Симбиоз с микроорганизмами — основа жизни растений

Нам предстоит коротко рассмотреть основные проблемы взаимодействия между растениями и симбионтнымн грибами, разработка которых в дальнейшем должна получить свое развитие в биохимических институтах, оснащенных современной аппаратурой, с использованием методов исследования продуктов синтеза эндофитов. Наша задача заключается только в том, чтобы доказать правильность утверждения о значительном участии эндофитов в синтетической деятельности растении, которым до сих пор неправильно приписывается автотрофность существования. Только некоторые физиологи отмечают зависимость основного процесса растений — фотосинтеза — от ростовых веществ, происхождение которых еще до недавнего времени не было известно. Так, Н. Г. Холодный и А. Г. Горбовский (1939) установили, что введение в зеленый ассимилирующий лист слабых растворов гетероауксина способно резко усилить его фотосинтез. «Таким образом, — писал Н. Г. Холодный (1939, с. 255), — и эта важнейшая функция растительного организма оказывается, по–видимому, связанной с наличием в клетке фитогормонов». Б. А. Рубин (1961, с. 138) в главе о фотосинтезе «Курса физиологии растений» отметил, что «исключительно большое влияние оказывают на ход фотосинтеза биологические (внутренние) особенности растений, которыми определяется характер реагирования организма на внешнее воздействие». По нашим представлениям, таким фактором может быть только степень микотрофности растений.

Общим положением, определяющим взаимозависимость растений и симбионтных грибов, служит использование последними избытка продуктов фотосинтеза, достигающих корневых систем, так как основная синтетическая деятельность эндофитов осуществляется в корнях, поскольку лишь здесь у них образуются специальные органы для накопления продуктов синтеза — везикулы и арбускулы. Последние отсутствуют в мицелии грибов в надземных частях растений. Взамен углеводов эндофиты возвращают растению более сложные азотсодержащие вещества.

Впервые такие продукты синтеза симбионтных грибов растении, как гормональные вещества, аминокислоты, ферменты, витамины, липиды и цветные пигменты, были обнаружены в пасоке корней Д. А. Сабининым (1949). В дальнейшем их наличие было установлено нами в лабораторных колбах с чистыми культурами эндофитов, выделенными из корней многочисленных растений (Гельцер, Коваль, Сапронова 1965; Гельцер, Кузнецова 1977).

Гормональные вещества. В подробном обзоре литературы, посвященной исследованиям ростовых гормонов, Н. Г. Холодный (1939) отмечал, что, несмотря на огромный труд, затраченный на изучение фитогормонов и их значения в жизни растений, эта отрасль знаний все еще находится в начальной стадии развития, о чем свидетельствует обилие разнообразных, иногда противоречивых гипотез. Вместе с тем Н. Г. Холодный предугадал скорое развитие науки о фитогормонах, которые при ничтожно малых количествах обладают исключительной физиологической и биохимической активностью. В своем труде он критически рассмотрел многие аспекты проблемы: участие гормонов в клеточных делениях, в процессах роста, тропизмах, ранениях растений и цветении, — отразив тем самым всю их значимости в жизни каждого растения.

Наиболее важных выводом Н. Г. Холодного (1939) является его заключение о регулирующем влиянии гормонов роста на ферментативную деятельность растений, от которой зависит характер образования различных органических соединений.

Около 80 лет ученые не могли установить места образования гормональных веществ в растениях, так как при господствующем в науке представлении об автотрофности растительного мира их искали в надземных частях растений, не учитывая необходимости затрат энергии на их синтез. Длительное время признавалось правильным представление об их возникновении в точках роста, где они впервые были обнаружены (Went, 1928), однако, позднее исследователями было установлено наличие гормонов во всех частях растении. Мы находим у В. И. Кефели (1978, с. 983) следующее высказывание по этому поводу: «Несмотря на то, что в высшем растении отсутствуют специализированные органы, ответственные за образование и транспорт гормонов, определенная тканевая и органная приуроченность в биогенезе этих веществ существует». Этот автор считал, что для апикальной меристемы стебля характерна высокая концентрация ауксилов, для корней — цитокининов и абсцизовой кислоты, для листьев — гиббереллипов.

Полученные нами данные об образовании гормональных веществ в корнях растений с участием эндофитов, обладающих для этого процесса нужной энергией, находятся в соответствии с данными об их синтезе гименомицетами, образующими эктотрофную микоризу (Dagus, Bluzmann, 1943). Мы использовали вытяжки из гименомицетов для получения первых чистых культур эндофитов, которые без воздействия гормональных веществ в питательных средах не прорастают из корней.

Обладая высокой проницаемостью, гормональные вещества достигают точек роста надземных частей растений, стимулируя деление и рост их клеток на любом расстоянии от места их синтеза в корнях. Однородность ростовых препаратов, полученных в стерильных питательных средах путем пересевов частиц мицелия чистой культуры эндофита, обеспечивает стандартность их действия на протяжении многих лет, чего трудно достигнуть при изготовлении препаратов ростовых веществ из растущих в лесу грибов. Не случайно экто–эндотрофной микоризой обладают только такие мощные породы деревьев, как береза, сосна, дуб, ель, пальмы и др., которые нуждаются в объединенных усилиях двух видов грибов для обеспечения ростовыми веществами в течение всей жизни.

Широко применяемый на практике ростовой препарат — индолилуксусную кислоту (ИУК) — получают путем применения ацетатных вытяжек из семян некоторых сортов кукурузы и последующего ряда обработок. Нами были изготовлены ростовые препараты из различных чистых культур эндофитов и назвали мы их симбионтами, поскольку продуцентами таких препаратов являются симбионтные грибы растении. Для получения препарата Симбионт 1 использовался эндофит, выделенный из корней женьшеня (Гельцер, 1973а, б), для Симбионта 2 — эндофит из облепихи (Гельцер, Игнатьев, 1982). В отличие от ИУК, которая обычно используется в небольших разведениях — в 5-10 раз, препараты Симбионт нужно разводить в 10 000 и более раз, что оправдывает их название — гормональные препараты. Замачивание черенков в препарате ИУК рекомендуется производить на 8-12 ч (Турецкая, 1947), а с препаратом Симбионт не более чем на 30 мин после 10 000 разведении (рис. 26).

Рис. 26. Влияние разных концентрации препарата Симбионт 1 на рост корней и побегов картофеля: 1 — контроль; 2 — обработка препаратом в разведении 0,0001, 3 — в разведении 0,00001

Перед высевом семена с тонкой оболочкой (например, пшеницы, ржи), клубни картофеля, луковицы и мелкие семена огородных культур нужно опрыснуть нашими препаратами в указанной концентрации и подсушить, а семена с более прочной оболочкой (у риса, гречихи, огурца, подсолнечинка и др.) замачивать в таком же растворе в течение 30 мин и тоже подсушить. Для обработки 3-4 т посадочного картофеля на 1 га потребуется 1 мл нашего препарата развести в 10 л воды. Таким же количеством можно обработать 600 кг семян зерновых культур.

Первые препараты были изготовлены из продуктов метаболизма чистых культур эндофитов, выделенных из корней овса, пшеницы, картофеля и многолетних сильно микотрофных растений пырея и мать–и–мачехи. Все указанные препараты не обладали специфичностью, и их можно было использовать для обработки семян любых культур. Однако, как видно из табл.9, где приведены результаты опыта с картофелем, заложенного на песчаных почвах Новозыбковской опытной станции ВИУАА в 6-кратном повторности, эффективность их действия обусловливалась степенью развития грибного симбиоза того растения, из которого были получены продуценты.

В полевом опыте с пшеницей и теми же препаратами лучший результат также был получен при обработке семян препаратом из эндофитов мать–и–мачехи.

Многочисленные лабораторные опыты, выполненные с применением методов учета роста колеоптилей, измерения длины корней при прорастании семян огурцов и пшеницы, подтвердили наличие зависимости эффективности гормональных препаратов от степени микотрофности корней растений, из которых был выделен эндофит. Становится понятным, почему для изготовления гормонального препарата широкого действия мы избрали сильно микотрофное многолетнее лекарственное растение женьшень, тонкие корни которого пронизаны гифами симбионтного гриба с многочисленными везикулами и арбускулами (рис. 27). Черный мицелий этого эндофита около 20 лет размножался в лаборатории без изменения высоких качеств препарата, что обеспечивалось удачным составом питательной среды с минимальным содержанием азота. Только недавно был вторично выделен эндофит из корней женьшеня, препарат из которого незначительно превосходил старый. Такой долгий срок активности указывает на длительную стабильность свойств препарата при строгой однородности его изготовления.

Рис. 27. Чистая культура эндофита из корней женьшеня

Гормональные препараты, изготовляемые из эндофитов, всегда следует применять совместно с одним из микроэлементов. К такому заключению мы пришли в результате работы по уточнению выводов физиологов о способности микроэлементов увеличивать содержание в растениях биологически активных веществ (Школьник, 1956). Так как последние синтезируются в растениях эндофитами, нужно было установить влияние микроэлементов на микотрофность растений. Вначале мы использовали вегетационные опыты с молибденом, проводимые в ВИУАА В. В. Яковлевой, которая изучала причину последействия молибдена на бобовых культурах. Нам удалось показать, что не только в год применения молибдена на бобовых культурах микотрофность их корней значительно превосходила контроль, но и на следующий год при посеве семян с обработанных вариантов развитие симбионтных грибов в их корнях было заметно лучше. Следовательно, последействие микроэлементов определяется наследственной передачей усиленной микотрофности семян в обработанных вариантах.

Действие меди (здесь и в дальнейшем использовался 0,02% CuS0₄) на микотрофность картофеля изучалось в мелкоделяночном опыте с 3-кратной повторностью на участке ВИУАА по вспаханной дернине. Схема его была следующей: 1 — контроль; 2 — опрыскивание молодой ботвы 0,02% CuS0₄, 3 — внесение в лунку куста картофеля 0,05 г. меди + опрыскивание ею ботвы. Микотрофность корней определяли за лето 3 раза, Сорт картофеля Приекульский (табл. 10).

Многократное повторение на Овощной опытной станции ТСХА наших опытов, в которых проверялось действие микроэлемента меди на микотрофность картофеля, не только подтвердило устойчивость ее влияния, но и показало, что эффективность совместного применения микроэлементов и гормональных препаратов, выражающаяся в значительном увеличении продуктивности растений и их микотрофности, заметно выше эффективности отдельных их воздействий.

Первые производственные опыты, в которых изучалось влияние ростового препарата Симбионт 1 на урожайность картофеля, проводились в Брянской, Вологодской, Московской, Калининской и Воронежской областях в семеноводческих совхозах на площадях в 1 га без повторностей. Препарат рассылался в совхозы с непременным условием присылки в нашу лабораторию сухих корней с контрольного и опытного вариантов для изучения их микотрофности и сравнения степени микотрофности с урожайными данными.

При хороших условиях роста картофеля опрыскивание клубней ростовым препаратом, а всходов — медью давало значительную прибавку урожая, при этом всегда уменьшалась изреженность посевов, увеличивались масса корневой системы и микотрофность, а также количество побегов (рис. 28). В тех случаях, когда проводились наблюдения за болезнями картофеля, исследователи устанавливали их уменьшение в вариантах с обработкой препаратом.

Рис. 28. Влияние препарата на рост корней и побегов картофеля: 1 — в контроле и 2 — при обработке препаратом и медью

Особый интерес представляет шестилетняя работа, выполненная в начале 70‑х годов на орошаемых сероземах Узбекистана Е. Г. Лучининой под руководством заведующего кафедрой овощеводства Ташкентского сельскохозяйственного института Н. Н. Балашова совместно с нами. В мелкоделяночных опытах изучалось влияние микродоз меди и ростового препарата Симбионт 1 на урожайность различных сортов картофеля. Повторность 4-6-кратная. Посадку клубней проводили в весенние и летние сроки сева. Под картофель вносили минеральные удобрения и обеспечивали оптимальный режим орошения.

Согласно нашей инструкции, ростовым препаратом следовало опрыскивать клубни картофеля, а 0,02% CuS0₄ молодую ботву в период полных всходов. Однако уже после первого года работы Н. Н. Балашов предложил усилить действие меди путем внесения ее как в разбавленный препарат из расчета 0,02%, так и при обработке ботвы. После установления положительного действия двукратного применения меди этот прием был включен в инструкцию под названием вариант 2 меди. В табл. 11 и 12 приведены данные по урожайности картофеля сортов Лорх и Вольтман.

Можно было бы привести подобные результаты по таким сортам картофеля, как Приекульский ранний и Седов.

Использование клубней, собранных с обработанных растений, для посадки на следующий год дало значительное повышение урожаев по сравнению с контролем. Повторная обработка клубней в потомстве подтвердила их способность улучшать наследственную природу растений в последующих поколениях и тем самым способствовать воспитанию более микотрофных семян и клубней картофеля высокого качества.

Первая реакция растений на обработку ростовыми препаратами с микроэлементами (при оптимальных их концентрациях) семян или клубней проявляется в более дружном и раннем (на 2-4 дня) их прорастании. Положительное действие проведенной обработки хорошо определяется по степени развития корневой системы через месяц после появления всходов.

В табл.13 приведены результаты действия препарата Симбионт 1 га урожай, листовую поверхность и массу корней картофеля сорта Приекульский в опыте, проведенном в Ташкентском сельскохозяйственном институте Е. Г. Лучининой и З. Иногамовым (1971). Повторность опыта 4-кратная.

Как видно из этой таблицы, масса корней и листовая поверхность куста картофеля при обработке клубней гормональным препаратом и медью, а затем опрыскивании ботвы медью удвоились, что способствовало повышению урожайности на 56,6%.

Наряду с повышением урожаев клубней в опытных вариантах происходило увеличение количества побегов в кусте, исчезновение мозаичности листьев, снижение поражаемости готикой и вирусами. Данные о повышении иммунитета растений рассмотрены в главе 5.

Препарат Симбионт 1 был испытан и на зерновых культурах. Так, в опытах, проведенных научным сотрудником Куйбышевского сельскохозяйственного института А. В. Бушевой на неорошаемых почвах Куйбышевской области в совхозе «Комсомолец», высевались ячмень сорта Одесский 36 и пшеница сорта Мироновская 808. В 1981 г. в связи с засухой (за вегетационный период выпало всего 46 мм осадков) урожай ячменя в контроле в среднем не превышал 10,6 ц/га, а прибавка в опытном варианте составила всего 2,6 ц/га. Немногим лучше были успехи в 1982 г., когда прибавка урожая ячменя от применения ростового препарата достигла 5,58 ц/га, а у пшеницы — 4,6 ц/га. Только в благополучном по осадкам 1983 г. при урожае ячменя в контроле 23,6 ц/га в опытных посевах было получено 37,2 ц/га, т. е. прибавка составила 13,6%, что свидетельствовало о высокой эффективности Симбионта 1.

В 1983 г. А. В. Бушевой впервые был применен новый способ использования ростового препарата на озимой пшенице — опрыскивание весной ее всходов с самолета. Опыт проводился на площади 99 га: по 33 га в каждом из трех вариантов. На обработку 8 га посевов затрачивалось 1,2 т воды, в которую добавляли 2,4 г сернокислой меди, 4 и 6 мл препарата Симбионт 1 (0,50 и 0,75 мл/га). Надо сказать, что для обычной обработки семян зерновых культур идет 0,33 мл препарата в расчете на 1 га. Все фазы развития пшеницы в опытных вариантах, включая созревание, проходили на 3 дня раньше, а пораженность растений корневыми гнилями была на 15,9% ниже, чем в контроле. Урожайность пшеницы в контрольных посевах составила 33,8 ц/га, а в опытных была соответственно на 14,5 и 24,9 ц/га, или на 42,9 и 73,7%, выше (НСР₀₅ 1,6 ц/га).

Из приведенных примеров с очевидностью следует, что эффективное применение ростовых препаратов в земледелии возможно только при хороших условиях роста растении, в частности при орошении. Мы уже давно отмечали, что с повышением урожая в контроле возрастает эффективность применения ростовых препаратов и поэтому не следует ожидать значительного увеличения продуктивности растений при низком ее уровне в контроле, а также давать оценку действия препарата в указанных условиях.

При использовании ростовых препаратов в закрытом грунте на огурцах и томатах часто наблюдалось снижение их эффективности при излишней экономии на освещении и отоплении оранжерей, в особенности в первый период роста растений (Гельцер, 1973б).

Вторым неблагоприятным фактором для деятельности эндофитов является применение высоких доз минерального азота (рис. 29), от которых страдают все микроорганизмы, обладающие способностью к азотфиксации. Сейчас стало очевидным, что установленное еще во времена Либиха вредное действие на растение высоких доз азота связано с морфологической деградацией строения симбионтных грибов в корневой системе. Гифы этих грибов, питающихся готовым азотом, значительно увеличиваются в размере, так же как и везикулы. Внутри последних мы не наблюдаем скопления продуктов синтеза эндофитов, что указывает на нарушение их основных функций. Отсюда следует, что при необходимости применения больших доз азота нужно вносить его дробно, в 2-3 срока.

Рис. 29. Влияние разных доз азота на рост растения

Очень важно при использовании препарата соблюдать рекомендуемые концентрации и сроки его воздействия на те или иные объекты. В процессе испытания влияния различных концентраций препарата Симбионт 1 нами было установлено, что примененный в более высокой дозировке он вместо стимулирования оказывает угнетающее действие. При более значительном сроке воздействия против оптимального также происходит торможение в развитии растении. Например, обработанные семена всходят на 2-4 дня позже, а не на столько же дней раньше, как наблюдается при оптимальной экспозиции обработки. Таким образом, стимулирующие препараты могут проявлять себя как ингибиторы. К такому же выводу пришли научные сотрудники Молдавской академии наук П. Н. Разумовский, Д. И. Атаманюк, М. А. Златоуст и Г. И. Якимова (1975).

Эти авторы указывают, что при расшифровке всего комплекса биоса в нем обнаружены витамины группы В, биологически активные липиды и азотистые соединения, к рассмотрению которых мы переходим. Близкое к указанному определение биоса было дано Н. Г. Холодным (1939).

Витамины и ферменты. Способность эндофитов синтезировать витамины подтверждается возможностью их многолетнего культивирования в лабораторных питательных средах без добавок витаминов извне, что указывает на их «автотрофность» по отношению к витаминам. Все же, поскольку не исключена возможность участия витаминов в стимулирующем действии продуктов метаболизма эндофитов, мы использовали разработанный Е. Н. Одинцовой (1959) микробиологический метод определения их наличия в нативной жидкости симбионтного гриба, выделенного из корней женьшеня. Тест–объектами были дрожжевые и мицелиальные грибки, реагирующие на определенные витамины. Испытывались витамины В₁, В₃, В₅, В₆, Н. В нативной жидкости установлено наличие указанных витаминов, представляющих собой продукты синтеза чистых культур эндофитов. Наиболее отчетливо качественная реакция обнаружила присутствие пиридоксина (В₆), пантотеновой кислоты (В₃) и биотина (Н).

Количественно определяли только рибофлавин (В₂) в связи с его большим значением для жизнедеятельности растений и участием в процессе их дыхания. Определение проводилось на электронном флуорометре по методу, разработанному К. Л. Поволоцкой с сотрудниками в Институте биохимии АН СССР им. Баха.

В природных объектах рибофлавин встречается как в прочносвязанном с белками, так и в свободном состоянии. В первом случае необходимо проведение ферментативного и кислотного гидролиза, после чего производится осаждение и очистка растворов от посторонних примесей и по интенсивности флуоресценции определяется количество витамина с помощью шкалы гальванометра.

Для количественного анализа витаминов в чистых культурах эндофитов мы использовали как мицелий гриба, так и его нативную жидкость. Раздельное определение рибофлавина в культурах эндофитов, выделенных из корней сильно микотрофных растений ольхи и ирисов, установило его наличие в обеих фракциях. Большее содержание его в нативной жидкости (табл. 14) указывает на способность симбионтного гриба выделять витамины во внешнюю среду и снабжать ими растение в процессе их совместной жизни.

Как и в предыдущих исследованиях биологически активных веществ эндофитов, в этом опыте было установлено, что синтез ими витаминов определяется интенсивностью микотрофности растений, из которых были выделены грибы.

После выявления нами сильной микотрофности у картофеля на высокогорном стационаре АН СССР клубни различных сортов были направлены Е. А. Буш в Институт физиологии Грузинской академии наук для определения содержания в них витаминов. Результаты этих исследовании указывают, что картофель, выращенный в горных условиях, можно использовать как витаминный продукт (табл. 15).

H. Г. Холодный (1939), присоединял витамины к группе фитогормонов, отметил их наличие в семенах и особенно в семенах злаковых растений, в которых витамины группы В находятся в зародыше и в алейроновом слое эндосперма.

Не было необходимости в проверке способности эндофитов синтезировать ферменты, поскольку жизненные процессы их, как и всех мицелярных грибов, катализируются экзо– и эндоферментами. Известно, что ферменты грибов участвуют не только в реакциях расщепления, но и реакциях синтеза (Лилли, Барнетт, 1953). Представляло интерес сравнить набор ферментов симбионтных и сапрофитных грибов, но такая большая работа выходила за пределы возможностей нашей лаборатории.

Б. А. Рубиным с сотрудниками (1945) было установлено, что при посеве сахарной свеклы в горах в районе Алма—Аты с увеличением высоты над уровнем моря от 1000 до 2500 м не только в 5 раз повышается содержание сахара в плодах, но значительно возрастает в клетках растении количество окислительных ферментов — пероксидаз и полифенолоксидаз. Эти ферменты обеспечивают устойчивость растений к патогенным агентам и кутинизацию тканей при их механических повреждениях. Для нас очевидно, что повышение защитного действия ферментов связано с увеличением микотрофности культур на больших высотах.

Когда–то считали, что сами растения не синтезируют ферментов, которые им не нужны, но после выявления участия ферментов в процессе дыхания в науке утвердилось мнение об их синтезе растениями. Об участии в этом процессе эндофитов никто не упоминает, что, по нашему мнению, усложнило правильное решение данного вопроса. Только в теории дыхания В. И. Палладина (1950) отмечается существование в растительной ткани посредников дыхания, названных им «дыхательными хромогенами», которые при окислении превращаются в пигменты. Последнее указание автора можно отнести к симбионтным грибам растений, так как пигменты синтезируют эндофиты. Сейчас при изучении чистых культур эндофитов можно внести ясность в сложный вопрос о дыхании растений.

Аминокислоты. Изучение аминокислот в богатом азотом мицелии гриба или в его нативной жидкости представляет известные трудности из–за наличия слизистых веществ, мешающих получению четкой хроматограммы. В связи с этим их изучение проводилось в 50 мл спиртовой вытяжки, очищенной от примесей стерильным углем, что соответствовало 150 мл нативной жидкости гриба, выделенного из корней женьшеня. Указанная работа проводилась в двух различных научных учреждениях: первый раз в 1968 г. С. М. Клуновой в Московском педагогическом институте, второй раз Е. Е. Колидзевой на кафедре кормления животных в Московской сельскохозяйственной академии. Использовались разные партии гормонального препарата Симбионт 1, приготовленные из одной и той же культуры симбионтного гриба. Во втором анализе было дополнительно установлено еще 3 аминокислоты: цистнн, гистидин и метионин, которые не были обнаружены в первом анализе, Всего было выявлено 15 аминокислот, синтезируемых чистыми культурами эндофитов из женьшеня (табл. 16).

Выводы

1. Изучение продуктов синтеза чистых культур эндофитов, выбеленных из корней растений, с достоверностью показало, что эндофиты образуют гормональные вещества, эффективность которых определяется степенью микотрофности корней, из которых они были выделены. Изготовленные из них ростовые препараты, названные нами «симбионтами», стимулируют развитие корневых систем растений, повышают микотрофность и продуктивность культур. Этими препаратами можно обрабатывать семена и клубни перед посевом, опрыскивать всходы, намачивать черенки.

2. Применение гормональных препаратов в сочетании с одним из микроэлементов способствует повышению эффективности их действия. Хорошие условия роста обработанных препаратом культур являются обязательными для положительного действия ростовых препаратов.

3. Кроме гормональных веществ, эндофиты синтезируют в растениях витамины, ферменты, липиды и пигменты разного цвета, взамен чего они получают от растения продукты его фотосинтеза, которые служат для них пищей и источником энергии.

4. Уже перечисленные факторы, число которых при дальнейшем рассмотрении результатов наших исследований будет увеличено, определяют значимость симбиотрофного существования растительного мира и невозможность наличия в природе растений вне этого симбиоза.