Танец жизни. Новая наука о том, как клетка становится человеком

Эмбриоидные тела

Мечта о выращивании эмбрионоподобных структур в лабораторных условиях не нова. Можно выделить разные ключевые этапы, но, на мой взгляд, серьезный прорыв в создании живых моделей эмбрионального развития был получен благодаря наблюдениям, сделанным в лаборатории Джексона в Бар-Харборе, штат Мэн, которые предоставили первые сведения о «бодибилдерском» потенциале ЭС-клеток. Там в 1950-х Лерой Стивенс обнаружил линию мышей, страдающих спонтанным образованием тестикулярных тератом (тератокарцином) — опухолей, состоящих из смеси эмбриональных и взрослых тканей [2]. Когда Стивенс и его коллега Дон Варнам пересадили образцы тератом в брюшную полость мышей, у тех сформировались целые агрегаты клеток. Несмотря на то что их рост носил бессистемный характер, Стивенс увидел в них некоторое сходство с мышиными эмбрионами в возрасте нескольких дней [3]. Эти структуры, построенные из ЭС-клеток, были названы эмбриоидными телами.

Поскольку такие опухоли состоят из клеток различных тканей, предполагалось, что они вырастают не из зрелых, а из недифференцированных мультипотентных клеток, имеющих близкое сходство с эмбриональными. Их стали называть клетками эмбриональных карцином (ЭК) [4].

На данном этапе ключевую роль сыграл Мартин Эванс. После серии экспериментов в 1970-х, в том числе вместе с Ричардом Гарднером, Мартин показал, что дифференциация этих клеток была вовсе не аномальной (как у злокачественных клеток), а похожей на таковую в эмбрионе. Хотя это означало, что можно изолировать клетки из раннего эмбриона и позволить им расти в лабораторных условиях, на совершение этого подвига потребовалось еще пять лет [5]. В 1980 году Мартин объединился с эмбриологом Мэттом Кауфманом и на следующий год представил в Nature доклад об открытии ЭК-подобных клеток, которые способны вызывать тератомы, а также использоваться для создания химер, продуцирующих функциональные зародышевые клетки; сегодня они известны как ЭС-клетки [6]. В том же году Гейл Мартин из Калифорнийского университета в Сан-Франциско умудрился вырастить ЭК-клетки из эмбриона [7].

В своей фундаментальной статье, опубликованной в Nature, Мартин подчеркнул, что ЭС-клетки можно использовать для генной модификации, а в 1986 году сделал вывод, что эти клетки являются эффективным средством для создания генетически измененных, или трансгенных животных. За это открытие он получил Нобелевскую премию 2007 года. Учитывая пластичность этих клеток для построения всех остальных типов клеток или эмбриональных тканей, кроме внеэмбриональных, казалось разумным предположить, что при выращивании ЭС-клеток в культуре можно воспроизвести развитие эмбриона. Не совсем так. ЭС-клетки способны сформировать эмбриоидные тела, но эти тела не выглядят и не развиваются как эмбрион.

Хотя я много знаю об ЭС-клетках (разумеется, от Мартина), я вдохновилась эмбриоидными телами гораздо позже, благодаря случайной встрече. Когда Саймону было около двух месяцев, мы с Дэвидом взяли его и Наташу в Японию на Окинаву, где Дэвид должен был выступать на конференции. По пути нам пришлось заглянуть в Стэнфордский университет, куда меня пригласил прочитать лекцию мой друг Мэтт Скотт, выдающийся профессор биологии развития, генетик и биоинженер. Во время этого визита я познакомилась с Роэлем Нуссе и его коллегой Дерком тен Бергом, которые любезно поделились со мной своим недавним открытием, связанным с эмбриоидными телами, — они знали, что я отслеживаю процесс создания и нарушения симметрии в эмбрионе. Они выяснили, что эмбриоидные тела могут спонтанно нарушать свою симметрию, в результате чего инициируются паттерны и активируются гены, такие как Brachyury, необходимые для создания мезодермы [8].

Это было потрясающее наблюдение. Тогда я и подумать не могла, что однажды попытаюсь создать эмбрионоподобные структуры, чтобы понять механизмы нарушения симметрии. Лишь годы спустя, вдохновленная нашими результатами, показавшими трансформацию плюрипотентных, неполярных клеток в высокополяризованную розетку на стадии имплантации, я поняла, что мы можем воссоздать этот процесс с помощью ЭС-клеток и построить эмбрионоподобную структуру в нашей лаборатории. Однако мы применили совершенно иной подход.

Как сделать эмбрион

Когда мы наконец-то нашли способ культивирования эмбрионов на стадии имплантации и начали изучать подробности их роста и самоорганизации, мы обнаружили, что это зависит не только от количества клеток, но и от контекста. Под контекстом я подразумеваю хореографию каждого типа клеток и их взаимодействие друг с другом в критическую фазу развития, когда эмбрион впервые увеличивается в размерах и претерпевает метаморфозы. Из работ многих великих биологов, занимавшихся онтогенезом млекопитающих, мы знали, что взаимодействие конкретных клеточных типов имеет решающее значение для нормального развития эмбриона, но точные взаимосвязи и пути, задействованные на этой специфической стадии онтогенеза, оставались для нас загадкой. Культивируя эмбрионы на стадии имплантации in vitro, мы научились распознавать химические и механические сигналы, побуждающие аморфный эпибласт превратиться в розетку из поляризованных клеток. Мы обнаружили, что эта самоорганизация запускается сигналом, в котором участвует внеклеточный матрикс, предоставляемый экстраэмбриональной примитивной энтодермой, и белок бета-интегрин, лежащий на поверхности клеток эпибласта [9]. И мы задались вопросом о том, можно ли сымитировать начало этого процесса у стволовых клеток, если предоставить им правильный контекст.

Наш первый подход был очень простым. Мы взяли клетки только одного типа (ЭС-клетки) и поместили их в трехмерный каркас — гелевую субстанцию матригель, которая содержит материал, в норме предоставляемый примитивной энтодермой. Мы подумали, что это индуцирует поляризацию клеток, которой может оказаться достаточно для запуска клеточной самоорганизации.

Коллега из моей команды, Иван Беджов, занимавшийся этим проектом, увидел, что через тридцать шесть часов культивирования пролиферирующая группа ЭС-клеток и впрямь самоорганизовалась в трехмерную розеткообразную структуру из поляризованных клеток. Эта розетка выглядела точно так же, как та, которую мы наблюдали во время имплантации эмбриона. Затем розетка «эволюционировала» и образовала полость — люмен. Опять же, словно эмбрион, открывающий свою амниотическую полость.

Так мы осознали, что с помощью одних лишь ЭС-клеток можем имитировать первые этапы эмбрионального развития. Несмотря на то что мы использовали только один из трех базовых типов стволовых клеток, присутствующих на заре жизни, нам удалось компенсировать (как минимум частично) отсутствие остальных двух типов подбором правильного количества клеток и правильного окружения из химических соединений, позволяющих клеткам самоорганизовываться.

С помощью нашей первой модели развивающегося эмбриона Иван попытался разобраться в молекулярных сигналах, запускающих формирование проамниотической полости. Когда он использовал ЭС-клетки, лишенные бета-интегрина, они не смогли образовать полость, что указывало на критическую важность передачи сигнала (посредством этого белка) между внеэмбриональными и эмбриональными тканями. Это наглядная демонстрация пользы упрощенных моделей эмбрионов для изучения эмбриогенеза. Наше открытие розетки, механизмов ее формирования в эмбрионе, а также ее имитация при помощи ЭС-клеток были опубликованы в 2014 году в журнале Cell [10].

Но можно ли было воспроизвести следующий шаг развития, тот, что приводит к нарушению симметрии и гаструляции, существенной для формирования всех тканей эмбриона? Те, кто занимается биологией развития, легко ответят на этот вопрос. Вместо использования одних только ЭС-клеток следовало добавить стволовые клетки, формирующие трофэктодерму, из которой образуется плацента, а также стволовые клетки, формирующие примитивную энтодерму, из которой получается желточный мешок. Могли этот рецепт привести к самоорганизации целого эмбриона, ведущей, в свою очередь, к нарушению симметрии?

Наш сумасшедший проект

Тот период совпал с первым годом скитания Сары Харрисон по разным лабораториям, где она выполняла краткосрочные проекты, прежде чем выбрать тему докторской диссертации. Сара подошла ко мне и спросила, могу ли я стать ее научным руководителем. Я с радостью согласилась и попросила ее помочь осуществить мою мечту — создать эмбрионоподобную структуру in vitro из разных типов стволовых клеток. У Сары было полно энтузиазма, сообразительности и амбиций, чтобы взяться за что-то трудное, но значительное. Зная, что прошу многого, я обещала всестороннюю поддержку на протяжении всего ее пути, который, как я подозревала, мог оказаться извилистым.

Под конец первого года работы над диссертацией Сара научилась имитировать с помощью ЭС-клеток первые этапы развития, а именно — поляризацию и люменогенез (Иван к тому времени покинул лабораторию, чтобы собрать собственную команду в Институте Макса Планка в Германии). Затем она продвинулась на шаг дальше и уже наблюдала, как клетки этих структур активируют ген Brachyury, экспрессия которого знаменует нарушение симметрии и обособление мезодермы. И все бы ничего, однако экспрессия Brachyury в ее синтетических эмбрионах была неорганизованной — происходила в случайных местах и совсем не так, как в естественных эмбрионах, у которых экспрессия этого гена всегда происходит между эмбриональной и внеэмбриональной тканями и на одной стороне эмбрионально-внеэмбриональной границы, то есть асимметрично.

Пока мы думали, что же предпринять с первыми результатами Сары, наши соседи из кембриджского отделения генетики во главе с Альфонсо Мартинесом Ариасом опубликовали статью с похожими выводами [11]. Их подход отличался от нашего. Вместо того чтобы начать с небольшого количества ЭС-клеток, формирующих розеточную структуру с открывающейся затем полостью, как у эмбрионов, они начали с сотен ЭС-клеток, создающих эмбриоидное тело, как в оригинальном исследовании Дерка тен Берга и Роэля Нуссе из Стэнфорда [12]. Такой подход тоже индуцировал экспрессию Brachyury, но, как и в нашем эксперименте, без настоящей гаструляции. Хотя методики были разными, итоговый смысл был схож с нашим. Многим исследователям было бы очень обидно наблюдать, как другая команда публикует их исследование. Но только не Саре.

Мы не стали писать еще одну научную статью с похожими результатами, а решили сделать глубокий вдох и предпринять следующий шаг. Он заключался в том, чтобы воссоздать структуру эмбриона с помощью всех компонентов, тем самым позволив ЭС-клеткам сотрудничать с ТС- и XEN-клетками — стволовыми клетками, происходящими из трофэктодермы и примитивной мезодермы, как мы и планировали изначально. Мы надеялись, что в результате экспрессия Brachyury будет организованной, а не стохастичной.

Однако создать успешный союз между разными типами стволовых клеток in vitro проще на словах, чем на деле. Поначалу мы, коротко говоря, не смогли заставить все клетки расти в одной среде и «договариваться» между собой. Но позже нам действительно удалось подтолкнуть ЭС-клетки к сотрудничеству с ГС-клетками, поместив их во внеклеточный матрикс из матригеля. Этот матрикс важен, поскольку заменяет собой третий недостающий тип ткани, примитивную энтодерму, ведь именно она индуцирует первый критический шаг самоорганизации — поляризацию клеток.

Пошаговая сборка эмбриона

Если бы мы занимались настоящей клеточной инженерией, мы бы складывали эмбрион из отдельных клеток, как ребенок по кирпичику собирает конструктор Лего. Мы смешали в чашке Петри два типа ткани в разных концентрациях и позволили клеткам взаимодействовать в случайном порядке. На второй день проверка под микроскопом показала, что некоторые клетки и в самом деле начали взаимодействовать и собираться в структуры. Их было немного, так как они формировались за счет непредсказуемых встреч, но когда эти ЭС- и ГС-клетки объединялись, их самоорганизация была изумительной — они как будто знали, что им делать, и преследовали конкретную цель.

Глядя в микроскоп во мраке лабораторной комнаты, мы стали свидетелями многих фундаментальных процессов развития. Первым делом мы увидели поляризацию клеток. Следуя ей, стволовые клетки организовывали себя таким образом, чтобы ЭС-клетки скапливались на одном конце, а ГС-клетки на другом. Затем в пределах каждого скопления открывалась полость и, благодаря диалогу между эмбриональными (производными ЭС-клеток) и внеэмбриональными (производными ГС-клеток) компартментами, получалась трехмерная структура в виде восьмерки. Мы выяснили, что при этом происходит передача сигнала с помощью белка Nodal[19]. Две полости в итоге сливались в одну с образованием крупной, так называемой проамниотической полости, существенной для развития эмбриона. Казалось, что этот люминогенез был идентичен таковому в естественном эмбрионе вскоре после имплантации. Мы стали свидетелями потрясающего подвига самоорганизации.

Но, как всегда, нам захотелось пойти дальше и сделать так, чтобы идентичные клетки в ЭС-производной части эмбриона нарушили свою симметрию должным образом. Я имею в виду попытку гаструляции — критический шаг, закладывающий основы будущего плана тела.

Мы обнаружили, что, если позволить структурам из ЭС- и ГС-клеток развиваться чуть дольше, они действительно нарушают свою симметрию. Как и в естественных эмбрионах, на границе между эмбриональными и внеэмбриональными компартментами начинается экспрессия генов, таких как Brachyury. Ген Brachyury очень важен, поскольку играет роль в формировании мезодермы и передне-задней оси симметрии [13]. Увиденное заставило замереть мое сердце и повергло в трепет всю лабораторию.

Архитектура этих эмбрионоподобных структур была достаточно близка к естественному эмбриону, чтобы приоткрыть тайны его развития на стадии имплантации в теле матери. Было очевидно, что эти ЭС-плюс-ГС-структуры имитировали морфологию и паттерны эмбриона намного точнее, чем одни только ЭС-клетки, и служили гораздо более правдивой моделью развития.

В каком-то смысле эти два вида стволовых клеток напоминали танцоров, сообщающих друг другу, где им расположиться в пределах эмбриона. Без этого па-де-де правильное развитие очертаний и форм и своевременное задействование ключевых биологических механизмов было бы невозможным. Мы также обнаружили, что, как и при естественном развитии, эти паттерны контролируются сигнальными путями Wnt и BMP, Bone Morphogenetic Protein (костного морфогенетического белка).

Когда мы с Сарой увидели формирование первых структур, странноватых, но кажущихся совершенными, мы не поверили своим глазам. Я восхищалась ими тогда и восхищаюсь теперь, когда пишу эти строки. Той осенью я поставила большую часть своей личной жизни на паузу, сопоставляя полученные результаты и описывая их для статьи. Темп моей работы, наверное, сводил Сару с ума, ведь я требовала от нее больше экспериментов, больше проверок и так далее и тому подобное, чтобы убедиться, что мы ничего не упустили и верно истолковали все данные.

Сара была очень преданной и организованной. Но возникла одна чисто практическая проблема. Согласно одному из условий ее докторской программы, она должна была несколько месяцев поработать с промышленным партнером. Чтобы помочь Саре закончить работу, я попросила еще одну аспирантку из Университета Акдениз в Анталии (Турция) приехать ко мне в лабораторию.

Так к Саре присоединилась Берна Созен. Я думаю, что поступила правильно. Поначалу Берна собиралась пробыть в моей лаборатории всего один год, но этот опыт изменил ее жизнь, и Берна осталась с нами заниматься своими постдокторскими исследованиями.

Мы представили статью в журнал Nature. Ее отправили на рецензирование, что уже было хорошо, поскольку довольно много статей отсеивалось в самом начале. Редакторы были настолько опытными и осведомленными, что даже такое решение являлось важным одобрением с их стороны (поэтому мы устроили небольшой праздник — даже скромный успех имеет значение). Но в итоге нам сообщили, что примут работу только в том случае, если мы, по словам одного из рецензентов, предоставим подробные сведения обо всех генах, которые принимают участие в сборке синтетического эмбриона, а также об изменениях паттернов их экспрессии на каждой стадии самосборки. Грандиозная задача. К тому же у меня не было соответствующих технологий для изучения изменений паттернов экспрессии всех генов. Нужны были средства на покупку оборудования, которое я не могла себе позволить. Наконец, мне надо было найти сотрудников. И я нашла их, но не в Кембридже, а на другом конце планеты благодаря воскресной прогулке по Сиднею.

Приключения в Австралии

За год до этой судьбоносной прогулки меня пригласили прочитать пленарную лекцию на конференции в Хантер-Вэлли, Австралия, это знаменитый винодельческий регион, расположенный в двух часах езды к северу от Сиднея. Вместе со мной в качестве почетного гостя был еще один практик клеточного искусства, Петер Фридль из Университета Неймегена в Нидерландах, по совместительству — доктор медицинских наук в Онкологическом центре имени М. Д. Андерсона в Хьюстоне, изучающий рост и вторжение опухолевых клеток и создающий ошеломляюще подробные визуализации.

Увлекательное путешествие пришлось на время школьных каникул, поэтому я взяла с собой Саймона. Мы летели через Гонконг и задержались там на один день в гостях у главы администрации Лян Чжэньина, отца Чжэньина-младшего, одного из моих лучших бывших аспирантов. Мы провели целый день в качестве специальных гостей Чжэньина-старшего и его супруги, которые отнеслись к нам со всей добротой. К превеликому удовольствию Саймона, у них жила великолепная собака породы хаски, с которой можно было поиграть. На следующее утро мы вылетели в Сидней, где Саймону предстояло впервые увидеть кенгуру.

Вступительное слово к моей лекции прочитал мой коллега по изучению эмбриологии мышей, биолог Патрик Тэм, что было огромной честью для меня, ведь я была поклонницей его научных работ. После конференции я, Саймон, Патрик и его жена Элизабет отправились на прогулку по побережью Сиднея, на которой Патрик рассказал мне о своем сотрудничестве с Найхэ Цзином из Шанхайских институтов биологических наук, изобретателем метода лазерного рассечения эмбрионов, позволяющего наблюдать паттерны экспрессии генов. Мне повезло вдвойне, потому что вскоре после моего возвращения в Кембридж Найхэ приехал туда с визитом, и я смогла пообщаться с ним лично. Мы договорились вместе заниматься изучением паттернов экспрессии генов моих эмбрионоподобных структур. О вкладе команды Найхэ я расскажу в следующей главе. Осознав, что на добросовестное выполнение этой задачи понадобится целый год, я начала сомневаться, стоит ли вообще тратить столько времени на то, чтобы удовлетворить (или нет, кто знает) запросы рецензентов Nature.

К тому моменту Сара и Берна успели собрать еще больше информации, и мы решили представить наши результаты в Science — журнал, с которым я была не так хорошо знакома. Это оказалось правильным решением. Как всегда, рецензенты попросили провести больше исследований, но в этот раз задание было выполнимо, хотя нам и пришлось трудиться все рождественские праздники 2016 года, дабы закончить рукопись до начала нового семестра. Дэвид пришел на помощь и сделался соавтором статьи, поэтому в то Рождество мы смогли провести вместе больше времени. Чтобы поднять всем настроение, я зажгла ароматические свечи с запахом свежей сосны и амбры. Это было роскошно. Журнал Science принял нашу статью. Ура!

Выбор названия немаловажен (как показал горький опыт с флуоресцентными гранулами), поэтому мы долго обсуждали, как назвать наши эмбрионоподобные модели. Нам хотелось подобрать что-нибудь особенное, поскольку они поведали нам изумительную историю о том, как эмбрионоподобные структуры собирают самих себя из стволовых клеток. Однако последнее слово было не за нами.

Редактору Science не понравился термин «синтетические» эмбрионоподобные структуры. Эта новость настигла меня во время школьных каникул, когда я отдыхала на лыжном курорте с семьей и друзьями, и я воспользовалась ситуацией, чтобы всем вместе придумать альтернативное название. Мы сошлись на варианте «ETs», навеянном научно-фантастическим фильмом Стивена Спилберга «Е. Т. the Extra-Terrestrial» («Инопланетянин»), Он повествует о госте из другого мира, и именно такими представлялись нам первые эмбрионоподобные структуры, самостоятельно собравшиеся из стволовых клеток. Только в нашем случае буквы Е и Т означали не extra (вне) и terrestrial (земной), a embryonic (эмбриональный) и trophoblast (трофобластный), то есть ЭС- и ГС-клетки, лежащие в основе этих структур.

В итоге в апреле 2017 года в журнале Science вышла статья под названием «Сборка эмбриональных и внеомбриональных стволовых клеток как имитация эмбриогенеза in vitro» [14]. Сегодня они известны как ETS-эмбрионы и являются упрощенной моделью, позволяющей заглянуть внутрь мышиного (а когда-нибудь и человеческого) развития без использования настоящих эмбрионов.

Первые ETS-эмбрионы

После одобрения статья всегда публикуется с задержкой, и порой это происходит совсем не вовремя. Когда статья об ETS-эмбрионах вышла на страницах Science, я мчалась на поезде в Париж на специализированное совещание по морфогенезу. Туда были приглашены многие мои друзья, поэтому я не хотела ничего отменять. Мы предупредили пресс-службу Кембриджского университета, что сможем принимать звонки от журналистов, и предложили Саре тоже в этом поучаствовать. Важно было самим объяснить журналистам смысл нашего исследования, не дожидаясь, пока кто-нибудь его исказит или раздует сенсацию.

Поездка на поезде и большая часть времени в Париже прошли в телефонных разговорах с журналистами. Никто из нас не ожидал такого внимания.

Журналистам свойственно спрашивать одно и то же. Ради чего все это? Мы отвечали, что можно использовать эмбрионоподобные структуры, чтобы понять основные процессы создания организма, включая и то, как клетки переговариваются друг с другом. Построив ETS-эмбрионы из генетически модифицированных стволовых клеток и пользуясь специальными ингибиторами, мы могли выявить сигнальные пути, укрепляющие партнерство между клетками, которое имеет существенное значение для развития с момента имплантации до образования зародышевых листков. Поскольку ETS-эмбрионы попроще настоящих, их физические, клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе переговоров между эмбриональными и внеэмбриональными стволовыми клетками в процессе эмбрионального роста и морфогенеза, легче поддаются анализу. Когда нужно послушать онтогенетические истории, эти структуры — отличные рассказчики. Но не идеальные. Им не хватает одного типа клеток, поэтому их рассказ не полон.

Наш следующий шаг был очевидным. Нам надо было расширить исследования и построить мышиные эмбрионы из трех типов клеток, как в природе. Это придало бы им завершенность, а может, и силу для перехода на следующие стадии развития. Они определенно были бы лучшей моделью для понимания принципов эмбриогенеза.

Искусство XEN

Построенные из двух типов клеток ETS-эмбрионы никогда не поведают всю историю эмбриогенеза целиком, потому что естественные эмбрионы зависят от третьего клеточного типа — клеток примитивной энтодермы, посылающей сигналы для эмбрионального развития и позже формирующей желточный мешок. Они образуют специализированную переднюю сигнальную структуру, AVE, о которой мы уже упоминали и которая считается ответственной за нарушение симметрии эмбриона для установки передне-задней оси. Но можно ли в роли примитивной энтодермы использовать стволовые XEN-клетки?

Я считала, что клеткам надо не только позволять самоорганизовываться, но и направлять их на этом пути или, по крайней мере, помогать. И так как у нас уже были эмбриональные структуры, эквивалентные постимплантационным эмбрионам, нам могли пригодиться структуры, которые сделаны на более ранней стадии развития — стадии бластоцисты.

В тот период члены моей команды то приходили, то уходили. Альма-матер Берны так впечатлилась ее экспериментами с эмбриональными моделями, что позволила ей остаться в Кембридже подольше, Сара защитила докторскую диссертацию и перешла в Wellcome Trust, а из Торонтского университета, что в Канаде, к нам присоединился Джанлука Амадей для проведения своих постдокторских исследований. Но Джан был не особо знаком с ранними мышиными эмбрионами. Потенциальная польза от их изучения предстала в моем воображении так ярко, что я позвонила лучшему из известных мне экспериментальных эмбриологов, Каролине Пиотровска-Нитше, и попросила ее прилететь из Эморийского университета в Атланте, чтобы присоединиться к нашей команде. Она согласилась.

Из-за своих обязательств Каролина могла остаться с нами только на две недели. Мне кажется, если бы она побыла подольше, мы бы прямо тогда и создали синтетическую бластоцисту, поскольку были на правильном пути. Я даже подумывала над тем, чтобы самой продолжить нашу работу. Однако мне не сильно хотелось, ведь в этом случае я не смогла бы видеться с семьей и друзьями до окончания экспериментов. И тогда удача улыбнулась мне снова.

Мне оказали честь, предложив должность директора Института молекулярной генетики Макса Планка в Берлине. Я много думала над этим предложением и, разумеется, не раз ездила в Берлин. Во время одного из таких визитов я прочитала лекцию о создании эмбрионоподобных структур. Среди слушателей была Эллен На из Берлинского медицинского университета «Шарите». Она экспериментировала с эмбриоидными телами и попросила меня взглянуть на созданные ею структуры. Хотя было неясно, сколько типов клеток входило в их состав, структуры выглядели многообещающе, и Эллен жаждала объединить наши усилия. Сотрудничество является важной составляющей нашей деятельности и причиной моей сильной любви к науке, поэтому я пригласила Эллен поработать с нами. Она могла приехать к нам лишь на пару недель. Но этого оказалось достаточно. Именно тогда Джан и Эллен смогли создать первые структуры из всех трех клеточных линий.

Результат был таким потрясающим, что мы решили это отпраздновать, собравшись вместе с Джаном и Эллен в выходные в лаборатории, ведь это был последний день нашей совместной работы с Эллен.

Но вскоре выяснилось, что рецепт эмбрионов из трех типов клеток плохо воспроизводим. Сегодня он работал, завтра нет. Мы учредили «Клуб любителей синтетических эмбрионов» и на его заседаниях диагностировали неисправности метода, чтобы сделать его более надежным. Мы решили во что бы то ни стало продолжать эксперименты. К тому времени Берна вернулась в нашу команду из Турции.

Берна и Джан трудились с полной отдачей каждый день, а я поощряла других сотрудников лаборатории помогать им. Быть может, самую важную роль сыграл Энди Кокс, мой постдок и управляющий лабораторией. Он был не только одаренным эмбриологом, но и очень творческим человеком. Когда нам пришлось переехать из Института Гёрдона в Кембридж, он помог обставить нашу новую лабораторию (и помогает обставить еще одну, пока я пишу эти строки). Энди отлично работал в команде, сосредоточиваясь на пользе для науки и всех людей, а не просто для того, чтобы присвоить себе успех. Когда какой-то проект или сотрудник лаборатории испытывал трудности при проведении экспериментов, я обычно просила Энди помочь. И он всегда соглашался. Благодаря Джану, Берне и Энди у нас наконец-то сформировался костяк команды, работающей над моделью эмбрионов из трех типов клеток.

К ноябрю 2017 года ежедневный мозговой штурм по поводу поиска лучших путей продвижения стал для нас привычным. Пока Джан, Берна и Энди занимались своими экспериментами, я искала другие подходы и новых ученых, чтобы дополнить наши усилия. К нам присоединились Тьерри Воэти его постдок Лия Чаппелл из Центра Сенгера, а также Ран Ван и Найхэ Цзин из Шанхая, чтобы проанализировать паттерны экспрессии генов в наших эмбрионоподобных структурах.

Несмотря на то что развитие этих структур выглядело высокоорганизованным, при объединении клеток мы по-прежнему полагались на случайные столкновения. Только теперь Берна, Джан и Энди к ЭС- и ТС-клеткам добавляли XEN-клетки. Они смешивали все три типа клеток и «подвешивали» их в питательной среде пирамидальной емкости, чтобы помочь им встретиться друг с другом. Каждый день они заботливо подкармливали этот клеточный коктейль питательными веществами.

Установив верную концентрацию клеток путем многочисленных проб и ошибок, мы наконец-то получили нечто похожее на эмбрион. Наблюдение под микроскопом за развитием этих структур напоминало просмотр блестящего документального фильма о самоорганизации всех трех клеточных типов, наглядно демонстрирующего то, как, вероятно, собирается настоящий эмбрион. Завораживающее зрелище. Один из тех моментов, ради которых мы занимаемся наукой. Руководствуясь принятой ранее терминологией, мы окрестили эти структуры ETX-эмбрионами, где каждая заглавная буква обозначала техническое наименование каждого из трех типов клеток.

Как настоящие, ETX-эмбрионы образовывали три группы клеток: эпибласт из ЭС-клеток, наблюдаемый в нашей самой первой модели, внеэмбриональную эктодерму из TC-клеток и примитивную энтодерму из XEN-клеток (технически на данной стадии развития она зовется висцеральной энтодермой), которая, разрастаясь, охватывала всю структуру (подробности этого процесса до сих пор неизвестны). В определенной точке пространства и времени естественный эмбрион нарушает свою симметрию и эпибласт образует первичную полоску, которая погружается в эмбрион и формирует новый клеточный слой, — мезодерму. Затем возникает еще один слой, энтодерма, которая в процессе гаструляции выталкивает прочь висцеральную энтодерму. Чтобы проделать все это, клетки должны подвергнуться так называемому эпителиально-мезенхимальному переходу — ключевому событию, позволяющему им покинуть эпителий (нечто подобное происходит с раковыми клетками, когда они отделяются от опухоли и распространяются по организму в смертоносном процессе метастазирования).

Наибольшее удовлетворение вызывал тот факт, что последовательность, архитектура и паттерны генетической активности в этих эмбриональных моделях соответствовали таковым в естественных эмбрионах на стадии гаструляции. Заменив внеклеточный матрикс, используемый в более ранних экспериментах, на третий тип клеток, мы не только смогли получить структуры из всех трех тканей, но и осуществить эпителиально-мезенхимальный переход, чтобы эмбрионоподобная структура прошла через гаструляцию. Ощущение изумления и трепета от этих экспериментов было таким прекрасным, что нет слов, чтобы его описать.

Имея в распоряжении модели, способные пройти через гаструляцию, мы могли лучше разобраться в том, как три типа клеток взаимодействуют друг с другом, позволяя эмбриону приобрести свой характерный облик. Мы бы могли, например, изменить сигнальный путь одного из клеточных типов и посмотреть, как это повлияет на один из двух остальных клеточных типов или на оба сразу.

Многие месяцы ушли на то, чтобы сопоставить все полученные данные, разобраться в их значении и подготовить статью в научный журнал. Мы все считали, что Science — лучший выбор, ведь именно там вышла наша статья об ETS-эмбрионах. Но мы ошибались. По мнению редактора, мы не достигли фундаментального прогресса после предыдущего исследования. Мы были в шоке. На наш взгляд, ЕТХ-модель была гораздо лучше, технология была иной, а конечный результат был очень близок к естественному, ведь нам удалось подтолкнуть все три типа клеток к самоорганизации и пройти основной этап развития. Тем временем мы получили еще больше результатов, дополнили статью и решили подать ее в Nature.

К нашему удивлению, примерно в это же время, в мае 2018 года, команда под руководством Николаса Риврона из Института Хюбрехта предоставила сведения о другой модели эмбриона из стволовых клеток. Они взяли две популяции стволовых клеток (ЭС и ТС) мыши и создали преимплантационную структуру, похожую на бластоцисту [15]. Несмотря на то что эта структура не развивалась за пределы стадии имплантации, она все равно была потрясающей. В конце статьи стало ясно, что Риврон и его команда потратили приличное количество времени на то, чтобы удовлетворить все требования рецензентов. Впервые они представили свое исследование в Nature в сентябре 2015 года, так что потребовалось два с половиной года на то, чтобы его приняли. Наука — это тяжелая работа.

Два рецензента одобрили нашу статью. Но третий сказал, что это просто еще одна синтетическая модель эмбриона. Статью рекомендовали отклонить, а нам — рассмотреть вариант ее публикации в Nature Cell Biology, где она в итоге и вышла в июле 2018 года [16]. На сегодняшний день ЕТХ-эмбрион остается, пожалуй, самой продвинутой моделью мышиного эмбриона и потенциально способен многое нам рассказать о нашем собственном развитии.

На данный момент

Эксперименты на эмбрионоподобных моделях прекрасно дополняют исследования, начавшиеся с того дня, когда мы впервые увлеклись танцем жизни. До этого все наши усилия были сосредоточены на наблюдении за этим танцем. Мы увидели, что после единственного деления оплодотворенной яйцеклетки одна из клеток склонна развиваться в эмбрион, а другая — в поддерживающие структуры, несмотря на то, что обе клетки невероятно пластичны с точки зрения потенциала развития. Делая фильмы с участием флуоресцентно меченых клеток, мы выяснили, что клеточные танцоры кооперируют друг с другом не потому, что хореограф отдает им команды, а потому, что они переговариваются между собой при помощи белков и других молекулярных факторов и реагируют на свое окружение. Как только конкурирующие клетки начинают кооперировать, развивается новый уровень организации [17]. Кооперация

способствует специализации и разнообразию клеточных типов, что побуждает эмбрион самоорганизовываться так, чтобы, например, после нескольких дроблений образовался свободноплавающий шарик из трех групп стволовых клеток, и одна из них превратилась в диск из клеток (эпибласт), которому суждено стать собственно эмбрионом. Остальные две группы формируют поддерживающие внеэмбриональные структуры.

Нам также удалось отследить танец жизни до самого момента имплантации, когда к танцу присоединяется материнский организм. С первой по вторую неделю человеческий эмбрион готовится к гаструляции, предвещающей ему реорганизацию из шарообразного скопления клеток (бластоцисты) в структуру в форме розетки, внутри которой открывается полость. Структура прогрессивно развивается в многослойный организм с тремя осями симметрии: передне-задней, дорсально-вентральной и лево-правой.

Теперь, когда мы построили эмбрионоподобную структуру из всех трех типов стволовых клеток (один отвечает за образование энтодермы, мезодермы и эктодермы, второй — за образование трофэктодермы, формирующей плаценту, и третий — за образование примитивной энтодермы, образующей желточный мешок), мы можем углубить наше понимание того, что запускает и направляет гаструляцию, которая начинается с водопада клеток, погружающихся из эпибласта в первичную полоску — бороздку, которая тянется от заднего конца туда, где в итоге будет голова, вдоль средней линии тела, разделяющей его на правую и левую стороны для сохранения симметрии и правильного развития эмбриона.

Тот слой, который глубже всех погрузится в полоску, станет энтодермой, а два следующих — мезодермой и эктодермой. Конкурирующие взаимодействия клеток и взаимные сигналы, ведущие к обособлению местоположения и судьбы клеток, демонстрируют то, как эпигенетическая модификация и поляризация клеток определяют развитие этих трех клеточных линий.

Несмотря на то что существует много сигнальных путей, отвечающих за межклеточную коммуникацию, мы можем попытаться понять, как именно взаимодействуют клетки, и создать прочные эмбриональные паттерны. Тем не менее мы достигли серьезного прогресса, когда, например, начали понимать, почему развитие человеческого и мышиного эмбрионов сильно различается, хотя фактически у них одинаковый набор генов [18]. С момента оплодотворения яйцеклетки до стадии бластоцисты человек и мышь развиваются по относительно сходным правилам, но после имплантации мышиный эмбрион приобретает форму цилиндра, а человеческий — форму диска. Их траектории развития расходятся из-за различий во взаимодействиях трех базовых типов клеток.

И здесь эмбрионы, созданные из стволовых клеток in vitro, предоставляют новые сведения. В отличие от эмбрионов, образующихся в результате слияния сперматозоида и яйцеклетки, модельные эмбрионы можно создавать в огромных количествах и подвергать генетическому редактированию для проведения высокопроизводительных генетических тестов и скрининга лекарственных препаратов [19]. Еще одним важным источником информации являются химеры, у которых человеческие клетки имплантированы в эмбрион другого биологического вида, что приводит к созданию новой оси [20]. Так с помощью «синтетической биологии» можно проверить, можем ли мы понять развитие в целом по отдельным его частям. Сегодня мы как никогда четко можем увидеть подробности танца жизни, при котором происходит кооперация и конкуренция клеток внутри самоорганизующегося эмбриона.

Этические аспекты использования моделей эмбрионов из стволовых клеток

Исследования по созданию эмбрионоподобных структур поднимают более широкие проблемы, которые знаменитый американский ученый Джордж Чёрч, ведущий специалист по синтетической биологии в Гарварде, разобрал в статье журнала eLife [21]. Интерес Чёрча и его коллег к «синтетическим человеческим существам с эмбрионоподобными чертами» начался с эксперимента, проведенного ими в 2011 году, когда они ввели человеческие стволовые клетки в мышиные эмбрионы, прикрепленные скаффолду[20] , применив то, что сами назвали инженерией эмбриональных тканей на основе скаффолдов. Для получения скаффолда из эмбрионов удалили клетки, оставив лишь межклеточный матрикс, и предполагалось, что сигнальные факторы побудят человеческие стволовые клетки превратиться во множество клеточных типов. Уже предпринимались попытки сделать таким образом сердце крысы [22]. В статье журнала eLife утверждалось, что подобные эксперименты «могут привести к созданию эмбрионоподобных существ, если ткани разовьются в достаточном количестве и установят между собой функциональные связи».

Как мы должны относиться ко всем этим существам, от эмбриоидов до эмбрионоподобных моделей, с учетом современных этических и правовых аспектов в разных юрисдикциях? Следует ли, с точки зрения закона, обращаться с модельными эмбрионами как с человеческими, сейчас или в будущем? Что, если получится сконструировать эмбрионоподобные модели, развивающиеся до более зрелого состояния? К ним нельзя применять четырнадцатидневный лимит, поскольку их время развития измеряется по другим часам. Как подчеркнули мои коллеги в комментарии к статье в Nature, существенным для решения этих вопросов является прозрачность и эффективное взаимодействие с общественностью [23].

Нет никаких сомнений, что рождение первой здоровой мыши из имплантированной эмбрионоподобной структуры станет знаковым моментом в репродукции, который породит столько же споров, сколько и научных перспектив. Как всякое исследование с практическим применением, репродуктология и наука о стволовых клетках в равной мере приносит новые возможности и этические проблемы. Однако в своей статье мы советовали запретить использование эмбрионоподобных структур в репродукции. Что касается этики, то для регулирующих органов на первом месте должна стоять цель экспериментального использования этих структур, а не попытки понять, насколько они похожи на естественные эмбрионы. Мы полагаем, что к структурам, воспроизводящим лишь часть эмбриона, нельзя относиться точно так же, как к полноценному эмбриону. Мы также призываем каждого ученого, использующего человеческие стволовые клетки, придерживаться существующих рекомендаций. Модели эмбрионов на основе стволовых клеток способны преобразить медицину. Но мы должны действовать осторожно.