Эпигенетика

Глава 2. Как мы учились катиться в гору

Итак, перепрыгнем почти через сорок лет, минувших с открытия Джона Гердона, и десятилетие после рождения Долли. Мы видим, что газеты просто переполнены публикациями о клонированных млекопитающих, и из-за их обилия создается впечатление, что эта процедура стала простой и рутинной. В действительности же процесс создания клонов путем переноса ядра продолжает оставаться чрезвычайно длительным и трудоемким и, соответственно, требующим существенных финансовых затрат. Трудности, с которыми сталкиваются исследователи, в значительной степени обусловлены тем, что им приходится вручную переносить соматические ядра в яйцеклетки. Кроме того, в отличие от амфибий, с которыми имел дело Джон Гердон, млекопитающие не производят одновременно яйцеклетки в больших количествах. Также усложняет их задачу и то, что яйцеклетки млекопитающих необходимо с предельной осторожностью извлекать из организма, поскольку сами собой они в аквариуме не оказываются, как это было с лягушачьей икрой. Яйцеклетки млекопитающих нуждаются в постоянном уходе и внимании, чтобы оставаться не просто живыми, но и здоровыми. Исследователи должны были вручную извлечь ядро из яйцеклетки, ввести ядро взрослой клетки (ничего при этом не повредив), но прежде чем имплантировать эту клетку в матку другой женской особи, необходимо было культивировать ее с максимальной осторожностью. Это невероятно напряженная и трудоемкая работа, причем каждый раз может быть пересажена лишь одна-единственная клетка.

Многие годы ученые мечтали о том, что у них появиться возможность клонирование в идеальных условиях. У взрослого млекопитающего, которое они хотели бы клонировать, исследователи брали бы самые доступные клетки. Крошечного соскоба клеток кожи было бы вполне достаточно, а сделать его было бы проще простого. Затем они бы обработали эти клетки в лаборатории, добавляя в них определенные гены, белки или другие химические соединения. Такая обработка принципиально изменила бы будущую судьбу ядер этих клеток. Вместо того чтобы вести себя как ядра клеток кожи, они перенимали бы манеру поведения ядер только что оплодотворенных яйцеклеток. Результат этой лабораторной обработки, таким образом, был бы аналогичен переносу ядер взрослых клеток в оплодотворенные яйцеклетки, из которых предварительно были удалены собственные ядра. Прелесть этой гипотетической методики заключается в том, что мы могли бы избавиться от множества сложных и трудоемких действий, требующих высочайшего уровня технического оснащения и мастерства при работе с крошечными клетками. Эта методика стала бы простой и доступной техникой, позволяющей применять ее одновременно на множестве клеток, а не выполнять каждый раз перенос лишь одного-единственного ядра.

Конечно, нам все еще предстояло бы найти способ доставки этих клеток в суррогатную мать, и это оставалось бы единственной задачей, требующей решения, если мы хотим создавать полноценных живых существ. Отчасти именно это и является нашей целью — дублировать племенных быков, например, или жеребцов, однако если говорить о воссоздании человека, то к такой перспективе большинство разумных людей относятся негативно. Более того, клонирование человека (репродуктивное клонирование) запрещено практически во всех странах, располагающих учеными и инфраструктурой для выполнения подобной задачи. Впрочем, на самом деле нам нет никакой нужды заходить настолько далеко и размышлять о перспективах клонирования человека, чтобы обосновать пользу, которую получит человечество от клонирования. Все, что нам нужно, это клетки, обладающие потенциалом превращаться в клетки других типов. Такого рода клетки называются стволовыми, и, образно говоря, они располагаются около вершины эпигенетического ландшафта Уоддингтона. Причина, по которой мы нуждаемся в таких клетках, объясняется природой заболеваний, составляющих одну из главных проблем нашей развитой цивилизации.

В богатых регионах нашей планеты болезни, убивающие наибольшее число людей, являются хроническими. Для развития им требуется продолжительное время, и часто столь же неспешно они убивают нас, когда принимаются за свое черное дело. Возьмем для примера сердечные заболевания — у человека, пережившего первый сердечный приступ, весьма незначительны шансы на то, что его сердце полностью восстановится и снова будет совершенно здоровым. Во время приступа некоторое количество клеток сердечной мышцы (кардиомиоциты) могут испытать кислородное голодание и погибнуть. На первый взгляд, это не должно представлять для нас большой проблемы, так как сердце наверняка может воссоздать новые клетки взамен утраченных, разве нет? В конце концов, мы ведь сдаем кровь, и наш костный мозг после этого производит больше красных кровяных телец. Точно так же, мы должны нанести ну уж очень большой вред собственной печени, чтобы она утратила способность восстанавливаться, «ремонтируя» сама себя. Но с сердцем дело обстоит несколько иначе. Кардиомиоциты принадлежат к так называемым «окончательно дифференцированным» клеткам — они скатились к самому подножию холма Уоддингтона и прочно застряли в отведенной им ложбине. В отличие от костного мозга или печени, сердце не располагает доступными запасами менее специализированных клеток (кардиальных стволовых клеток), которые могли бы превратиться в новые кардиомиоциты. Соответственно, долгосрочная проблема, вызванная сердечным приступом, состоит в том, что наш организм не способен создавать новые клетки сердечной мышцы. Организм делает единственное, что в его силах, заменяя погибшие кардиомиоциты соединительной тканью, и сердце никогда уже не бьется точно так, как билось прежде.

Подобные явления происходят при очень многих заболеваниях: синтезирующие клетки, секретирующие инсулин, разрушаются, когда у подростка развивается диабет 1 типа, клетки мозга погибают при болезни Альцгеймера, клетки ткани, из которых состоят хрящи, разрушаются при остеоартрите, и этот список можно продолжать бесконечно. Как было бы здорово, если бы мы могли заменять их новыми клетками, полностью идентичными нашим собственным. В этом случае мы могли бы навсегда забыть об отторжении тканей, с которым часто приходится сталкиваться при трансплантации органов, или об отсутствии так нужных нам доноров. Использование стволовых клеток таким образом называется терапевтическим клонированием; под ним мы подразумеваем создание клеток, идентичных клеткам конкретного больного, для лечения его заболевания.

Сорок с лишним лет мы знали, что теоретически это возможно. Работы Джона Гердона и его многочисленных последователей продемонстрировали, что взрослые клетки хранят в себе информацию обо всех клетках организма, и нам остается лишь найти эффективный способ извлечения ее. Джон Гердон брал ядра клеток взрослых лягушек, помещал их в яйцеклетки и закатывал эти ядра на самую вершину ландшафта Уоддингтона, создавая тем самым новых животных. Взрослые ядра оказывались — и это очень важное определение — перепрограммированными. Иэн Вилмут и Кит Кэмпбелл практически то же самое проделали с овцой. Важнейший общий признак, объединяющий эти работы, заключался в том, что в обоих случаях перепрограммирование срабатывало лишь тогда, когда взрослое ядро помещалось в неоплодотворенную яйцеклетку. Именно яйцеклетке была отведена в этом процессе главная роль. Мы не сможем клонировать живое существо, поместив взрослое ядро в клетку какого-либо другого типа.

Почему?

Чтобы разобраться в этом, нам придется сделать небольшое отступление и поговорить о биологии клетки. В ядре содержится подавляющее большинство ДНК и генов, которыми мы закодированы, это чертеж, по которому мы созданы. Очень незначительная часть ДНК располагается не в ядре — она находится в крошечных структурах, называемых митохондриями, но в данном случае это ничуть не должно нас беспокоить. Когда мы впервые знакомились с понятием клетки в школе, у большинства из нас складывалось впечатление, что самое главное и важное в ней — это ядро, тогда как все прочее, а именно цитоплазма, не более чем мешочек с жидкостью, пользы от которого не так уж и много. Трудно представить себе что-либо, столь же далекое от истины, и особенно, если речь идет о яйцеклетке, ибо и лягушки, и Долли научили нас тому, что цитоплазма в яйцеклетке играет ключевую роль. Что-то, содержащееся в этой яйцеклеточной цитоплазме, активно перепрограммировало взрослые ядра, помещенные в нее экспериментаторами. Эти неизвестные факторы откатили ядро со дна одного из уоддингтоновских желобов на самую вершину его ландшафта.

Никто толком не понимал, каким образом цитоплазме яйцеклетки удавалось преобразовывать взрослые ядра в ядра, присущие зиготам. Оставалось лишь предполагать, что, чем бы это ни было, оно должно быть невероятно сложным и запутанным для анализа. Часто в науке случается так, что действительно большие вопросы, получить ответы на которые не представляется возможным, содержат в себе ряд меньших вопросов, поддающихся осмыслению. Поэтому несколько лабораторий занялись решением концептуально более простых, но технически не менее сложных задач.

Давайте вспомним шарик на вершине ландшафта Уоддингтона. Пользуясь клеточной терминологией, мы называем его зиготой и характеризуем как тотипотентный, то есть обладающий потенциалом сформировать любую клетку в организме, включая и плаценту. Конечно, зиготы по определению крайне ограниченны количественно, и большинство ученых, занимающиеся исследованиями самых ранних стадий развития, пользуются клетками чуть более взрослыми, знаменитыми эмбриональными стволовыми (ЭС) клетками. Эти клетки получаются в результате естественного процесса развития. Зигота дробится и делится несколько раз, образуя в итоге группу клеток, называемую бластоцистой. Несмотря на то, что бластоциста обычно насчитывает менее 150 клеток, она уже является эмбрионом на ранней стадии развития, состоящим из двух четко разделенных структур. В ней присутствует внешний слой, называемый трофэктодермой, из которой позже сформируется плацента и другие внеэмбриональные ткани, и внутриклеточная масса (ВКМ).

На рисунке 2.1 показано, как выглядит бластоциста. Рисунок выполнен в двух измерениях, однако в действительности бластоциста представляет собой трехмерную структуру, так что на самом деле она похожа на теннисный мячик, внутрь которого вклеен шарик для гольфа.

^{Рис. 2.1. Строение бластоцисты млекопитающих. Из клеток трофэктодермы образуется плацента. В процессе естественного развития клетки внутриклеточной массы (ВКМ) сформируют ткани эмбриона. В лабораторных условиях клетки ВКМ могут выращиваться в культуре как плюрипотентные эмбриональные стволовые (ЭС) клетки будут делиться неограниченное количество раз, оставаясь при этом полным подобием своей родительской клетки. Их мы и называем ЭС клетками, и, как следует из их полного наименования, они способны сформировать любую клетку эмбриона и, в конечном итоге, взрослого животного. Они не тотипотентны — так как не могут образовать плаценту — и называются плюрипотентными, поскольку все остальное им по силам.}

Клетки ВКМ могут выращиваться в лаборатории в чашках для культивирования. Очень нежные и прихотливые, они требуют особых условий и крайне внимательного и бережного обращения, но соблюдайте правила, и они вознаградят вас за усердие тем, что ЭС клетки оказались поистине бесценными для понимания того, что необходимо для сохранения плюрипотентного состояния клеток. На протяжении долгих лет многие выдающиеся ученые, в первую очередь Азим Сурани в Кембридже, Остин Смит в Эдинбурге, Рудольф Джениш в Бостоне и Шинья Яманака в Киото, не жалея времени и сил, пытались идентифицировать гены и белки, экспрессированные (включенные) в ЭС клетках. Особые усилия они направляли на определение генов, поддерживающих ЭС клетки в плюрипотентном состоянии. Эти гены чрезвычайно важны, так как ЭС клетки демонстрируют высокую склонность к превращению в клетки других типов в культуре, стоит лишь чуть изменить условия их содержания. Допустите совсем незначительные вариации в выверенном режиме выращивания, и ЭС клетки, делящиеся в чашке для культивирования, тут же начнут дифференцироваться, например, в кардиомиоциты и заниматься тем, что лучше всего остального получается у клеток сердца: сокращаться в унисон друг с другом. Очередное едва уловимое изменение условий содержания, такое как, скажем, нарушение четкого баланса химических соединений в культуральной жидкости, может заставить ЭС клетки отказаться от их первоначального плана превратиться в клетки сердца и приступить к формированию клеток, из которых развиваются нейроны нашего головного мозга.

Ученые, работающие с ЭС клетками, определили огромное множество генов, играющих важную роль в сохранении клеток плюрипотентными. Функциональное назначение различных выявленных ими генов далеко не всегда было одинаковым. Некоторые из них были важны для самообновления, то есть одна ЭС клетка при делении образовывала две ЭС клетки, тогда как другие были необходимы для того, чтобы не позволять клеткам дифференцироваться[9].

Таким образом, к началу XXI века ученые обнаружили способ сохранения плюрипотентных ЭС клеток в чашках с культурой и узнали очень много нового и важного об их биологии. Кроме того, им удалось установить, как именно следует менять состав культурального раствора, чтобы находящиеся в нем ЭС клетки дифференцировались в клетки различных типов, включая клетки печени, сердца, нейроны и так далее. Но насколько это приближает нас к осуществлению мечты, о которой мы говорили выше? Смогут ли исследователи воспользоваться этой информацией, чтобы разработать новые способы обращения собственного времени клеток вспять, закатывания их вверх, в высшую точку уоддингтоновского ландшафта? Можно ли будет взять полностью дифференцированную клетку и обработать ее в лаборатории таким образом, чтобы она стала во всем подобной ЭС клетке, со всем присущим ей потенциалом? И если у ученых имелись веские основания полагать, что теоретически это возможно, то до осуществления этих идей на практике требовалось проделать еще очень и очень долгий путь. Однако эта работа сулила в высшей степени манящие перспективы для ученых, стремившихся с помощью стволовых клеток излечивать людей от самых разнообразных заболеваний.

К середине первого десятилетия нашего века было идентифицировано более двадцати генов, играющих важную роль в развитии ЭС клетках. Далеко не всегда ученым было понятно, каким образом они взаимодействуют между собой, и, конечно же, было совершенно ясно, что в биологии ЭС клеток для нас еще остается слишком много белых пятен. Однако абсолютно точно было известно то, что будет невообразимо сложно взять зрелую клетку и воссоздать в ней широчайший комплекс внутриклеточных условий, существующий в ЭС клетке.

Иногда величайшие научные прорывы случаются лишь по той причине, что кто-то попросту отваживается игнорировать превалирующий в каком-то вопросе пессимизм. В нашей истории оптимистами, решившими на практике проверить то, что все остальные по определению считали невозможным, были уже упоминавшийся выше Шинья Яманака и помогавший ему в проведении экспериментов докторант Казутоши Такахаши.

Профессор Яманака принадлежит к числу молодых светил в области изучения стволовых клеток и плюрипотентности. Родившийся в Осаке в начале 1960-х годов, он, что весьма необычно, занимал высокие академические посты в узкоспециализированных научно-исследовательских учреждениях Японии и США. Получив медицинское образование, он стал практикующим врачом в области ортопедической хирургии. Своих коллег-ортопедов другие хирурги часто снисходительно называют «мастерами кувалды и зубила». Хотя справедливого в этом определении мало, но все же практическая деятельность хирурга-ортопеда настолько далека от утонченной молекулярной биологии и изучения стволовых клеток, насколько это только можно себе представить.

Пожалуй, более любых других исследователей, занимавшихся изучением стволовых клеток, профессор Яманака горел желанием найти способ создания в лабораторных условиях плюрипотентных клеток из дифференцированных клеток. Приступив к этой работе, он располагал списком из 24 генов, имеющих жизненно важное значение для ЭС клеток. Все они принадлежали к числу «генов плюрипотентности» — они должны были оставаться активированными, чтобы ЭС клетки могли сохранить свою плюрипотентность. Если с помощью различных экспериментальных техник эти гены репрессировались, то ЭС клетки начинали дифференцироваться (как те самые сокращавшиеся клетки сердца в чашках с культурой) и уже никогда не возвращались к своему первоначальному состоянию ЭС клеток. Отчасти именно это и происходит в процессе естественного развития млекопитающих, когда клетки дифференцируются и становятся специализированными, — они «отключают» свои гены плюрипотентности.

Шинья Яманака решил проверить, не обратят ли некие комбинации этих генов биологическое время дифференцированных клеток вспять, не отодвинут ли их на более ранние стадии развития. Работа ему предстояла долгая и трудоемкая, причем имело место обоснованное опасение, что, если результаты окажутся отрицательными, то есть если ни одна из этих клеток не «откатится» в свое прошлое, то он не сможет узнать наверняка, в чем причина такого завершения экспериментов — в том, что это невозможно в принципе, или в том, что не были верно соблюдены условия проведения экспериментов. Это был рискованный проект даже для такого авторитетного ученого как Яманака, но еще больше подводных камней он таил в себе для его юного помощника Такахаши, поскольку тому только предстояло взбираться по лестнице своей научной карьеры.

Когда герцогу Веллингтону стало известно о возможности обнародования его личной интимной переписки, грозившей нанести ему значительный вред, он произнес свои ставшие крылатыми слова: «Публикуйте и катитесь ко всем чертям!» Мантра ученых практически такая же, однако она отличается одним очень важном нюансом. Для нас она звучит «публикуйте или катитесь ко всем чертям» — если вы не публикуете свои научные труды, то не получите для них финансирования и не найдете работу в университетах. И крайне немного шансов у вашей работы быть опубликованной в солидном научном журнале, если весь ваш рассказ о годах напряженного труда можно выразить в одной фразе: «Я старался, старался, но у меня ничего не получилось». Так что желание заняться проектом, имевшим относительно небольшую вероятность завершиться положительным результатом, с полным правом можно назвать отчаянно смелым поступком, а перед Такахаши, в частности, нам остается лишь снять шляпу.

Яманака и Такахаши, имея в своем распоряжении 24 гена, решили испытать их в клеточном типе, известном как МЭФ — мышиные эмбриональные фибробласты. Фибробластами называются основные клетки соединительной ткани, присутствующие в самых разнообразных органах, включая кожу. Извлечь их очень легко, и они быстро растут в культуре, поэтому представляют собой превосходный клеточный материал для проведения экспериментов. Поскольку клетки МЭФ, как следует из их названия, получают из эмбрионов, существовала надежда, что они, будучи помещенными в подходящую среду, вспомнят хоть немногое о своем происхождении и сумеют вернуться к более ранним стадиям собственного развития.

Помните, как Джон Гердон в своих экспериментах выбирал доноров и акцепторов среди лягушек разных групп, обладавших различными маркерами генетического кодирования, чтобы определить, какие именно ядра развиваются в новых животных? Нечто подобное проделал и Яманака. Он брал клетки у мышей, имевших предварительно добавленный лишний ген. Этот ген называется геном неомициновой резистентности (neo^R) и действует в полном соответствии со своим наименованием. Неомицин — это принадлежащее к антибиотикам соединение, которое в обычных условиях убивает клетки млекопитающих. Но если клетки были генетически перестроены для экспрессии гена neo^R, они выживут. Когда Яманака готовил мышь, необходимую ему для проведения экспериментов, он особым образом добавил ей ген neo^R. Это означало, что ген neo^R должен активироваться лишь в том случае, если клетка, в которой он находился, станет плюрипотентной. Эта клетка должна была повести себя так, как будто она стала ЭС клеткой. То есть, если эксперименты по насильственному возвращению фибробластов в состояние недифференцированной ЭС клетки окажутся успешными, клетки будут продолжать расти даже при добавлении в них летальной дозы антибиотика. Если же эксперименты завершатся неудачей, все клетки погибнут.

Профессор Яманака и доктор Такахаши ввели 24 гена, которые они хотели протестировать, в особые молекулы, называемые векторами. Эти молекулы исполняют роль троянского коня, доставляя в клетку высокие концентрации «дополненной» ДНК в фибробласты. Оказавшись в клетке, эти гены должны активироваться и начать вырабатывать специфические для каждого из них белки. Введение векторов может быть осуществлено довольно просто одновременно в большое количество клеток при помощи химической обработки или электрического импульса (никаких кропотливых микро-инъекций, только не для японских исследователей!) Когда Шинья Яманака вводил все 24 гена одновременно, некоторые клетки оживали после обработки их неомицином. Доля их была крошечной, но, тем не менее, это был впечатляющий результат. Из него следовало, что эти клетки активировали ген neo^R. Они и начинали вести себя соответственно, как ЭС клетки. Но если он вводил гены поодиночке, ни одна клетка не выживала. Тогда Шинья Яманака и Казутоши Такахаши стали вводить в клетки различные комбинации из 23 генов. Результаты этих экспериментов они использовали для идентификации десяти генов, каждый из которых был необходим для создания неомицин-резистентных плюрипотентных клеток. Пробуя различные сочетания этих десяти генов, они, наконец, опытным путем определили минимальное количество генов, которые, действуя совместно, превращали фибробласты эмбриона в ЭС клетки.

Волшебное число оказалось четверкой. Когда в фибробласты вводились векторы, несущие в себе гены, называемые Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, происходило нечто совершенно невероятное. Клетки выживали в неомицине, демонстрируя тем самым, что они активировали ген neo^R, и как следствие, становились подобными ЭС клеткам. И это не все — фибробласты начинали менять форму и внешне превращаться в ЭС клетки. Прибегая к разнообразным экспериментальным системам, ученые смогли преобразовать эти перепрограммированные клетки в три основных типа тканей, из которых формируются все органы млекопитающих — эктодерму, мезодерму и эндодерму. Именно это и проделывают обычные ЭС клетки. Фибробластам такое просто не по силам. Затем Шинья Яманака продемонстрировал, что он может повторить весь процесс, пользуясь в качестве исходного материала фибробластами взрослых мышей, а не эмбрионов. Это стало доказательством, что успех его метода не зависит от каких-то особенностей эмбриональных клеток, но может также применяться при работе с клетками полностью дифференцированных и зрелых организмов.

Созданные им клетки Яманака назвал «индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками», и аббревиатура этого термина — iPS (иПС) клетки — сегодня уже прочно укоренилась в профессиональном языке всех, кто занимается биологическими исследованиями. Если только представить, что каких-то пять лет назад этого словосочетания просто не существовало, а теперь оно пользуется всемирным признанием среди ученых, то мы поймем, насколько важен и велик был этот прорыв в науке.

Трудно поверить, что клетки млекопитающих несут в себе около двадцати тысяч генов, и всего лишь четыре из них необходимы для того, чтобы превратить полностью дифференцированную клетку в ее плюрипотентную предшественницу. При помощи этих четырех генов профессор Яманака сумел закатить шарик с самого дна одной из уоддингтоновских ложбин в верхнюю точку его ландшафта.

Нет ничего удивительного в том, что Шинья Яманака и Казутоши Такахаши опубликовали результаты своих открытий в журнале Cell («Клетка») — самом авторитетном и солидном в мире издании, посвященном биологическим исследованиям[10]. Что заставило слегка удивиться, так это последовавшая реакция. Все в 2006 году понимали, что это величайшее открытие, однако понимали они и то, что назвать его таковым можно лишь в том случае, если публикация в журнале соответствует истине. Очень многие ученые просто не могли поверить, что так оно и есть. Нет, они ни на мгновение не заподозрили профессора Яманаку и доктора Такахаши во лжи или в какой-либо подтасовке результатов. Они всего лишь усомнились, что исследователи сами не ошиблись в чем-либо при проведении экспериментов, потому что не может быть все настолько просто. Это можно сравнить с тем, что человек, решивший найти Святой Грааль, обнаружил его уже на второй минуте поисков под пакетом с зеленым горошком у задней стенки собственного холодильника.

Вполне очевидное развитие событий, казалось бы, напрашивалось само собой — кто-нибудь должен повторить работу японских ученых и посмотреть, получатся ли у него такие же результаты. Для читателя, не занимающегося наукой профессионально, это может показаться странным, но лаборатории не помчались наперегонки друг с другом в стремлении первыми повторить исследования своих коллег. Шинья Яманака и Казутоши Такахаши потратили два года на проведение экспериментов, которые были в высшей степени трудоемкими и требовавшими скрупулезной точности на каждой их стадии. Другие лаборатории, кроме того, были жестко привязаны к проведению собственных исследовательских программ и не горели особым желанием отвлекаться от них. Еще одним препятствием было то, что организации, выделяющие исследователям средства для осуществления конкретных проектов, мягко говоря, не приходят в восторг, если сотрудники лабораторий вдруг забрасывают утвержденную программу исследований и начинают заниматься чем-то совершенно посторонним. Особенно неприятно и опасно в такой ситуации то, что конечные результаты могут оказаться негативными. На практике это означало, что только располагающая неограниченными финансовыми ресурсами и оснащенная по последним требованиям лаборатория с очень уверенным в себе руководителем может задуматься о том, чтобы «тратить время» на воспроизведение и повторение чьих-то экспериментов.

Рудольф Джениш из института Уайтхеда в Бостоне по праву считается колоссом в области создания генетически модифицированных животных. Родившийся в Германии, вот уже почти тридцать лет он работает в Соединенных Штатах. Обладатель вьющихся седых волос и впечатляющих усов, он сразу же приковывает к себе взгляды участников любых конференций. Может быть, и неудивительно то, что именно он стал тем ученым, который отважился отложить выполнение собственных исследовательских проектов и лично убедиться в том, что Шинья Яманака действительно осуществил невозможное. В конце концов, ему принадлежит следующее общеизвестное высказывание: «На протяжении многих лет я брался за многие рискованные проекты, поскольку считаю, что, если вам пришла блестящая идея, вы просто обязаны учитывать возможность неудачи и продолжать эксперименты».

На конференции в Колорадо в апреле 2007 года профессор Джениш выступил с докладом, в котором сообщил, что ему удалось повторить эксперименты Яманаки. Результаты совпали. Яманака был прав, iPS клетки действительно могут быть созданы при введении всего лишь четырех генов в дифференцированную клетку. Эта новость произвела на слушателей эффект разорвавшейся бомбы. В зале воцарилась атмосфера, подобная той, что можно увидеть в ключевых эпизодах старых фильмов, когда присяжные оглашают свой вердикт, и репортеры сломя голову бросаются к телефонам, чтобы сообщить о нем редакторам своих изданий.

Рудольф Джениш был великодушен — он охотно признал, что взялся за воспроизведение этих экспериментов, поскольку был уверен, что Яманака ошибается. То, что произошло после этого в отрасли, можно назвать настоящим переворотом. Во-первых, действительно крупные лаборатории, занимающиеся исследованиями стволовых клеток, начали изучать методику Яманаки, оттачивая и совершенствуя ее, чтобы добиться наибольшей эффективности. Через какую-то пару лет даже те лаборатории, которые прежде не вырастили ни единой ЭС клетки, вовсю занимались созданием iPS клеток из интересующих их тканей и доноров. Материалы исследований на тему iPS клеток теперь публикуются еженедельно. Эта техника модифицирована для прямого превращения человеческих фибробластов в нервные клетки человека без предварительного создания iPS клеток[11]. Это можно сравнить с тем, что мы закатываем шарик вверх до середины склона уоддингтоновского эпигенетического ландшафта, а затем запускаем его вниз по другой выемке.

Трудно не задаться вопросом, было ли для Шиньи Яманаки обидно, что никто не стал развивать его работу и пользоваться результатами исследований, пока американская лаборатория не доказала его правоту. В 2009 году он разделил Ласкеровскую премию с Джоном Гердоном, так что, возможно, он и не сильно переживает. Его репутация теперь не подлежит сомнению.

Если бы все, что мы читаем, являлось исключительно научной литературой, то наш рассказ об этой истории был бы повествованием восторженным и весьма незатейливым. Однако существуют и другие источники информации, в частности, патентные свидетельства, на которые обычно обращают внимание через некоторое время после появления в специализированных журналах статей, сопровождаемых рецензиями экспертов. Как только начинают появляться заявки на получение патента, история приобретает несколько усложненный сюжет. Для этого всегда требуется некоторое время, так как заявки на патент после представления документов в патентное ведомство остаются конфиденциальными от года до полутора лет. Это делается для того, чтобы защитить интересы изобретателей, поскольку такой льготный период дает им время завершить работу над некоторыми секретными аспектами своих исследований, не разглашая всему миру, что они изобрели. Здесь важно понимать, что и Яманака, и Джениш подали заявки на получение патентов на открытие, сделанное каждым из них в управлении судьбами клеток. Обе эти патентные заявки были приняты, патенты выданы, и теперь, вероятно, только в суде предстоит решать, кто из них имеет юридическое право на владение патентом. Осложняется решение этого вопроса тем, что, хотя Яманака первым опубликовал результаты своих исследований, подать заявку на получение патента первым успел Джениш.

Как могло такое случиться? Отчасти это объясняется тем, что процедура подачи заявки на получение патента весьма любопытна. Соискатель освобожден от необходимости доказывать каждый тезис, фигурирующий в его заявке. Он имеет право воспользоваться льготным периодом, чтобы попытаться найти какие-либо доказательства в поддержку утверждений, сделанных в патентной заявке. С юридической точки зрения, патент Шиньи Яманаки датирован 13 декабря 2005 года и темой его является работа, описанная в нескольких абзацах выше: как взять соматическую клетку и с помощью четырех факторов — Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус — превратить ее в плюрипотентную клетку. Официальной датой выдачи патента Рудольфу Дженишу значится 26 ноября 2003 года. В нем описываются некоторые технические аспекты и делаются заявления относительно экспрессии гена плюрипотентности в соматической клетке. Одним из упоминаемых в патенте генов является Oct4. Однако и прежде было известно, что ген Oct4 необходим для плюрипотентного состояния, в конце концов, это и была одна из причин, по которым Яманака включил его в свои первые эксперименты по перепрограммированию. Юридические споры вокруг этих патентов, вероятнее всего, завершатся весьма нескоро.

Но по какой причине эти две лаборатории, возглавляемые выдающимися и в высшей степени творческими учеными, вообще озаботились получением патентов? Теоретически, владение патентом предоставляет его обладателю некие эксклюзивные права и возможности в заявленной области. Однако в академических кругах никто и никогда даже подумать не может о том, чтобы пытаться воспрепятствовать коллеге из другой лаборатории в проведении научных экспериментов. Единственным практическим назначением патента является гарантия того, что настоящий изобретатель сможет получить финансовую прибыль от озарившей его идеи, и по праву заслуженные им деньги не потекут в карманы предприимчивых мошенников.

Наиболее прибыльными патентами в биологии вообще являются те, описанные в которых открытия могут быть использованы для лечения заболеваний людей или помочь исследователям быстрее разработать новые лекарственные средства. Именно по этой причине разгорелась столь нешуточная борьба между Дженишем и Яманакой за право обладания патентом. В суде могут постановить, что каждый раз, когда кто-либо получит iPS клетки, он должен будет заплатить деньги исследователям и лабораториям, первыми добившимися успеха в этом направлении. Если компании станут продавать полученные ими iPS клетки и отчислять определенный процент прибыли держателям патента, финансовая выгода для последних может оказаться весьма существенной. Стоит поговорить о том, почему эти клетки являются настолько ценным в монетарном выражении товаром.

Разберем это на примере какого-нибудь заболевания, скажем, диабета 1 типа. Он обычно возникает в детстве, когда определенные клетки поджелудочной железы (носящие просто волшебное название — бета-клетки островков Лангерганса) разрушаются в ходе процесса, природа которого не до конца ясна. Погибая, эти клетки никогда уже не восстанавливаются и не заменяются новыми, и в результате этого больной не способен более вырабатывать гормон инсулин. Без инсулина невозможно контролировать уровень сахара в крови, и последствия этого могут быть просто катастрофическими. До тех пор, пока не были обнаружены способы получения инсулина у свиней и введения его больным, дети и подростки регулярно умирали из-за диабета. Даже сегодня, когда прием инсулина (теперь это обычно искусственно синтезированный человеческий гормон) стал делом вполне обыденным, эта процедура продолжает сопровождаться целым рядом обременительных проблем. Больным приходится измерять уровень содержания сахара в крови по нескольку раз в день и соответственно менять дозы лекарства и рацион, стараясь оставаться в пределах жестко установленных границ. Заниматься этим на протяжении многих лет чрезвычайно сложно, особенно для подростков. Много ли вы знаете детей, которые искренне беспокоятся о том, что с ними может что-то случиться, когда им стукнет сорок? А хронический диабет 1 типа способен спровоцировать самый широкий спектр осложнений, включая потерю зрения, нарушение кровообращения, которое может привести к ампутациям, и заболевания почек.

Как было бы здорово, если вместо того, чтобы ежедневно делать себе инсулиновые инъекции, диабетики смогли бы получить новые бета-клетки! Тогда они сами снова смогли бы вырабатывать инсулин. Собственные внутренние механизмы организма обычно очень эффективны в контролировании уровня содержания сахара в крови, так что о большей части проблем можно было бы просто позабыть. Загвоздка в том, что в организме не существует клеток, которые могли бы преобразоваться в бета-клетки (они располагаются на самом дне одной из уоддингтоновских ложбин), поэтому нам придется прибегать к трансплантации поджелудочной железы или, возможно, превратить некоторые человеческие ЭС клетки в бета-клетки и ввести их в организм.

Выполнению этой задачи препятствуют две большие проблемы. Первая из них заключается в том, что донорский материал (как ЭС клетки, так и здоровая поджелудочная железа) в большом дефиците, и его никогда не будет достаточно для обеспечения всех диабетиков. Но даже если бы мы располагали им в достаточных количествах, существовал бы серьезный риск того, что они окажутся не совсем такими, как ткани пациента. Иммунная система больного идентифицирует их как чужеродные и попытается отторгнуть. В этом случае пациент, возможно, и избавится от необходимости делать себе инсулиновые инъекции, но будет вынужден всю свою жизнь принимать иммуно-подавляющие лекарственные препараты. Такое решение проблемы никак нельзя назвать приемлемым, поскольку эти препараты обладают целым рядом чрезвычайно тяжелых побочных эффектов.

Принципиально новый выход из этой запутанной ситуации предлагают iPS клетки. Возьмем крошечный соскоб клеток кожи у нашего пациента, которого условно назовем Фредди. Будем выращивать эти клетки в культуре, пока не получим достаточного количества, с которым можно было бы работать (это очень просто). Воспользуемся четырьмя факторами Яманаки для создания большого количества iPS клеток, обработаем их в лаборатории, превращая в бета-клетки, а после этого вернем пациенту. Иммунного отторжения не произойдет, поскольку Фредди получит обратно свои собственные клетки. Недавно ученые продемонстрировали, что на практике это вполне осуществимо, когда они проделали эту процедуру на больных диабетом мышах[12].

Все это, конечно, не так просто. Еще предстоит преодолеть целый сонм технологических барьеров, не говоря уже о том, что один из четырех факторов Яманаки, с-Мус, провоцирует развитие рака. Но за несколько лет, прошедших после той знаменитой публикации в журнале Cell, ученым удалось достичь заметного прогресса в совершенствовании технологий, благодаря чему мы теперь находимся едва ли не на самом пороге клинических испытаний. Мы научились создавать человеческие iPS клетки так же легко и уверенно, как мышиные, причем для этого теперь далеко не всегда используется с-Мус[13]. Разработаны новые способы создания клеток, устраняющие и некоторые другие тревожившие нас раньше проблемы безопасности. Например, при ранних методиках создания iPS клеток на стадии клеточной культуры использовались животные продукты. Это было небезопасно, поскольку всегда имел место риск заражения человека специфическими болезнями животных. Однако теперь исследователи обнаружили синтетические заменители этих животных продуктов[14]. Весь процесс воспроизводства iPS клеток постоянно и неуклонно совершенствуется. Но финишную черту мы пока не пересекли.

Одна из проблем, связанных с воспроизводством iPS клеток в промышленных масштабах, состоит в том, что мы пока не знаем, каковы будет требования регулирующих органов к вопросам безопасности, прежде чем они разрешат использовать iPS клетки для лечения людей. В настоящее время предоставление прав на терапевтическое использование iPS клеток регламентируется двумя совершенно разными инструкциями. Происходит это по той причине, что мы будем вводить пациенту клетки (клеточная терапия), которые были предварительно генетически модифицированы (генная терапия). Регламентирующие органы чрезвычайно осторожны по той причине, что очень многие испытания в области генной терапии, с завидным энтузиазмом проводившиеся в 1980-х и 1990-х годах, в лучшем случае не приносили больным никакой практической пользы, а иногда приводили к непредвиденным и ужасающим последствиям, в том числе к развитию смертельных форм рака[15]. Количество потенциальных регулятивных барьеров, которые предстоит преодолеть iPS клеткам, прежде чем они получат право применяться в терапевтических целях, поистине неисчислимо. Можно было бы подумать, что ни один инвестор не станет вкладывать собственные деньги в такие рискованные проекты. Однако вкладывают, и делают они это по той причине, что если исследователи смогут разработать непогрешимую технологию, то рентабельность инвестиций будет колоссальной.

Вот всего лишь один расчет. По самым скромным оценкам, на обеспечение инсулином и оборудованием для измерения уровня сахара в крови каждого диабетика в Соединенных Штатах затрачивается ежемесячно около 500 долларов. За год эта цифра вырастает до 6000 долларов, следовательно, если человек болеет диабетом в течение сорока лет, то на него будет израсходовано 240 тысяч долларов. Прибавим сюда затраты на все виды лечения, которые потребуется пройти даже тем диабетикам, которые скрупулезно следят за своим здоровьем, поскольку никто из них не застрахован от осложнений, провоцируемых их болезнью. Нетрудно будет подсчитать, что затраты на поддержание здоровья каждого человека, болеющего диабетом, в течение его жизни составят не менее миллиона долларов. А только в Соединенных Штатах насчитывается как минимум миллион человек, страдающих диабетом 1 типа. Это означает, что в самом лучшем случае экономика США расходует свыше миллиарда долларов каждые четыре года только на борьбу с диабетом 1 типа. Так что, какой бы затратной ни оказалась дорога iPS клеток в клиники, они потенциально способны принести инвесторам громадные прибыли, если использование их окажется дешевле, чем расходы на нынешнее лечение диабетиков на протяжении всей их жизни.

И это мы коснулись только диабета. А сколько еще, кроме него, болезней, панацеей от которых могли бы стать iPS клетки! В первую очередь, они смогли бы помочь больным, страдающим нарушениями свертываемости крови, такими как гемофилия, болезнью Паркинсона, остеоартритом и слепотой, вызванной дегенерацией желтого пятна. По мере того как ученые будут разрабатывать все новые технологии производства искусственных структур, которые могут быть имплантированы в наши организмы, мы научимся использовать iPS клетки для замены поврежденных кровеносных сосудов при заболеваниях сердца, для регенерации тканей, пораженных раком, и его лечения.

Исследования в области iPS клеток финансирует и Министерство обороны США. Военные всегда нуждаются в больших запасах крови, чтобы в любой боевой ситуации иметь возможность лечить раненный личный состав. Красные кровяные тельца не похожи на большинство клеток нашего организма. В них нет ядер, а это значит, что они не могут делиться и тем самым образовывать новые клетки. Благодаря этой особенности красные кровяные тельца представляют собой наиболее подходящий с точки зрения безопасности материал, с которого можно было бы начать клинические испытания iPS клеток, так как они остаются в организме лишь несколько недель. Кроме того, мы не отторгаем эти клетки так же, как могли бы поступить, например, с донорской почкой, по той причине, что наша иммунная система распознает эти клетки несколько иначе. Разные люди могут иметь совместимые красные кровяные тельца — это знаменитая система групп крови АВО плюс некоторые дополнительные факторы. Было подсчитано, что с помощью всего лишь сорока доноров с каждой группой крови можно было бы создать банк клеток iPS, который бы полностью удовлетворил все наши потребности[16]. Поскольку iPS клетки способны продолжать делиться, производя все больше и больше iPS клеток, если выращивать их в правильных условиях, мы могли бы стать обладателями поистине неисчерпаемого банка клеток. Существуют проверенные и надежные способы извлечения незрелых стволовых клеток крови и методик их выращивания, воздействуя на клетки различными стимуляторами таким образом, чтобы они дифференцировались и превращались (в конечном итоге) в красные кровяные тельца. В результате, стало бы возможным создать огромный банк красных кровяных телец различных групп, чтобы всегда располагать достаточными запасами крови соответствующей группы, необходимой для переливания пациентам, поступившим с поля боя или выжившим в автомобильной аварии.

Получение iPS клеток стало одним из тех редких событий в биологии, которые не просто расширяют границы известного, но и открывают совершенно новые, немыслимые прежде возможности. По мнению многих, Шинья Яманака является главным претендентом на то, чтобы в самом ближайшем будущем разделить Нобелевскую премию с Джоном Гердоном, поскольку трудно переоценить практическую ценность проделанной ими работы. Но хотя их достижения по праву считаются исключительными, сама природа делает то же самое намного эффективнее и быстрее.

Когда сперматозоид и яйцеклетка сливаются, два ядра перепрограммируются цитоплазмой яйцеклетки. Ядро сперматозоида, в частности, очень быстро утрачивает большую часть своей молекулярной памяти о том, чем оно было прежде, и становится едва ли не чистым холстом. Именно этот феномен перепрограммирования использовали и Джон Гердон, и Иэн Вилмут с Китом Кэмпбеллом, когда помещали взрослые ядра в цитоплазму яйцеклеток и создавали новые клоны.

При слиянии яйцеклетки и сперматозоида начинается стремительный процесс перепрограммирования, на который затрачивается всего лишь 36 часов. Когда Шинья Яманака впервые получил iPS клетки в ничтожных количествах, то — в самых удачных его экспериментах — лишь крохотная доля созданных клеток, значительно менее одного процента, оказалась перепрограммирована. Для того чтобы вырастить первые перепрограммированные iPS клетки, потребовалось несколько недель. С тех пор удалось достичь существенного прогресса в повышении количества создаваемых клеток и скорости перепрограммирования взрослых клеток в iPS клетки, но при этом мы ни на шаг не приблизились к показателям, демонстрируемым при естественном оплодотворении. Почему?

Ответом на этот вопрос является эпигенетика. Дифференцированные клетки особым образом эпигенетически модифицируются, и происходит это на молекулярном уровне. Вот почему фибробласты кожи в обычных условиях всегда останутся кожными фибробластами и никогда не превратятся, например, в кардиомиоциты. Когда дифференцированные клетки перепрограммируются, чтобы стать плюрипотентными клетками — с помощью переноса ядра соматической клетки или четырех факторов Яманаки,—то специфическая для данной дифференциации эпигенетическая отличительная черта должна быть удалена, чтобы ядро стало более похожим на ядро только что оплодотворенной зиготы.

Цитоплазма яйцеклетки невероятно эффективна в обращении вспять эпигенетической памяти наших генов, действуя как гигантский молекулярный ластик. Именно это и делает она с огромной скоростью, когда ядра яйцеклетки и сперматозоида, слившись, образуют зиготу. Искусственное перепрограммирование для создания iPS клеток больше похоже на действия первоклассника, выполняющего домашнюю работу — он то и дело стирает неловко написанную букву в одном и том же слове и, в конце концов, протирает в странице дырку, так как работает ластиком слишком усердно. Хотя мы постепенно и начинаем все больше разбираться в участвующих в этом процессах, нам по-прежнему еще очень и очень далеко до воссоздания в лабораторных условиях того, что происходит в природе естественным путем.

До сих пор мы рассуждали только о феномене эпигенетики. Теперь настало время поговорить о молекулах, лежащих в основе всех удивительных явлений, которые мы уже успели рассмотреть, и многих других, с которыми нам еще предстоит познакомиться.