о которых мы говорили выше, являются результатами вариативности в экспрессии генов. Клетки сетчатки, например, экспрессируют совсем иной набор генов, чем, скажем, клетки мочевого пузыря. Но каким же образом различные типы клеток активируют или репрессируют разные группы генов?

Специализированные типы клеток в сетчатке и мочевом пузыре располагаются на самом дне двух разных впадин на эпигенетическом ландшафте Уоддингтона. Работы Джона Гердона и Шиньи Яманаки убедительно показали нам, что, какие бы механизмы ни использовали клетки для того, чтобы всегда оставаться в этих ложбинах, они не имеют никакого отношения к изменению исходного чертежа ДНК клетки. Он всегда остается постоянным и не подвергается корректировкам. Следовательно, активация и репрессия определенных наборов генов должно осуществляться с помощью какого-то другого механизма, причем такого, который мог бы оставаться в рабочем состоянии очень долгое время. Этот тезис не подвергается сомнению, поскольку нам известно, что некоторые клетки, такие, например, как нейроны головного мозга, относятся к настоящим долгожителям. Возраст нейронов мозга 85-летнего человека, к примеру, составляет около 85 лет. Они формируются в самом раннем детстве и остаются неизменными на протяжении всей жизни человека.

Но другие клетки ведут себя совсем иначе. Клетки верхнего слоя кожи, эпидермы, полностью заменяются приблизительно каждые пять недель в результате постоянного деления стволовых клеток в более глубоких слоях этой ткани. Из этих стволовых клеток всегда получаются только новые клетки кожи, а не, например, клетки мышц. Таким образом, система, поддерживающая определенные наборы генов в активированном или репрессированном состоянии, должна, кроме того, обладать механизмом, который может передаваться от родительской к дочерней клетке при каждом делении.

Возникает парадокс. С момента опубликования в середине 1940-х годов работы Освальда Эйвери и его коллег исследователям известно, что ДНК является клеточным веществом, переносящим нашу генетическую информацию. Если ДНК всегда одинакова в разных типах клеток человека, то, как могут невероятно точные комбинации экспрессии генов передаваться друг другу многими поколениями клеток при их делении?

И снова на помощь нам приходит уже ставшая привычной аналогия с актерами, читающими сценарий. Баз Дурман вручает Леонардо Ди Каприо шекспировский текст «Ромео и Джульетты», на котором режиссер написал от руки или напечатал собственные примечания — как расположить актеров, куда поставить камеру и много другой дополнительной рабочей информации. Лео делает себе фотокопию сценария, и все добавленные Базом Лурманом пометки копируются вместе с ним. Клэр Дейнз также получает свой экземпляр сценария «Ромео и Джульетты». Комментарии режиссера на нем иные, чем на сценарии ее партнера, и этот вариант текста пьесы также копируется. Вот таким образом и осуществляется эпигенетическая регуляция экспрессии генов — разные клетки имеют одинаковый чертеж ДНК (оригинальную авторскую пьесу), но несут в себе различные молекулярные модификации (режиссерский сценарий), которые при каждом делении клетки могут передаваться от материнской клетки к дочерней.

Эти модификации ДНК ничуть не меняют изначальную природу А, Ц, Г и Т в нашем генетическом сценарии, в нашем чертеже. Когда какой-либо ген активируется и копируется для образования мРНК, эта мРНК обладает точно такой же последовательностью, контролируемой правилами спаривания оснований, независимо от того, несет или нет этот ген в себе некие эпигенетические дополнения, Точно так же, когда ДНК копируется, чтобы образовать новые хромосомы для деления клетки, именно те же последовательности А, Ц, Г и Т копируются вместе с ней.

Но если эпигенетические модификации не меняют информацию, которую несут в себе гены, то для чего же они служат? Главным образом, они способны очень резко повлиять на то, насколько ярко будет экспрессироваться ген, и будет ли он экспрессироваться вообще. Эпигенетические модификации также могут передаваться следующим поколениям клеток при их делении, и благодаря этому механизм регуляции экспрессии генов в дочерней клетке остается тем же, каким он был в материнской клетке. Именно по этой причине стволовые клетки кожи могут развиться только в новые клетки кожи, но не в клетки какого-либо другого типа.

Первой обнаруженной эпигенетической модификацией было метилирование ДНК. Метилирование означает добавление метиловой группы к какому-либо другому химическому соединению, в данном случае к ДНК. Метиловая группа чрезвычайно крошечная. Она состоит всего лишь из одного атома углерода, присоединенного к трем атомам водорода. Ученые — химики описывают атомы и молекулы исходя из их молекулярной массы, причем атом каждого элемента имеет собственную, отличную от других атомов массу. В среднем, молекулярная масса пары оснований составляет около 600 Да (Да — это сокращение от «Дальтон», единицы измерения молекулярной массы). Метиловая группа имеет молекулярную массу всего лишь 15 Да. При присоединении метиловой группы масса пары оснований увеличивается на 2,5 процента. Это можно сравнить с приклеиванием виноградинки к теннисному мячу.

На рисунке 4.1 можно увидеть, как выглядит метилирование ДНК с точки зрения химии.

^{Рис. 4.1. Химическая структура одного из оснований ДНК, цитозина, и его эпигенетически модифицированной разновидности, 5-метилцитозина. С — углерод; Н — водород; О — кислород. Для упрощения схемы на ней намеренно не показаны некоторые атомы углерода, но они присутствуют там, где изображены две соединительные линии DNMT — это сокращенное обозначение ДНК-метилтрансферазы (от английского DNA (ДНК) methyltransferase). Различные DNMT представляют собой примеры эпигенетических «шифровальщиков», ферментов, создающих эпигенетический код. В большинстве случаев эти ферменты добавляют метиловую группу только к основанию Ц, за которым следует Г. Последовательность Ц и Г принято записывать как CpG.}

Здесь показано основание Ц, цитозин. Это единственное из четырех оснований ДНК, подвергаемое метилированию для получения 5-метилцитозина. «5» указывает место на кольце, к которому присоединяется метил, а не количество метиловых групп — она всегда одна. Такая реакция метилирования осуществляется в наших клетках, как и в клетках большинства других организмов, с помощью одного из трех ферментов — DNMT1, DNMT3A или DNMT3B.

Такое CpG-метилирование является эпигенетической модификацией, которая также может называться эпигенетической меткой. Химическая группа «наклеивается» на ДНК, но при этом не меняет присущую ей генетическую последовательность. Основание Ц подвергается скорее декоративной отделке, нежели капитальному ремонту. Учитывая, что модификация настолько мала, нам, пожалуй, следовало бы удивляться тому, что мы будем вновь и вновь встречаться с упоминанием этого явления на протяжении всей книги, равно как и тому, что без него не обходится ни одна дискуссия на темы эпигенетики. Объясняется это тем, что метилирование ДНК оказывает поистине огромное влияние на экспрессию генов и, в конечном итоге, на функции клеток, тканей и организмов в целом.

В начале 1980-х годов было доказано, что если вы ввели ДНК в клетки млекопитающего, то именно от уровня метилирования этой введенной ДНК будет зависеть, насколько активно она будет транскрибирована в РНК. Чем более метилированной оказывалась введенная ДНК, тем менее продуктивной была ее транскрипция[19]. Иными словами, была установлена прямая взаимосвязь между высокими уровнями метилирования ДНК и количеством репрессированных генов. Однако оставалось неясным, насколько это явление будет влиять собственные гены ядер клеток, а не на те, которые были введены в них.

Фундаментальная работа по определению роли метилирования в клетках млекопитающих была выполнена в лаборатории Эдриана Бёрда, который большую часть своей научной карьеры провел в Эдинбурге, любимом городе Конрада Уоддингтона. Профессор Бёрд является членом Королевского научного общества и научным сопредседателем фонда Wellcome Trust, чрезвычайно влиятельной благотворительной организации, финансирующей научные исследования в Великобритании. Он являет собой истинный образец классического британского ученого — удивительно скромного, даже незаметного обладателя изысканных манер, тихого голоса и тонкого чувства юмора. Совершенно не свойственное ему стремление к известности резко контрастирует с его ошеломительной международной репутацией, ведь во всем мире он признан крестным отцом механизма метилирования ДНК и его роли в регуляции экспрессии генов.

В 1985 году Эдриан Бёрд опубликовал в журнале Cell основополагающую статью, в которой показал, что большинство мотивов CpG не распределяются по всей ДНК случайным образом. Вместо этого, подавляющая часть пар CpG концентрируется непосредственно против хода транскрипции определенных генов, в области промотора[20]. Промоторами называются участки генома, в которых связываются транскрипционные комплексы ДНК и начинается копирование ДНК для образования РНК. Области с высокой концентрацией мотивов CpG называются островками CpG.

У приблизительно 60 процентов генов, кодирующих белки, промоторы располагаются внутри островков CpG. Когда эти гены активны, уровни метилирования в островках CpG низкие. Островки CpG оказываются высокометилированными только в тех случаях, когда эти гены репрессированы. Разные типы клеток экспрессируют различные гены, поэтому нет ничего удивительного в том, что модели метилирования островков CpG также различаются в клетках разных типов.

В течение некоторого времени не стихали оживленные дискуссии о том, что же должна означать такая взаимозависимость. Это были старые добрые споры о том, что является причиной, а что — следствием. По одной из версий, метилирование ДНК представляет собой, по сути, историческую модификацию — сначала гены были подавлены неким неизвестным механизмом, а затем ДНК стала метилированной. Согласно этой модели, метилирование ДНК было следствием репрессии генов. Представители другой точки зрения доказывали гипотезу о том, что сначала островок CpG стал метилированным, а уже потом это метилирование вызвало репрессию гена. В таком случае именно эпигенетическая модификация является причиной изменений в экспрессии генов. Хотя и сегодня время от времени вспыхивают яростные споры по этому вопросу между конкурирующими лабораториями, подавляющее большинство занимающихся этой темой ученых сходятся во мнении, что данные, накопленные за четверть столетия, прошедшую после опубликования статьи Эдриана Бёрда, свидетельствуют в пользу второй, каузальной версии. В большинстве случаев метилирование островка CpG в начале гена подавляет его.

Эдриан Бёрд продолжил исследования этого процесса. Он показал, что когда происходит метилирование ДНК, она связывает белок, называемый МеСР2 (от английского Methyl CpG binding protein 2 — метил CpG связывающий белок 2)[21]. Однако этот белок не связывает неметилированные мотивы CpG, что должно показаться нам довольно удивительным, если мы вернемся к рисунку 4.1 и задумаемся, насколько похожи метилированные и неметилированные формы цитозина. Ферменты, добавляющие метиловую группу к ДНК, выше уже были названы «шифровальщиками», составителями эпигенетического кода. МеСР2 не привносит какие-либо модификации в ДНК. Роль его состоит в том, чтобы позволить клетке интерпретировать имеющиеся модификации на каком-либо участке ДНК. МеСР2 являет собой пример «дешифровщика», читателя эпигенетического кода.

Когда МеСР2 связывается с 5-метилцитозином в промоторе гена, он одновременно выполняет и другие функции. Он притягивает к себе другие белки, также способствующие подавлению определенного гена[22]. Кроме того, он может остановить связывание транскрипционного механизма ДНК с промотором гена, а это, в свою очередь, останавливает продукцию информационной молекулы мРНК[23]. На участках, где гены и их промоторы очень сильно метилированы, связывание МеСР2 выглядит как часть процесса, при котором этот участок хромосомы почти навсегда перестает функционировать.

ДНК становится невероятно туго закрученной, и механизм транскрипции генов не может получить доступа к парам оснований для создания копий мРНК.

Это одна из причин, по которой метилирование ДНК настолько важно. Помните, мы говорили о том, что возраст нейронов головного мозга 85-летнего человека практически равен возрасту их хозяина? На протяжении восьми с лишним десятилетий благодаря метилированию ДНК некоторые участки генома остаются в чрезвычайно туго сжатом состоянии, что позволяет нейронам полностью подавлять определенные гены. Именно поэтому клетки нашего головного мозга никогда не продуцируют, например, гемоглобин или пищеварительные ферменты.

А как насчет другой ситуации—тех же самых стволовых клеток кожи, которые делятся чрезвычайно часто, но производят при этом всегда только новые клетки кожи, а не клетки каких-либо других типов, например костные? В данном случае, схема метилирования ДНК передается от материнской клетки дочерним клеткам. Когда половинки двойной спирали ДНК разделяются, каждая из них копируется по принципу спаривания оснований, в чем мы убедились в главе 3. На рисунке 4.2 показано,-что происходит, когда такая репликация выполняется на участке, где метилированию подвергается основание Ц в паре CpG.

^{Рис. 4.2. На этой схеме показано, каким образом может быть сохранена модель метилирования ДНК при ее репликации. Метиловая группа представлена черным кружком. После разделения двойной спирали родительской ДНК на этапе 1 и репликации обеих цепочек ДНК на этапе 2 новые цепочки «проверяются» ферментом ДНК-метилтрансфераза 1 (DNMT1). DNMT1 может определить, что метиловая группа на каком-либо цитозиновом мотиве одной цепочки молекулы ДНК не соответствует только что синтезированной цепочке. Тогда DNMT1 переносит метиловую группу на новую цепочку (этап 3). Это происходит только в тех случаях, когда основания Ц и Г стоят друг за другом в мотиве CpG. Благодаря этому процессу обеспечивается сохранение модели метилирования ДНК при ее репликации и делении клетки.}

DNMT1 способен определить, метилирован ли мотив CpG только на одной цепочке. Когда DNMT1 обнаруживает этот дисбаланс, он восстанавливает «пропущенное» метилирование на только что скопированной цепочке. Таким образом, дочерние клетки в итоге получат те же модели метилирования ДНК, какие были у родительской клетки. Как следствие, они будут подавлять те же гены, что и родительская клетка, и клетки кожи всегда будут оставаться клетками кожи.

Эпигенетика имеет обыкновение проявлять свое влияние там, где ученые никогда и не ожидали. Один из наиболее интересных примеров этого за последние годы непосредственно связан с МеСР2, белком, считывающим метки метилирования ДНК. Несколько лет назад широкой популярностью пользовалась ныне дискредитировавшая себя теория о том, что вакцина против кори вызывает аутизм, и самые разные СМИ уделяли ей просто невиданное внимание. Одна весьма уважаемая британская газета в мельчайших подробностях описывала на своих страницах вызывающую дрожь историю некой маленькой девочки. В младенческом возрасте ей были сделаны все обычные в таких случаях прививки. Вскоре после прививки от кори, которую она получила незадолго до своего первого дня рождения, она начала быстро деградировать, утрачивая большую часть навыков, которые успела приобрести к тому времени. На момент написания статьи девочка приближалась уже к четырехлетнему возрасту, и автор газетной публикации уверял, что ей присущи такие тяжелые симптомы аутизма, которых ему прежде не доводилось и видеть. У нее не развивалась речь, обнаруживалась устойчивая неспособность к обучению, а те немногие действия, которые ей давались, отличались итеративностью (например, она уже не тянула ручку за едой). Прогрессирование этого невероятно тяжелого заболевания, несомненно, было настоящей трагедией и для нее, и для ее семьи.

Но читатель, хоть сколько-нибудь сведущий в нейрогенетике, при изучении этой статьи непременно обратил бы внимание на два момента. Первая странность заключалась в том, что для девочек очень нехарактерно — не то что бы невозможно, но крайне маловероятно — демонстрировать такую тяжелую форму аутизма. В значительно большей степени это свойственно мальчикам. Второй факт, который должен был озадачить их, состоял в том, что описанные симптомы в мельчайших деталях соответствовали признакам редкого генетического заболевания, именуемого синдромом Ретта, вплоть до нормального развития в первые месяцы жизни и временем проявления характерных для этого недуга явлений. Лишь случайным совпадением является то, что симптомы синдрома Ретта, как, впрочем, и большинства типов аутизма, впервые обнаруживаются примерно в том самом возрасте, когда младенцам обычно делают прививку против кори.

Но какое отношение эта история имеет к эпигенетике? В 1999 году группа ученых, возглавляемая выдающимся нейрогенетиком Худой Зогби, из Медицинского института Говарда Хьюза в Мэриленде убедительно продемонстрировала, что большинство случаев синдром Ретта вызываются мутациями в МеСР2, гене, кодирующем «дешифровщика» метилированной ДНК. У детей, страдающих этим нарушением, присутствует некая мутация в гене МеСР2, а это значит, что у них не вырабатывается функциональный белок МеСР2. Несмотря на то, что их клетки сохраняют полную способность к нормальному метилированию ДНК, они не в состоянии правильно расшифровать эту часть эпигенетического кода.

Тяжелые клинические симптомы детей с мутацией МеСР2 являются более чем веским доказательством важности правильного прочтения эпигенетического кода. Сообщают они нам также и о другом. Не все ткани девочек с синдромом Ретта поражены в равной степени, так что, возможно, именно этот эпигенетический путь играет важную роль только в одних, а не во всех тканях. На том основании, что у больных девочек развивается тяжелая умственная отсталость, мы можем предположить, что для головного мозга очень важно иметь определенные количества нормального белка МеСР2. Учитывая, что другие органы этих детей, такие как печень или почки, оказались совершенно не затронуты, мы можем сделать вывод, что для них активность МеСР2 не играет, по-видимому, важной роли. Возможно, что и само метилирование ДНК не столь принципиально для этих органов, или может быть их ткани содержат другие белки, кроме МеСР2, способные читать эту часть генетического кода.

Пройдет некоторое время, и ученые, медики, родные и близкие детей, страдающих синдромом Ретта, с благодарностью воспользуются этими открытиями, позволяющими понять природу этого заболевания и найти эффективные способы его лечения. Для нас это более чем серьезный вызов, поскольку нам предстоит иметь дело с факторами, воздействующими на головной мозг в результате генетических мутаций, происходящих в процессе развития ребенка.

Одним из наиболее угнетающих аспектов синдрома Ретта является прогрессирующее слабоумие, присутствующее практически у всех больных. Никто не мог сказать наверняка, возможно ли решить такую связанную с неврологическим развитием проблему как слабоумие, если установлены причины ее возникновения, однако общее мнение не отличалось оптимизмом. И опять в нашей истории на первый план выходит Эдриан Бёрд. В 2007 году в журнале Science он в соавторстве с коллегами опубликовал выдающуюся статью, в которой показал, что синдром Ретта может быть обращен вспять, и доказательства этого уже получены в ходе экспериментов с мышами.

Эдриан Бёрд и исследователи его лаборатории создали клонированную линию мышей с инактивированным геном Меср2. Для этого они воспользовались методикой, первопроходцем в которой был Рудольф Джениш. У мышей развились тяжелые неврологические симптомы, а их активность в зрелом возрасте далеко не соответствовала норме. Если вы посадите здоровую мышь в центр большой белой коробки, она практически мгновенно начнет исследовать свой новый ареал обитания. Она станет много двигаться, бегать вдоль стенок коробки, совсем как обычная домашняя мышь, которая мчится вдоль плинтуса, спасаясь от преследующей ее кошки, и часто вставать на задние лапки, стараясь расширить поле зрения. Мышь с мутацией Меср2 не демонстрирует почти ничего из этих действий — посадите ее в середину большой белой коробки, и она там и останется.

Когда Эдриан Бёрд создавал свою линию мышей с мутацией Меср2, он одновременно с этим позаботился и о том, чтобы у мышей сохранилась и нормальная копия Меср2. Однако эта копия оставалась «спящей» — она не была активирована в мышиных клетках. Настоящая изюминка этого эксперимента заключалась в том, что если мыши получали определенный безвредный химический препарат, у них активировался нормальный ген Меср2. Таким образом, экспериментаторы могли дать мышам развиться и вырасти без Меср2 в клетках, а затем, когда ученые решат, что подходящий момент наступил, они могли активировать ген Меср2.

Результаты такой активации гена Меср2 оказались просто невероятными. Мыши, пассивно сидевшие в середине белой коробки, мгновенно превращались в любопытных исследователей, каковыми им и надлежит быть[24]. Ход этого эксперимента запечатлен на видео, и вы сами можете найти его на Ю-Тьюбе вместе с интервью Эдриана Бёрда, в которых он скромно признается, что и сам не ожидал увидеть настолько разительные перемены в поведении мышей[25].

Результаты этих экспериментов настолько важны по той причине, что они дают нам обоснованную надежду на то, что мы сможем найти новые способы лечения больных, страдающих тяжелыми формами неврологических недугов. До появления этой статьи в журнале Science в научных кругах господствовало мнение, что если уж серьезное неврологическое состояние имеет место, то с этим ничего не поделать, поскольку его невозможно обратить вспять. Особенно распространенной эта точка зрения была применительно к состояниям, возникающим в период развития, то есть в утробе матери или в раннем младенчестве. Это крайне важный период, когда головной мозг создает огромное количество связей и структур, которыми будет пользоваться на протяжении всей жизни. Результаты экспериментов с мышами с мутированным Меср2, позволяют предположить, что, возможно, и при синдроме Ретта все компоненты аппарата клеток, необходимые для нормального неврологического функционирования, уже присутствуют в головном мозге — и их нужно лишь должным образом активировать. Если это окажется справедливым и в отношении человека (а на уровне головного мозга мы не так уж сильно отличаемся от мышей), то мы получим реальную надежду на то, что сможем начать разрабатывать такие способы лечения, которым по силам будет обратить вспять даже столь тяжелые заболевания как врожденное слабоумие. Нам не удастся проделать это таким же образом, как с мышами, поскольку такая генетическая методика может быть использована только на подопытных животных, но не на людях, однако не приходится сомневаться в том, что имеет смысл заниматься разработкой лекарственных препаратов, способных привести к аналогичным результатам.

Совершенно ясно, почему такое огромное значение имеет метилирование ДНК. Ошибки в прочтении метилирования ДНК могут привести к тяжелым и разрушительным неврологическим расстройствам, делающим детей, пораженных симптомом Ретта, инвалидами на всю жизнь. Метилирование ДНК также чрезвычайно важно для сохранения правильной модели экспрессии генов в клетках различных типов — ив существующих на протяжении нескольких десятилетий долгожителях-нейронах, и во всем потомстве стволовых клеток таких постоянно меняющихся тканей как, например, кожа.

Но мы пока так и не решили концептуальную проблему Нейроны кардинально отличаются от клеток кожи. Если оба типа клеток прибегают к метилированию ДНК для подавления определенных генов и для сохранения их в таком состоянии, значит, этому процессу подвергаются разные наборы генов. В противном случае, экспрессировались бы всегда одни и те же гены в одинаковой степени, и тогда они неизбежно порождали бы одни и те же типы клеток, а не нейроны и клетки кожи.

Ключ к ответу на вопрос, как два типа клеток могут использовать один и тот же механизм для получения настолько разных результатов, лежит в понимании того, каким образом метилирование ДНК затрагивает различные области генома в клетках разных типов. А это отсылает нас ко второй глобальной области молекулярной эпигенетики. К белкам.

ДНК часто описывается как некая обособленная молекула, то есть это ДНК и ничего больше. Если мы попытаемся представить ее себе, то двойная спираль ДНК в нашем воображении, скорее всего, будет выглядеть как очень длинное и закрученное вокруг своей оси железнодорожное полотно. Собственно, так мы ее и описывали в предыдущей главе. Однако действительность разительно отличается от таких представлений, и многие гениальные прорывы в эпигенетике случались именно тогда, когда ученые начинали в полной мере осознавать эти различия.

ДНК тесно связана с белками, особенно с теми из них, которые называются гистонами. Сегодня главное внимание в эпигенетике и регуляции генов сосредоточено на четырех конкретных гистоновых белках, а именно Н2А, Н2В, H3 и Н4. Эти гистоны имеют так называемую глобулярную структуру, поскольку они упаковываются в компактную шарообразную форму. Но у каждого такого шарика есть также подвижная свободная цепочка аминокислот, которая называется гистоновым отростком. Два экземпляра каждого из этих четырех гистоновых белков группируются вместе и образуют плотную структуру, называемую гистоновым октамером (этим наименованием он обязан именно тому, что состоит из восьми отдельных гистонов).

Пожалуй, проще будет представить себе этот октамер как восемь шариков для настольного тенниса, расположенных двумя слоями по четыре шарика один на другом. ДНК туго обвивает это белковое образование, подобно длинному побегу лакричника, заключившему в свои объятия алтей^{1}, и образует структуру, которая называется нуклеосомой. Вокруг каждой нуклеосомы обернуты 147 пар оснований ДНК. На рисунке 4.3 показана очень упрощенная схема строения нуклеосомы, на которой белая лента изображает ДНК, а серые завитки представляют гистоновые отростки.

^{Рис. 4.3. Гистоновый октамер (по две молекулы гистонов Н2А, Н2В,H3 и Н4), туго упакованный и обернутый ДНК, образует основную единицу хроматина под названием нуклеосома.}

Если бы мы попытались найти какую-нибудь информацию о гистонах всего лишь лет пятнадцать назад, то узнали бы, что это некие «упаковывающие белки» и не более того. Нет сомнений в том, что ДНК должна каким-то образом упаковываться. Диаметр ядра клетки составляет обычно около 10 микронов (это 1/100 миллиметра), а если бы ДНК в клетке оставалась в свободном состоянии, она могла бы вытянуться в длину до 2 метров. ДНК туго обернута вокруг нуклеосом, а те плотными слоями уложены друг на друга.

Определенные участки наших хромосом почти постоянно имеют ярко выраженные формы подобных структур. Преимущественно, это те участки, которые не несут в себе информацию о генах. В большинстве случаев, они представляют собой структурные участки, расположенные, например, на самых кончиках хромосом, или области, важные для разделения хромосом после копирования ДНК при делении клеток.

Участки ДНК, подвергаемые действительно активному метилированию, также имеют такие сверхплотные структуры, и метилирование играет очень важную роль в формировании этих образований. Это один из тех механизмов, которые обусловливают репрессию определенных генов на протяжении десятилетий в таких долго живущих типах клеток как нейроны.

А как насчет тех участков, которые не скручены туго, в которых находятся активированные гены или же способные к последующей активации? Здесь-то на первые роли и выдвигаются гистоны. Функции их неизмеримо расширяются, теперь они не являются только лишь молекулярными катушками, на которые могла бы наматываться ДНК. Если метилирование ДНК представить как достаточно долговечные дополнительные пометки на нашем сценарии «Ромео и Джульетты», то модификации гистонов будут служить в этой аналогии примечаниями, обреченными на скорое исчезновение. Их можно сравнить со сделанными карандашом записями, которые отобразятся при последовательном копировании несколько раз, а потом станут невидимыми. А может быть, судьба их окажется еще более мимолетной, как у самоклеющихся листочков бумаги для записей, годных лишь на один раз.

Впечатляющее число научных прорывов в этой области было сделано в лаборатории профессора Дэвида Эллиса из Рокфеллеровского университета в Нью-Йорке. Ее руководитель, всегда с иголочки одетый, аккуратный, чисто выбритый американец, выглядящий значительно моложе своих 60 лет, пользуется чрезвычайной популярностью среди коллег. Как и многие эпигенетики, он начинал карьеру в области биологии развития. Подобно Эдриану Бёрду и, еще раньше, Джону Гердону, Дэвид Эллис едва ли не равнодушно относится к своей репутации мирового светила в эпигенетике. В целом цикле выдающихся статей, опубликованных в 1996 году, он вместе с коллегами показал, что гистоновые белки претерпевают в клетках химическую модификацию, и эта модификация повышает экспрессию генов, если они находятся возле специфически измененных нуклеосом[26].

Гистоновая модификация, обнаруженная Дэвидом Эллисом, была названа ацетилированием. Ацетилирование представляет собой присоединение химической ацетил-группы, в данном случае, специфической аминокислоте, которая называется лизин, на свободном отростке одного из гистонов. На рисунке 4.4 показано строение лизина и ацетил-лизина, и мы опять видим, что изменения относительно незначительны. Как и метилирование ДНК, ацетилирование лизина представляет собой эпигенетический механизм для изменения экспрессии генов, не влияющий на исходную последовательность генов.

^{Рис. 4.4. Химическое строение аминокислоты лизин и ее эпигенетически модифицированной формы ацетил-лизин. С — углерод; Н — водород; N — азот; О — кислород. Для упрощения некоторые атомы углерода намеренно не отмечены, однако они присутствуют там, где изображены две соединительные линии}

Тогда, в 1996 году, все казалось ясным и понятным. Метилирование ДНК репрессирует гены, а ацетилирование гистонов активирует их. Но экспрессия генов — это куда более тонкий процесс, не ограничивающийся лишь их включением или выключением. Экспрессию генов нельзя сравнивать с неким рубильником, имеющим два положения, «вкл» и «выкл»; она скорее подобна круглой рукоятке настройки громкости радиоприемника. Поэтому никто особенно не удивился, когда выяснилось, что в этом процессе задействована не только гистоновая модификация. Нужно сказать, что более 50 различных эпигенетических модификаций гистоновых белков были обнаружены с момента опубликования тех самых статей Дэвида Эллиса; и открытия эти были сделаны как самим Эллисом, так и многими другими лабораториями[27]. Все эти модификации меняют экспрессию генов, но не всегда одинаково. Одни модификации гистонов усиливают этот процесс, тогда как другие ослабляют его. Шаблон, по которому происходят модификации, стали называть гистоновым кодом[28]. Но проблема, с которой столкнулись эпигенетики, оказалась в том, что прочесть этот код невероятно сложно.

Представьте себе хромосому в виде ствола огромной новогодней елки. Ее ветви, раскинувшиеся во все стороны по всей высоте дерева, это гистоновые отростки, которые могут быть украшены эпигенетическими модификациями. Мы берем фиолетовые шары и вешаем один, два или три фиолетовых шара на некоторые ветви. У нас также есть зеленые сосульки, и мы можем повесить одну или две из них на разные ветви, на некоторых из которых уже висят фиолетовые шары. Затем мы берем красные звезды, но знающие люди сказали нам, что ими нельзя украшать ветви, по соседству с которыми висит хоть один фиолетовый шар. Золотые снежинки и зеленые сосульки запрещается вешать на одни и те же ветви. И чем дальше, тем сложнее и запутаннее становятся правила, которым мы должны следовать, наряжая нашу елку. В конце концов, мы развесили все наши украшения и обернули елку электрической гирляндой. Лампочки на ней — это отдельные гены. Эта гирлянда оснащена удивительным программным обеспечением, меняющим яркость свечения каждой лампочки в строгой зависимости от того, какие елочные игрушки находятся рядом. И мы будем практически не в состоянии предугадать, с какой яркостью станут гореть все лампочки на нашей гирлянде, потому что схема расположения украшений на елке чрезвычайно сложна.

Именно в таком положении и находятся на настоящий момент ученые, пытающиеся предсказать, как все разнообразные комбинации гистоновых модификаций влияют в своей совокупности на экспрессию генов. Во многих случаях бывает вполне понятно, чего ожидать от какой-либо одной модификации, но делать сколько-нибудь точные предположения об их комбинированном влиянии не представляется возможным.

Огромные усилия прикладываются учеными для того, чтобы научиться понимать этот код; многочисленные лаборатории по всему миру и сотрудничают, и соперничают друг с другом в попытках привлечь самые быстрые и сложные технологии к решению этой проблемы. Причина этого в том, что, пусть мы и не можем пока прочесть этот код правильно, но мы знаем о нем достаточно, чтобы понимать, насколько он важен.

Много очень важной информации мы получаем из области биологии развития — науки, из которой пришли в эпигенетику многие выдающиеся исследователи. Как мы уже говорили выше, после деления одноклеточной зиготы ее дочерние клетки очень быстро начинают приобретать индивидуальные функции. Первое примечательное событие, происходящее при делении клеток, заключается в том, что клетки эмбриона на самых ранних стадиях своего развития начинают разделяться на внутриклеточную массу (ВКМ) и трофоэктодерму. Клетки ВКМ, в частности, начинают дифференцироваться и образовывать постоянно увеличивающееся количество клеток разнообразных типов. Этот спуск клеток по склонам эпигенетического ландшафта к его ложбинам является в большой степени процессом постоянным и самовозобновляющимся.

Главная идея, которую нам нужно уловить на этом этапе, состоит в представлении о том, каким образом волны экспрессии генов и эпигенетических модификаций следуют друг за другом и вытекают друг из друга. Подходящей аналогией для проникновения в суть этого процесса для нас может стать игра «Мышеловка», впервые появившаяся в начале 1960-х годов, но продолжающая пользоваться популярностью и в наши дни. В ходе игры ее участники должны построить безумно сложную мышеловку. Чтобы активировать мышеловку, в нее нужно запустить шарик. Этот шарик прокатывается через самые разнообразные и хитроумные приспособления, которыми могут быть и горка, и катапульта, и ряд ступенек, и человечек, прыгающий в воду с трамплина. Если все до единой детали головоломки размещены относительно друг друга правильно, то эта головокружительная конструкция работает как часы, и игрушечная мышка оказывается захваченной в сети. Но если лишь один ее элемент стоит чуть-чуть не на своем месте, то он выбивается из общего ряда, вся последовательность нарушается, и ловушка не срабатывает.

Развитие эмбриона во многом похоже на эту игру. Зигота заранее загружена определенными белками, полученными главным образом из цитоплазмы яйцеклетки. Эти приобретенные из яйцеклетки белки проникают в ядро, в котором прикрепляются к своим целевым генам (которые мы в честь «Мышеловки» будем называть «катапультами») и регулируют их экспрессию. Кроме этого, они притягивают к генам «катапульт» некоторые выбранные ими эпигенетические ферменты, Эти эпигенетические ферменты также могут быть позаимствованы в цитоплазме яйцеклетки, и они вызывают более продолжительные модификации ДНК и гистоновых белков хроматина, одновременно влияя и на то, как активируются или подавляются эти «катапультные» гены. Белки «катапульт» прикрепляются к генам «ныряльщиков» и активируют их. Некоторые гены «ныряльщиков» сами могут кодировать эпигенетические ферменты, что оказывает уже свое влияние на членов семейства генов «горок» и так далее. Генетические и эпигенетические белки работают в безупречно упорядоченном режиме, аналогично тому, как это происходит в «Мышеловке» после того, как в нее запускается шарик.

Иногда фактор, экспрессия которого «балансирует на грани тонко настроенного равновесия, экспрессируется клеткой с небольшим отклонением в одну или другую сторону. В этом случае возникает вероятность изменения пути развития, по которому движется клетка, как могло бы быть, если двадцать «Мышеловок» соединить друг с другом. Едва уловимые отклонения в том, как элементы головоломки соотносятся друг с другом или, как катится шарик в критические моменты, способны активировать одну ловушку и отключить другую.

Примеры в предложенной аналогии придуманы нами, но мы можем рассматривать их как реально существующие. Одним из ключевых белков на самых ранних стадиях эмбрионального развития является Oct4. Белок Oct4 присоединяется к определенным ключевым генам и одновременно притягивает конкретный эпигенетический фермент. Этот фермент модифицирует хроматин и меняет регуляцию гена. И Oct4, и эпигенетический фермент, с которым тот взаимодействует, жизненно важны для эмбриона на ранних стадиях его развития. Если один из них отсутствует, зигота не сможет развиться даже до того, чтобы сформировать ВКМ.

Схемы экспрессии генов на ранних этапах развития эмбриона, в конечном счете, регулируются автоматически. Когда экспрессируются определенные белки, они могут связаться с промотором Oct4 и подавить экспрессию этого гена. В обычных условиях соматические клетки не экспрессируют Oct4. Это было бы для них слишком опасно, поскольку Oct4 мог бы нарушить нормальную схему экспрессии генов в дифференцированных клетках и превратить их в некое подобие стволовых клеток.

Именно это и проделал Шинья Яманака, когда использовал Oct4 в качестве перепрограммирующего фактора. Искусственно создав очень высокие уровни содержания Oct4 в дифференцированных клетках, он сумел «обмануть» клетки и вынудить их вести себя так, как будто они находились на ранних стадиях развития. Даже эпигенетические модификации были аннулированы — вот насколько велика сила этого гена.

Нормальное развитие предоставляет нам важные доказательства необходимости эпигенетических модификаций для контроля участи клетки. Не менее наглядно демонстрируют нам значение эпигенетики и те случаи, когда развитие идет по неверному пути.

Так, в одной из публикаций журнала Nature Genetics в 2010 году были приведены примеры мутации, вызывающей редкое заболевание, которое называется синдромом Кабуки. Синдром Кабуки представляет собой комплексное нарушение развития, характеризуемое целым рядом симптомов, в том числе, таких как врожденное слабоумие, низкий рост, патологии лица и расщелина неба. В статье отмечалось, что синдром Кабуки провоцируется мутациями в гене под названием MLL2[29]. Белок MML2 является эпигенетическим шифровальщиком, добавляющим метиловые группы к определенной лизиновой аминокислоте в позиции 4 на гистоне H3. Белки с такой мутацией не способны прочесть эпигенетический код правильно, вследствие чего и возникают такие симптомы.

Заболевания людей также могут быть вызваны мутациями ферментов, удаляющих эпигенетические модификации, то есть «ластиков» эпигенетического кода. Мутации в гене под названием PHF8, который удаляет метиловые группы из лизина в позиции 20 на гистоне H3, вызывают синдром врожденного слабоумия и расщелины неба[30]. В этих случаях клетки больных приобретают эпигенетические модификации без проблем, но не могут правильным образом удалить их.

Интересно отметить, что хотя белки MML2 и PHF8 играют разные роли, но клинические симптомы, вызываемые мутациями в этих генах, проявляют себя в одинаковой степени. И в первом, и во втором случае они приводят в расщелине неба и врожденном слабоумии. Оба эти симптома принято считать признаком нарушения хода развития. Эпигенетические пути важны на протяжении всей жизни человека, но, как оказывается, особенное значение они приобретают в период развития.

Кроме этих гистоновых шифровальщиков и ластиков, существует свыше 100 белков, которые выступают в роли «дешифровщиков» этого гистонового кода, связываясь с эпигенетическими метками. Эти дешифровщики притягивают другие белки и выстраивают комплексы, активирующие или репрессирующие экспрессию генов. Происходит это подобно тому, как МеСР2 помогает подавить экспрессию генов при метилировании ДНК.

Гистоновые модификации принципиально отличаются от метилирования ДНК. Метилирование ДНК представляет собой очень стабильное эпигенетическое изменение. Если какой-либо участок ДНК стал метилированным, то он и останется метилированным в подавляющем большинстве случаев. Вот почему эта эпигенетическая модификация настолько важна для того, чтобы нейроны всегда оставались нейронами, и именно по этой причине зубы не вырастают у нас на глазных яблоках. Хотя метилирование ДНК и может быть удалено из клетки, это явление весьма маловероятно и возможно лишь в крайне чрезвычайных обстоятельствах.

Большинство гистоновых модификаций значительно более вариативно. Некая модификация может быть произведена на каком-либо гистоне определенного гена, затем удалена, а позже возвращена обратно. Это происходит в результате реакции на самые разнообразные стимулирующие сигналы, поступающие в ядро клетки извне. Природа этих стимуляторов может варьироваться до безграничных пределов. В некоторых типах клеток гистоновый код может меняться, реагируя на гормоны. Ими могут быть и инсулин, проникающий в клетки мышц, и эстроген, воздействующий на клетки груди во время менструального цикла. В головном мозге гистоновый код может меняться в ответ на прием таких наркотических препаратов как кокаин, тогда как в клетках, выстилающих пищеварительный канал, схема эпигенетических модификаций будет меняться в зависимости от количества жирных кислот, вырабатываемых бактериями кишечника. Такие изменения гистонового кода являются одним из ключевых способов взаимодействия внешних факторов (окружающей среды) и внутренних (наших генов) при создании любого высшего организма на земле во всей его сложности.

Гистоновые модификации также позволяют клеткам «испытывать» определенные модели экспрессии генов, особенно в процессе развития. Гены временно подавляются, когда репрессивные гистоновые модификации (которые снижают уровень экспрессии генов) затрагивают гистоны, соседние с этими генами. Если репрессия генов идет на пользу клетке, то гистоновые модификации могут продолжаться достаточно долго, чтобы вызвать метилирование ДНК. Гистоновые модификации притягивают белки-дешифраторы, которые выстраивают комплексы из других белков на нуклеосоме. В некоторых случаях эти комплексы могут включать в себя DNMT3 А или DNMT3B —два фермента, доставляющие метиловые группы на мотивы CpG в ДНК. В таких ситуациях ОЫМТЗАили ЗВ могут «вытягиваться» из комплекса на гистоне и метилировать соседнюю ДНК. Если метилирование ДНК оказывается достаточным, экспрессия гена будет подавлена. В чрезвычайных обстоятельствах вся область хромосомы может стать сверхплотной и оставаться подавленной на протяжении многочисленных делений клетки или даже сохраняться таким десятилетиями в таких неделящихся клетках как нейроны.

Почему организм для регулирования экспрессии генов создал в процессе эволюции такие сложные схемы гистоновых модификаций? Эта система представляется особенно запутанной, если сравнивать ее с довольно бескомпромиссной механикой метилирования ДНК. Одна из причин этого, вероятно, состоит в том, что благодаря ее сложности появляется возможность производить предельно выверенную, точную настройку экспрессии генов. Благодаря этому процессу клетки и организмы могут соответствующим образом корректировать экспрессию генов для адекватного реагирования на изменения окружающей среды, такие как недостаток питательных веществ или воздействие вирусов. Однако, в чем мы убедимся из содержания следующей главы, такая точная настройка может привести и к некоторым очень неожиданным последствиям.