Физико-химические факторы биологической эволюции (1979)

_{Есть, однако, и существенное различие. Величина кинетиче}­_{ского совершенства U характеризует (при прочих равных усло­виях) скорость возрастания массы веществ данного видя, a W{— приращение численности (особей, молекул) данного вида. Это различие становится важным при сопоставлении биологиче­ского совершенства дальних родственников, например, мелкихс крупными. Wi является непосредственным критерием отбора, U — как непосредственным критерием отбора, так и абсолютной характеристикой биологического совершенства данного вида.}

_{Эйген ограничивает свою задачу физико-химическим анали­зом лишь первых шагов биологической эволюции. Основной проводимой здесь мною мыслью является применимость одного и того же критерия естественного отбора — кинетического (био­логического) совершенства на всем пути биологической эволю­ции от «самого начала» до человека.}

_{Мне не кажется правильным писать в настоящее время урав­нения динамики эволюционного процесса для поздних его эта­пов. В сущности вся сложность динамики этого процесса скры­вается в параметре К. в уравнении типа:}

_{ihi = Kimi.}

_{Однако К зависит от многих переменных — совершенства матричного конвариантного воспроизведения, совершенства катализаторов, совершенства процессов использования энергии, совершенства аппаратов перемещения в пространстве и т. д. Все эти переменные и являются факторами биологической эволюции‘. По существу их можно охарактеризовать в физико-химических терминах. Поэтому в книге и рассматриваются физико-химиче­ские факторы биологической эволюции. Все эти факторы под­даются количественной оценке.}

_{В самом деле, т,- в конце концов определяется скоростью синтеза полимерных молекул, скоростью притока и оттока метаболитов, эффективностью использования энергии, длитель­ностью нативного существования матричных молекул и других компонентов организмов.}

_{Прослеживание детальных путей возрастания т( в зависи­мости от того или иного физико-химического фактора нереально. Зато вполне реальна оценка предельного по данному фактору значения т(. Полагая время, отводимое на эволюционное совер­шенствование в данном направлении достаточно большим, можно оценить предельно возможную, ограничиваемую лишь физиче­скими законами, скорость синтеза полимерных молекул, пре­дельно возможную эффективность преобразования энергии, предельно возможную скорость притока и оттока метаболитов, предельно возможную скорость перемещения организмов в про­странстве и т. д. Такой «принцип предельного совершенства»,}

_{как метод дед^кхивного анализа траекторий и динамики эволю­ционного проц'есса> оказывается, по-видимому, единственно воз­можным применительно к столь сложному предмету, каким является биолс)ГИЧеСкий эволюционный процесс.}

_{Используя этот метод для прослеживания процесса эволюции «с самого начала», можно убедиться в том, что физико-химиче­ские факторы биологической эволюции выступают на эволюцион­ную арену последовательно. Сначала возрастание величины тп{ определяется, например, скоростью синтеза полимерных цепей из предсуществующих, возникших «абиотически», мономеров. Потом оказывается, что рост определяется уже ростом концен­трации этих мономеров, зависящим от скорости их биосинтеза. Потом оказывг^тся, что при некоторых величинах скорости син­теза полимеров и скорости (био) синтеза мономеров дальнейшее увеличение определяет «транспорт»—скорость притока}

_{«пищи» и оттока «катаболитов». Так, одно узкое место, ограни­чивающее рост rhi, сменяет другое, один физико-химический фактор биологической эволюции перестает быть критерием естественного отбора и сменяется в этом качестве другим, очередным фактором. В силу этого процесс эволюции идет ступенчато: периоды быстрого увеличения при движении к физическому пределу по данному фактору эволюции сменя­ются периодами поиска новых принципов увеличения ть по новому критерию естественного отбора, соответственно очеред­ному фактору эволюции.}

_{Дальнейшая задача этой книги и состоит в выявлении и характеристике роли различных факторов эволюции на разных этапах биологического эволюционного процесса.}

_{Глава 3}

_{ЕСТЕСТВЕННЫЙ ОТБОР МАТРИЧНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ, СПОСОБНЫХ К КОНВАРИАНТНОМУ ВОСПРОИЗВЕДЕНИЮ}

_{Спонтанное возникновение в планетных условиях полипептидов и полинуклеотидов, вовлекаемых в естественный отбор.}

_{Необходимость однозначного соответствия полипептидных и полинуклеотидных полимерных цепей. Проблемы генетического кеда, прямого структурного соответствия полинуклеотидов и полипептидов}

_{( «узнавание»).}

_{Белки и нуклеиновые кислоты в дальнейшей эволюции. Разделение функций.}

_{Фенотип и генотип.}

_{Из многих в принципе возможных систем матричного конвари- антного воспроизведения, обладающих сходными физико-хими­ческими свойствами, рано или поздно остается («побеждает») лишь одна с наибольшим эволюционным потенциалом. Таким образом, существенным этапом эволюции оказывается отбор эво­люционирующей системы. Рассмотрим критерии выбора такой системы.}

_{Эволюционный потенциал, естественно, сильно зависит от фи­зико-химической природы матричных молекул.}

_{Из простых соображений ясно, что /,• будет тем больше, чем больше удельная поверхность матричного вещества. Предельно большой поверхностью обладает одномерный кристалл — нить. Эволюционный потенциал зависит от разнообразия элементов матричной нити. Необходим набор элементов, обеспечивающий все возможные каталитические и матричные свойства.}

_{Таким образом, максимально возможным эволюционным по­тенциалом будет обладать одномерная последовательность раз­личных элементов кристаллической решетки — «букв, образу­ющих строки». Следуя принятому нами при описании эволюци­онного процесса принципу предельного совершенства, мы можем отнести все сказанное о естественном отборе в полиморфной кри­сталлической системе к одномерному апериодическому кристал­лу [344], т. е. к гетерополимерной макромолекулярной нити, со­стоящей из набора разных мономеров, порядок чередования ко­торых в полимерной цепи может быть разным.}

_{Необходимо лишь, чтобы такая нить обладала матричными свойствами, чтобы любое чередование мономеров в цепи было в принципе термодинамически равновероятным, но отличалось другот друга по кинетическим свойствам *. Этим общим условиям соответствуют нуклеиновые кислоты.}

_{Однако прежде чем перейти к анализу возможных этапов эво­люции в конкретных биохимических системах, рассмотрим усло­вия, необходимые для начала биологической эволюции.}

_{Условия неизбежности начала биологической эволюции. Эво­люция становится неизбежной при выполнении основных усло­вий: существования механизмов матричного, конвариантного воспроизведения и различия в скоростях воспроизведения раз}­_{ных форм полиморфных матриц.}

_{Таким условиям удовлетворяет одномерная полимерная нить, для которой скорость матричного размножения, скорость синтеза матричных копий зависит от природы и последователь­ности мономеров.}

_{При выполнении этих двух условий в ограниченном простран­стве—ареале (третье условие)—при неравновесности самой системы или при наличии внешнего источника свободной энер­гии в среде, содержащей все необходимые компоненты для спон­танного возникновения линейных гетерополимеров (четвертая группа условий) начнется эволюционный процесс, и будет осу­ществляться естественный отбор по критерию наибольшей ско­рости образования полимера данного вида. Слово «вид» употреблено здесь вполне сознательно, хотя это еще совсем не такой же вид, как «ящерица прыткая» или «овес посевной» (см. гл. 2, стр. 36).}

_{Однако реализация эволюционного потенциала системы, удовлетворяющей только этим условиям, может оказаться очень затрудненной. Ареал может быть заполнен формой, полимеризу- ющейся не с наибольшей скоростью. Затравка этой формы воз­никает случайно, в результате тепловых флуктуаций, и вероят­ность того, что случайно возникшая затравка соответствует наи­более кинетически совершенной форме очень мала. Вместе с тем заполнившая ареал полимерная форма будет препятствовать об­разованию более совершенных форм — материала для их постро­ения не останется, а тот, который уже использован для построе­ния заполнивших ареал матриц, защищен кинетическими потен­циальными барьерами от посягательств пусть и способных к бо­лее быстрому воспроизведению зародышей, но возникающих позже затравок новых матриц. Речь идет, следовательно, о том, что одна даже самая удачная мутантная форма способная обес­печить наибольшую скорость матричного воспроизведения «ни­чего не сможет сделать» с уже заполнившей ареал менее совер­шенной массой полимерных молекул.}

_{Нужно «открыть путь» для реализации полезных мутаций, реализации эволюционного потенциала. Этого можно достичь}

^;I _{Для этого энергии связей между мономерами в полимерной цепи должны быть одинаковыми в разных последовательных сочетаниях мономеров.}

_{лишь одним способом: время жизни каждой матричной полимер­ной молекулы должно быть ограниченным, необходима зако­номерно наступающая смерть, т. е. распад матричных молекул по истечении некоторого времени жизни. Иными словами, условием длительного осуществления эволюции оказывается смена про­цессов синтеза процессами распада.}

_{Каков в общем виде способ реализации вновь возникших му­таций в условиях заполненности ареала ранее образовавшимися видами?}

_{Наверное, таких способов, по крайней мере, два. Вновь воз­никшие виды должны быть в состоянии «поедать» виды, образо­вавшиеся ранее, и использовать их материал для построения сво­их матричных молекул, или ранее появившиеся виды должны са}­_{ми распадаться по истечении некоторого времени жизни. Первый способ (столь популярный на поздних стадиях эволюции), по- видимому, нереален на ранних интересующих нас сейчас стади­ях. Представим себе даже, что вновь возникшие затравки — ма­трицы — обладают каталитическими свойствами, позволяющими им ускорить распад образовавшихся ранее. И что же? Эти ката­литические свойства приведут к разрушению как ранее возник­ших, так и вновь возникающих. Невероятно спонтанное в резуль­тате однократной мутации появление в полимерной цепи такой последовательности мономеров, которая катализировала бы рас­пад всех остальных последовательностей, а свою бы не разру­шала. Для избирательного поедания представителей лишь чужого вида необходим длительный процесс эволюционного совершен­ствования, выработки механизмов различения «свое — чужое».}

_{Для обеспечения распада матричных молекул нет необходи­мости придумывать сложные регуляторные механизмы — типа бомбы замедленного действия, взрывающей матричную полимер­ную молекулу после некоторого времени ее существования, ее жизни. Эволюция осуществляется в открытой системе, пронизы­ваемой потоками энергии разного типа, которые обеспечивают эволюцию энергетически и служат причиной мутаций. Таким об­разом, в результате мутаций возникают не только затравки но­вых видов. Тепловые флуктуации, ультрафиолетовое и более жесткое излучения повреждают уже заполимеризованные ма}­_{тричные молекулы. Накопление возникших повреждений и при­водит через некоторое время (время жизни) к разрушению по­лимерных молекул.}

_{Однако на самих примитивных стадиях эволюционного со­вершенствования может преобладать весьма простой механизм, ограничивающий время жизни уже образовавшихся матричных форм.}

_{В нашей абстрактной модели с полиморфной кристаллизаци­ей время жизни данной г'-й формы тем меньше, чем быстрее она образуется. Действительно, одинаковая термодинамическая ста­бильность всех форм означает равенство всех констант равно­весия Кг для всех i реакций кристаллизации (полимеризации) из мономеров в полимер i-го вида. Так как:}

_Kt=ki'/ki",

_{где k{ и к/' — константы скорости соответственно процессов об­разования и растворения (плавления) кристаллов, отношения всех к/ и к" равны для всех i: чем быстрее образуется кристалл {чем больше k/), тем быстрее он растворяется (тем больше к/').}

_{В этой системе сначала все пространство заполняется преи­мущественно видом кристаллов, образующимся быстрее всего, а затем появляются и медленно растущие кристаллы. Через не­ограниченно большое время весь объем заполнится всеми воз­можными формами в соответствующих долях.}

_{Все приведенное выше рассуждение относилось к закрытой системе. При условии притока энергии картина может оказаться совершенно иной; возможны кинетические «приспособления» — «барьеры», замедляющие распад даже .быстрее всего возника­ющей формы.}

_{В этом случае жизнь полимерных матричных молекул сла­гается из двух качественно различных стадий, или периодов, или фаз: периода роста — относительно быстрой (и, быть может, ускоряющейся) полимеризации по возникшей затравке, т. е. пе­риода матричного размножения, и периода относительно мед­ленного умирания, т. е. накопления разрушений и, по-видимому, быстрого распада.}

_{Эволюция нуклеиновых кислот — первый этап биологической эволюции. Главный кризис — необходимость возникновения полипептидных катализаторов-ферментов. Возможно, что пере­численным выше необходимым условиям начала биологической эволюции отвечает большое число различных по химической при­роде веществ — гетерополимеров. Реальное осуществление эво­люционного процесса, выбор той или иной системы матричного воспроизведения зависит прежде всего от возможности спонтан­ного, доэволюционного образования соответствующих этим усло­виям веществ. Иными словами, общее направление эволюционно­го процесса с самого начала полностью детерминировано хими­ческими и физическими свойствами среды.}

_{Как следует из множества данных последних лет, в планет­ных условиях, т. е. при температурах и давлениях, соответству­ющих существованию полимерных химических веществ, с наи­большей вероятностью под влиянием ультрафиолетового и дру­гого излучения из воды, углекислоты, аммиака, цианидов обра­зуются аминокислоты, нуклеиновые основания, а также углево­ды. Кроме того, спонтанно образуются нуклеотиды, полинуклео­тиды и полипептиды (см. [1, 16, 23, 24, 53, 126, 127, 128, 132, 207, 228, 240, 243, 250, 261, 303, 306, 309а, 385, 389, 390, 408., 447, 448]).}

_{Итак, аминокислоты, нуклеотиды и их полимеры — весьма вероятный исходный материал для естественного отбора. Намследует попытаться решить, какие же системы — полипептиды или полинуклеотиды — больше соответствуют указанным выше условиям, с неизбежностью приводящим к эволюционному со­вершенствованию. Необходимо, чтобы полимер синтезировался матричным образом с конвариантным сохранением вариантов- мутаций, чтобы скорости этого синтеза были различными для разных последовательностей мономеров в полимерной цепи и чтобы время жизни уже синтезированных матричных копий было не очень большим.}

_{Для выбора возможного исходного объекта эволюции необхо­димо тщательное сопоставление реальных свойств полинуклеоти­дов и полипептидов.}

_{«Матричность» полинуклеотидов бесспорна. Вопрос «матрич- ности» полипептидов должен еще стать предметом непредвзя­того исследования (см. [421]). Можно предполагать, что скорости спонтанного синтеза и матричной полимеризации для разных последовательностей мономеров неодинаковы и для полипепти­дов, и для полинуклеотидов. Однако и этот вопрос требует тща­тельного исследования (литературного, теоретического и экспе­риментального) .}

_{Старение — ограниченность времени сохранения нативности— свойственна и белкам, и нуклеиновым кислотам. Длительность сохранения нативности зависит от реальных условий.}

_{Мы еще вернемся к этим вопросам, в частности к возможной «матричности» полипептидов. Пока же поступим следующим образом. Примем сначала, что матрицами являются только по­линуклеотиды, что только они соответствуют условиям неизбеж­ного начала эволюционного процесса и посмотрим, как при та­ком допущении должен идти эволюционный процесс. Затем при­мем другую версию — предположим, что матрицами являются и полипептиды и попытаемся понять как в таком случае должен осуществляться эволюционный процесс. А потом сопоставим по­лученное с современными биохимическими данными.}

_{Представим себе первичную полинуклеотидную эволюцион­ную систему. В среде спонтанно, в результате флуктуаций, воз­никают разные последовательности нуклеотидов в небольших по­лимерных цепях — образуются низкомолекулярные нуклеиновые кислоты со случайной последовательностью мономеров. По этим возникающим в результате флуктуаций затравкам идет кристал­лизация (матричное воспроизведение, размножение), на что рас­ходуются мономеры из среды. В конкуренции за «пищу» —моно­мерный материал для полимеризации — происходит естествен­ный отбор определенных последовательностей нуклеотидов по признаку наибольшей скорости матричного синтеза.}

_{Полимерные молекулы стареют и разрушаются. С некоторого момента темп эволюции, темп естественного отбора будет опре­деляться именно скоростью разрушения возникших ранее по­лимерных молекул. Этот момент наступит тогда, когда скорость.}

_{интенсивность, матричных синтезов сравняется и превзойдет ин­тенсивность спонтанного образования в среде новых мономерных молекул нуклеотидов.}

_{Так мы подошли к рассмотрению первого кризиса в биологи­ческой эволюции — дальнейшее совершенствование, т. е. даль­нейшее ускорение матричного воспроизведения посредством уже существующих механизмов оказывается невозможным. Здесь эволюционирующая система может задержаться неопределенно долго до тех пор, пока не возникнет принципиально новый меха­низм ускорения кинетического совершенствования объектов эво­люции. Есть два неисключающих друг друга пути выхода из это­го самого острого в биологической эволюции кризиса: первый — выработка механизмов ускорения синтезов мономеров и вто­рой — выработка механизмов ускорения разрушения «старых» полинуклеотидов. Избирательное ускорение определенных хими­ческих реакций есть катализ. Следовательно, основное содержа­ние второго этапа биологической эволюции — возникновение в ходе естественного отбора предельно совершенных катализато­ров-ферментов. Самое естественное начальное предположение состоит в допущении каталитических свойств у самих матричных полимерных молекул. В одном отношении такое допущение три­виально — матрицы избирательно катализируют синтез своих копий ‘.}

_{Однако рассматриваемый нами кризис обусловлен не недо­статочной скоростью синтеза на матрице полимеров из мономе­ров, а недостаточно высокой концентрацией именно мономеров. Было бы невероятно счастливым совпадением наличие нужных нам каталитических функций у самих матричных молекул, их спо­собность ускорять процессы синтеза мономеров или разрушения старых полимерных молекул.}

_{Более того, молекулы, способные к конвариантиому матрич­ному воспроизведению, должны обладать (для обеспечения со­вершенства в этой функции) возможно меньшей химической ак­тивностью, возможно меньше «ввязываться» в разные химиче­ские процессы; их назначение—сохранение уникальных возник}­_{ших в результате естественного отбора последовательностей мо­номеров в полимерной цепи. Иными словами, они обеспечивают наследственность и являются основой изменчивости. Каталити­ческие функции должны быть отделены от них.}

_{Тем не менее возникновение таких катализаторов-ферментов в ходе естественного отбора возможно лишь при условии зависи­мости синтеза этих катализаторов от последовательности моно­меров в полимерной полинуклеотидной цепи. Иными словами, данная последовательность нуклеотидов должна определять свойства катализатора, возникающего на полинуклеотидной ма­трице.}

_{В силу основного механизма эволюционного совершенствова­ния катализаторы-ферменты по своему происхождению должны представлять собой одномерные нитчатые полимеры. Иначе не­возможен постепенный процесс совершенствования катализато­ров в результате отбора полезных мутаций, сопряженный с со­вершенствованием полинуклеотидных матриц.}

_{Химические реакции, избирательный катализ которых необ­ходим для обеспечения должной скорости синтеза матричных ко­пий данного вида, сложны и разнообразны. Соответственно слож­ными и разнообразными должны быть функциональные свойст­ва ферментов. Требованиям относительно большой реакционной способности, возможности существования в виде полимерных нитчатых молекул отвечают аминокислоты и их полимеры — белки. К тому же, как мы видели, аминокислоты и полипептиды легко возникают спонтанно в планетных условиях. Удовлетво­римся земным опытом и будем считать разнообразие из 20 амино­кислот достаточным для обеспечения всех свойств ферментов. Главным для нас в данном контексте является вопрос о способе сопряжения синтезов двух полимерных систем — полинуклеотид­ной и полиаминокислотной (полипептидной). Необходимо, чтобы последовательность аминокислот в полипептидной цепи опреде­лялась последовательностью нуклеотидов в полинуклеотидной це­пи. Если наличие образующего в результате такого соответствия фермента способствует большей скорости матричного воспроиз­ведения нуклеотидной последовательности данного вида, то и количество этого фермента тоже увеличивается быстрее.}

_{Следовательно, на начальных стадиях эволюции, когда еще не возникли сложные механизмы обеспечения опосредованного со­ответствия полинуклеотидного и полипептидных синтезов, долж­на существовать прямая связь между последовательностью ну­клеотидов и синтезом полипептидных цепей. Отсюда следует, что полинуклеотидная цепь должна непосредственно влиять на последовательность аминокислот и скорость синтеза полипептид­ной цепи *.}

_{Итак, исходя из общих эволюционных соображений, следует,, что такая связь — непосредственный, избирательный катализ об­разования полипептидной цепи на полинуклеотидной цепи — должна была иметь место. Иначе не может начаться эволюцион­ное совершенствование белков, не способных к самостоятельному матричному воспроизведению и, значит, к самостоятельному уча­стию в процессе эволюции.}

_{Получается, следовательно, такая картина. Нуклеотидная цепь ускоряет синтез полипептидных цепей. Образуются полипеп­тиды, в которых последовательность аминокислот соответствует последовательности нуклеотидов. Некоторые последовательности аминокислот в полипептидной цепи оказываются способными ускорять синтез мононуклеотидов или ускорять распад уже су­ществующих полинуклеотидов, ускоряя тем самым эволюцион­ный процесс. Острейший кризис начального этапа биологической эволюции преодолевается — возобновляется естественный отбор полинуклеотидных матриц, причем теперь уже по признаку их способности обеспечить синтез все более каталитически совершен}­_{ных полипептидных цепей.}

_{Как ясно из сказанного, условием преодоления этого кри­зиса, условием продолжения биологической эволюции должно быть прямое, контактное соответствие нуклеотидных матриц по- липептидным отпечаткам. Посмотрим, в какой мере последнее- требование реализуется в действительности.}

_{При первоначальном знакомстве с современной биохимией кажется, что такого соответствия нет. Последовательность ами­нокислот в полипептидных цепях определяется не непосредствен}­_{ным контактом аминокислот и нуклеотидов матричной цепи ну­клеиновых кислот, а посредством адаптора — тРНК}[4]_{. Необходи}­_{мость адаптора в свое время предсказал Крик на основании гео­метрических соображений. Каждая аминокислота кодируется- тремя нуклеотидами. Нуклеотидный триплет много больше ами­нокислотного радикала и строгое геометрическое соответствие- триплета аминокислоте невозможно. Все верно. Однако извест­ны весьма важные биохимические процессы, в которых осущест­вляется непосредственное, строго специфическое взаимодейст­вие аминокислот и нуклеотидов. Так, сам процесс соединения аминокислотного ацильного остатка с гРНК основан на таком непосредственном взаимодействии, обеспечиваемом строгим спе­цифическим соответствием аминокислотной последовательности в полипептидной цепи и нуклеотидной последовательности в по­линуклеотидной цепи. Речь идет о процессе узнавания специфи}­_{ческой для данной аминокислоты тРНК специфической же моле­кулой фермента—аминоацил-тРНК-синтетазой. Напомним' здесь высказывания В. А. Энгельгардта: «Зашифровку амино­}

_{кислот, осуществляемую действием фермента аминоацил-тРНК- синтетазы, можно считать узловым пунктом всего механизма биосинтеза белков. Здесь впервые скрещиваются и неразрывно переплетается биохимические функции обеих главенствующих групп биологических полимеров — белков и нуклеиновых кислот» [133, 353]. Итак, это «узнавание» происходит при строго специ­фическом непосредственном взаимодействии аминокислотных и нуклеотидных радикалов — белка-фермента и нуклеиновой кис­лоты. Можно было бы привести и другие примеры специфическо­го взаимодействия аминокислотных и нуклеотидных последова­тельностей.}

_{Механизм узнавания интенсивно изучается последние годы (см. [453]).}

_{Представляют интерес взгляды на этот вопрос В. И. Брускова, изложен­ные им на нашем семинаре еще осенью 1966 г. Брусков полагал, что строгое однозначное соответствие нуклеотидных триплетов одной из 20 аминокислот может быть достигнуто при наличии соответствующего комплементарного сло­варя из трипептидных слов, т. е. при однозначном соответствии трех амино­кислот трем нуклеотидам. Брусков шел в своей гипотезе дальше: он предполо­жил, что четырехбуквенному нуклеотидному словарю мог бы соответствовать четырехбуквенный аминокислотный словарь и что этими аминокислотами как раз и являются три ароматических аминокислоты и одна неароматическа-л, я именно, триптофан, тирозин, фенилаланин и производное имидазола гистидин,}

_{В основе этой гипотезы лежало старое предположение о возможной спе­цифичности заряд-флуктуациониых взаимодействий в биологических системах. Хотя исследования последних лет, действительно показали, что наиболее силь­ные взаимодействия в водных растворах наблюдаются между ароматическими аминокислотами и нуклеотидами, заметной специфичности при этом выявить не удалось (см., например, [32]). Поэтому в настоящее время специфичность узнавания на такой основе представляется весьма сомнительной.}

_{В недавней работе Брусков [39] существенно изменил и развил представ­ления о возможных механизмах специфического нуклеотид-аминокислотного узнавания. Анализ проблемы в предположении о существовании аминокислот-, но-нуклеотидного кода показал, что наиболее вероятными кандидатами на роль аминокислот, участвующих в узнавании нуклеотидов, являются амино­кислотные радикалы, способные к одновременному образованию двух (или большего числа) водородных связей. С помощью молекулярных моделей Брус­ков исследовал и показал стереохимическую возможность существования комплементарных к азотистым основаниям аминокислот, ди- и трипептидон. При этом в коде узнавания однонитчатых нуклеиновых кислот достаточно участия не более семи аминокислот (аргинина, аспарагина, аспарагиновой кис« лоты, глутамина, глутаминовой кислоты, серина и треонина), соответствующих четырем типам различных химических групп, образующих водородные связи, а именно, гуанидиновой, амидной, карбоксильной и гидроксильной группам. Легко видеть, что минимальное необходимое число химических групп, участву­ющих в узнавании четырех нуклеотидов, равно двум. Из опытов с моделями ^сделан также вывод о вырожденности и конформационном характере кодаузнавания однонитчатых полинуклеотидов. Именно для специфичности оказы- ;ается необходимой строго определенная стабилизация в пространстве боко- ых радикалов аминокислот и пептидных групп, что, возможно, осуществляет- я в белках за счет стерических ограничений или дополнительных связей.}

_{В работе [38] рассмотрены возможные физико-химические механизмы, при омощи которых матричные ферменты — полимеразы могут влиять на степепь эчности матричных синтезов и, следовательно, регулировать ее. В частности, редполагается, что ферменты синтеза и репарации нуклеиновых кислот содер! •;ат «узнающий участок», определяющий правильность комплементного спаря- ания (в результате образования дополнительных водородных связей) по ин­вариантным для комплементарных пар атомам N = 3 пуринов и 0 = 2 пирими- динов. Такой узнающий участок (центр) фермента играет роль дополнитель­ной белково-нуклеиновой матрицы, способной «усиливать» отбор правильных и выбраковывать неправильные пары.}

_{Вернемся, однако, к начальным стадиям эволюции [388]. На начальных этапах эволюции вовсе не требуется строгого одно­значного соответствия нуклеотидов и аминокислот. Конфигура­ции белковых макромолекул грубо определяются не строго од­нозначной аминокислотной последовательностью, а лишь поряд­ком чередования в полипептидной цепи полярных и неполярных аминокислотных радикалов. Исходя из этого, все аминокислоты можно разделить на два класса — полярные и неполярные. Мо­жет быть, полярные аминокислоты следует в свою очередь раз­делить на отрицательно и положительно заряженные в водных растворах — тогда будет три класса. Таким образом, в начале эволюции было бы достаточно, чтобы одни нуклеотидные ради­калы в полинуклеотидной цепи непосредственно кодировали связывание полярных аминокислот, а другие — неполярных. Здесь следует отметить работу М. В. Волькенштейна [55], обна­ружившего корреляцию между нуклеотидным составом кодиру­ющих триплетов (кодонов) и полярностью кодируемых ими ами­нокислот. Волькенштейн обратил внимание на то, что во всех слу­чаях, когда второй нуклеотид в кодоне — аденин, кодируемый .аминокислотный остаток полярен, во всех случаях, когда второй нуклеотид — уридин, аминокислотный остаток неполярен. Я ду­маю, что мы имеем здесь дело с корреляцией, обусловленной фи­зико-химическими особенностями непосредственного взаимодей­ствия аминокислот и нуклеотидов, действовавшей в древнейшие времена, когда современный перевод нуклеотидного языка в ами­нокислотный еще не сформировался. Сам Волькенштейн рас­сматривает эту корреляцию как приспособление, повышающее «помехоустойчивость» кода: если в результате мутации изменит­ся кодон, то велика вероятность того, что вместо одной, напри­мер, неполярной аминокислоты в кодируемом белке появится другая, но также неполярная. Конфигурация макромолекулы от этого изменится не очень сильно, и мутант не погибнет. Мне же кажется, что в ходе эволюции такая корреляция могла возник-}

_{нуть лишь в том случае, если по своим физическим свойствам аденин лучше «приспособлен» к взаимодействию с полярными аминокислотами, а уридин —• с неполярными.}

_{Следует сказать, что и Волькенштейн допускает мысль о не}­_{посредственном взаимодействии аминокислот с полинуклеотид­ной цепью на ранних стадиях эволюции. «Возможно, матричный синтез белка на заре жизни осуществлялся иначе, скажем, без участия тРНК, а посредством прямой сборки белковой цепи на полинуклеотиде. Вероятность такой сборки, однако, невелика.. Скорее следует думать, что современный код является результа}­_{том селективного давления естественного отбора, минимизиру}­_{ющего эффект мутаций» [55].}

_{Анализируя проблему возникновения жизни, Д. С. и Н. М. Чер- навские [322] выдвинули гипотезу о возможном механизме уста­новления соответствия между последовательностями нуклеоти­дов и аминокислот. Они предположили, что двойная полину- клеотидная спираль служит гетерогенным катализатором, ускоря­ющим синтез пептидных связей между аминокислотами, адсор­бированными на полинуклеотиде. Так образуется белковый че}­_{хол, предохраняющий полинуклеотидную двойную спираль от разрушений, который сам может обладать каталитическими свойствами, способствующими тем или иным путем образованию' полинуклеотидных цепей. Для того, чтобы такой механизм играл биологическую, т. е. эволюционную, роль, последовательность, аминокислот, образующих белковый чехол, должна зависеть от последовательности нуклеотидов. Гипотеза ценна тем, что ее можно проверить экспериментально (см. также [371]).}

_{Наличие даже слабой корреляции между последовательно­стями нуклеотидов и аминокислот в синтезируемой на полину­клеотидной матрице полипептидной цепи позволяет продолжить­ся естественному отбору. В конкуренции за «пищу и простран­ство» будут побеждать такие полинуклеотидные последователь­ности, на которых синтезируются полипептиды, способствующие более быстрому размножению матриц своего вида. Критерием отбора на этом этапе служит каталитическое совершенство обра­зующихся белков-ферментов, которое в свою очередь зависит от степени совершенства перевода последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Таким образом, необходимость совершенствования каталитических свойств белков-ферментов, вызванная давлением естественного отбора, обусловливает направление эволюции в сторону совер­шенствования механизма перевода нуклеотидного языка на ами­нокислотный. Предел совершенства этого механизма — полная детерминированность последовательности всех аминокислот, не­обходимых для полноценного функционирования белков, после­довательностью нуклеотидов в матрице — нуклеиновой кислоте. Мы приходим, следовательно, к необходимости кодирования при­мерно 20 аминокислот четырьмя нуклеотидами, т. е. к механизму,.}

_{в котором каждая аминокислота должна соответствовать опре­деленному сочетанию по крайней мере трех нуклеотидов (кодо­ну). Недостаточность простого соответствия аминокислота — ну­клеотид, необходимость трех нуклеотидов для кодирования каж­дой аминокислоты обусловливают обязательное существование адаптора при синтезе белка на нуклеиновой матрице. Однако преодоление этого очередного кризиса представляется мне более легким, чем предыдущего — хоть какие-то уже ферменты есть. Ключевым пунктом при этом оказывается аминоацил-тРНК-син- тетаза (ее древние предшественники), т. е. фермент, катализиру­ющий соединение аминокислоты с адаптером — полинуклеоти­дом, содержащим антикодон, комплементарный специфическому для данной аминокислоты кодону. Аминокислоты, «подвешенные» посредством эфирной связи к кислороду гидроксильной группы рибозного кольца молекулы адаптора, в должной последователь­ности соединяются в полипептидную цепь. Прямо же код, осно­ванный на непосредственном физико-химическом соответствии аминокислот и нуклеотидов (см. выше), продолжает использо­ваться в механизме узнавания при функционировании аминоцил- тРНК-синтетазы, а также в процессах регулирования считывания генетической информации.}

_{Мне хочется еще раз подчеркнуть «автоматический», «цикли­ческий», характер эволюционного совершенствования после прео­доления первого кризиса: ферменты, образующиеся в соответ­ствии с нуклеотидным текстом, возникающим в результате от­бора мутаций, будут тем совершеннее, чем «совершеннее сам текст». В понятие совершенства текста входит качество инструк­ций о механизме его перевода на аминокислотный язык, и, сле­довательно, о свойствах синтезируемых ферментов. Получается эффективная система (цикл) положительных обратных связей, приводящая ко все более эффективной, все более быстрой эво­люции в направлении все большего кинетического совершенства конвариантно размножающихся матричных полимерных систем *.}

_{В мою задачу не входит детальное описание биохимических механизмов синтеза белка в ныне живущих организмах. Это прекрасно сделано в ряде оригинальных книг. Мне важно под­черкнуть физико-химическую детерминированность эволюцион­ного возникновения связи, корреляции синтезов полинуклеоти­дов и полипептидов, а также основных механизмов этих синте­зов. Естественный отбор в планетных условиях рано или поздно с неизбежностью должен привести к формированию предельно совершенного механизма синтеза белка и нуклеиновых кислот, аналогичного механизму, работающему в системе рибосома — ферменты.}

_{Возможность начала эволюции с полипептидов. Теперь по­смотрим, каким должен быть процесс эволюции, начинающийся}

¹ _{М. Эйген называет эту систему «гиперциклом» [350]; см. гл. 2, с. 40.}

_{с отбора все более кинетически совершенных полипептидов. Условия неизбежного начала эволюции остаются те же — ма}­_{тричное конвариантное воспроизведение, различия в скоростях воспроизведения (синтезов) разных форм матриц, конечное вре­мя жизни каждой (и, разумеется, ограниченность ареала). Наи­более важен здесь ответ на первый вопрос — способны ли поли}­_{пептиды к матричному конвариантному воспроизведению?}

_{Тут уместно отметить, что для полинуклеотидов мы полагали положительный ответ очевидным. Однако, как это ни парадо­ксально, взаимно комплементарные матричные свойства нуклеи­новых оснований в водных растворах не проявляются. Их уда­ется выявить лишь в «вакууме»: вода, конкурируя за водородные связи, препятствует спариванию комплементарных нуклеиновых оснований. Подобные «вакуумные условия» возникают в поли- нуклеотпдной цепи при ее спирализации: внутрь спирали вода не проникает, и поэтому ничто не мешает комплементарному спа­риванию. Таким образом, эволюционный процесс мог бы начать­ся лишь после спонтанного возникновения биспиральных поли- нуклеотидных молекул со случайной последовательностью нукле­отидов (при условии разных кинетических свойств различных по- линуклеотидных вариантов). Как мы видели, однажды начавший­ся процесс естественного отбора «чистых» полинуклеотидных ма­триц очень быстро (т. е. через небольшое число актов эволюци­онного совершенствования) прекращается — эволюционный по­тенциал исчерпывается. Для выхода из этого кризиса необходимо осуществление сопряженного синтеза катализаторов с достаточ­но разнообразными кинетическими свойствами, т. е. белков.}

_{Тем более важно выяснить, не могут ли полипептиды всту­пать на путь естественного отбора независимо от нуклеиновых кислот.}

_{Да, могут, если они способны к конвариантному матричному воспроизведению. Н. К- Кольцов предполагал, что полипептид- ные цепи обладают этой способностью и, быть может, такая его позиция кажущаяся неверной с точки зрения современной нам биохимии, не вовсе ошибочна.}

_{Способность белков, полипептидных цепей к точнейшему, строго специфичному различению молекул (что служит необхо­димым условием матричной полимеризации), общеизвестна. Про­славленная специфичность ферментов — один из примеров этой способности.}

_{Известно много разных ферментов, строго специфичных к той или иной аминокислоте. Можно назвать все те же амино- ацил-тРНК-синтетазы, каждая из которых специфична для од­ной данной аминокислоты, протеолитические ферменты, разры­вающие быстрее всего пептидную связь около определенной, специфичной для данного фермента аминокислоты (ее радика­ла) и т. д. Однако кажется вероятным, что во всех перечисленных выше случаях специфичность по отношению к данной аминокис­лоте обусловлена специфической укладкой полипептидной цепи фермента, в результате чего в активном центре (точнее, в центре связывания аминокислоты на ферменте) достигается необходи­мое пространственное взаиморасположение нескЬ^ьких (двух, трех) аминокислотных радикалов. Впрочем, точно это еще неиз­вестно. Быть может, сама специфичность связывания ферментом данной аминокислоты обусловлена наличием лишь одного тако­го же или комплементарного ему аминокислотного радикала по­липептидной цепи фермента. Остальные аминокислотные радика­лы в центре связывания выполняют другие функции — собствен­но каталитические, а именно обеспечивают поляризацию связан­ной молекулы, ее деформацию и т. п.}

_{Может показаться, что я ломлюсь в открытую дверь — спо­собность аминокислот к кристаллизации — чего еще желать для иллюстрации матричных свойств аминокислот? Однако возмож­ность кристаллизации аминокислот в значительной мере опреде­ляется геометрией их заряженных групп (отрицательного карбо­ксила и положительно заряженной аминогруппы). Геометрия этих ионизированных групп у всех аминокислот практически оди­накова. Поэтому вряд ли можно ожидать избирательной кри­сталлизации аминокислот из их смеси. Впрочем, возможна ли такая избирательная кристаллизация, я не знаю (но очень хотел ■был бы узнать). Вместе с тем общеизвестна способность белков, полипептидов образовывать кристаллы. К сожалению, это их свойство не очень проясняет картину. Во-первых, не известно, возможна ли избирательная кристаллизация белков, во-вторых, она определяется не столько детальным соответствием полипеп­тидных цепей друг другу, сколько сходством геометрии целых белковых глобул. Кроме того, нас интересует способность поли­пептидных цепей служить матрицами при синтезе новых поли­пептидных цепей из аминокислот. Это значит, что нас интересу­ет специфическое связывание аминокислот на полипептидной цепи.}

_{Насколько мне известно, возможность такого специфического связывания не исследована. Много лет назад я занимался изу­чением связывания меченных (метками служили радиоактивные изотопы углерода или серы) аминокислот белками [334]. Белки действительно связывают аминокислоты, причем для разных аминокислот это происходит неодинаковым образом. Однако специфичность такого связывания, его обусловленность амино­кислотным составом белка должным образом не изучены. Всего- то речь идет об опыте, в котором... нужно измерить количество разных аминокислот, неотмываемых от полипептидов разного ■состава.}

_{Особый интерес в связи с обсуждаемыми вопросами представ­ляют взгляды Н. Г. Есиповой, изложенные ею по моей просьбе ниже. «Еще раз напомним, что Крик выдвинул адаптерную ги}­_{потезу, в которой соответствие между аминокислотой и трину-клеотидом устанавливается специальной молекулой-адаптером (транспортной РНК), только потому, что он не усмотрел кон- формационного соответствия между тринуклеотидом в раз}­_{вернутой конформации и аминокислотой. Важная черта адаптер- ной гипотезы состоит также в том, что длина кодона становится унифицированной, не зависящей от размера аминокислоты. Адап­тер является по существу элементом логической машины и с его помощью могут исправляться ошибки, которые были бы фаталь­ны при прямом конформационном соответствии аминокислот и нуклеотидов. Весьма привлекательна, однако, мысль, что на ран­них этапах эволюции между полинуклеотидами и аминокислота­ми существовало такое непосредственное соответствие. Подобный механизм обладает очевидным преимуществом и очень прост, кроме того он обеспечивает обратное влияние аминокислотной последовательности на полинуклеотидную, а подобного рода об­ратная связь, быть может, и создает то недостающее ускорение эволюции, которое позволило начальным ее этапам уложиться в известные нам сроки.}

_{Вначале рассмотрим возможное непосредственное соответст­вие аминокислоты и кодирующего ее триплета. Анализ стереохи­мии аминокислот и триплетов, входящих в состав ДНК, прове­денный в двух лабораториях почти аналогичными методами по­казывает, что всегда можно заметить специфическое соответст­вие боковых радикалов аминокислоты и триплета из нуклеоти}­_{дов, если аминокислота расположена в малой бороздке двойной спирали ДНК. Структурное подобие описанного типа наглядно определяет степень вырожденности кода — короткие аминокис­лоты (гли, ала, сер) кодируются фактически одним нуклеотидом, средние — двумя и, наконец, наиболее длинные — арг, лиз, три— тремя нуклеотидами. Наличие такого соответствия можно счи­тать одним из факторов эволюции сопряженного синтеза нуклеи}­_{новых кислот и белков.}

_{Одно из проявлений соответствия между нуклеотидами и бел}­_{ковыми (аминокислотными) структурами следует усматривать в супрессии бессмысленных мутаций у бактерий. Механизм су­прессии состоит в нивелировке мутаций, приводящих к вклини}­_{ванию бессмысленного кодона в структурный ген. В результате мутаций тРНК-адаптор, содержащий антикодон с бессмыслен­ным триплетом, начинает транспортировать нужную аминокисло}­_{ту в нужное место при синтезе белка. Казалось бы ошибка в: адапторе исправляется на уровне адаптора же. Но на пути трансляции аминокислоты имеется специфический фермент тРНК-синтетаза—именно в этом месте, видимо, работает меха}­_{низм непосредственной связи между нуклеотидной и аминокис­лотной последовательностью».}

_{Однозначное соответствие последовательности нуклеотидов- в синтезируемом полинуклеотиде последовательности аминокис}­_{лот в уже существующем полипептиде, т. е. «обратный переносинформации» кажется в настоящее время большинству ученых чистой крамолой. Установление такого соответствия\означало бы, что «центральная догма» молекулярной биологии — не дог­ма, что знаменитая схема ДНК.-*-РНК->белок, уже нарушенная открытием обратной транскриптазы (в присутствии которой ока­залось возможным направление переноса информации РНК->- —>ДНК), нарушается и в следующем звене.}

_{Как ясно из сказанного, об узнавании белком определенной последовательности нуклеотидов и из исследований Н. Г. Есипо}­_{вой и В. Г. Туманяна, а также Томас [466], физико-химическое соответствие полинуклеотндных и полиаминокислотных последо­вательностей вполне реально. Очевидно, однако, что глобуляр­ные белки уступают по своим матричным свойствам нуклеиновым кислотам вследствие своей упаковки (в общем случае вследст­вие своей сложной третичной структуры). Естественна мысль, что фибриллярные белки, не свернутые в глобулу полипептидные цепи, могут в принципе служить вполне «хорошими» матрицами (так думал Н. К. Кольцов!) как для саморепликации, так и для снятия с них полинуклеотндных комплементарных копий. Эта мысль развита в очень интересной статье Картера и Краута [371] (о возможности матричного воспроизведения на белках см. так­же [306]).}

_{Картер и Краут показали, что весьма распространенная вытя­нутая конформация полипептидных цепей (р-складчатая струк­тура по Полингу и Кори) соответствует стабильной правозакру- ■ченной двойной спирали, т. е. существует двойная полипептидная спираль. Ее шаг и радиус примерно такие же, как и у двойной спирали нуклеиновых кислот. Авторы весьма тщательно построи­ли пространственные молекулярные модели и увидели, что поли­пептидная двойная спираль в точности комплементарна двойной спирали РНК, причем полипептидная двойная спираль точно входит в малую бороздку двойной спирали РНК. В результате ■образуются водородные связи между 2'-ОН-группами рибозы (что, по-видимому, и объясняет особые свойства РНК, у ДНК нет этого гидроксила) и кислородом карбонила пептидной свя­зи. Авторы отмечают, что такую точную комплементарность ста­бильных конформаций РНК и полипептидов вряд ли можно считать простым совпадением. Они предположили, что обе эти двойные спирали взаимно катализировали сборку друг друга из активированных предшественников на ранних стадиях эволю­ции. В самом деле, комплементарное соответствие двух двойных спиралей представляется весьма важным, но оно обеспечивает ускорение синтеза лишь основных каркасов — полипептидного и полинуклеотидного, тогда как для преодоления обсуждаемого нами кризиса на начальной стадии биологической эволюции не­обходимо установление полного однозначного соответствия оп­ределенных аминокислотных и нуклеотидных радикалов. Для этого нужно, чтобы «взаимная» полимеразная активность поли-}

_{нуклеотидной и полипептидной двойных спиралей зависела от последовательностей нуклеотидов и аминокислот соответствен­но. Существование такой зависимости может показать лишь эксперимент.}

_{В октябре 1975 г. опубликована статья Г. В. Гурского,,}

_{В. Г. Туманяна, А. С. Заседателева, А. Л. Жузе, С. Л. Гроховско­го и Б. П. Готтиха. «Код, управляющий специфическим связыва}­_{нием регуляторных белков с ДНК, и структура стереоспецифиче- ских участков регуляторных белков» [79]. Как ясно из заглавия статьи, в .ней расшифрован второй биологический код, выяснен ме­ханизм однозначного соответствия полинуклеотидных и поли}­_{пептидных цепей в процессах узнавания. Механизм узнавания основан на специфическом взаимодействии двух двойных спира­лей— нуклеотидной и полипептидной [371]. Регуляторные бел­ки узнают последовательность оснований в двойной спирали ДНК; не расплетая ее. Узнавание основано на пространственном соответствии контактных, связывающих друг с другом группи­ровок в полипептидных и полинуклеотидных спиралях. Оно ана­логично специфическому совпадению отверстий в двух налагае­мых друг на друга перфокартах. Такой способ установления од­нозначного соответствия авторы называют решеточным принци}­_{пом узнавания. В качестве контактных групп в нуклеотидных це­пях функционируют или гуанин, или цитозин, тимин и аденин, а в полипептидных цепях — только атомы азота амидных групп полипептидного остова. Амидные азоты связываются посредст­вом водородных связей с контактными группами полинуклеотид­ных цепей. С гуанином способны образовывать водородные свя­зи атомы амидного азота полипептидной цепи; их конформация рассчитана авторами и она оказалась отличной от конформации полипептидной цепи, способной взаимодействовать с тимином. Такие конформационно различные полипептидные цепи называ}­_{ются соответственно g- и /-цепями. Оказалось, что эти две анти- параллельные полипептидные цепи, находящиеся в g- и /-конфор­мациях, могут соединяться в полипептидную двойную спираль во­дородными связями, образующими между амидными группами двух цепей, не взаимодействующими с основаниями ДНК.}

_{Специфичность связывания белков и нуклеиновых кислот объясняется тем, что боковые радикалы некоторых аминокислот в /-цепи (названные авторами фундаментальными аминокисло­тами) могут образовывать водородные связи с карбонильными группами g-цепи, разрывая или резко ослабляя водородные связи между g'-цепью и гуаниновыми основаниями ДНК Таких фунда­ментальных аминокислот шесть: серии, треонин, аспарагин, ци- стеин, гистидин и глутамин. Таким образом, код вырожден в от­ношении аминокислотных последовательностей в стереоспецифи- ческом участке белка. Он требует присутствия аминокислот — «выключателей» в определенных местах последовательности. Авторы отмечают, что высокая степень вырожденности кода по-}

_{зволяет совершенствовать трехмерную структуру и каталитиче­ские центры регуляторных белков в ходе эволюции, оставляя не­изменной их способность находить правильные места"связыва­ния на ДНК.}

_{Предложенный авторами код узнавания проверен ими путем исследования соответствия последовательности нуклеотидов в. 1ас-операторе и последовательности аминокислот в 1ас-репрессо- ре Е. coli. Они показали наличие единственного участка поли­пептидной цепи (от треонина 19 до валина 30), находящегося согласно принятому механизму узнавания в полном соответст­вии с последовательностью нуклеотидов в ДНК.}

_{Если бы даже эволюция началась с возникновения поли­пептидных матриц, все равно произошел бы кризис. Сохранение- матриц трудно совместимо с относительно высокой химической активностью полипептидов. Две противоположные тенден­ции—«консерватизм» и высокую каталитическую активность, нельзя с должным совершенством объединить в одном веществе. Поэтому, начнись дело с белков, все равно наступил бы кризис— побеждали бы матричные полипептиды, катализирующие синтез химически малоактивных «информационных» полимерных моле­кул (т. е. тех же нуклеиновых кислот) и в данном случае кризис удалось бе преодолеть лишь посредством выработки однознач­ного соответствия последовательности аминокислот в полипепти­де последовательности нуклеиновых оснований в полинуклео­тиде.}

_{Это чисто диалектическое противоречие. С одной стороны, не­обходимость возможно более совершенного сохранения накоп­ленного в поколениях запаса полезных мутаций, сохранение на­следственных текстов, и с другой — обеспечение возможно более интенсивной жизнедеятельности и достижение темпа мутаций, достаточного для обеспечения возможно большей скорости эво­люционного совершенствования.}

_{Первая консервативная задача решается переходом функции сохранения наследственных текстов к специализированным моле­кулам ДНК- Почему именно ДНК? Вероятно из-за отсутствия гидроксила в положении 2 углеводного кольца дезоксирибозы, что делает ДНК химически более инертной, чем РНК.}

_{Наличие двойной спирали ДНК существенно повышает со­хранность наследственных текстов — повреждение одной из двух нитей в двойной спирали легко восстанавливается: уцелевшая нить служит матрицей для восстановления правильной последо­вательности мономеров в поврежденной.}

_{Н. Г. Есипова и В. Г. Туманян следующим образом объясняют физико-химические причины функциональных различий ДНК и РНК:}

_{«...Химические различия РНК и ДНК невелики: ОН группа во 2-м положении рибозы и урацил вместо тимима. Однако эти небольшие химические различия обусловливают существенные-различия их конформаций. Конформация двуспиральной РНК обычно A-форма, конформация ДНК — 5-форма. 5-форма ха­рактеризуется увеличенной по сравнению с А формой проекцией нуклеотидов на ось опирали: 13,4 А вместо 2,8 А. Однако главное стереохимическое отличие 5-формы от A-формы заключается в том, что в первой расстояния между любой соседней парой фос­фатов отличаются друг от друга меньше, чем в A-форме. Расчет потенциальной энергии различных конформаций ДНК, проведен­ный методом атом-атомных потенциалов показал [120], что един­ственным устойчивым с точки зрения возможности достижения минимума потенциальной энергии типом структуры ДНК явля­ется 5-форма. A-форма сама по себе нестабильна: она дестаби­лизируется электростатическими взаимодействиями. A-форма су­ществует лишь при условии компенсации роста свободной энер­гии электростатических взаимодействий возрастанием энтропии в системе полинуклеотид — вода.}

_{*~^СИСТ ’ *5ДНК “Ь 5раств.}

_{Увеличение 5СИСТ возможно либо за счет 5ДНК — например, если линейная молекула ДНК свертывается в макроструктуру, либо за счет SpaCTB — например при разупорядочении воды. По­следнее возможно при добавлении в раствор сильного и структур­но подвижного дегидратанта. Наличие полимерного дегидра- танта увеличивает вероятность перехода молекулы нуклеиновой кислоты в квазиглобулярное состояние, но не в А-форму.}

_{Таким образом конформация A-типа возникает как частный случай конформационного перехода с увеличением энтропии си­стемы ДНК-растворитель. Энтропийная стабилизация А-конфор- мации делает ее неустойчивой по отношению к внешней поли­мерной среде. Напротив, 5-форма устойчива как в такой среде, так и при комплексировании с полимерами. Это определяет ос­новной тип взаимодействия ДНК с белкам,и и лолимерными ли­гандами — взаимодействие типа решетка — решетка.}

_{Из рассмотрения физико-химических особенностей ДНК и РНК следует возможная причина уникальной роли ДНК как хранителя информации в сложных биологических системах. РНК как структура неравновесная, не может быть основой для иерар­хического упорядочения при наличии в результирующей системе нескольких уровней иерархии, так как организация следующего уровня сложности в системе требует устойчивости предыдущего уровня, являющегося «строительным кирпичом» для следующе­го. В то же /время в процессах считывания информации важно, чтобы полимер с одной стороны удовлетворял условиям компле­ментарное™, а с другой был бы легко разъединяем с матрицей — носителем информации. Этим требованиям удовлетворяет РНК, образующая с ДНК энтропийно или кинетически стабильную А-форму.}

_{Таким образом, данные о потенциальной энергии для различ}­_{ных структур ДНК и РНК могут служить объяснением, почему два типа нуклеиновых кислот, идентичных по многим физико}­_{химическим свойствам, различны по своим функциям в процес­сах жизнедеятельности».}

_{Вторая задача, в частности достижение темпа мутаций, доста­точного для возможно большей скорости эволюции, решается не так просто. Темп мутаций должен быть «соразмерным» — не слишком быстрым и не слишком медленным. Таким образом, вторая задача решается выработкой механизмов регулирования: частоты мутаций. В последние годы была обнаружена неожидан­но сложная и совершенная биохимическая система регулирования’ темпа мутаций. Один из существенных ее механизмов — процесс ферментативной репарации поврежденных молекул ДНК, ката­лизируемый так называемыми репаразами (см. [61]).}

_{Обеспечение возможно более интенсивной жизнедеятельности решается передачей соответствующих функций белкам. Однаю> интенсивная работа «дорого стоит» макромолекулам белков. Эти молекулы все время повреждаются и ломаются. Взамен синте­зируются новые. Таким образом, чем интенсивнее функция бел­ков, тем интенсивнее они обновляются. Это постоянное их об}­_{новление стало очевидным после первых же опытов Р. Шонхей- мера с изотопной меткой (см. [244]). По существу, после возник­новения механизма синтеза белка на полинуклеотидных матри}­_{цах, дальнейшая эволюция состоит в совершенствовании бел­ков, полипептидных цепей. Кинетические свойства самих мат­ричных полинуклеотидных молекул перестают быть факторами эволюции. Фенотип, т. е. результат реализации наследственных свойств в жизнедеятельности (кинетические свойства) отделя­ется от генотипа, т. е. совокупности наследственных текстов (ин}­_{формационно-термодинамические свойства), т. е. белковый фе­нотип отделяется от нуклеотидного генотипа. Такое разделение кинетики и термодинамики, фенотипа и генотипа, не нужно по­нимать слишком буквально. Речь идет лишь о ведущих критериях естественного отбора, физико-химических факторах эволюции.}

_{Дарвиновские эксперименты Спигелмана. Естественный отбор в растворе макромолекул. Справедливость представлений о при­ложимости дарвинизма к процессам на молекулярном уровне, возможность естественного отбора в растворе макромолекул, до}­_{казана Спигелманом [460]. Более того, из его опытов следует и правильность вывода о кинетическом совершенстве как критерии естественного отбора.}

_{Спигелман исследовал репликацию молекул РНК, катализи}­_{руемую выделенным из Qd-фага очищенным ферментом, Qp-pe- пликазой. Этот фермент использует в качестве матриц молекулы фаговой РНК и катализирует образование на матрице новых молекул РНК из нуклеотидов. При проведении синтеза рибо­нуклеиновой кислоты в эксперименте было обнаружено возник}­

_{новение «мутантов» — молекул РНК, отличающихся от исход­ных матричных молекул большей скоростью репликации. Такие мутанты размножались при посредстве того же фермента Qp- репликазы. Получение клонов этих мутантов достигалось по­следовательными «пересевами» (молекул!) — переносом неболь­шой части инкубационной смеси, в которой процесс репликации завершился, в новую инкубационную смесь, содержащую фер­мент и трифосфорибонуклеотиды УТФ, ЦТФ, АТФ, ГТФ. Оказа­лось, что достаточно попадания в новую среду одной молекулы мутанта для образования нового клона популяции таких же мо­лекул. В работе [460] было показано, что после 74 переносов можно выделить мутант, у которого скорость репликации в 15 раз превышает скорость репликации исходной, «родитель­ской» РНК Qp-фага. Такое увеличение этой скорости, по-видимо­му, обусловлено уменьшением длины молекулы РНК — вместо 3600 нуклеотидных остатков в исходной РНК в мутанте их ока­залось лишь 550. (В мутантных молекулах РНК для обеспечения высокой скорости размножения не требуется большинства по­следовательностей нуклеотидов, «осмысленных» предшеству­ющей эволюцией фага).}

_{Затем авторы цитируемой выше работы исследовали воз­можность возникновения в условиях молекулярного дарвинов­ского эксперимента молекул-мутантов с определенными новыми свойствами (т. е. молекул, отличающихся не только скоростью репликации). Был получен мутант, способный быстрее реплици­роваться при меньших концентрациях субстратов (например, ЦТФ). Нуклеотидный состав и размер этой молекулы-мутанта примерно такие же, как и у исходной формы. Следовательно, от­бор привел к изменению последовательности нуклеотидов в РНК • Как оказалась, ее изменение происходит при меньших кон­центрациях не только ЦТФ, но и других нуклеотидтрифосфатов. Быть может в результате изменения последовательности нукле­отидов изменилась вторичная структура мутантных молекул РНК, что привело либо к взаимодействию последних с фермен­том, либо к увеличению активности фермента посредством алло- стерических механизмов. Затем были получены мутанты, спо­собные к репликации в присутствии веществ, нарушающих ре­пликацию «нормальной» РНК, — сначала авторы обнаружили мутант, чувствительный к концентрации АТФ, (мутант У-8), а затем осуществили серию переносов (пересевов) в среды, содер­жащие ингибиторный аналог АТФ (туберцидинтрифосфат (ТуТФ), содержащий в положении 7 пуринового кольца вместо азота углерод). В результате возник мутант У-9 вдвое быстрее реплицирующийся в присутствии ТуТФ, чем У-8.}

_{Таким образом, в этих опытах показана решающая роль ки­нетических факторов в эволюции — побеждают в отборе те му­танты, скорость размножения которых .в данных условиях выше.}

_{Глава 4}

_{ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ}

_{Конечный результат биохимического этапа биологической эволюции — создание предельно совершенных катализаторов — ферментов. Обеспечение ферментами прохождения процесса по наиболее «быстрому» маршруту, путем отбора конформационно-лабильных полипептидных молекул. Возможность синхронизации отдельных конформационных циклов макромолекул ферментов. '}

_{Ускорение диффузии и механо-химические преобразования энергии как результат этой синхронизации.}

_{Итак, в естественном отборе выживают матричные полимерные макромолекулы, способные к более быстрому результирующему конвариантному воспроизведению. В этом состоит кинетический принцип, критерий естественного отбора. Как подчеркивалось выше, кинетическое совершенство — сложное понятие, и на сте­пень такого совершенства влияет не только скорость матричного воспроизведения, но и скорость синтезов мономеров, а также ки­нетические («барьерные») механизмы сохранения уже синтези­ровании х макромолекул, кинетические механизмы осуществле­ния реакций, обеспечивающих энергией «противотермодинамиче- ский» ход биологической эволюции.}

_{Все аспекты кинетического совершенствования в ходе эволю­ции определяются эволюционным совершенствованием белков, полипептидов, т. е. полимеров, состоящих из достаточно разно­образных в химическом отношении мономеров (аминокислот).}

_{Та или иная биохимическая реакция достигает в ходе эволю­ции необходимой скорости, целесообразно (в соответствии с нуждами данного этапа существования) регулируемой различ­ными факторами, только при эволюционном совершенствовании соответствующего фермента.}

_{Следовательно, эволюция аппарата матричного воспроизве­дения, процессов энергетического обеспечения (фотосинтез, гли­колиз) и аппарата синтеза белка — есть эволюция ферментов.}

_{Рассмотрим поэтому, пользуясь, как и раньше, методом ана­лиза предельно совершенного этапа эволюции, общие свойства ферментов. При этом мы будем иметь в виду множество книг и обзоров, посвященных частным и общим вопросам ферментатив­ного катализа [25, 29, 54, 56, 89, 90, 116, 176, 223, 238, 297, 302, 329, 395, 405, 436, 445]. Наш эволюционно-дедуктивный подход может способствовать выявлению нерешенных вопросов.}

_{Для этого сформулируем эволюционные задачи, из которых следует необходимость высоко совершенных ферментов; учтем физические и химические свойства материалов, образующие био­логические системы; попробуем представить себе, что получилось бы при неограниченно большом времени совершенствования фер­ментов, и, наконец, сравним полученную нами картину с дей­ствительной.}

_{Эволюционные задачи мы уже неоднократно формулировали. Кратко их можно определить так: достижение предельно воз­можного биологического (кинетического) совершенства. В ка­честве материала, подлежащего эволюционному совершен­ствованию, мы уже выбрали полипептиды. Итак, необходимы белковые катализаторы, способные катализировать множество различных химических процессов и изменять свою каталитиче­скую активность при взаимодействии с веществами-регулятора­ми, причем по принятому условию обе эти способности должны быть предельно совершенными. Все менее совершенные счита­ются погибшими в ходе эволюции.}

_{Уточним сначала смысл основных понятий. Что значит «ката­лизировать»? Меня не смушают при постановке этого наивного вопроса великие имена Я. Берцелиуса или В. Оствальда. Вовсе не лишнее раз в 50—100 лет возвращаться к таким вопросам. Катализ — это ускорение одной из в принципе многих возмож­ных реакций, в которых опять же в принципе способны участво­вать реагенты. В закрытых системах катализатор ускоряет как прямую, так и обратную реакции. В открытых системах катали­затор определяет направление превращения веществ, которые в отсутствие катализатора вообще могут не взаимодействовать друг с другом с заметной скоростью. В этих системах катализа­тор может ускорять превращение лишь в одну сторону. Такая роль катализаторов следует из концепции маршрутов реакций Хориути [317, 401] и М. И. Темкина [286]. Вещество А может пре­вратиться через целый ряд промежуточных реакций в вещество X — термодинамически наиболее стабильный конечный продукт. В достаточно сложной системе, содержащей множество различ­ных веществ, превращение А в X может идти множеством путей— маршрутов. В принципе, только один маршрут «самый быстрый». Однако высокая итоговая скорость прохождения по маршруту отнюдь не обязательно означает высокую скорость на всех эта­пах пути. Вполне вероятно медленное, затрудненное прохожде­ние по начальным этапам маршрута, оказывающегося в конце концов самым быстрым. Для некатализируемых реакций верен принцип Хиншелвуда, а именно, спонтанное прохождение их в конечном итоге по самому быстрому маршруту. Однако принцип Хиншелвуда отнюдь не обеспечивает высокой скорости реакции, не гарантирует самого быстрого из вообше возможных маршру­тов (имеется в виду система без катализатора). Внесение в си­стему катализатора увеличивает разнообразие возможных мар­шрутов, среди которых оказывается и наиболее быстрый. На самом же деле, задачи ферментов и сложнее — речь идет не толь­ко об ускорении превращения А в X, но и о накоплении опреде­ленного промежуточного продукта Р. Такой продукт не обяза­тельно «лежит» на самом быстром маршруте. Следовательно, катализатор — вещество, так изменяющее возможные маршруты реакций, что среди них оказывается маршрут, проходимый быст­рее всех, возможных в отсутствие катализатора. А дальше рабо­тает, по существу, статистический принцип Хиншелвуда. Такое понимание роли катализаторов означает, что если бы и в отсут­ствие катализатора можно было обеспечить маршрут реакций, идентичный самому быстрому в его присутствии, то мы пол­ностью имитировали бы каталитический процесс. Система реак­ций, в которых осуществляется наиболее быстрый маршрут, на­зывается конгруентной. В соответствии с таким представлением о катализаторе последний лишь обеспечивает необходимый на­бор конгруентных промежуточных реакций.}

_{Это понимание роли фермента является чисто химическим и не требует наличия каких-либо специфических физических меха­низмов ускорения катализируемых процессов. Для допущения необходимости подобных механизмов нужны серьезные, в том числе эволюционные обоснования. Посмотрим далее, найдутся ли такие обоснования, а пока попробуем конкретизировать «мар­шрутную» роль ферментов.}

_{Что значит сделать возможным новый маршрут? Это значит обеспечить прохождение процесса через ряд новых промежуточ­ных реакций. Новые промежуточные стадии не осуществляются без катализатора, и поэтому соответственные промежуточные вещества (состояния) нестабильны вне комплекса с катализато­ром. Отсюда следует весьма важный вывод — сколько-нибудь со­вершенный катализ возможен лишь при условии непрерывного комплексообразования реагирующих веществ с катализатором (ферментом). Это значит, что в пределе ни на одной из проме­жуточных стадий катализируемого процесса промежуточные ве­щества не должны выходить из комплекса с ферментом. Отсюда формулируется первое условие в «техническом задании» на эво­люционное изготовление ферментов. Молекулы ферментов долж­ны образовывать комплексы с исходными веществами и всеми промежуточными формами реагирующих веществ. Для появле­ния комплексов с последовательно возникающими промежуточ­ными веществами в катализируемом процессе макромолекула белка-фермента должна обладать способностью к последователь­ному изменению своей конформации. Конформационная лабиль­ность служит условием последовательного изменения «реакцион­ного клубка», т. е. образования в активном центре необходимого очередного сочетания химически активных боковых радикалов определенных аминокислот. Так и обеспечивается осуществление особо быстро проходимого маршрута в присутствии фермента.}

_{Как отмечалось, по происхождению и вследствие единственно возможного способа эволюционного совершенствования посред­ством мутаций ферменты представляют собой белки, полипепти­ды. Следовательно, именно макромолекулы ферментов должны быть конформационно лабильными. Конформационной лабиль­ностью могут обладать полипептидные цепи, не сшитые жесткими (например, дисульфидными) связями. Макромолекула фермента должна состоять из нескольких консолидированных частей, по­движно (на шарнирах) связанных друг с другом.}

_{Такую макромолекулу можно макроскопически моделировать, например, системой шаров, соединенных шарнирами и пружина­ми. Следовательно, для надлежащей функции она должна пред­ставлять собой машину - -устройство с весьма ограниченным целесообразным набором степеней свободы — направлений пере­мещений частей друг относительно друга [318].}

_{Чем замечательна такая машина? Все ее своеобразие — в мо­лекулярных размерах}[5]_.

_{Мы часто в последнее время произносим словосочетание «мо­лекулярная машина», не осознавая его экстравагантности. «Нор­мальная» машина — устройство, в котором тепловое движение составляющих ее атомов (деталей) не играет никакой роли. Ма­шина обычно вполне макроскопична. Молекулярная машина су­ществует в оглушительном тепловом шуме, «целесообразные» движения ее деталей происходят среди теплового беспорядка и являются статистическим итогом разнонаправленного «броуни- рования» [136—138]. Почему же мы говорим о макромолекуле белка как о машине? Потому, что в силу структурных ограниче­ний большая часть взаимных перемещений «кусков» макромоле­кулы друг относительно друга невозможна и сама она совершает броуновское движение как целое. Лишь в некоторых функцио­нально значимых направлениях тепловые флуктуации приводят к изменениям конформации, изменениям взаимного расположе­ния частей макромолекулы. В макромолекуле фермента, не со­единенной с субстратом, эти движения равновероятны в двух направлениях — «туда» и «обратно» (они представляют собой флуктуационные конформационные колебания), тогда как в мак­ромолекуле, связанной с превращаемым субстратом, движения «туда» и «обратно» неравноценны. Например, при движении какой-либо функциональной группы полипептидной цепи «туда» осуществляется реакция, сопровождающаяся необратимым изме­нением субстрата (его свободная энергия уменьшается и выде­ляется тепло), а при движении «обратно» реакция не идет (без сопряженного подвода энергии).}

_{Так осуществляется выбор нужного направления флуктуа­ций, использование тепловой энергии для направленного превра­щения. Нас обычно преследует демонобоязнь — боимся мы де­монов Максвелла!}

_{Действительно, по первоначальному замыслу Максвелла, де­моны должны были открывать дверцу в перегородке для моле­кул газа, летящих с большей, чем средняя, скоростью, имеющих избыток кинетической энергии, и закрывать эту дверцу перед медленными молекулами. Так демоны призваны были разделять газ, находящийся в тепловом равновесии на две части — холод­ную н горячую. Давно уже Сциллард и Бриллюэн показали принципиальную невозможность сушествования таких демонов. Затраты свободной энергии на различение молекул в точности равны ожидаемому возрастанию свободной энергии (за счет уменьшения энтропии системы) при сортировке молекул.}

_{Нужно поэтому особо подчеркнуть, что в данном случае мы имеем дело с неравновесной системой, идет превращение веще­ства, при котором выделяется энергия, причем выделяется она необратимо. Следовательно, принципиальных запретов для оку­паемого затратами энергии направленного использования флук­туаций нет.}

_{Молекулярные демоны—анизотропные структуры — в прин­ципе могут работать за счет энергии, освобождаемой в катали­зируемой реакции.}

_{Механизм нашего демона также вполне рационален — отоб­ранные в ходе длительной эволюции, синтезируемые с затратой свободной энергии из сопряженных процессов, структуры макро­молекул таковы, что конформационные движения в них резко и целесообразно ограниченны. Таким образом, предполагаемое своеобразие макромолекулы фермента в том, что она представ­ляет собой машину, работа которой невозможна без тепловых флуктуаций, хотя энергия, обеспечивающая весь ее рабочий цикл, поступает из нетепловых источников — тратится химический по­тенциал превращаемых веществ (см. [328, 337, 445]).}

_{Впрочем, для приведенной выше картины работы макромоле- кулярной машины не требуется каких-либо механизмов накоп­ления флуктуаций; не предполагается и ускорение катализируе­мого процесса за счет энергии, накопленной тем или иным спо­собом в макромолекуле фермента ‘. Например, в результате «ре­куперации» энергии, выделяющейся в ферментативной реакции [136—138]. Любая конгруентная реакция, т. е. превращение ве­ществ без участия фермента (если бы ее удалось осуществить) шла бы с такой же скоростью, как и при помощи фермента. Мед­ленные реакции и там и тут медленные. Просто без фермента эти процессы в данной системе вообще не идут таким маршру­том. Итак, ферменты могут не ускорять отдельные элементарные}

_{* Кажется поивлекательной возможность «собирания флуктуаций» со многих степеней свободы в активном центре фермента в качестве механизма уско­рения катализируемых реакций [400]. Нам не удалось показать реальность этой гипотезы [328].}

_{реакции, а «просто» позволяют осуществляться таким промежу­точным элементарным стадиям, которые невозможны без них, они ускоряют образование конечных продуктов, делая возможным осуществление новых маршрутов. Это звучит, конечно, парадок­сально, и тем не менее, вероятно, соответствует действитель­ности.}

_{Здесь уместно отметить, что представление о ферментатив­ных реакциях как об очень быстрых — привычное заблуждение. Ферментативные реакции (правильнее, процессы) обычно гораз­до быстрее неферментативных. Но неферментативные, как было показано, нельзя сравнивать с ферментативными — они идут по другим маршрутам. Абсолютные скорости ферментативных про­цессов (как и конгруентных им неферментативных) вовсе не велики.}

_{В самом деле, ферментативные циклы — превращения суб­страта в продукт — совершаются за 1 —10}^_3 _{сек, т. е. идут очень медленно. За это время в элементарном акте взаимодействия мо­лекул, атомов, радикалов происходит 10}¹³_—10¹⁰ _{соударений и только одно из 10}¹³_—10¹⁰ _{эффективно — где уже тут говорить о высокой скорости!}[6]

_{Поэтому актуальны «парадоксальные» вопросы — в чем при­чина столь медленной работы ферментов? Почему столь малы числа оборотов большинства ферментов? Что ограничивает эти числа? Скорее всего — малая частота больших тепловых флук­туаций. В самом деле, частота появления флуктуаций величиной 30 кТ на каждую степень свободы составляет примерно 1 сек}^-1_{, 25 кТ — 100 сек}^-1_{, 20 кТ — 10}⁴ _сек^-1_{. А такие флуктуации и нуж­ны для преодоления потенциальных барьеров при взаимодейст­вии реагентов. Таким образом, ферментативные процессы проте­кают медленно из-за малой частоты больших тепловых флук­туаций.}

_{Подведем итог. Белки — ферменты должны претерпевать по­следовательные изменения конформации, что обеспечивает про­хождение катализируемого процесса по наиболее быстрому мар­шруту. Эти последовательные изменения конформации осуще­ствляются за счет флуктуации тепловой энергии и энергии, вы­деляющейся в катализируемом процессе. Общее для всех фер­ментов «узкое место» — малая частота больших флуктуаций.}

_{В табл. 2 приведены данные о числе оборотов, т. е. о числе полных циклов ферментативного процесса за 1 сек для разных ферментов. Как мы видели, для большинства ферментов числа оборотов очень малы — от нескольких единиц до тысяч единиц в 1 сек (и это при 10}¹³_—10¹⁰ _{элементарных актов-столкновений в 1 сек).}

_{ТАБЛИЦА 2}

_{КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ В ЧИСЛЕ ОБОРОТОВ}

_{Фермент}

_{Источник получения}

_{Субстрат}

_{Число оборо- тов, сек~*}

_{«Медленные» ферменты}

_Пепсин

_{Желудочный сок}

_{Ацетил-/-фенилаланил-}

_2-10-'

_свиньи

_{дийодтирозии}

_{То же}

_{То же}

_{Ацетил-/-феиилаланшЯ-}

_1,19-10^-2

_{фенилалаиин}

_»

_»

_{Карбобензокси-1 - г лутамил-}

_1,09-10^-8

_{/-тирозин}

_{Т рипсин}

_{Поджелудочная же­}

_{Этиловый эфир бензоил-/-}

₂₂

_леза

_{аргинииа}

_{То же}

_{То же}

_{Бензоил-/-аргинин}

_►Ч

₁

_О

_ОО

_•^н

_{Химотрипсии}

_»

_{Этиловый эфир ацетил}

_7,МО"¹

_{триптофана}

_{То же}

_»

_{Метиловый эфир бензол-/-}

_1,1-Ю-¹

_{лейцина}

_{Тромбин}

_{Кровь человека}

_{/7ара-нитрофеииловый}

_2,2-10^-1

_{эфир N-карбобензокси-/-}

_{тпрозина}

_{То же}

_{То же}

_{Лара-нитрофеииловый}

_7,2-Ю'¹

_{эфир N-карбобензокси}

_{/-лизина}

_{«Средние» ферменты}

_{Алкогольдег идро-}

_Дрожжи

_Этаиол

₂₅₀

_геназа

_{То же}

_{То же}

_{Ацетальдегид}

₄₁₆

_{Г лкжозо-6-фосфат-}

_{Глюкозо-6-фосфат}

₁₅₀₀

_{дегидрогеназа}

_{Сукцинатдегидроге-}

_{Митохондрии серд­}

_{Сукцннат}

₁₈₄

_наза

_{ца быка}

_{Алаиинаминот ранс-}

_{Сердце свиньи}

_Аланнн

₆₈₀

_фераза

_{Г ексокиназа}

_Дрожжи

_{Глюкоза}

₁₃₀₀

_{Фосфофруктокииаза}

_{Мышцы кролика}

_{Фруктозо-6-фосфат}

₁₈₀₀

_{а-амилаза}

_{Поджелудочная}

_{Амилоза}

₁₀₃₅

_железа

_{Альдолаза}

_{Животные, высшие}

_{Фрукт озо-1,6-дифосфат}

₆₃

_{растения}

_{Ппруватдекарбокси-}

_Дрожжи

_{Пируват}

₁₅₀

_лаза

_{Карбокснпептидаза}

_{Поджелудочная же­}

_{Г 1:ппурил-/-лизин}

₂₂₀

_В

_леза

_{То же}

_{То же}

_{Г иппурил-/-аргинин}

₁₀₅

_{Фермент}

_{Источник получения}

_{Субстрат}

_{Число оборо­тов, сек~}¹

_{«Быстрые» ферменты}

_{Каталаза}

_{Печень быка}

_н202

_9-104

_{Ацетилхолинэстера­}

_{Электрический}

_{Ацетилхолин}

_за

_угорь

_{Угольная ангидра­}

_{Эритроциты чело­}

_Н2СОа

_{2,3 ■ 10}⁴

_{за Ь}

_века

_{Угольная ангидра­}

_—

_—

_3,6•10⁵

_{за с}

_Уреаза

_{Бобы капавалии}

_{Мочевина}

_1,7-10^

_{Инвертаза}

_Дрожжи

_{Сахароза}

_1,3-Ю⁴

_{Т риозофогфз тизо-}

_{Мышцы кролика}

_{3-фосфоглицериновый аль­}

_8,5-Ю³

_мераза

_дегид

_{Такую картину нельзя объяснить биологической целесообраз­ностью— тем, что большие скорости и не были нужны в эволю­ции. Давление естественного отбора не терпит пустоты. Совер­шенство ферментов, в силу сказанного ранее, должно быть пре­дельно возможным. И если их числа оборотов столь малы, зна­чит, они ограничены физическими причинами.}

_{Мы видим, однако, в табл. 2 и несколько ферментов, у кото­рых числа оборотов на несколько порядков выше, чем у осталь­ных— это ацетилхолинэстераза, каталаза, угольная ангидраза. Они выполняют функцию быстрого разрушения небольших мо­лекул— ацетилхолина, перекиси водорода, угольной кислоты. Из сказанного выше мы должны вывести, что эти ферменты отли­чаются от основной группы принципом работы. Возможно, что катализируемые ими реакции происходят в один акт, и сами быстрые ферменты не должны претерпевать значительных кон- формационных изменений в каталитическом цикле. Такие фер­менты, по-видимому, наиболее близки к небиологическим гете­рогенным катализаторам.}

_{Протеолитические ферменты (см. общие сведения [217]). В табл. 2 приведены также сверхмедленные ферменты — протеа- зы, которые гидролизуют белки. Иные из них осуществляют все­го один оборот за 10}³ _{сек. Чем это можно объяснить? Сложностью катализируемых процессов? Вряд ли. Процессы, катализируемые синтетазами, например, синтетазой жирных кислот, по числу от­дельных стадий, необходимости взаимодействия большого числа молекул, согласованности действия разных субъединиц макро­молекулы фермента нисколько не проще, а идут быстрее.}

_{Можно предложить несколько объяснений этого странного явления.}

_{Возможно, что причина медленности протеолиза — особые}

_{свойства субстратов-белков. Нативная конформация белковых макромолекул «устроена» так, что возникающие в полипептид­ной цепи флуктуации энергии отводятся по «хребту» главных валентностей на поверхность глобулы и там рассеиваются. Такая канализированная теплопроводность обеспечивает особую устой­чивость нативной макромолекулы белка. Протеолитический фер­мент, атакуя пептидную связь в нативной макромолекуле, дол}­_{жен дожидаться для ее разрыва значительно больших флуктуа}­_{ций энергии, чем для разрыва такой же связи в денатурирован­ной макромолекуле с нарушенной внутримолекулярной тепло­проводностью. Существенно легче, быстрее должны разрушаться пептидные связи и в низкомолекулярных пептидах. Этого, как видно из таблицы, нет. Однако эффект резкого ускорения ско­рости протеолиза после денатурации белков широко известен. На этом эффекте основан метод характеристики степени нативности конформаций макромолекул белков. На этом же, в сущности, основана и кулинарная обработка мяса. Однако, несмотря на огромный исторический опыт человечества в денатурации белков для ускорения их протеолиза, достоверный механизм этого эф­фекта не выяснен. Принято думать, что ускорение протеолиза после денатурации белков-субстратов вполне объясняется увели­чением доступности для ферментов, скрытых в нативном белке пептидных связей, гидролизуемых данной протеазой. Мне не ка­жется, что такое объяснение вполне обосновано. Необходимы тщательные кинетические исследования.}

_{Более правдоподобно объяснение особой медленности — гид­ролиза пептидных связей, в том числе и низкомолекулярных пеп­тидов, эволюционными причинами. В эволюции не было необхо­димым возникновение высокоактивных протеаз, поскольку их активность лимитирована медленностью диффузии их естествен­ных субстратов — белков (см. главу 5, с. 81).}

_{Общая картина функционирования ферментов представляет­ся такой. «Голодные» макромолекулы фермента в растворе без субстратов (или встроенные в какую-либо структуру) подверга­ются действию тепловых флуктуаций — испытывают случайные изменения конформации, «щелкают челюстями», т. е. иными сло­вами, в результате анизотропии теплопроводности макромолекул тепловые удары молекул среды по всей поверхности макромоле­кулы фермента преобразуются в высоко амплитудные конфор- мационные движения ее частей друг относительно друга.}

_{При взаимодействии фермента с молекулами субстрата обра­зуются фермент-субстратные комплексы. Теперь анизотропия теплопроводности макромолекул обусловливает подведение флуктуаций энергии в активный центр, где эта энергия тратится на преодоление потенциальных барьеров, препятствующих осу­ществлению реакций. Преодоление этих барьеров осуществляет­ся за счет высоко амплитудных конформационных движений (колебаний) макромолекулы фермента, которая перекусывает,разгрызает, или наоборот слепляет молекулы субстрата. Реак­ции могут состоять из многих элементарных стадий. Каждой стадии соответствует своя конформация макромолекулы, свое время ожидания должной по величине флуктуации энергии, свой вид конформационных движений. По завершении всех промежу­точных превращений возникает конечный продукт, не образую­щий достаточно прочного комплекса с ферментом и этот комп­лекс диссоциирует. Длительность существования так®ге фермент- субстратного комплекса определяется в основном суммарным (по всем этапам) временем ожидания нужных флуктуаций. Вре­мя это велико, чем и объясняется непреодолимая в эволюции медленность ферментативных процессов. Конформационные дви­жения макромолекул ферментов при осуществлении ими катали­тических реакций должны приводить к увеличению скорости диффузии макромолекул, «работающих» ферментов по сравне­нию с неработающими.}

_{Возможная синхронность конформационных движений макро­молекул в ансамблях и ее следствия. Представим себе теперь большое число таких макромолекул фермента в растворе, содер­жащем соответствующий субстрат. По существу речь здесь идет}

_{множестве генераторов механических колебаний, распределен­ных в среде, в которой они совершают циклические изменения конформации. Поскольку эти генераторы полностью идентичны, обязательно должно происходить их взаимодействие, приводя­щее к образованию упорядоченных в пространстве синхронно колеблющихся ассоциаций ферментных макромолекул. В резуль­тате в растворе должны образоваться структуры типа жидких кристаллов отличающиеся от обычных своей эфемерностью ■— они представляют собой ансамбли лишь работающих макромо­лекул фермента. Мне представляется появление таких ассоциа­ций обязательным следствием способа функционирования фер­ментов. Иными словами они образуются не потому что это эво- люционно необходимо а потому что не могут не возникнуть (см. гл. 8). Однако их формирование, обусловленное физико-химиче­скими механизмами, может стать причиной ряда биологических следствий. Существование таких ансамблей макромолекул, син­хронно циклически изменяющих свою конформацию, должно приводить к некоторым макроскопическим эффектам. Среди них наиболее вероятным представляется не только резкое ускорение диффузии, но и возникновение около таких ансамблей более или менее регулярных потоков жидкости, возбуждаемых и поддер­живаемых синхронными движениями ансамблей макромолекул. (Нужно помнить, что в результате осуществления катализируе­мых ферментами реакций выделяется энергия, окупающая все расходы и достаточная для совершения разного рода работы}[7]_.)

_{Эквивалентным эффектом является перемещение самих макро­молекул, которое в силу синхронизации и синфазности конфор- мационных циклов отдельных макромолекул должно значитель­но превышать перемещение последних. Так, перемещение лодки- восьмерки с синхронно работающими гребцами, значительно превосходит перемещение отдельных лодок-одиночек, движущих­ся в разных направлениях и мешающих друг другу. Такой эф­фект— ускорение диффузии и перемещение в пространстве ката­литических ансамблей — имеет огромное принципиальное значе­ние и создает новое направление кинетического совершенствова­ния в процессе эволюции.}

_{Из возможных следствий взаимодействия макромолекул фер­ментов, осуществляющих конформационные колебания, или в общем случае, циклические изменения конформации, рассмотрим пульсации давления — звуковые волны. Диапазон чисел оборо­тов большинства ферментов соответствует слышимым звуковым частотам. Некую, пока еще фантастическую картину «музыкаль­ных взаимодействий» биохимических систем, клеток, органов, и возможную роль этих взаимодействий в жизнедеятельности мы рассмотрим подробнее в главе 8 (см. [253, 337]). Возможно, наи­более важным следствием функционирования макромолекул ферментов посредством изменения своей конформации являются механо-химические преобразования энергии. Способность к та­ким преобразованиям не может остаться вне поля зрения естест­венного отбора. Начинается эволюционное совершенствование, образование специализированных, высокоэффективных систем биологической подвижности (см. гл. 9, с. 174).}

_{Теплоустойчивость белковых макромолекул и анизотропия теплопроводности. Анизотропия теплопроводности макромолеку­лы белка делает эту молекулу особо устойчивой к разрушающе­му влиянию тепловых флуктуаций — они отводятся по «хребту» главных валентностей и разряжаются на концевых группах, спо­собных совершать высоко амплитудные конформационные дви­жения, или же на дефектах структуры. Можно представить себе такой ход тепловой денатурации белка, при котором первона­чальное медленное из-за анизотропной теплопроводности нару­шение нативной структуры, требующее преодоления очень высо­кого барьера, сменяется быстрым легко осуществляемым ее на­рушением. Такая пороговая зависимость тепловой денатурации от температуры и будет восприниматься в опыте как проявление очень больших величин предэкспоненциальных множителей и больших энергий активации в уравнении Аррениуса для скоро­сти денатурации.}

_{Как скажется на теплоустойчивости макромолекулы фермен­та взаимодействие с субстратом? В разных случаях по-разному. В свободной макромолекуле фермента больше всего должны}

_{быть подвержены тепловому разрушению связи, близкие к кон­цевым группам, шарнирные группы и т. п., т. е. все области, где разряжаются тепловые флуктуации. При взаимодействии с суб­стратом большие тепловые флуктуации обеспечивают катализи­руемые превращения, и тогда можно ожидать повышения тепло­устойчивости работающего фермента по сравнению с безработ­ным. Вместе с тем в ходе каталитического акта может выделять­ся энергия, создающая дополнительную нагрузку на структуру фермента. В этом случае можно ожидать неоднозначной зави­симости теплоустойчивости ферментов от концентрации субстра­та — при малых концентрациях субстрата теплоустойчивость мо­жет падать, а при больших — расти.}

_{Возможные способы регулирования ферментативной актив­ности. В понятие совершенства функционирования катализато­ров входит и совершенство изменения скоростей биохимических процессов. Поскольку их скорости определяются в основном на­личием и активностью соответствующих ферментов, регулирова­ние биохимических процессов может идти двумя путями: регу­лированием синтеза ферментов, т. е. регулированием преобразо­вания генетической информации, записанной в полинуклеотидных цепях, в последовательность аминокислот в полипептидных цепях белков — ферментов и регулированием активности уже синтези­рованных ферментов. Оба эти пути — предмет многочисленных исследований и им посвящены фундаментальные работы и об­зоры [11а, 25, 33, 42, 56, 89, 90, 176, 211, 245, 257, 258, 302, 310].}

_{В связи со сказанным ранее, здесь все же следует подчерк­нуть, что конформационная лабильность, машинный принцип функционирования макромолекулы фермента создают возмож­ность для тонкой регуляции ферментативной активности.}

_{Резюмируем сказанное в этой главе. Биологические катали­заторы по своему происхождению и способу эволюционного со­вершенствования с необходимостью должны быть полипептида­ми, белками. Их каталитические свойства определяются строго специфическим соединением как с исходным субстратом, так и с промежуточными продуктами его превращения. Это достига­ется в большинстве случаев посредством закономерных обрати­мых конформационных изменений макромолекул ферментов. Ра­ботающие молекулы ферментов, возможно, образуют многомоле­кулярные ансамбли с синхронными конформациониыми движе­ниями всех его членов. Следствием таких движений может быть активное перемешивание реакционной смеси, эквивалентное су­щественному ускорению диффузии. Эти ансамбли могут в ходе дальнейшей эволюции явиться началом формирования специа­лизированных аппаратов активного перемещения в пространстве. Анизотропная теплопроводность может быть причиной как по­вышенной теплоустойчивости, так и повышенной устойчивости к протеолизу нативных молекул белка.}

_{Глава 5}

_{КИНЕТИЧЕСКИЙ СМЫСЛ И ВОЗМОЖНЫЕ СПОСОБЫ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ}

_{Принципиальная осуществимость всех биохимичскш процессов в гомогенных растворах.}

_{Необходимость структурной организации для обеспечения высокой скорости переключений многоэтапных биохимических превратный и для осуществления этих превраще-ий посредством наименьших количеств ферментов.}

_{Обеспечение полиферментными комплексами t органеллах, окруженных избирательно проницаемыми мтб ранами, при активном, противоградиентном накачивании и.хосных веществ наивысшей возможной суммарной скорости м-огсэтапных биохимических превращений и наибольшей сксоости изменения их режима.}

_{В предыдущей главе мы рассматривали общие механизмы функ­ционирования ферментов, не обращая внимания на диффузные ограничения обеспечения ферментов субстратами. На самом деле дальнейшее эволюционное совершенствование каталитиче­ской активности ферментов становится с некоторого момента бесполезным и, следовательно, не происходит из-за диффузион­ных ограничений (см. [208]).}

_{В самом ли деле диффузия ограничивает скорости биохими}­_{ческих процессов? Убедиться в этом можно лишь посредством количественных оценок. Такая оценка проведена при содействии}

_{С. Э. Шноля нами [343].}

_{В этой статье оценена интенсивность дифсузяонных потоков субстратов в биохимических процессах, идусих без активного перемешивания для двух случаев моделей гои диффузии суб­страта к каталитически активной поверхностна 2\ при диффузии субстрата в растворе катализатора-фермента. Первый случай соответствует расположению фермента, на какой-либо внутри­клеточной мембране или адсорбции фермента на наружной по­верхности клетки (например, в случае так называемого «присте­ночного пищеварения» [294]). Второй случай еоогветствует про­цессам типа гликолиза.}

_{Модель 1. Пусть на одном конце трубки длиной I поддержи­вается постоянная концентрация S0 данного субстрата. На дру­гом конце представим себе тонкий слой молек л фермента, пони­жающих S0 до Si. Максимально возможный диффузионный поток получится при Si = 0. Он равен:}

_{/’max ^ DSq — ,где D — коэффициент диффузии, 0 — площадь поперечного сече­ния трубки. Для D~ 10~}⁶ _см²_{/сек, 50 — 10}³ _{М (10~}^в _{моль/см}³_{) по­лучим /т.ах в зависимости от I и а = а}²_{, приведенную в табл. 3.}

_{ТАБЛИЦА 3}

_{МАКСИМАЛЬНЫЙ ДИФФУЗИОННЫЙ ПОТОК СУБСТРАТА /тах В МОЛЬ/СЕК К ФЕРМЕНТАТИВНО-АКТИВНОИ ПОВЕРХНОСТИ}

₁

_а

₁

_ю->

_Ю-»

_ю-*

_Ю-‘

₁

_10-¹²

_10-U

_10-16

_Ю-!8

_10-20

_10-*

_кг¹¹

_Ю-is

_10-!5

_10~¹⁷

_10-19

_1(Г²

_10-¹⁰

_Ю-12

_1(Г¹⁴

_10-16

_Ю-18

_10-³

_1<Г⁹

_10-11

_10-13

_10-15

_Ю-17

_10-4

_10“⁸

_Ю-ю

_Ю'12

_Ю-м

_10-!в

_{Посмотрим теперь, какой каталитической активностью дол­жен обладать фермент, чтобы обеспечивать переработку всего субстрата, поступающего с диффузионным потоком.}

_{Пусть молекулы фермента расположены на площадке а в один слой. При концентрации фермента Е0 моль/см}³ _{на площадке в}

_см² _{расположится n=(E0N)*}^!_{* молекул фермента (N—число Авогадро).}

_{Таким образом, каждая молекула фермента должна перера­батывать j-N/(E0N)}^% _{молекул субстрата в секунду, чтобы обес­печивать максимальный диффузионный поток. Следовательно:}