Вопрос об унии был злободневным для Польши на протяжении более полутора столетий. Польские магнаты поднимали вопрос об унии на четырех сеймах. Шляхту привлекали земли Великого княжества, чины и богатства. Она открыто добивалась инкорпорации Великого княжества Литовского. Идея унии находила поддержку со стороны белорусской шляхты, надеявшейся получить «золотую польскую вольность». В 1562 г. белорусская шляхта создала в лагере под Витебском конфедерацию и обратилась с просьбой к Великому князю заключить унию с Польшей. Польская католическая церковь видела в унии средство расширения своего влияния на восток.
В 1558 г. Иван Грозный начал войну с Ливонией. Великий магистр Ордена Г. Кеттлер обратился к Великому князю Литовскому и королю Польскому Сигизмунду II Августу (1548 – 1572 гг.) с просьбой о помощи. В результате Орден был поделен на две части: Курляндское герцогство и литовско-польскую провинцию Инфлянты. Курляндский герцог признал себя вассалом Великого князя Литовского. В связи с этим царь начал войну против Великого княжества Литовского. В 1563 г. взял Полоцк и стал именоваться «Великим князем Полоцким». Он занял северо-восточную Беларусь, ему открылся путь на столицу княжества. Государство оказалось на грани политического краха и военной катастрофы, под угрозу было поставлено само его существование.
В январе 1569 г. в Люблине открылся общий сейм. Продолжался он шесть драматических месяцев. Каждая сторона ставила свои условия, которые не принимались другой. Увидев угрозу насильственного заключения унии на неприемлемых условиях, послы Великого княжества Литовского покинули город. Тогда польская сторона продемонстрировала силу. Сигизмунд Август II издал указ о присоединении к Польскому королевству Подляшья, Волыни, Подолии и Киевщины, в результате чего почти половина территории Великого княжества Литовского отошла к Польше. Оказать сопротивление Польше княжество не могло. В этих условиях была сделана попытка начать переговоры с Иваном IV о мире, но она была безрезультатной. В этих условиях делегация Великого княжества Литовского вынуждена была вернуться в Люблин и 1 июля 1569 г. подписать акт унии в той форме, которую предлагала Польша.
В соответствии с этим актом Польское Королевство и Великое княжество Литовское объединялись в одно государство – Речь Посполитую . Единого государя предполагалось избирать на общем сейме, провозглашая его Королем Польским, Великим князем Литовским, Русским, Прусским, Мазовецким, Жемойтским, Киевским, Волынским, Подляшским и Инфлянтским. Отдельное избрание Великого князя Литовского прекращалось. Права поляков в княжестве и жителей княжества в Польше уравнивались. Для обсуждения общегосударственных дел предусматривались общие сеймы. Люблинская уния сильно ограничивала суверенитет княжества, но его государственности окончательно не ликвидировала. Оно сохранило свое войско, судебную систему, административный аппарат, печать с Погоней. Обе части Речи Посполитой имели самостоятельные названия и до конца XVII в. – государственные языки. В княжестве таковым был белорусский.
В результате Люблинской унии Польша получила большие возможности для проведения великодержавной политики в отношении населения Великого княжества. Политика Речи Посполитой по насаждению на белорусских землях католицизма и проведению полонизации дополнили дифференциацию белорусского общества этнорелигиозной дезинтеграцией. Полонизаторские процессы привели к отрыву от белорусской этнической общности ее интеллигенции, высших слоев, чем затруднили процесс формирования и развития единого народа. Противодействовать этим явлениям было трудно. Сенат Речи Посполитой состоял преимущественно из польских представителей. В сейме, где из ста восьмидесяти послов только сорок шесть приходилось на Великое княжество, из них на белорусские поветы – тридцать четыре.
Наряду с политическими ограничениями белорусская шляхта почувствовала и экономические ограничения. Она не могла получать земли в тех регионах, что были присоединены к Польше. Польская же шляхта стала активно пользоваться правом приобретения имений в княжестве. Все это явилось основой сепаратистских и даже антипольских настроений в Беларуси в 70 – 90 гг. XVI в. Было немало сторонников разрыва союза с Польшей, которые вели борьбу за независимость своего государства. В этот период регулярно созывало свои сеймы ВКЛ. В 1581 г. была создан высшая инстанция – Трибунал, а принятие в 1588 г. своего свода законов – Статута – по существу сводило на нет некоторые положения Люблинской унии.
В 1572 г. умер Сигизмунд II Август, последний Польский Король и Великий князь Литовский из династии Ягеллонов, занимавший трон по праву наследования. После него короли стали избираться сеймом, что часто приводило к так называемым бескоролевьям, которые тянулись от смерти одного монарха до избрания другого. После очередного бескоролевья на престол был избран Стефан Баторий (1576 – 1586 гг.). В 1579 г. войска Речи Посполитой под руководством Стефана Батория взяли Полоцк, Велиж, Усвяты и Великие Луки, в 1582 г. начали осаждать Псков, но занять его не удалось. В 1582 г. Ливонская война завершилась Ям-Запольским миром, по которому к Речи Посполитой перешла вся Ливония, Полоцк и Велиж.
В конце XVI – первой четверти XVII в. В правящих кругах Речи Посполитой была популярной идея присоединения к ней Московского княжества. Ее поддерживали и великокняжеские политики, рассчитывавшие, что в новом огромном евроазиатском государственном образовании княжеству будет принадлежать лидирующая роль. От дипломатических способов осуществления этой идеи – выдвижения на трон речи Посполитой кандидатуры Ивана IV и его сына Федора в 1573 и 1587 гг. – перешли к военным походам Лжедмитриев на восток в 1604 и 1607 гг. В военную компанию 1609 г. войско Речи Посполитой вернуло в состав княжества Смоленск, а в 1610 – 1612 гг. овладело самой Москвой, но было изгнано народным ополчением под руководством Д. Пожарского и К. Минина. В войне 1633 – 1634 гг. Россия попыталась взять реванш за Смоленск, но потерпела неудачу, и Полянский мир покинул границы прежними. Тем не менее, в конце XVI – первой половине XVII в. доминирующая роль в Восточной Европе перешла от Великого княжества Литовского, а затем Речи Посполитой, к их сопернику – Московскому государству.