Симбиоз с микроорганизмами — основа жизни растений

Многие исследователи эндотрофной микоризы растений пытались выделить чистые культуры симбионтных грибов. Неожиданной оказалась невозможность их получения из корней растений, когда уже были известны составы питательных сред для культивирования почвенных грибов. Иногда выделялись грибы из семейства Fusarium или других сапрофитных грибов, которые считали эндофитами растений. К сожалению, эту ошибку повторили и некоторые современные исследователи (Хрущева, 1956; Дорохова, 1970). Ш. Тернец (Tcrnetz, 1907), применив оригинальную питательную среду с добавлением вытяжек из торфа и листьев рододендрона, выделила эндофиты из корней клюквы, брусники, подбела и вереска. Приведенные ею фотографии препаратов (рис. 9) убеждают, что под микроскопом она наблюдала прорастание характерных многоклеточных симбионтных грибов. Однако из–за ненадежной стерилизации поверхности корней 1%-иой соляной кислотой в качестве чистой культуры выделился быстрорастущий фикомицетный гриб Phoma, который Ш. Тернец и в дальнейшем М. Рейнер (Rayner, 1925) считали настоящим эндофитом, так как он способствовал заражению молодых сеянцев эндофитами и заметно усиливал рост их корней. Данные, полученные этими авторами, длительно обсуждались в научной литературе и были признаны ошибочными, но их питательные среды еще долго использовались исследователями.

Рис. 9. Прорастание эндофитов из клеток эпидермиса корней различных растений (по Ternetz, 1907)

X. Вольф (Wolff, 1926) выделил многоклеточный мицелий грибов из корней Neottia nidus avis и некоторых других зеленых орхидей на средах с глюкозой, пептоном, вытяжками из гумуса и листьев граба. Этот исследователь впервые заметил очень важную особенность эндофитов: их лучший рост в жидких питательных средах, чем на твердом агаре, что подтверждает их адаптацию к плазме растительной клетки. У Вольфа мицелий эндофитов обычно рос глубинно и только изредка возникал воздушный мицелий со спорангиями на поверхности питательной среды, что, но нашему убеждению, указывало на загрязнение чистых культур эндофитов, которые никогда не образуют воздушного мицелия. Примененный автором метод стерилизации корней был оригинален, но ненадежен. Для освобождения от поверхностных плесневых грибов автор помещал корни в питальный раствор Кнопа и после прорастания и удаления наружных грибов промывал корни спиртом. Процедура повторялась 3 раза, что не всегда избавляло препараты от загрязнения другими грибными культурами.

До сих пор выделение чистых культур эндофитов удавалось немногим исследователям, которые сами не могли установить основную причину успеха. Так, Р. Фрейслсбен (Freisleben, 1933, 1936) пытался выделить чистые культуры эндофитов из 42 растений, но ему удалось получить их только в одном случае из сильно микотрофного растения черники (Myrlillus). У этого эндофита не было спороносящих органов размножения, и он состоял из многоклеточного мицелия. При заражении эндофитом семян различных растений у них повышалась всхожесть, усиливались рост растений и развитие микоризы. Е. Поммеру (Pommer, 1959) удалось выделить многоклеточный эндофит из клубеньков ольхи (Alnus glutinosa) на обычной питательной среде, обогащенной соком из поверхностно стерильного клубенька этого растения после освобождения его от кожицы. До Поммера из клубеньков ольхи некоторые исследователи выделяли только актиномицеты, которые являются необязательными их компонентами. Автор подчеркнул медленный рост эндофитов и гранулированное строение их плазмы, а также образование везикул. При заражении стерильно выращенных проростков ольхи чистой культурой эндофитов на их корнях через 4-6 недель образовались клубеньки, тогда как у контрольных растений они не возникали. Это, по мнению автора, доказывало, что появление клубеньков у небобовых растений определяется грибами, а не актииомицетами. Однако Поммеру не удалось на основании своего метода выделить эндофиты из клубеньков других небобовых растений.

А. Келли (1952) считал, что в природе не существует специальных микотрофных грибов, а имеется только «микоризное состояние» любых почвенных грибов, обладающих способностью интенсивно внедряться в ткани растений. Этим недоказанным утверждением А. Келли оказал плохую услугу науке о симбиотрофном существовании растений, поскольку многие исследователи восприняли данное ошибочное положение как аксиому. Отрицание специфичности и особой ферментативной направленности у различных микроскопических грибов противоречит успехам, достигнутым технической микробиологией в синтезе определенных органических веществ или антибиотиков.

Некоторые ботаники считают возможным перерождение симбионтных грибов в паразитарных и наоборот. Однако это утверждение явно ошибочно, так как такое перерождение должно сопровождаться перестройкой их ферментативного аппарата в процессе выполнения противоположных по своему характеру действий. Также нельзя согласиться с указаниями Б. Моссе (Mosse, 1969, 1973), что симбионтными грибами являются фикомицетные эндогоновые грибы, разлагающие лесную подстилку. Если бы эти грибы действительно заразили растение, то они произвели бы в нем такую же разрушительную работу, как в подстилке. Б. Моссе в противоположность своим предшественникам Ш. Тернец (Ternetz, 1907) и М. Рейнер (Rayner, 1929) придерживалась теории заражения корней растений эндофитами в почве, так как, по ее представлениям, генеративные органы растений не содержат эндофитов, что было ошибочно подтверждено и Л. В. Крюгер (1969). Для заражения Б. Моссе предпочла использовать сапрофитный фикомицетный гриб из семейства Endogonaceae. Заражение стерильных семян различных растении спорокарпиями этого гриба приводило иногда к желаемым результатам, и в корнях опытных растений образовывалась, по ее мнению, «везикулярно–арбускулярная фикомицетная микориза». Б. Моссе (Mosse, 1969) усиливала заражаемость эндогоновыми грибами, включая ризосферную бактерию из рода Pseudomonas, после чего получила более убедительные доказательства значения поверхностного заражения стерильных семян для образования эндотрофной микоризы фикомицетного типа.

Ни Б. Моссе, ни ее последователи в нашей стране Л. В. Крюгер и И. Л. Селиванов (1976), включая в процесс заражения новый фактор — ризосферные бактерии, не определили отдельно степень участия данного фактора в образовании указанных микориз. Между тем это избавило бы исследователей от необходимости проводить кропотливую работу по разработке метода получения эндогоновых грибов из лесной подстилки, так как желаемая микориза образовалась бы при действии одной ризосферной бактерии, вместе с чем отпала бы необходимость считать ее фикомицетной.

Вряд ли теоретически можно допустить, что сапрофитные грибы, обладающие набором ферментов для разрушения мертвых растительных остатков лесной подстилки, способны осуществлять в корнях растений многочисленные синтетические процессы, поскольку такая универсальность несвойственна микроорганизмам.

Для окончания затянувшейся на несколько десятилетий дискуссии о природе и происхождении грибных симбионтов растений назрела необходимость в разработке метода выделения чистых культур эндофитов с целью установления их морфологии, физиологии, происхождения и сущности взаимосвязи с растениями. Неудачные опыты многих исследователей, предпринимавших попытки решить этот вопрос, заставили нас искать новые пути получения таких культур.

Метод выделения эндофитов. Наша работа по выделению чистых культур эндофитов из корней растений была начата с выяснения надежной стерилизации поверхности корней, не нарушающей жизнедеятельности находящихся внутри них живых организмов. Было установлено, что применение 2-3‑минутной обработки тонких корешков сулемой в концентрации 1 : 1000 и последующая отмывка сулемы спиртом и многократно стерильной водой обеспечивают стерильность поверхности корня и не нарушают жизнеспособности эндофитов. Это же достигается при короткой обработке 30%‑ной перекисью водорода.

Состав питательной среды. После долгих поисков мы остановились на следующей буферной питательной среде (г на 1 л воды): глюкоза — 8; К2НРО4 — 0,3; КН₂Р0₄— 0,9; MgS0₄ — 0,2; K₂SО₄ — 0,1; FeS0₄ и MnS0₄ — следы, аспарагин — 0,01.

Нам удалось также установить основную особенность симбионтных грибов растений — их потребность в ростовых веществах в короткий период прорастания из растительной ткани в питательную среду и, как мы увидим дальше, в процессе прорастания из семени в корень, В обоих указанных случаях без наличия гормонального воздействия извне эти грибы не прорастают (Гельцер, 1973а, б). В редких случаях при сильной микотрофности растений и, очевидно, достаточной концентрации гормональных веществ в тканях их корней, а также при небольшом разведении питательной среды эндофиты прорастают без добавления ростовых веществ. Так были получены чистые культуры эндофитов из черники (Freisleben, 1936), корней зеленых орхидей (Wolff, 1926) и из ирисов в наших опытах.

В качестве ростовых веществ могут быть использованы спиртовые вытяжки из различных гименомицетов и фитобактериомицета, который изготовляется из актиномицета (Actinomyces lavendulae), ризосферных бактерий или наших препаратов, изготовленных из эндофитов и получивших авторские свидетельства: Симбионт I (Гельцер, 1973а) и Симбионтм2 (Гельцер, Игнатьев, 1982). Во всех случаях количество добавляемых в питательную среду ростовых веществ должно быть минимальным при экспериментально установленной концентрации препарата.

За исключением указанной особенности эндофитов, нами не выявлено каких–то их особых требований к составу питательных сред. В качестве энергетических веществ эндофиты хорошо усваивают глюкозу, сахарозу и крахмал, но неспособны использовать органические кислоты (кроме янтарной), целлюлозу и лигнин.

Заканчивается подготовка к выделению чистых культур эндофитов внесением в каждую колбочку гормональных веществ (по 2-3 капли препарата Симбионтм1 или других активных веществ). После прорастания мицелия эндофитов, которое происходит через 5-12 суток, для освобождения от корней мицелий пересевают в колбы с указанной питательной средой без добавления гормональных веществ, которые грибы синтезируют сами. Так как эндофиты обладают азотфиксацией, то применение минимальных доз азота сохраняется и для их дальнейших пересевов, чтобы при многолетнем культивировании этих грибов в лаборатории не нарушать их способности использовать атмосферный азот, о чем мы подробно расскажем в главе 3.

Чистые культуры эндофитов. Разработанная методика выделения эндофитов обеспечивает получение их чистых культур из любых растений, т, е. из сильно и слабо микотрофных, а также растений, считающихся не микотрофными из–за того, что визуально в их корнях под микроскопом эндофиты не были обнаружены.

Мы выделили чистые культуры эндофитов из корней следующих водных растений: рдестов (Potamogeton natans L.), тростника (Phragmites communis Trin.), белокрыльника (Calla palustris L.) и рогозы (Tipha latifolia L.). Замедленный рост и слабое наращивание мицелия заметно отличают чистые культуры водных от сильно микотрофных сухопутных растений, описание которых приводится ниже.

Мать–и–мачехa (Tussilago farfara L.). Эндофиты из корней этого растения ежегодно выделялись в нашей лаборатории па протяжении 9 лет и постоянно получались одинаковые результаты. Четко септированный многоклеточный мицелий, заполненный зернистой плазмой, никогда не спороносит. При старении в мицелии образуются круглые везикулярные вздутия (рис. 10), хорошо окрашиваемые анилин–бляу. Мицелий гриба в жидких средах растет погружённо, образуя студенистую массу вначале темно–зеленого цвета, а в дальнейшем — черного. Пигмент не переходит в раствор. Эндофиты, выделенные из молодых завязей этого растения, окрашены в золотисто–желтый цвет, как и его цветок.

Рис. 10. Везикулы о старом мицелии чистой культуры эндофитов из корней мать–и–мачехи

Вишня (Primus cerasus L.). Эндофит из корней вишни ежегодно выделялся в течение 8 лет. Сильно септированный мицелий с гранулированной плазмой золотистого цвета выделяет в раствор пигмент густо–вишневого цвета. Много шарообразных везикул, образующих цепочки. Спороносящие органы не обнаружены. При нагревании до 60° мицелий теряет жизнеспособность. В жидких средах растет погруженно.

Облепиха (Hippophae rharnnoides L.). Чистая культура эндофита 2 года выделялась из клубеньков и корней. Многоклеточный четко септированный мицелий. иногда с веретенообразными клетками, заполненными гранулированной плазмой. Мицелий преимущественно выделяет коричнево–бурый пигмент.

Клевер (Trifolium pratense L.). Отличительной особенностью эндофитов этого растения, ежегодно выделявшихся нами в течение 7 лет, является хрупкость молодого мицелия, который легко обламывается, при этом кусочки гиф накапливаются на дне колбы. Извлеченные стерильным капилляром, такие отрезки гиф в новой питательной среде образуют такой же мицелий с отпадающими отростками. Многоклеточный мицелий клевера синтезирует красный пигмент. Плодоносящие органы не наблюдались.

Пшеница (Triticum vulgare Vill.). Ежегодно выделялись в течение 5 лет эндофиты из корней разных пшениц. Сильно септированный мицелий образует рыхлую массу, обычно окрашенную в красный цвет. При старении на концах гиф образуются везикулярные вздутия. Рост гриба в жидкой среде погруженный. Плодоносящие органы не наблюдались.

Ирисы (Iris germanica L.). Эндофиты из корней растения ежегодно выделяли 8 -лет. Многоклеточный мицелий в начале роста с удлиненными, а в дальнейшем — с почти круглыми клетками, заполненными гранулированной плазмой, при старении образует темно–зеленую слизистую массу. Иногда мицелии был окрашен в розовый цвет, что, очевидно, зависит от сорта растения. Плодовые органы не наблюдались. При нагревании мицелия до 60° он терял свою жизнеспособность.

Любка (Platanthera bifolia Rchb.). Топкие, слабо септированные гифы при старении образуют четко септированный мицелий (рис. 11). Его отличительной особенностью является белый цвет. За 7 лет выделении эндофитов только один раз мицелий был окрашен в черный цвет. При погруженном росте плодоносящие органы не наблюдались.

Рис. 11. Мицелии чистой культуры эндофита из корней любки

Вереск (Calluna vulgaris Salisb.). Эндофит этого растения выделялся б лет. Четко септированный мицелий, заполненный гранулированной плазмой, растет погружен но. При старении гифы темнеют и приобретают, как и у всех сильно микотрофных растении, темно–зеленый или черный цвет. Эпдофит, выделенный из цветущей ветки этого растения, синтезировал фиолетовый пигмент. В остальном все так же, как у вышеописанных культур.

Можно было бы представить более 100 подобных описаний чистых культур эндофитов, в которых варьировала бы окраска пигментов и их способность переходить или не переходить в раствор. Эндофиты синтезируют пигменты всех цветов. Так, гриб, выделенный из герани, всегда окрашивался в желтый цвет, но однажды оказался фиолетовым. Выяснилось, что эта герань цвела фиолетовыми цветами.

Общими морфологическими показателями для всех выделенных чистых культур эндофитов были следующие: 1) отсутствие спороносящих органов размножения; 2) многоклеточный мицелий, принимающий по мере старения четко септированную форму с везикулярными расширениями; 3) гранулированная плазма, рассыпающаяся при разрыве оболочки клетки; 4) погруженный рост в жидкой среде при отсутствии поверхностного мицелия; 5) способность синтезировать пигменты разных цветов.

Отличие в развитии мицелия у водных растений заключалось в крайней медлительности их роста в первый год выделения в питательных средах. Только после многих пересевов на протяжении года в богатых углеводами средах они уже ничем не отличались от симбионтных грибов сухопутных растений. Создавалось впечатление, что в корнях водных растений эндофиты голодали и понадобился год частых пересевов в богатых углеводами питательных средах для того, чтобы придать им характерную форму, обычную для эндофитов сухопутных растений.

Разработанная методика получения чистых культур настоящих эндофитов открывает широкие возможности для развития науки о симбиотрофном существовании растительного мира. Ее применение способствует устранению многих спорных вопросов, обременяющих изучение грибного симбиоза растений.

Во введении к разделу об эндотрофной микоризе Дж. Харли (1963, с. 134) сообщает, что «наиболее ярким признаком, позволяющим разделить все типы эндотрофной микоризы на две большие группы является членистость (септированность) их гиф. Гифы могут быть септированными, как у аскомицетов, несовершенных грибов и базидиомицетов, или, наоборот, несептированными, например, у фикомицетов». Это утверждение как бы обобщает выводы различных авторов по данному вопросу, поскольку одни твердо убеждены, что эндофиты принадлежат к фикомицетам, а другие — к несовершенным грибам гифомицетам. Никто из авторов не установил, что определенным семействам растений соответствует один из двух указанных видов грибов. Напротив, дли семейства злаковых растении одни исследователи отмечали наличие септированного мицелия, а другие — несептированного. Очевидно, это расхождение определялось тем, что авторы выделяли из корней пшениц разные грибы. Мы всегда наблюдали в корнях всех растений у хорошо развитого мицелия только многоклеточное строение эндофитов, что подтвердилось при выделении их чистых культур.

При микроскопическом изучении выявление перегородок у мицелия эндофитов, растущих в тканях растений, представляет известные трудности даже после мацерации препаратов в щелочи. В молодых гифах перегородки плохо просматриваются в препаратах. В старых гифах, образующих клубки и петли, они видны отчетливо. Дж. Харли (1963) считал, что микориза у злаковых и бобовых растений относится к фикомицетному типу. Выделенные нами дополнительно для проверки его утверждения чистые культуры эндофитов из люцерны, гороха, вики, акации и бобов всегда имели многоклеточный мицелий, как и эндофиты из ржи, овса, тимофеевки, ежи, пырея и кукурузы. Многие исследователи, применив электронный микроскоп, подтвердили многоклеточную природу эндофитов.

Из всего изложенного следует, что обычно принятое и уже ставшее трафаретным положение о наличии у растений «везикулярно–арбускулярной фикомицетной микоризы» не соответствует действительности и не может быть признано научно доказанным.

Многоклеточное строение гиф эндофитов не дает основания причислить их к роду Rhizoctonia, от которых они отличаются как по морфологическим, так и по физиологическим свойствам. Сравнивая мицелий эндофитов с Rhizoctonia solani u R. ailcrholdii, выращенных в одинаковых по составу питательных средах, можно установить, что последние не образуют везикулярных вздутий, не имеют гранулированной плазмы, как эндофиты, и не синтезируют пигменты. Кроме того, обе культуры Rhizoctonia не обладают азотфиксирующей способностью и не синтезируют гормональных веществ. Все указанные различия заставляют отказаться от причисления эндофитов к указанному роду.

Многовековая адаптация эндофитов к растительной клетке, постоянство морфологических признаков при выполнении ими определенных функций, в том числе и защитного характера (см. главу 5), исключают участие в этом сложном взаимодействии случайного сообщника при заражении корней в почве естественным путем или исследователем в эксперименте. Отсутствие спороносящих органов заставляет отнести эндофиты к классу несовершенных грибов (Fungi imperfecli), где они могут быть выделены в особый порядок симбиофитов — Symbiophytum, отличительной особенностью которых могут являться их морфология и физиологическая способность к синтезу определенных соединений.

Метод получения чистых культур эндофитов из корней растений дал возможность не только составить правильное представление об их морфологии, по и обнаружить наличие эндофитов в корнях тех немногих растений, у которых из–за слабого развития симбионта он не мог быть визуально обнаружен под микроскопом.

Нам предстояло использовать этот метод для решения еще одного вопроса — вопроса о наличии эндофитов в надземных частях растений, что необходимо для доказательства наследственной передачи симбионтных грибов от семени к семени.

В руководимой нами лаборатории О. И. Громыко установила, что чистые культуры эндофитов хорошо выдерживают лиофильное высушивание и длительно сохраняют свою жизнеспособность в сухом состоянии. При прорастании в питательных средах с ростовым веществом они синтезируют пигменты тех же цветов, которые были им свойственны до сушки. Как известно, мицелий плесневых грибов не выдерживает лиофилизации.

Наличие у эндофитов в корнях растений гиф с такими характерными образованиями, как везикулы, арбускулы и спорангиолы, в которых накапливаются белковые продукты их синтеза, хорошо окрашиваемые аиалин–бляу в фиолетовый цвет, а также расположение гиф вдоль коровой паренхимы не оставляют сомнений и их принадлежности к симбионтным грибам.

В мацерированных щелочью листьях и хвое различных растений обнаруживаются слаборазвитые гифы грибов, но их признаки еще не определяют принадлежности к эндофитам.

В книге, посвященной биологии микориз, Дж. Харли (1963), приводя мнение многих авторов о наличии эндофитов в надземных частях растений, подчеркивал его недостоверность, так как все авторы отмечают «ослабленное» состояние гиф в листьях. Только применяя метод выделения чистых культур эндофитов, можно решить вопрос о присутствии симбионтных грибов в надземных частях растений.

Листья и хвоя растений стерилизовались сулемой, спиртом и промывались стерильной водой, после чего их помещали в стерильные чашки Петри с небольшим количеством питательного раствора и 1-2 каплями ростового препарата Симбионт I. Одновременно стерильность листьев проверяли на твердых питательных средах. Спустя 10-15 дней эндофиты из листьев прорастали, что отчетливо просматривалось в микроскопических препаратах, а еще через несколько дней стало возможным выделение их чистых культур. Последние были получены из листьев таких сильно микотрофных растений, как вереск, мать–и–мачеха, брусника, черника, дуб, ольха, липа и др., а также из слабо микотрофных растений картофеля и пшеницы.

В первый период роста мицелий из листьев заметно отличался от мицелия из корней простотой своего строения, малой разветвленностью гиф и слабо очерченными перегородками. Только при длительном культивировании в лабораторных питательных средах с пересевами через каждые 2-3 месяца гифы становятся более разветвленными и широкими, с четко очерченными перегородками и гранулированной плазмой, с везикулярными вздутиями, характерными для эндофитов из корней. Скорость изменения строения гифов определяется степенью микотрофности растений. Для выделения эндофитов из листьев дуба, липы, ольхи, вереска, мать–и–мачехи и других сильно микотрофных растений достаточно было несколько месяцев, тогда как эндофиты из листьев слабо микотрофных растений нуждались в культивировании в течение 1-2 лет (рис. 12). Становится очевидным, что «ослабленное» состояние и «упрощенное» строение эндофитов определяются их неспособностью использовать для питания продукты фотосинтеза листа или отсутствием последних в листе. Возможно, упрощенность функций эндофитов в надземных частях растений связана с отсутствием у них везикул, арбускул и гранулированной плазмы, а основное их назначение сводится к наследственной передаче симбионтных грибов в пыльцу и семена.

Рис. 12. Строение эндофитов» выделенных из листьев стерильно выращенной ольхи (1); та же культура через 1 (2) в 2 года (3)

Достоверность результатов выделения чистых культур эндофитов из листьев была проверена в нескольких стерильных опытах, в которых применялись широкогорлые колбы, заполненные на одну треть силикагелем с питательной средой и закрытые ватной пробкой (в силикагеле лучше, чем в песчаной среде, развивается мелкая корневая система растений, благоприятная для развития эндофитов (Гельцер, 1966). Подопытными растениями были просо, ольха и облепиха, стерильность семян которых проверялась перед посевом на твердых питательных средах. При хорошем освещении растения выращивались 45—60 дней. Контрольные семена намачивались в стерильной воде, а в опытных вариантах — в растворе ростового препарата фитобактериомицина (ФБМ) разных концентраций.

После вскрытия стерильных опытов в контрольных вариантах эндофиты не были обнаружены ни в корнях, ни в надземных частях растений, а в опытных они были выделены и из листьев, и из корней, при этом гифы эндофитов имели весьма четкие везикулярные вздутия; на корнях ольхи и облепихи образовались присущие им клубеньки (рис. 13). Очевидно, нет необходимости применять к стерильным семенам заражение какими–либо грибами. Подробнее на рассмотрении этого вопроса мы остановимся в дальнейшем.

Рис. 13. Клубеньки на корнях облепихи, выращенной из семян, обработанных ФБМ

Необходимо отметить еще одну особенность эндофитов из листьев. Они при длительном культивировании в питательных средах начинают синтезировать цветные пигменты, что характерно для чистых культур эндофитов из корней (Гельцер, 1975). Так, эндофиты из листьев цветущего вереска вскоре начали синтезировать фиолетовый пигмент, из листьев липы (через год после их выделения) — желтый пигмент, характерный для ее цветов.

Несколько культур эндофитов было выделено из завязей липы, яблони, вишни и золотистой смородины. В этом случае для эксперимента нужно брать молодые, недавно образовавшиеся завязи. В отличие от мицелия из листьев растений мицелий из завязей вскоре после своего разрастания синтезирует характерный для данного растения пигмент и по своей морфологии больше соответствует мицелию из корней. Так, колонии эндофитов из завязей липы и яблони были окрашены и ярко–желтый цвет.

Наличие симбионтных грибов в молодых завязях определило необходимость изучения самого сложного органа растения — цветочной пыльцы, которую нельзя подвергнуть поверхностной стерилизации, так как при всех применяемых для этого приемах она теряет способность к прорастанию. Легкая стерилизация возможна только для пыльцевого мешка с последующими стерильными приемами сбора пыльцы. Способность эндофитов к анабиозу подтверждает возможность их существования в пыльцевой клетке без стадии визуально наблюдаемого мицелия. Основным условием, определяющим прорастание эндофитов из растительных клеток, является наличие в питательных средах или окружающих клетках гормональных веществ. При попадании пыльцы на рыльце пестика она получает гормональное воздействие, которое вызывает ее прорастание.

Пыльцевые клетки проращивались многими генетиками, но применение ими несовершенных питательных сред, состоящих из сахара и бора, но без ростовых веществ, всегда обеспечивало развитие только первой стадии их прорастания образование пыльцевой трубки и выход плазмы, содержащей спермин. Вторая стадия — прорастание симбионтных грибов в природных условиях — происходит только при попадании пыльцы на рыльце пестика, который обладает гормональным воздействием.

Для выделения эндофитов из пыльцы в лабораторных опытах мы применяли указанную выше питательную агаровую среду. После застывания этой среды в чашках Петри ее поверхность обрабатывал и янтарной кислотой для предохранения от бактериального заражения. Пыльцевые клетки наносили в нескольких местах и смачивали их гормональным препаратом Симбионт 1 и разбавлении 0,0001. В таких условиях эндофиты пыльцы прорастали.

С. Г. Навашин (1951) установил, что прорастание пыльцы начинается с роста пыльцевой трубки и выделения из нее плазмы спермия во внешнюю среду. В наших опытах этот процесс всегда предшествовал развитию грибного мицелия. В тех случаях, когда пыльцевая трубка не прорастала или содержимое пыльцы не переходило наружу, мицелий гриба не развивался. При наличии водной пленки на поверхности агара в чашках Петри выделившееся из пыльцы плазменное содержимое переносится током жидкости на некоторое расстояние от клетки, создавая впечатление независимого от нее процесса развития грибного мицелия. При подсушке поверхности агара эндофиты прорастают непосредственно около выделившейся плазмы. На рис.14 и 15 видно развитие эндофитов у пыльцы лилии и крокусов.

Рис. 14. Прорастание пыльцы лилия

Рис. 15. Прорастание пыльны крокуса

Наблюдаемая последовательность в фазах развития пыльцы исключает возможность объяснения образования мицелия в результате воздушного загрязнения, не говоря уже о том, что специалист, изучающий чистые культуры эндофитов, не может принять за эндофиты плесневые спороносящие грибы.

Через 1-2 дня после прорастания пыльцевой клетки образуется характерная по своему габитусу многоклеточная грибная колония эндофита. Вначале молодые гифы состоят из удлиненных клеток, заполненных зернистой плазмой с четко очерченными перегородками. При прорастании пыльцы ярко окрашенных цветков, таких как у настурции, георгина или красной лилии, мицелии эндофитов приобретает оранжевый оттенок, но уже на 3-4‑й день он становится темно–зеленым. К этому времени клетки мицелия принимают округлую септированную форму и гифы распадаются на отдельные сегменты. Такую способность к распаду гиф на отдельные клетки, а также быстрый переход удлиненных клеток в бусовидные, мы не наблюдали у других эндофитов, выделенных из других частей растений. На рис.16, 17 видны септированные гифы из пыльцы огурцов и томатов.

Рис. 16. Септированные гифы из пыльцы огурцов

Рис. 17. Септиронанные гифы из пыльцы томатов

Участие симбионтных грибов в процессе оплодотворения растений может быть изучено под микроскопом. Нанесению пыльцы на рыльце и окраске их анилин–бляу должна предшествовать предварительная мацерация препарата в щелочи, что дает возможность отчетливо различать белок грибного происхождения по фиолетовой окраске и белок растительных клеток, окрашенных в голубой цвет.

Какие наблюдения цитологов подтверждают установленный нами факт наличия эндофитов в пыльцевой клетке?

При установлении двойного процесса оплодотворения яйца и вторичных клеток С. Г. Навашин (1951) отмечал проникновение спермия не только в зародышевый мешок, но и в окружающие его клетки нуцеллюса. Это явление было изучено и подтверждено Я. Е. Элленгорном и В. В. Светозаровой (1950), которые обнаружили, что полиспермия сопровождается подкисленном среды. Развитие легко распадающегося грибного мицелия при прорастании пыльны может объяснить явление полиспермии и также вызванное ростом гриба подкисление среды. В. Е. Козлов (1951), описывая цитологический процесс полиспермии у гороха, сообщает, что спермин при соприкосновении с яйцеклеткой разрыхляется и превращается в скопление множества гранул, в конце концов принимая вид длинных неправильных бусовидных нитей. В статье «Новый пример халацогамии» С. Г. Навашин (1951, С, 174) пишет: «Пыльцевые трубки грецкого ореха обладают способностью посылать боковые выросты, появляющиеся почти в любой точке пути пыльцевой трубки», В его груде представлены рисунки сильноветвящихся пыльцевых трубок в халаце. Сейчас, когда установлена способность пыльцевой клетки прорастать мицелием эндофитов, высказывание С. Г. Навашина служит подтверждением указанного процесса.

Как обычно, при изучении природных явлений новые наблюдения порождают новые исследования. Вот и в данном случае предстоит изучить, в чем заключается участие эндофитов в процессе оплодотворения? Служат ли их гифы транспортирующим средством для передвижения спермия в зародышевый мешок или они обеспечивают условия, благопрнятные для слияния двух разнополых клеток, а возможно, они гарантируют наследственную передачу грибных симбионтов растений однородного происхождения? Настоящий опыт показывает, как может гриб попасть в семена.

Нельзя не вспомнить раннюю работу Дж. Пекло (Peklo, 1913), который приложил много усилий, чтобы доказать наличие в семенах гиф грибов. Ему удалось слетать несколько снимков гиф в недозрелом зерне пшеницы. Он считал, что его богатый азотом алейроновый слой состоит из мицелия эндофитов, находящихся в состоянии анабиоза.

Мы разработали следующие приемы для получения чистых культур эндофитов из семян растений. После стерилизации поверхности семян их обрабатывали гормональным препаратом и помещали в стерильные чашки Петри для проращивания до образования первых корешков, после чего семена слегка растирали в стерильной агатовой ступке и переносили в питательную среду. Через несколько дней эндофиты начинают прорастать и скорость этого процесса зависит от степени микотрофности изучаемого семени.

В природных условиях гормональное воздействие на прорастающее семя оказывают эпифитные н ризосферные бактерии, которые обильно развиваются на прорастающем семени. Наиболее подробно эти бактерии были изучены Ю. М. Возняковской (1964), которая установила их способность синтезировать стимулирующие вещества, проникающие в ткани растении. Латвийский микробиолог Л. Л. Клинцаре (1970) создал из эпифитных бактерий препарат, стимулирующий рост растений, и получил на него в 1970 г. авторское свидетельство. При постановке стерильных опытов стерилизация семян лишает их гормонального воздействия указанных бактерий, в результате чего эндофиты из семян не переходят в корень.

Таким образом, метод выделения чистых культур симбионтных грибов способствовал выяснению сложного вопроса о распространенности эндофитов в надземной части растений. Его использование позволило установить наличие таких грибов во всех органах, включая пыльцу и семена. По вызывает сомнений, что синтетическая деятельность эндофитов сосредоточена в корнях, даже в тех случаях, когда нельзя визуально установить их наличие.

Наши четырехлетние исследования по выделению эндофитов из листьев, хвои, завязей, пыльцы и семян растений дают возможность установить, что источником грибной инфекции для корней и надземных органов растений служит прорастающее семя. Такая передача от семени к семени обеспечивает наследственную природу грибного симбиоза, а в ослабленном виде — и при вегетативном размножении от клубня к клубню, от луковицы к луковице и от черенка к саженцу. Для получения микотрофного растения в стерильных условиях нужно обработать семена гормональным препаратом растительного или микробного происхождения.

В природных условиях процесс образования эндотрофной микоризы происходит при активном участии симбионтных бактерий, когда в процессе прорастания семени значительно увеличивается количество эпифитных бактерий и их переход на поверхность молодых корней, где эти микроорганизмы рассматривают в качестве ризосферных бактерий. Продуцируемые ими биологически активные вещества активизируют выход симбионтных грибов, находящихся в алейроновом слое семени, и активное их прорастание в корни. При изучении нами первых корешков длиной 0,5 см в прорастающем семени можно было установить, что их поверхность покрыта слоем ризосферных бактерий. Стерилизация семян исключает возможность развития на них бактерий и тем самым продуцирование гормональных веществ, необходимых для прорастания эндофитов. Нанесение на стерильное семя гормональных препаратов обеспечивает развитие в корнях везикулярно–арбускулярной микоризы. Присвоение последней названия «фикомицетной» нужно еще суметь доказать тем исследователям, которые не хотят признать многоклеточную природу мицелия эндофитов (Гельцер, Кузнецова, 1977).

Вряд ли нужно увеличивать количество литературных примеров, чтобы прийти к выводу, что все значение производимых многочисленными авторами «заражений» стерильных семян различными грибами определятся добавлением некоторого количества гормональных веществ микробного происхождения, необходимых для активизации прорастания свойственных данному растению эндофитов из семян, клубней и луковиц, Вспомним, что выделение чистых культур эндофитов из любых частей растений стало возможным только после того, как была доказана необходимость наличия в питательных средах гормональных веществ. Как мы увидим дальше, эту зависимость симбионтных грибов от гормональных воздействий можно использовать для повышения их активности в корнях сельскохозяйственных культур.

Занимаясь изучением проблем происхождения эндофитов, мы не применяли «заражений» различными грибами, так как всегда считали эндофиты облигатными симбионтами, имеющими большое генетическое значение в сохранении вида растений. Нас интересовал вопрос о специфичности действия различных ростовых веществ на пробуждение эндофитов при прорастании семени, а также характер их действия: стимулируют ли они активность гриба или изменяют растение, создавая более благоприятные условия для развития грибов в корнях. Хотя наши опыты не сопровождались химическим изучением состава примененных ростовых веществ, они в качестве первой разведки могут представлять интерес, в особенности для решения второго вопроса.

В стерильных краткосрочных опытах по выяснению влияния различных стимулирующих веществ на развитие эндофитов из семени использовались следующие питательные среды: песок, почвенно–песчаная смесь, почвенные вытяжки с агаром при добавлении питательной среды Гельригеля. Этими средами заполнялись стаканы емкостью 200 мл, которые стерилизовались в автоклаве в зависимости от состава среды от 0,5 до 1 часа при 1 ат (0,1 МПа). Так как никто не указывал на возможное заражение эндофитами из воздуха, то в дальнейшем растения находились в обычных условиях и только иногда поверхность стаканов 'прикрывали парафинированным песком.

Семена стерилизовались сулемой или перекисью водорода, но так как в контрольных вариантах эндофиты не развивались, мы в дальнейшем ограничивались промывкой их спиртом и стерильной водой.

В качестве гормональных препаратов были взяты спиртовые вытяжки из различных гименомицетов, таких, как белые грибы (Boletus edulis), мухоморы (В. scaber), скрипица (Lactarius vellereus), различные сыроежки (Russula), фитобактериомицин (ФБМ), изготовляемый из актиномицета (Actinomyces lavendulae), гиббереллин, а впоследствии и наш препарат Симбионт 1, продуцентом которого был эндофит, выделенный из корней женьшеня. Семена контрольных растений замачивались в стерильной воде, а опытных — с добавлением в нее 2-3 капель указанных выше ростовых веществ. После 2-4 недель роста растений в стаканах при хорошей освещенности, их корни отмывались от среды, мацерировались в щелочи и продольные препараты изучались под микроскопом при окраске анилин–бляу.

В отличие от поперечных срезов корней, обычно применяемых при изучении микотрофностн, продольные препараты дают возможность просмотреть содержание эндофитов в больших отрезках корня. В зависимости от количества полей зрения, в которых наблюдаются гифы эндофитов, арбускулы, спорангиолы и везикулы, а главное по форме и размерам последних дается оценка микотрофности растений по 5-балльной системе.

Хорошим объектом для изучения влияния ростовых веществ на однолетних растениях были сильно микотрофные просо сорта Саратовское 853 и пшеница сорта Сарубра. После намачивания контрольных семян 30 мин в воде, а опытных — с добавлением 2 капель спиртовых вытяжек из указанных гименомицетов и препаратов ФБМ, гиббереллина, их высушивали и высеивали. Через месяц роста растений на стерильных агаризованных почвенных вытяжках корни в опытных вариантах, кроме варианта с гиббереллином, значительно превосходили по размерам контрольные. Если это основное и самое характерное действие ростовых веществ не проявляется при хороших условиях роста растений, даже если отмечено небольшое улучшение развития эндофитов в корнях, то у изучаемого препарата явно отсутствует способность к гормональному воздействию. В контроле эндофиты не были визуально обнаружены под микроскопом, а в опытных вариантах у проса имелись характерные для него клубки септированных гиф и крупные круглые везикулы с оценкой в 3-4 балла. Подобные результаты получены и при изучении корней менее микотрофной культуры пшеницы.

Вторая серия опытов, проведенная с пшеницей сорта Сарубра, отличалась тем, что в них семена не обрабатывали вытяжками гименомицетов и препаратов, а последние вносили в стерильную среду. Результаты предыдущих опытов повторились, и микотрофность корней была установлена во всех опытных вариантах, но целесообразность использования такого приема для нестерильных почв должна быть проверена, так как в связи с их возможной минерализацией активность препаратов может снижаться.

Наши опыты с применением указанных гормональных воздействий для развития эндофитов в корнях в тех случаях, когда единственным источником их образования были поверхностно стерильные семена, подтвердили мнение исследователей о наследственной передаче грибного симбиоза в растениях. Окончательное признание «циклической наследственности» было связано с доказательством наличия эндофитов в надземных частях растений. Применение методов выделения чистых культур симбионтных грибов из листьев, хвои, завязей, пыльцы, семян и тканевых культур, выращенных из одной клетки в стерильных условиях вне организма, позволило установить присутствие эндофитов в надземных частях растений, чего нельзя было убедительно доказать с помощью визуального их изучения под микроскопом.

Рассмотрение вопроса о наследственной передаче грибного симбионта растений мы хотим закончить результатами изучения эндофитов у вегетативно размножаемых культур (черенками, усами) и у живородящих растений. Что касается картофеля, размножаемого в основном клубнями, то о нем подробнее будет сказано в других главах, так как наиболее важные выводы о значении микотрофизма были получены при изучении именно этой культуры.

Образующиеся миниатюрные зародыши на концах листьев живородящих растений Bryophyllum degramonlianum представляют собой интересный объект для изучения миграции симбионтных грибов в надземной части растений. Снятые с листьев материнского растения ростки имели 3-5 листочков и несколько тонких корешков. После промывания стерильной водой их помещали в закрытые ватными пробками стерильные, склянки с песком, смоченным питательным раствором с уменьшенным содержанием азота. Опыт включал контроль и 2 опытных варианта: с добавлением в среду 0,5 мл гиббереллина и с прибавкой 0,5 мл спиртовой вытяжки из гриба скрипицы. При обработке гиббереллином бриофиллум сильно, вытянулся, что характерно для действия этого препарата. Вытяжка из скрипицы способствовала лучшему развитию корней и листьев, чем в контроле. Через 40 дней при тщательном изучении корней у контрольных растений гифы грибов не были визуально обнаружены. В варианте с гиббереллином наблюдались большое количество типичных везикул и гифы эндофитов с оценкой в 2 балла. Наиболее сильная микотрофность корней была установлена у растений, обработанных метаболитами гименомицета. Здесь в большом количестве встречались многоклеточные гифы и скопления круглых везикул, ярко окрашенных анилин–бляу в фиолетовый цвет, с оценкой в 5 баллов. В данном опыте мы установили (передачу симбионтного гриба через стебель и листья материнского растения своему вегетативному потомству.

При образовании корней у веток ивы и тополя, помещенных в воду, в которую добавлялись питательные соли, визуально наблюдаемые эндофиты появились в короткий срок только в тех вариантах, где в среду вносили несколько капель метаболитов из гриба мухомора или подберезовика.

Такие же опыты были поставлены с семенами лука, укропа и клевера. Во всех случаях ростовые вещества из гименомицетов обеспечивали развитие эндофитов из семян растений, выращиваемых в стерильной среде, тогда как в контрольных вариантах эндофиты в корнях не развивались.

Приведенные результаты опытов, количество которых можно было бы значительно увеличить, не позволяют сомневаться в наследственной передаче эндофитов через прорастающее семя или вегетативные органы растений при непременном наличии в среде гормональных веществ растительного или микробного происхождения. Неясным, однако, оставался вопрос о сущности действия ростовых веществ: оказывают ли они влияние непосредственно на грибной симбионт или, создавая тонкую корневую систему растения, способствуют тем самым развитию в ней симбионта? Для ответа на него нужно было установить влияние гормональных препаратов на развитие растений в различных стерильных средах.

Обычно исследователей не удовлетворяют среды, в которых приходится ставить стерильные опыты. Дело в том, что для этой цели нельзя использовать почву, в которой в процессе стерилизации накапливаются токсические для роста растений вещества. Замена почвы водой с добавлением нужных питательных солей приводит к значительному изменению всего облика корневой системы, которая в водной культуре состоит из толстых слаборазветвленных стержневых корней при полном отсутствии корешков третьего порядка, т. е. тех, где хорошо себя чувствуют эндофиты (рис. 18). Несколько лучше развиваются корневые системы в песчаных средах, но и в них растения (потребляют питательные вещества из водного раствора, что не способствует образованию мельчайшей корневой системы, которая развивается в том случае, когда элементы питания находятся в поглощенном состоянии. Микробиологи часто применяют в качестве стерильной среды жидкое стекло или агаровые среды, которые представляют собой плохо аэрируемую плотную коллоидную массу, куда корни растений проникают с трудом.

Рис. 18. Корни кукурузы, выращенной в различных средах: в водной культуре (1), песке (2), силнкагеле (3), в почве (4)

Плохие свойства указанных питательных сред заставляли исследователей применять для стерильных культур смешанные среды, в которых почва в 2-3 раза разбавлялась песком, что несколько улучшало физические свойства среды и уменьшало концентрацию токсических веществ почвы после ее стерилизации.

В поисках наиболее пригодных для наших опытов стерильных сред был испытан заводской гранулированный силикагель марки ШСК (шихта силикагель крупнопористый). Хорошие физические условия среды определяются структурой силикагеля, а его высокая поглотительная способность имитирует поглощающий комплекс почвы. Стерилизация силикагеля не меняет его свойств.

После длительной очистки силикагеля от поглощенного водорода и хлора в него добавлялись питательные вещества. Лучший рост растений наблюдался при небольшом слое силикагеля — 13-15 см. При более высоком его слое не обеспечивалась равномерная влажность и избыток воды скапливался на дне колбы. Небольшие растения удобно выращивать в широкогорлых конических колбах на 0,5 л. Состав питательной среды можно менять в зависимости от цели опыта.

Создание небольшой прослойки силикагеля в верхней части вегетационного сосуда, заполненного 6 кг дерново–подзолистой неплодородной почвы, способствовало значительному развитию корневой системы растений и повышению ее микотрофности. В опыте, проведенном Н. Г. Коваль, в каждый сосуд вносилось по 400 г. смеси низового торфа с перегноем, по 2 г СаС0₃ и 1 г К₃РО₄. В сосудах опытного варианта создавались 2-сантиметровые прослойки силикагеля, в контроле они отсутствовали. Повторность 3-кратная.

Как видно из табл.2, урожаи зерна яровой пшеницы сорта Краснозерная в опытном варианте были на 45% выше, чем в контроле.

В корнях контрольных растений эндофиты были слабо развиты с оценкой в 1 балл, нередко наблюдались гифы и единично встречались небольшие везикулы. В опытном варианте микотрофность корней достигла небывалых для яровой пшеницы размеров. Она была оценена в 5 баллов. Многочисленные гифы гриба встречались на всей протяженности тонких корней, а количество крупных везикул достигало 20-40 шт. во многих полях зрения микроскопа. Хорошо просматривалось зернистое содержимое везикул с жировыми включениями. Полученные результаты позволили высоко оценить значение силикагеля, обеспечившего развитие мелкой корневой системы растений (рис. 19).

Рис. 19. Корни яровой пшеницы, выращенной в сосудах с прослойкой силикагеля (1) и в контроле (2).

В небольшие цветочные горшки с силикагелем были высеяны стерильные семена проса Саратовское 853. В контроле семена опрыскивали водой, в опытном варианте — фитобактерномицином (ФБМ) в разведении 5 мг на 100 мл. Через 2 мес. растения в опытном варианте оказались на 7 см выше контрольных. Корневая система у последних была хорошо развита и мало отличалась от нормальной корневой системы проса. В эндофитах корней были установлены круглые и продолговатые везикулы. Корни растений опытного варианта заметно превосходили контроль по своим размерам, а также по числу везикул.

До применения силикагеля мы не наблюдали появления эндофитов в корнях стерильно выращенных растений при отсутствии гормональных веществ в питательной среде или на семенах. Хорошее развитие мочковатой корневой системы в силикагеле обеспечило образование эндофитов в тонких корешках и без применения стимуляторов, что раскрывает сущность действия последних, которая сводится к изменению строения корневых систем. В многочисленных опытах со стимулирующими веществами при положительном их действии всегда наблюдалось лучшее развитие корневых систем по сравнению с контролем. Увеличение роста и продуктивности растений под влиянием ростовых препаратов является следствием более развитой и более микотрофной корневой системы_? которая определяет питательный режим и способствует усилению физиологических процессов.

Слабое влияние Берлингтона на продуктивность сельскохозяйственных культур связано с несоответствием замедленного роста корневых систем, что определяется действием этого препарата, и усиленного роста надземной части растений в результате увеличения растянутости клеток стебля и листьев. Вполне закономерно предположить, что гиббереллин не выполняет функций, свойственных гормональным препаратам, так как его продуцент происходит из семейства Fusarium, в котором много патогенных видов. Наросты на рисе, привлекшие внимания исследователей, оказались связанными с патогенным явлением, а не со стимуляцией самого растения.

Приведем результаты еще нескольких опытов, показавшие влияние различных питательных сред на формирование корневых систем растений и степень их микотрофности. Стерильные семена яровой пшеницы проращивались и укреплялись на парафинированной сетке над широкими стерильными пробирками, заполненными водой, песком и силикагелем. Количество питательной среды во всех случаях было одинаковым. В каждом варианте имелись пробирки, в которых семена обрабатывались водой (контроль) и ФБМ. После 30 дней роста проводилась оценка степени развития эндофитов в корнях. Уже по своему виду последние резко различались по вариантам. В воде пшеница образовала прямые толстые корни с редкими разветвлениями второго порядка, тогда как в силикагеле они гофрированы, объемны и имели ответвления второго и третьего порядков. Корни из песчаной среды по своему габитусу занимали промежуточное положение, приближаясь к корням пшеницы, выросшим в водной среде. Во всех вариантах корни из семян, опрыснутых ФБМ, были развиты лучше, чем контрольные.

Изучение эндофитов в корнях проводилось по отдельным отрезкам, начиная от ближайших к семени и далее до конца. Наиболее микотрофными были корни пшеницы из силикагеля, в клетках которых имелись септированные гифы, арбускулы и много клеток с продуктами грибного синтеза, окрашенными анилин–бляу в фиолетовый цвет. Особенно часто такие образования встречались в отрезках корня, прилегающих к семени. Корни пшеницы, росшей на песке, оказались слабо микотрофными, и в них изредка встречались небольшие отрезки гиф эндофитов. Корни из водной культуры были визуально немнкотрофны. Применение гормонального препарата ФБМ заметно усилило микотрофность корней в силикагеле и песке.

В результате многократного повторения опытов с другими культурами установлено, что в стерильных условиях роста источником заражения корней эндофитами является семя,, для активации которого нужно гормональное воздействие,, способствующее как пробуждению эндофита из состояния анабиоза, так и образованию разветвленной корневой системы растений, благоприятной для развития симбионтных грибов. В природных условиях эту роль продуцентов гормонов выполняют всегда сопутствующие семени эпифитные и ризосферные бактерии.

Образование клубеньков на корнях небобовых растений изучала в нашей лаборатории О. И. Громыко. У ольхи и облепихи мы выделили из клубеньков эндофит и актиномицет, что подтверждает их тройной симбиоз — растение, эндофит, актиномицет. Для выяснения условий образования клубеньков на корнях ольхи и облепихи было поставлено два лабораторных стерильных опыта. В первом опыте стерильные семена проращивались в чашках Петри, в одну из которых добавляли 0,1 мл препарата ФБМ в концентрации 0,005%, что способствовало повышению всхожести семян. Пророщенные семена' пересаживали в цветочные горшки со смесью дерновой почвы и силикагеля в отношении 1:3, которые были предварительно простерилизованы в автоклаве I час при 1 ат (0,1 МПа) и промыты стерильной водой для удаления токсических веществ. Применение силикагеля обеспечило образование разветвленной корневой системы, необходимой для развития эндофитов. После 2,5 мес. роста растений их корни были отмыты. Как видно из рис.20, в варианте с ФБМ клубеньки образовались и у ольхи, и у облепихи, в контроле один маленький клубенек вырос только у облепихи.

Рис. 20. Клубеньки на корнях облепихи и ольхи в варианте с обработкой семян ФБМ (2,5 мес. роста)

Второй опыт с этими растениями поставлен был по более развернутой схеме. В качестве стимулятора, кроме ФБМ, использовались живые и убитые кипячением чистые культуры эндофитов, выделенные из клубеньков ольхи и облепихи.. В каждом сосуде росло по 3 растения. Через 3 мес. опыт был вскрыт. По внешнему виду лучшими оказались те растения,, семена которых обрабатывались ФБМ. Их листья были крупнее и более темного цвета, а на хорошо развитых корнях имелось по несколько крупных клубеньков. Меньше клубеньков небольшого размера образовалось на корнях растений в вариантах с обработкой семян живыми или убитыми при кипячении чистыми культурами родственных им эндофитов. На корнях контрольных растений клубеньков не удалось обнаружить, т. е. они были визуально немикотрофны.

Результаты двух опытов позволяют убедиться в том, что применяемые обычно приемы «заражения» стерильных семян различными грибами (а в данном случае даже специфическими для растений) оказывают более слабое стимулирующее влияние на развитие эндофитов из семян растений, чем гормональный препарат, обладающий высоким потенциалом действующего начала. В дальнейшем мы широко использовали ростовые препараты, изготовляемые из чистых культур сильно микотрофных растений для значительного повышения микотрофности любых культур.

Многие авторы (Bond, McConnell, 1956, Hewitt, Bond, 1961; Peuss, 1958 и др.), не располагая чистыми культурами эндофитов, применяли для заражения стерильных культур различных растений растертые клубеньки или отрезки корня нестерильных растений. Этим приемом нарушалась стерильность опытов, что способствовало развитию почвенных микроорганизмов, продукты метаболизма которых оказывали стимулирующее действие на развитие эндофитов из семян растений.

Все изложенные результаты опытов, посвященных вопросам происхождения эндофитов и проведенных с использованием метода стерильных культур, дают возможность прийти к выводу, что в стерильных опытах эндотрофная микориза не развивается в корнях растений не из–за уничтожения эндофитов при стерилизации среды, а в связи с общим отсутствием продуктов метаболизма, и в особенности ризосферных бактерий, стимулирующее действие которых необходимо как для образования разветвленной корневой системы, так и для перехода эндофитов семени из анабиотического состояния в активное.

Многие микроорганизмы в той или иной степени обладают способностью синтезировать гормональные вещества, оказывающие воздействие на развитие эндофитов из стерильного семени, что и послужило основанием для утверждения о «заражении» ими корней. Это мнение не потеряло своего значения и после того, как была доказана возможность «заражения» при использовании убитых кипячением грибов, которые благодаря термостабильности ростовых веществ сохраняли свое действие.

Мы неоднократно пытались установить рост чистых культур эндофитов в почве, внося их с добавлением крахмала, торфа, навоза и без удобрений, но каждый раз убеждались в невозможности роста грибов в почве из–за лизиса их мицелия в этих условиях. Эндофиты не растут в почве, а следовательно, не могут заражать корни растений. Эти грибы тысячелетиями приспосабливались к росту в организме растения, и их физиологические функции осуществляются обменными реакциями с растениями.

А. Г. Винтер (1963, с. 367), вопреки своему мнению о почвенной инфекции корней, писал: «Наши исследования не оставляют сомнений в том, что значительное развитие микоризообразующих грибов в почве исключено». Это положение противоречит данным некоторых авторов, которые непосредственно наблюдали внедрение грибов через корневые волоски. Однако Сивере (Sicvers, 1958), в своей работе подчеркивал, что, даже просмотрев огромное количество корней растений в нескольких странах, он никогда не наблюдал гиф грибов в корневых волосках.

Таким образом, мы опять стоим перед противоречивыми утверждениями, которыми так богата наука о микотрофизме растений. Преимущество авторов, свидетельствующих о наличии внедрений гиф через волоски, заключается в том, что они дают фотографии этого процесса, тогда как представители другой точки зрения не могут показать «отсутствие» внедрения.

Выводы

1. Затяжной характер, который приняло решение вопроса о происхождении эндофитов в корнях растений, определил задержку развития науки о симбиотрофном существовании растительного мира. Причиной указанных трудностей явилась необычная для многих микроорганизмов зависимость симбионтных грибов от гормональных воздействий, без которых они неспособны осуществить переход от семени, в котором грибы находятся в состоянии анабиоза, в корни растений. В процессе своей жизнедеятельности в корнях они сами синтезируют гормональные вещества, обеспечивая ими ростовые процессы растений.

2. Основным аргументом при доказательстве необходимости заражения корней растений эндофитами в почве было их отсутствие в корнях стерильно выращенных растений. Результаты многочисленных опытов, в которых стерильные семена заражались различными почвенными грибами, снабжавшими их гормональными веществами, необходимыми для прорастания в семенах прирожденного эндофита, создавали видимость правдоподобия утверждения о «заражении». Такое же действие оказывают на стерильное семя вытяжки из различных гименомицетов, ризосферных бактерий и гормональные препараты без участия живых грибов.

3. В природных условиях для перехода из семян в корни эндофиты снабжаются гормональными веществами, продуцируемыми эпифитными и ризосферными бактериями, которые обильно размножаются на поверхности семени в процессе его прорастания.

Установленное нами наличие эндофитов не только в корнях, по и в надземных частях растений, включая пыльцу, завязь и семя, подтверждает наличие «циклической наследственности» в передаче эндофитов. Это положение повышает генетическое значение грибного симбионта и свидетельствует о возможности его совершенствования из поколения в поколение и передачи в процессе установленного С. Г. Навашиным (1951) двойного оплодотворения. При вегетативном размножении культур переход эндофитов из клубней, луковиц и черенков заметно замедляется в связи с более слабым гормональным воздействием этих грибов.

4. Что касается микроскопических исследований, проведенных некоторыми авторами, визуально наблюдавшими процесс вторжения гиф в корневой волосок, то в этих опытах гриб попадает в корень не из почвы, а из коровой части последнего, что подтверждается ненарушенностью внешней оболочки корневого волоска. Это явление связано с приготовлением препарата и уменьшением давления плазмы, вызывающем распрямление свернутых в петли гиф гриба. Кроме того, эндофиты не могут использовать почву как среду для своего существования, так как подвергаются лизису.

5. Гормональное воздействие на семена растений как в природных условиях, так и при использовании ростовых препаратов не только стимулирует активность симбионтных грибов, но и оказывает значительное влияние на развитие разветвленной корневой системы растений, что способствует заметному увеличению микотрофности культур и повышению их продуктивности.