Биология. В 3-х томах. Т. 1

У эукариот фотосинтез происходит в особых органеллах, называемых хлоропластами. Хлоропласты рассеяны в цитоплазме, их число варьирует от одного (как у Chlamydomonas и Chlorella) примерно до ста (в палисадных клетках мезофилла). У высших растений хлоропласты на срезе обычно имеют двояковыпуклую форму, а при взгляде сверху выглядят округлыми. Диаметр хлоропластов около 3-10 мкм (в среднем 5 мкм), так что они хорошо видны в световой микроскоп. У водорослей форма хлоропластов более разнообразна; например, у Spirogyra они спиралевидные, у Chlamydomonas чашевидные, и в них обычно содержатся пиреноиды, как у Spirogyra (разд. 3.2.4).

Хлоропласты образуются из небольших недифференцированных телец, называемых пропластидами; такие тельца имеются в растущих частях растения (в клетках меристемы), они окружены двойной мембраной — будущей оболочкой хлоропласта. В хлоропластах всегда содержатся хлорофилл и другие фотосинтетические пигменты, локализованные в системе мембран, которые погружены в основное вещество хлоропласта — строму. Детали строения хлоропластов выявляются с помощью электронного микроскопа. На рис. 7.6 показан внешний вид типичных хлоропластов в клетке мезофилла при сравнительно малом увеличении. На рис. 9.6 и 9.8 представлены другие электронные микрофотографии, а на рис. 9.7. — схема расположения мембран. Мембранная система-это то место, где протекают световые реакции фотосинтеза (разд. 9.4.2). В мембранах находятся хлорофилл и другие пигменты, ферменты и переносчики электронов. Вся система состоит из множества плоских, заполненных жидкостью мешков, называемых тилакоидами. Тилакоиды местами уложены в стопки — граны. Отдельные граны соединены друг с другом ламеллами (одиночными слоями). Каждая грана похожа на кучку монет, уложенных столбиком, а ламеллы чаще всего имеют вид пластинок (рис. 9.8). В световом микроскопе граны едва различимы в виде мелких зернышек.

Рис. 9.6. Электронная микрофотография хлоропласта. ЭР — эндоплазматический ретикулум. × 15800

Рис. 9.7. Строение хлоропласта. Для удобства система мембран изображена лишь частично. Звездочкой отмечен белоксинтезирующий аппарат, схожий с аппаратом прокариот

Рис. 9.8. Микрофотография 'оголенного' хлоропласта (т. е. хлоропласта с удаленной наружной оболочкой), полученная при помощи сканирующего электронного микроскопа (вид сверху). Ламеллы и граны изображены объемно. Обратите внимание на то, что ламеллы плоские, как листы бумаги, и что они соединяют граны друг с другом. Препарат-реплика с напылением (см. Приложение 2)

В строме происходят темповые реакции фотосинтеза (разд. 9.4.3). По своему строению строма напоминает гель; в ней находятся растворимые ферменты, в том числе все ферменты цикла Кальвина, а также другие химические соединения, в частности сахара и органические кислоты. Избыток углеводов, образовавшихся в процессе фотосинтеза, запасается здесь в виде зерен крахмала (главным образом на свету). С мембранами часто бывают связаны шаровидные капельки липидов. Их становится заметно больше, когда мембраны стареют и разрушаются. По-видимому, в этих капельках аккумулируются липиды мембран. В хромопластах они часто бывают очень большими, и в них накапливаются каротиноидные пигменты.

Белоксинтезирующий аппарат и теория эндосимбиоза

Одной из интересных особенностей хлоропластов, помимо их способности к фотосинтезу, является наличие белоксинтезирующего аппарата. В 60-е годы было показано, что и в хлоропластах, и в митохондриях есть ДНК и рибосомы. Это привело к гипотезе о том, что в тех клетках, где имеются эти органеллы, они могут быть частично или полностью независимы от клеточного ядра. Было даже высказано предположение, что митохондрии и хлоропласты — это прокариотические организмы, которые внедрились в клетки эукариот на ранних этапах эволюции жизни. Согласно теории эндосимбиоза, эти органеллы олицетворяют крайнюю форму симбиоза. В табл. 9.3 приведены некоторые данные в пользу этой гипотезы.

Таблица 9.3. Сравнение прокариот, хлоропластов и митохондрий с эукариотами

У фотосинтезирующих прокариот (сине-зеленых водорослей и некоторых бактерий) хлоропластов нет; фотосинтетические пигменты находятся у них не в хлоропластах, а в мембранах, расположенных внутри цитоплазмы. Поэтому такая клетка напоминает один большой хлоропласт, тем более что и по своим размерам они почти не различаются.

Хотя хлоропласты и митохондрии могут кодировать и синтезировать некоторые из своих белков, было установлено, что в них недостаточно ДНК, чтобы кодировать все их собственные белки, поэтому эволюционное происхождение этих органелл все еще остается неясным.

Фотосинтетические пигменты высших растений делятся на две группы — хлорофиллы и каротиноиды. Роль этих пигментов состоит в том, чтобы поглощать свет и превращать его энергию в химическую энергию. Пигменты локализованы в мембранах хлоропластов, и хлоропласты обычно располагаются в клетке так, чтобы их мембраны находились под прямым углом к источнику света, что гарантирует максимальное поглощение света. В табл. 9.4 перечислены пигменты, характерные для различных групп растений.

Таблица 9.4. Главные фотосинтетические пигменты, их цвет и распространение

Хлорофиллы

Хлорофиллы поглощают главным образом красный и сине-фиолетовый свет. Зеленый свет они отражают и потому придают растениям характерную зеленую окраску, если только ее не маскируют другие пигменты. На рис. 9.9 показаны спектры поглощения хлорофиллов a и b — для сравнения — спектр каротиноидов.

Рис. 9.9. Спектры поглощения хлорофиллов a и b и каротиноидов

Для хлорофиллов характерно наличие порфиринового кольца (рис. 9.10). Такая же структура имеется и в других важных биологических соединениях — в геме гемоглобина, миоглобина и цитохромов. Порфириновое кольцо — это плоская квадратная структура, состоящая из четырех меньших колец (I-IV), каждое из которых содержит по одному атому азота, способному взаимодействовать с атомами металлов; в хлорофиллах это магний, в геме-железо. К такой "голове" присоединен длинный углеводородный "хвост" — сложноэфирная связь образуется между спиртовой группой (-ОН) на конце фитола и карбоксильной группой (-СООН) на самой голове. У разных хлорофиллов разные боковые цепи, и это несколько изменяет их спектры поглощения.

Рис. 9.10. Строение хлорофилла. Координационная связь: Х-СН₃ — у хлорофилла а; -СНО — у хлорофилла b

Связь такой структуры с функцией можно описать следующим образом:

а) длинный хвост растворим в липидах (т. е. он гидрофобный) и таким образом удерживает молекулу в мембране тилакоида;

б) голова гидрофильная (т. е. обладает сродством к воде), и поэтому она обычно лежит на той поверхности мембраны, которая обращена к водной среде стромы;

в) для лучшего поглощения света плоскость головы расположена параллельно плоскости мембраны;

г) модификация боковых групп на голове приводит к изменениям в спектре поглощения, в результате чего меняется и количество поглощаемой энергии света;

д) поглощение световой энергии головой приводит к эмиссии электронов.

Хлорофилл а — фотосинтетический пигмент, представленный в наибольшем количестве; это единственный пигмент, который имеется у всех фотосинтезирующих растений и играет у них центральную роль в фотосинтезе. Существует несколько форм этого пигмента, которые различаются своим расположением в мембране. Каждая форма слегка отличается от других и по положению максимума поглощения в красной области; например, этот максимум может быть при 670, 680, 690 или 700 нм.

9.6. Чем отличается спектр поглощения хлорофилла а от спектра поглощения хлорофилла b?

Каротиноиды

Каротиноиды — это желтые, оранжевые, красные или коричневые пигменты, которые сильно поглощают в сине-фиолетовой области. Обычно они замаскированы зелеными хлорофиллами, но хорошо выявляются перед листопадом, так как хлорофиллы в листьях распадаются первыми. Каротиноиды содержатся также в хромопластах некоторых цветков и плодов, яркая окраска которых служит для привлечения насекомых, птиц и других животных, участвующих в опылении цветков или распространении семян; например, красный цвет кожицы помидоров обусловлен присутствием одного из каротинов — ликопина.

Каротиноиды имеют три максимума поглощения в сине-фиолетовой области спектра (рис. 9.9); они не только функционируют как дополнительные пигменты, но и защищают хлорофилл от избытка света и от окисления кислородом, выделяющимся при фотосинтезе.

Каротиноиды бывают двух типов — каротины и ксантофиллы. Каротины — это углеводороды, большую часть которых составляют тетратерпены (С₄₀-соединения). Самым распространенным и самым важным из них является β-каротин (рис. 9.11), который знаком всем как оранжевый пигмент моркови. Позвоночные животные способны в процессе пищеварения расщеплять молекулу каротина надвое с образованием двух молекул витамина А. Ксантофиллы по химическому строению очень сходны с каротинами и отличаются от них только тем, что содержат кислород.

Рис. 9.11. Строение β-каротина

Спектры поглощения и спектры действия

При изучении какого-либо процесса, активируемого светом, в частности фотосинтеза, очень важно знать спектр действия для данного процесса — тогда можно попытаться идентифицировать пигменты, которые в нем участвуют. Спектр действия — это график, показывающий эффективность стимулирующего действия света с различной длиной волны на исследуемый процесс, в нашем случае — на фотосинтез; эту эффективность можно оценивать, например, по образованию кислорода. Спектр поглощения — это график, отображающий относительное поглощение света с различной длиной волны тем или иным пигментом. Спектр действия для фотосинтеза показан на рис. 9.12, вместе с объединенным спектром поглощения всех фотосинтетических пигментов. Обратите внимание на большое сходство этих двух графиков: оно свидетельствует о том, что именно пигменты, и в частности хлорофилл, ответственны за поглощение света при фотосинтезе.

Рис. 9.12. Сравнение спектра действия фотосинтеза со спектром поглощения фотосинтетических пигментов

Возбуждение пигментов светом

Пигменты — это химические соединения, которые поглощают видимый свет, что приводит к переходу некоторых электронов в возбужденное состояние, т. е. эти электроны поглощают энергию. Чем меньше длина волны, тем выше энергия света и тем больше его способность переводить электроны в возбужденное состояние. Такое состояние обычно неустойчиво, и вскоре молекула возвращается в свое основное состояние (т. е. исходное низкоэнергетическое состояние), теряя при этом энергию возбуждения. Эта энергия может использоваться разными способами, в том числе на процесс, обратный поглощению света и называемый флуоресценцией. При этом часть энергии теряется в виде тепла, поэтому излучаемый свет имеет несколько большую длину волны (и меньшую энергию), чем поглощенный. Это можно увидеть, если сначала осветить раствор хлорофилла, а затем посмотреть на него в темноте.

Во время световых реакций фотосинтеза возбужденные пигменты теряют электроны, и на их месте в молекулах остаются положительные "дырки", например:

Всякий потерянный электрон будет принят другой молекулой — так называемым акцептором электрона, так что в целом это окислительно-восстановительный процесс (см. Приложение 1.2). Хлорофилл окисляется, а акцептор электрона восстанавливается. Хлорофилл служит здесь донором электрона.

Главные и вспомогательные пигменты

Фотосинтетические пигменты бывают двух типов — главные и вспомогательные. Пигменты второго типа передают испускаемые ими электроны главному пигменту. Электроны, испускаемые главными пигментами, непосредственно доставляют энергию для реакций фотосинтеза.

Существует два главных пигмента, это две формы хлорофилла а; их обозначают Р690 и Р700 (см. ниже). Сокращение Р означает "пигмент" (pigment). К вспомогательным пигментам относятся другие формы хлорофилла (в том числе все остальные формы хлорофилла а) и каротиноиды.

9.7. Поскольку энергию нельзя передавать со 100%-ной эффективностью, переход электрона от одной молекулы пигмента к другой должен сопровождаться некоторой потерей энергии в виде тепла. Хлорофилл b передает электроны на хлорофилл а. Можете ли вы сказать заранее, какой из этих хлорофиллов — а или b — обладает меньшей энергией возбуждения (т. е. энергией, необходимой для того, чтобы пигмент испустил электрон)?

Фотосинтетические единицы и реакционные центры

За последние двадцать лет мы многое узнали о расположении пигментов и связанных с ними молекул в мембранах тилакоидов. В настоящее время принято считать, что существует два типа фотосинтетических единиц, которые называют фотосистемами I и II (ФСI и ФСII). Каждая из этих единиц состоит из набора молекул вспомогательных пигментов, передающих энергию на одну молекулу главного пигмента. Последняя называется реакционным центром; в нем энергия света используется для осуществления химической реакции. Именно здесь происходит преобразование световой энергии в химическую, и именно оно является центральным событием фотосинтеза.

Судя по результатам биохимических и электронно-микроскопических исследований, каждая фотосистема содержит около 300 молекул хлорофилла. Препараты для электронной микроскопии приготовлялись методом замораживания-скалывания, который описан в Приложении 2.5; это один из хороших примеров успешного применения такого метода. Как видно на рис. 9.13, в мембранах тилакоидов имеются частицы двух типов, расположенные в определенном порядке; такие частицы называются квантосомами. Как полагают, более мелкие частицы составляют фотосистему I, а более крупные — фотосистему ΙΙ. Для каждого типа частиц характерен свой специфический набор молекул хлорофилла (рис. 9.14). Частицы фотосистемы II, по-видимому, в основном связаны с гранами. На рис. 9.14 схематически показано, как энергия (в виде возбужденных электронов) "переливается" со вспомогательных светособирающих пигментов на главный пигмент, который представлен особой формой хлорофилла а — пигментом Р690 или Р700 (в соответствии с максимумом поглощения в нанометрах). Р690 и Р700 — это энергетические ловушки. Другие специфические формы хлорофилла а, например a670 или a680, можно считать такими же вспомогательными пигментами, как и хлорофилл b. На рис. 9.14 не показаны каротиноиды, но они, по-видимому, тоже играют роль вспомогательных пигментов. Электроны, попавшие в энергетическую ловушку, используются для запуска световых реакций.

Рис. 9.13. Тилакоиды хлоропласта, выявленные методом замораживания-скалывания. Видна поверхность скола мембран самих гран и между ними. Обратите внимание на агрегаты частиц на этих мембранах

Рис. 9.14. Схематическое представление об энергетических ловушках в фотосистемах I и II. Р — пигмент, те молекула первичного пигмента хлорофилла а

В 1958 г. Арнон и его сотрудники показали, что на свету изолированные хлоропласты могут синтезировать АТФ из АДФ и фосфата (фосфорилирование), восстанавливать НАДФ до НАДФ·Н₂ и выделять кислород.

Арнон показал также, что СО₂ можно восстановить до углевода даже в темноте, при условии что в среде присутствуют АТФ и НАДФ·Н₂ (разд. 6.2.3). Это позволяло думать, что роль световых реакций состоит лишь в образовании АТФ и НАДФ·Н₂. Арнон обратил внимание на сходство этого процесса с дыханием, при котором тоже происходит фосфорилирование АДФ. Для фосфорилирования нужна энергия. При дыхании энергия высвобождается в результате окисления питательных веществ пищи (чаще всего глюкозы), и потому этот процесс называют окислительным фосфорилированием. При фотосинтезе источником энергии служит свет, и соответствующий процесс назвали фотофосфорилированием. Таким образом, окислительное фосфорилирование — это превращение АДФ и Ф_н в АТФ за счет химической энергии, получаемой из пищи в процессе дыхания, а фотофосфорилирование — это такое же превращение с использованием энергии света в процессе фотосинтеза (Ф_н — неорганический фосфат).

Арнон совершенно верно предсказал, что фотофосфорилирование, как и окислительное фосфорилирование, должно быть сопряжено с переносом электронов в мембранах. Перенос электронов — это основа для понимания как фотосинтеза, так и дыхания.

Циклическое и нециклическое фотофосфорилирование

Роль световых реакций заключается в синтезе АТФ и НАДФ·Н₂ за счет энергии света. Этот процесс связан с переносом электронов от главных пигментов, а свет доставляет энергию для такого переноса:

Судьба таких электронов отражена на рис. 9.15. Путь переноса электронов, показанный на этом рисунке, иногда называют "Z-схемой", так как эта схема похожа на букву Z. Вспомните, что отдача электрона — это окисление, а присоединение электрона — восстановление (см. Приложение 1.2). Для удобства на Z-схеме показаны два электрона, хотя на самом деле они поступают в систему по одному.

Судьба электронов. Во-первых, электрон из фотосистемы I или II поднимается на более высокий энергетический уровень, т. е. приобретает избыток энергии (энергию возбуждения). Вместо того чтобы вернуться в фотосистему, возвратившись на свой исходный уровень с потерей энергии (скажем, в результате флуоресценции), такой электрон захватывается акцептором электронов (X или Y на рис. 9.15). Это очень важное превращение световой энергии в химическую энергию. Акцептор электронов таким образом восстанавливается, а в фотосистеме остается положительно заряженный (окисленный) пигмент. Далее электрон мигрирует по нисходящей линии (в отношении своей энергии) и переходит от одного акцептора электронов к другому в ряде окислительно-восстановительных реакций. Такой перенос электронов сопряжен с образованием АТФ — как при циклическом, так и при нециклическом фотофосфорилировании; к тому же при нециклическом фотофосфорилировании происходит восстановление НАДФ.

Рис. 9.15. Z-схем а переноса электронов при циклическом и нециклическом фотофосфорилировании

Нециклическое фотофосфорилирование

Нециклическое фотофосфорилирование инициируется светом, падающим на фотосистемы I и II. Возбужденные электроны пигмента Р690 (ФС II) или Р700 (ФС I) восстанавливают соответствующие акцепторы электронов, т. е. X или Y. P690 и Р700 становятся положительно заряженными (т. е. окисленными). Электроны воды возвращают Р690 в нейтральное состояние: они переносятся по "нисходящей" линии от воды на Р690 через переносчик электронов Z, а в качестве побочного продукта фотосинтеза образуется кислород.

Р700 нейтрализуется электронами, движущимися "вниз" от X и далее по цепи переноса электронов, и при этом их энергия используется для синтеза АТФ. В расчете на одну пару электронов может образоваться до двух молекул АТФ, но эта величина, по-видимому, сильно варьирует (на рис. 9.15 показаны две молекулы). В конце концов электроны доходят от Y до НАДФ и взаимодействуют с ионами водорода, образуя НАДФ·Н₂. Обратите внимание на то, что при "расщеплении" воды ионы водорода образуются в избытке.

Циклическое фотофосфорилирование

При циклическом фотофосфорилировании электроны от Y снова возвращаются на Р700 по цепи переноса электронов. Так же как и при нециклическом фотофосфорилировании, энергия возбуждения электронов используется для синтеза АТФ.

Основные различия между циклическим и нециклическим фотофосфорилированием показаны в табл. 9.5.

Таблица 9.5. Сравнение циклического и нециклического фотофосфорилирования

Нециклическое фотофосфорилирование описывается следующим суммарным уравнением:

При циклическом фотофосфорилировании могут образовываться дополнительные количества АТФ. Эффективность преобразования энергии при световых реакциях очень высока и составляет около 39%.

Реакция Хилла

В 1939 г. Роберт Хилл, работая в Кембридже, обнаружил, что изолированные хлоропласты способны высвобождать кислород в присутствии окислителя (акцептора электронов). С тех пор эту реакцию называют реакцией Хилла. Природный акцептор электронов — НАДФ — можно заменить другими окислителями (они получили название окислителей Хилла). Один из них — голубой краситель ДХФИФ (2,6-дихлорфенолиндофенол), который обесцвечивается после восстановления:

Опыт 9.1. Исследование реакции Хилла

Листья шпината, салата или капусты

Ножницы

Предварительно охлажденная ступка с пестиком (либо гомогенизатор или бытовой миксер)

Марля или нейлон

Воронка для фильтрования

Центрифуга и центрифужные пробирки

Водяная баня со льдом и солью

Стеклянная палочка

0,05 М фосфатный буфер, рН 7,0

Среда для выделения

Раствор ДХФИФ (реакционная среда)

Для выделения хлоропластов можно взять листья шпината, салата или капусты. Листья заливают холодной средой с нужным рН и подходящей осмотической и ионной силой; годится, например 0,4 М раствор сахарозы с 0,01 М КС1 и 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,0. Если вы хотите сохранить биохимическую активность, все растворы и необходимые принадлежности надо предварительно охладить и всю работу проводить на холоде и как можно быстрее. Поэтому сначала хорошо разберитесь в методике, а затем уже подготовьте все оборудование.

Если нет возможностей для самостоятельного получения препаратов каждой группой студентов, этим методом можно выделить достаточное количество хлоропластов сразу для нескольких групп.

1. Измельчите ножницами три небольших листочка шпината, салата или капусты (средние жилки и черешки не берите). Залейте в холодную ступку или стакан гомогенизатора 20 мл охлажденной среды для выделения (если надо, пропорционально увеличьте объем измельченной массы и среды) и бросьте туда измельченные листья.

2. Быстро и энергично разотрите листья в ступке (или гомогенизируйте их около 10 с).

3. Положите на воронку четыре слоя марли или нейлона, смочите холодной средой для выделения.

4. Профильтруйте гомогенат через воронку. Фильтрат соберите в охлажденные центрифужные пробирки, помещенные в водяную баню со льдом и солью. Соберите края марли вместе и тщательно отожмите ее в пробирки.

5. Удостоверьтесь в том, что объем фильтрата во всех пробирках одинаков[32].

6. Если ваша настольная центрифуга имеет всего одну постоянную скорость, центрифугируйте фильтрат в течение 2-5 мин (нужно, чтобы появился небольшой осадок, но время осаждения должно быть минимальным).

Если имеется настольная центрифуга, скорость которой можно менять, центрифугируйте фильтрат 1-2 мин при 100-200 g (g — ускорение силы тяжести). Надосадочную жидкость отцентрифугируйте еще раз в течение 5 мин при 1000-2000 g (этого времени достаточно для получения небольшого осадка хлоропластов).

7. Слейте надосадочную жидкость. Налейте в одну из пробирок примерно 2 мл среды для выделения и ресуспендируйте осадок с помощью стеклянной палочки. Полученную суспензию перелейте во вторую пробирку и повторите ресуспендирование. (Если работают несколько групп студентов, то можно налить во все пробирки по 2 мл среды для выделения и дать каждой группе по одной пробирке.)

8. Полученную суспензию хлоропластов держите в водяной бане со льдом и солью и используйте ее как можно быстрее.

Теперь суспензию хлоропластов можно использовать для изучения реакции Хилла. Раствор ДХФИФ должен быть комнатной температуры. Подготовьте четыре пробирки (1-4) и налейте в них соответственно

1) 0,5 мл суспензии хлоропластов + 5 мл раствора ДХФИФ; оставьте пробирку на ярком свету;

2) 0,5 мл среды для выделения + 5 мл раствора ДХФИФ; оставьте пробирку на ярком свету;

3) 0,5 мл суспензии хлоропластов + 5мл раствора ДХФИФ; сразу же спрячьте в темное место;

4) прилейте к 5 мл дистиллированной воды 0,5 мл суспензии хлоропластов. Эта пробирка послужит цветным стандартом: она покажет, какой должна быть окраска суспензии после полного восстановления ДХФИФ. Через 15-20 мин запишите ваши наблюдения.

Если в лаборатории есть колориметр, то за ходом реакции можно проследить, отмечая уменьшение поглощения света красителем по мере изменения его окраски. В окисленном состоянии краситель синий, а в восстановленном бесцветный. В этом случае пробы 2 и 4 следует приготовлять прямо в кюветах колориметра. Поставьте красный (или желтый) светофильтр и установите прибор на ноль, взяв в качестве контроля кювету с пробой 4. Затем быстро приготовьте пробу 1, снимите для нее показания прибора и поставьте кювету с пробой 1 на яркий свет. Дальнейшие измерения делайте через каждые 30 с. Постройте график хода реакции. Как только реакция закончится, измерьте поглощение пробы 3. Самопроизвольное восстановление красителя можно оценить по пробе 2, при этом для установки колориметра на ноль берут в качестве контроля среду для выделения. В идеале для полного восстановления достаточно 10 мин.

Приготовьте следующие растворы:

0,05 М фосфатный буфер, рН 7,0

Na₂HPО₄·12Н₂О 4,48 г (0,025 М)

КН₂РО₄ 1,70 г (0,025 М)

Доведите дистиллированной водой до 500 мл и поставьте в холодильник (0-4°С).

Среда для выделения

Сахароза 34,23 г (0,4 М)

КС1 0,19 г (0,01 М)

Растворите все в фосфатном буфере при комнатной температуре и доведите буфером до 250 мл. Держите среду в холодильнике при 0-4°С.

Раствор ДХФИФ (реакционная среда)

ДХФИФ 0,007-0,01 г (~ 10^-4 М)

КС1 0,93 г (0,05 М)

Растворите в фосфатном буфере при комнатной температуре и доведите объем до 250 мл. Храните в холодильнике при 0-4°С. Используйте при комнатной температуре. (Хлорид калия — кофактор реакции Хилла.)

9.8. Заметили ли вы какие-нибудь изменения в пробирке 1?

9.9. Для чего были нужны пробирки 2 и 3?

9.10. Какие другие органеллы помимо хлоропластов могут, по вашему мнению, попасть в суспензию?

9.11. Из чего видно, что они не участвуют в восстановлении красителя?

9.12. Почему среду для выделения надо держать на холоде?

9.13. Для чего забуферивают среду для выделения?

9.14. Что служит а) донором и 6) акцептором электронов в реакции Хилла?

9.15. При реакции Хилла ДХФИФ действует на участке между X и ФС I в Z-схеме (рис. 9.15), и при этом выделяется кислород. Связана ли реакция Хилла с циклическим или с нециклическим фотофосфорилированием или же с тем и другим? Обоснуйте ваш ответ.

9.16. На рис. 9.16 показано, как выглядят хлоропласты после описанного выше опыта: вид но, к чему приводит перенос их из гипертонической среды выделения в гипотоническую реакционную среду.

Рис. 9.16. Электронная микрофотография хлоропластов после выделения их в гипотонической среде; × 13485. Оболочки и строма утрачены

а) Чем хлоропласты на рис. 9.16 отличаются по внешнему виду от нормальных хлоропластов?

б) Можете ли вы объяснить, почему перенос хлоропластов в среду без сахарозы приводит к таким изменениям?

в) Почему желательно, чтобы эти изменения произошли в нашем опыте до реакции Хилла?

9.17. Как вы думаете, какое значение имело открытие реакции Хилла для понимания фотосинтетического процесса?

Для темновых реакций, которые протекают в строме, свет не нужен. Восстановление СО₂ происходит за счет энергии (АТФ) и восстановительной силы (НАДФ·Н₂), образующихся при световых реакциях. Темновые реакции контролируются ферментами. Последовательность этих реакций была определена в США Кальвином, Бенсоном и Бэссемом в период с 1946 по 1953 г.; в 1961 г. Кальвину была присуждена за эту работу Нобелевская премия.

Эксперименты Кальвина

Работы Кальвина были основаны на использовании радиоактивного изотопа углерода ¹⁴С (период полураспада 5570 лет, см. Приложение 1.3), который стал доступным для исследователей только в 1945 г. Кроме того, Кальвин применял бумажную хроматографию, которая в то время была сравнительно новым, еще мало распространенным методом. Культуры одноклеточной зеленой водоросли хлореллы (Chlorella) выращивали в специальном аппарате (рис. 9.17). Культуру выдерживали с ¹⁴СО₂ в течение различных промежутков времени, затем клетки быстро фиксировали, выливая суспензию в горячий метанол. Растворимые продукты фотосинтеза экстрагировали, концентрировали и разделяли при помощи двумерной хроматографии на бумаге (рис. 9.18 и Приложение 1.8.2). Цель состояла в том, чтобы проследить путь, по которому меченый углерод попадает (через ряд промежуточных продуктов) в конечные продукты фотосинтеза. Положение радиоактивных соединений на бумаге определяли с помощью радиоавтографии: для этого на хроматограмму накладывали фотопленку, чувствительную к излучению ¹⁴С, и она засвечивалась, т. е. чернела, в тех местах, где находились радиоактивные вещества (рис. 9.18). Уже за одну минуту инкубации с ¹⁴СО₂ синтезировались многие сахара и органические кислоты, в том числе различные аминокислоты. Однако Кальвину удалось, используя очень короткие экспозиции — в течение 5 и менее секунд — идентифицировать первый продукт фотосинтеза и установить, что это кислота, содержащая три атома углерода, а именно фосфоглицериновая кислота (ФГК). Затем он выяснил всю цепь промежуточных соединений, по которой передается фиксированный углерод; эти стадии будут рассмотрены позднее. С тех пор эти реакции называют циклом Кальвина (или циклом Кальвина — Бенсона- Бэссема).

Рис. 9.17. Схема, изображающая принцип устройства аппарата Кальвина. Он состоит из тонкого прозрачного сосуда, в котором выращивают одноклеточные водоросли. В опытах по изучению пути углерода при фотосинтезе через суспензию водорослей продували двуокись углерода, содержащую радиоактивный углерод

Рис. 9.18. А. Фиксация ¹⁴СО₂ У водорослей при кратковременном освещении. Определение продуктов фиксации с помощью хроматографии на бумаге и радиоавтографии. Б. Радиоавтографы продуктов фотосинтеза, получающихся после кратковременного освещения водорослей в присутствии ¹⁴СО₂

9.18. Какие преимущества дает применение долгоживущих радиоактивных изотопов в биологических исследованиях?

9.19. Какие преимущества можно получить, взяв хлореллу вместо высшего растения?

9.20. Почему сосуд аппарата Кальвина имеет плоскую, а не шарообразную форму?

Этапы пути углерода

Фиксация двуокиси углерода:

Акцептором СО₂ служит пятиуглеродный сахар (пентоза) рибулозобисфосфат (т. е. рибулоза с двумя фосфатными группами; раньше это соединение называли рибулозодифосфатом). Присоединение СО₂ к тому или иному веществу называется карбоксилированием, а фермент, катализирующий такую реакцию, — карбоксилазой. Образующийся шестиуглеродный продукт неустойчив и сразу же распадается на две молекулы фосфоглицериновой кислоты (ФГК), которая и является первым продуктом фотосинтеза. Фермент рибулозобисфосфат-карбоксилаза содержится в строме хлоропластов в большом количестве — это фактически самый распространенный в мире белок.

Восстановительная фаза:

ФГК содержит три атома углерода и имеет кислотную карбоксильную группу (-СООН). ТФ — это триозофосфат, или глицеральдегидфосфат (трехуглеродный сахар); он имеет альдегидную группу (-СНО).

Для удаления кислорода из ФГК (т. е. для ее восстановления) используются восстановительная сила НАДФ·Н₂ и энергия АТФ. Реакция протекает в два этапа: сначала расходуется часть АТФ, образовавшегося в ходе световых реакций, а затем используется весь НАДФ·Н₂, также полученный на свету. Суммарный результат — восстановление карбоксильной группы кислоты (-СООН) до альдегидной группы (-СНО). Продукт реакции — триозофосфат, т. е. трехуглеродный сахар с присоединенной к нему фосфатной группой. В этом соединении больше химической энергии, чем в ФГК, и это первый углевод, который образуется при фотосинтезе.

Регенерация акцептора для СО₂ — рибулозобисфосфата. Часть триозофосфата (ТФ) должна израсходоваться на регенерацию рибулозобисфосфата, который используется в первой реакции. Этот процесс представляет собой сложный цикл, в котором участвуют сахарофосфаты с 3, 4, 5, 6, 7 атомами углерода. Именно здесь и расходуется остальной АТФ. Все темновые реакции суммированы на рис. 9.19. На этом рисунке цикл Кальвина изображен в виде "черного ящика", в который с одной стороны поступают СО₂ и Н²О, а с другой стороны выходит триозофосфат. Как видно из этой схемы, остаток АТФ используется для фосфорилирования рибулозобисфосфата, однако детали этой сложной цепи реакций не показаны.

Рис. 9.19. Обобщенная схема темновых реакций фотосинтеза (цикла Кальвина). РиБФ — рибулозобисфосфат; РиФ — рибулозофосфат; ФГК — фосфоглицериновая кислота; ТФ — триозофосфат

Из рис. 9.19 можно вывести такое суммарное уравнение:

Здесь важно обратить внимание на то, что на образование двух молекул триозофосфата идет шесть молекул СО₂. Уравнение можно упростить, поделив все коэффициенты на 6:

9.21. Перерисуйте рис. 9.19, указав только число атомов углерода, участвующих в реакциях; например, вместо 6 РиБФ напишите "6 × 5С" и т. д.

Основные сведения о процессе фотосинтеза резюмированы в табл. 9.6.

Таблица 9.6. Краткие сведения о фотосинтезе

Хотя триозофосфат (фосфоглицеральдегид) и является конечным продуктом цикла Кальвина, он не накапливается в больших количествах, так как сразу же превращается в другие продукты. Самые известные из них — глюкоза, сахароза и крахмал, однако быстро образуются и другие вещества — жиры и органические кислоты (в том числе жирные кислоты и аминокислоты). Строго говоря, фотосинтез заканчивается, как только образуется триозофосфат, поскольку все дальнейшие реакции происходят и у нефотосинтезирующих организмов, таких, как грибы и животные. Очень важно, однако, показать здесь, каким образом фосфоглицериновая кислота и триозофосфат могут использоваться для синтеза всех питательных веществ, необходимых растению. Некоторые из главных путей метаболизма представлены на рис. 9.20. Из приведенной схемы видно, какое центральное место в общем метаболизме клетки занимают реакции гликолиза и цикла Кребса. Эти два пути мы рассмотрим в гл. 11. И фосфоглицериновая кислота, и триозофосфат являются промежуточными продуктами гликолиза.

Рис. 9.20. Метаболизм ФГК и ТФ. Показана взаимосвязь между фотосинтезом и синтезом питательных веществ у растений. Изображены только основные метаболические пути. Некоторые промежуточные этапы опущены

Синтез углеводов

Углеводы образуются в результате процесса, который по существу представляет собой обращение гликолиза. Два важнейших углеводных продукта — сахароза и крахмал. Углеводы транспортируются из листьев во флоэму в форме сахарозы (разд. 14.8), а крахмал — это запасный углевод и один из самых легко выявляемых продуктов фотосинтеза.

Синтез липидов

Фосфоглицериновая кислота вступает на путь гликолиза, превращается в ацетильную группу, которая присоединяется к коферменту А и образует ацетилкофермент А. Из последнего синтезируются жирные кислоты — как в цитоплазме, так и в хлоропластах (но не в митохондриях, где, наоборот, происходит расщепление жирных кислот). В то же время из триозофосфата образуется глицерол.

Синтез белков

В состав фосфоглицериновой кислоты и триозофосфата входят углерод, водород и кислород. Между тем для синтеза аминокислот, а значит и белков, нужны еще азот, сера и в некоторых случаях фосфор. Все эти элементы растения получают из почвенного раствора (а водные растения — из окружающей их воды) в виде неорганических солей (нитратов, сульфатов и фосфатов).

Высшие растения способны синтезировать все необходимые им аминокислоты. Для этого им нужен источник азота в виде аммиака или нитратов, а источником углерода служит фосфоглицериновая кислота — продукт фотосинтеза. Млекопитающие не могут синтезировать некоторые обычные аминокислоты (о незаменимых аминокислотах см. в разд. 5.4) и поэтому должны в конечном счете получать их от растений. Фосфоглицериновая кислота сначала превращается через ацетилкофермент А в одну из кислот цикла Кребса (рис. 9.20). Реакции, ведущие к образованию аминокислот, приведены ниже:

Например,

Реакция 2 — это главный путь включения аммиака в аминокислоты. Другие аминокислоты могут синтезироваться в результате процесса, называемого трансаминированием, т. е. переноса аминогруппы (-NH₂) с одной кислоты на другую. Например,

Существуют и другие пути синтеза аминокислот. Некоторые аминокислоты синтезируются прямо в хлоропластах. Для образования аминокислот непосредственно расходуются около одной трети всего фиксируемого углерода и примерно две трети азота, поглощаемого растением.

Освещенность, концентрация СО₂ и температура — вот те главные внешние факторы, которые влияют на скорость фотосинтеза. Если по горизонтальной оси отложить изменение того или иного фактора, то во всех случаях мы получим графики, сходные с кривой на рис. 9.21. На всех таких графиках скорость фотосинтеза сначала возрастает линейно (на том участке, где данный фактор является лимитирующим), а затем увеличивается все медленнее и, наконец, стабилизируется, когда лимитирующим становится другой фактор (или факторы).

В дальнейшем мы будем считать, что меняется только тот фактор, который мы рассматриваем, а все остальные находятся на оптимальном уровне.

Свет

При оценке действия света на тот или иной процесс важно различать влияние его интенсивности, качества (спектрального состава) и времени экспозиции на свету.

Интенсивность света. При низкой освещенности скорость фотосинтеза прямо пропорциональна интенсивности света (рис. 9.21). Постепенно лимитирующими становятся другие факторы, и увеличение скорости замедляется. В ясный летний день освещенность составляет примерно 100000 люкс (10000 футо-кандел), а для светового насыщения фотосинтеза хватает и 10000 люкс. Поэтому свет обычно может быть важным лимитирующим фактором только в условиях затенения. При очень большой интенсивности света иногда начинается обесцвечивание хлорофилла, и это замедляет фотосинтез, однако в природе растения, находящиеся в таких условиях, обычно тем или иным способом защищены от этого (толстая кутикула, опушенные листья и т. п.).

Продолжительность освещения (фотопериод). Фотосинтез происходит только на свету, однако продолжительность освещения никак не влияет на скорость этого процесса.

Качество света (его спектральный состав). Влияние качества света можно оценить по спектру действия для фотосинтеза (см. рис. 9.12).

Концентрация СО2

Для темновых реакций нужна двуокись углерода, которая включается в органические соединения. В обычных полевых условиях именно СО₂ является главным лимитирующим фактором. Концентрация СО₂ в атмосфере варьирует в пределах от 0,03 до 0,04%, но если повысить ее, то можно увеличить и скорость фотосинтеза (см. кривую 3 на рис. 9.22). При кратковременном воздействии оптимальная концентрация СО₂ составляет около 0,5%, однако при длительном воздействии возможно повреждение растений, поэтому оптимум концентрации в этом случае ниже — около 0,1%. Уже сейчас некоторые тепличные культуры, например томаты, стали выращивать в атмосфере, обогащенной СО₂. В настоящее время большой интерес вызывает группа растений, которые намного эффективнее поглощают СО₂ из атмосферы и поэтому дают более высокий урожай. О таких "С₄-растениях" речь пойдет в разд. 9.8.2, где мы также рассмотрим, каким образом высокая концентрация СО₂ ингибирует фотодыхание и стимулирует фотосинтез.

Температура

Темновые, а отчасти и световые реакции фотосинтеза контролируются ферментами; поэтому они зависят от температуры. Оптимальная температура для растений умеренного климата обычно составляет около 25°С. При каждом повышении температуры на 10° (вплоть до 35°С) скорость реакций удваивается, но из-за влияния ряда иных факторов растения лучше всего растут при 25°С.

9.25. Почему при более высоких температурах скорость фотосинтеза снижается?

Вода

Вода — один из субстратов (исходных веществ) для фотосинтеза, но оценить непосредственное влияние воды на фотосинтез совершенно невозможно, так как ее недостаток влияет на множество клеточных процессов. Тем не менее, изучая продуктивность (количество синтезируемого органического вещества) у растений, страдающих от недостатка воды, можно показать, что временное увядание приводит к серьезным потерям урожая. Даже небольшая нехватка воды, когда еще нет никаких видимых изменений, может очень сильно повлиять на урожайность. Причины этого сложными недостаточно изучены. Одна из очевидных причин-то, что при увядании устьица у растений обычно закрываются, а это мешает свободному доступу СО₂ для фотосинтеза. К тому же было установлено, что при нехватке воды в листьях некоторых растений накапливается абсцизовая кислота-ингибитор роста.

Концентрация хлорофилла

Концентрация хлорофилла, как правило, не бывает лимитирующим фактором, однако количество хлорофилла может уменьшаться при различных заболеваниях (мучнистая роса, ржавчина, вирусные болезни), недостатке минеральных веществ (разд. 9.12) и с возрастом (при нормальном старении). Когда листья желтеют, говорят, что они становятся хлоротичными, а само это явление называют хлорозом. Хлоротические пятна на листьях часто бывают симптомом заболевания или недостатка минеральных веществ. Для синтеза хлорофилла нужны железо, магний и азот (два последних элемента входят в его структуру), поэтому они особенно важны для фотосинтеза. Важен также калий. Хлороз может быть вызван и недостатком света, так как свет нужен для конечной стадии биосинтеза хлорофилла.

Кислород

Сравнительно высокая концентрация кислорода в атмосфере (21%), в которой обычно находятся растения, как правило, ингибирует фотосинтез. В последние годы было установлено, что кислород конкурирует с СО₂ за активный центр рибулозобисфосфат-карбоксилазы (фермента, участвующего в фиксации СО₂), а это снижает суммарную интенсивность фотосинтеза. Кроме того, в дальнейших реакциях образуется СО₂, что тоже уменьшает чистый фотосинтез. Из таких реакций складывается "фотодыхание" — мы рассмотрим этот процесс в разд. 9.8.

Специфические ингибиторы

Самый простой способ погубить растение — это подавить фотосинтез. Именно для этой цели и были придуманы различные гербициды. Один из ярких примеров — ДХММ (дихлорфенилдиметилмочевина), которая шунтирует нециклический перенос электронов и таким образом подавляет световые реакции. ДХММ оказалась весьма полезной при изучении световых реакций.

Загрязнение окружающей среды

Некоторые газы промышленного происхождения, особенно озон и сернистый газ, даже в малых концентрациях сильно повреждают листья у ряда растений, однако точные причины этого до сих пор не установлены. Согласно произведенным оценкам, в сильно загрязненных районах потери урожая зерновых могут доходить до 15%, особенно если ситуацию усугубляет засуха, как это было летом 1976 г. в Великобритании. К сернистому газу очень чувствительны лишайники. Сажа забивает устьица и уменьшает прозрачность листовой эпидермы.

9.26. Назовите возможные местообитания или природные условия, в которых факторами, лимитирующими фотосинтез, могут быть а) интенсивность освещения, 6) концентрация кислорода и в) температура.

Для того чтобы установить, что имел место фотосинтез, можно идентифицировать какой-либо из его продуктов. Самый первый продукт фотосинтеза — фосфоглицериновая кислота; она очень быстро превращается в ряд других соединений, включая сахара, а затем и в крахмал. Выявить крахмал очень несложно, поэтому он может служить удобным индикатором того, что идет фотосинтез, если для опыта брать листья или целые растения, лишенные крахмала.

Для удаления крахмала растения оставляют в темноте на 24-48 ч. Прежде чем приступить к опыту 9.2, рекомендуется проверить, полностью ли удален крахмал.

9.27. Почему крахмал исчезает в темноте?

Опыт 9.2. Выявление крахмала в листе

Листья, подготовленные для исследования

Пробирка

Пинцет

Белая кафельная плитка

Горячая водяная баня

90%-ный этанол

Раствор йода в йодистом калии

Крахмал можно обнаружить при помощи раствора йода в йодистом калии (I₂/КI). Для того чтобы зеленый цвет хлорофилла не маскировал происходящее изменение окраски, листья нужно предварительно обесцветить. Для этого лист опускают в пробирку с кипящим 90%-ным этанолом, помещенную в водяную баню, и держат его там столько, сколько потребуется (не следует пользоваться открытыми горелками, так как этанол легко воспламеняется). Обесцвеченный лист промывают горячей водой, чтобы удалить спирт и размягчить ткани, расправляют на кафельной плитке и сверху заливают йодным раствором. Этот красно-коричневый раствор окрашивает все части листа, где есть крахмал, в сине-черный цвет.

Опыт 9.3. Изучение потребности в свете

Растение с листьями, лишенными крахмала

Источник света, например настольная лампа

Черная бумага или металлическая фольга

Все, что нужно для выявления крахмала

Хотя уже само исчезновение крахмала в темноте показывает, что растениям нужен свет, потребность в нем можно изучить более подробно. На лист, лишенный крахмала, накладывают полоску черной бумаги или металлической фольги и выставляют его на несколько часов на свет. Методика и ожидаемые результаты показаны на рис. 9.23.

Рис. 9.23. Опыт по изучению необходимости света для фотосинтеза

9.28. В чем недостаток описанной методики? Как можно видоизменить ее с учетом ваших соображений?

Опыт 9.4. Изучение потребности в двуокиси углерода

Растение с листьями, лишенными крахмала, например комнатная герань (Pelargonium)

Источник света, например настольная лампа

Вата

20%-ный раствор гидроокиси калия

Все, что нужно для выявления крахмала

Коническая колба (Эрленмейера) на 250 мл

Штатив и зажимы к нему

Известковая вода

Одна из методик, пригодных для изучения потребности в СО₂, показана на рис. 9.24. Растение оставляют на несколько часов на свету, а затем определяют крахмал в листьях, использованных для опыта.

Рис. 9.24. Опыт по изучению необходимости двуокиси углерода для фотосинтеза. Ватную пробку смачивают в известковой воде для поглощения СО₂

9.29. Опишите, в каких условиях должен находиться контрольный лист.

Более наглядно использование двуокиси углерода растением можно продемонстрировать, поставив опыт с включением ¹⁴СО₂ (содержащей радиоактивную метку) в сахара и другие соединения.

Опыт 9.5. Изучение потребности в хлорофилле

Растение с пятнистыми листьями — Chlorophyton, пестролистная форма плюща, герани, клена или бирючины

Все, что нужно для выявления крахмала

У многих растений листья пятнистые-с зелеными участками, где есть хлорофилл, и незелеными, где его нет. Несколько примеров мы назвали только что. Если сначала зарисовать, как располагаются зеленые и белые (незеленые) участки, а потом выявить крахмал в таком листе, станет ясно, что крахмал образуется только там, где есть хлорофилл.

Опыт 9.6. Изучение выделения кислорода

Элодея (Elodea canadensis)

Пробирка

Стеклянная воронка

Источник света (например, настольная лампа)

Гидрокарбонат натрия

Стакан на 400 мл

Деревянная лучинка

Пластилин

Самый простой способ показать, что при фотосинтезе выделяется кислород, — взять водное растение, например элодею, поставить его на яркий свет и собрать выделяемый кислород, как это показано на рис. 9.25. В следующем разделе мы рассмотрим один из количественных методов.

Рис. 9.25. Опыт по изучению выделения кислорода при фотосинтезе

Как полагают, фотосинтез возник, когда атмосфера была намного богаче двуокисью углерода, чем теперь, а кислорода в ней было очень маловероятно, около 0,02% (сейчас-21%). Уже в 1920 г. стало известно, что кислород обычно подавляет фотосинтез, однако причины этого были выяснены только в 1971 г. Оказалось, что для фермента, фиксирующего СО₂, т. е. рибулозобисфосфат-карбоксилазы, субстратом может служить не только двуокись углерода, но и кислород. Действительно, эти два газа конкурируют за один и тот же активный центр. Если с ферментом взаимодействует кислород, то катализируется такая реакция:

Реакция 1 называется оксигенацией; поэтому один и тот же фермент называют рибулозобисфосфатоксигеназой, когда он катализирует эту реакцию, и рибулозобисфосфат-карбоксилазой, когда он участвует в реакции 2. Вместо двух молекул фосфоглицериновой кислоты (ФГК), образующихся в ходе реакции 2, во время реакции 1 образуется одна молекула ФГК и одна молекула фосфогликолата. Фосфатная группа сразу же отщепляется, и фосфогликолат (фосфогликолевая кислота) превращается в гликолат (гликолевую кислоту).

Поэтому кислород является конкурентным ингибитором (разд. 6.5) фиксации СО₂, и всякое повышение концентрации кислорода способствует поглощению его самого, а не СО₂, и таким образом ингибирует фотосинтез. И наоборот, всякое повышение концентрации СО₂ будет благоприятствовать реакции карбоксилирования.

Теперь возникает новая проблема: а что же растению делать с гликолатом? Для его использования у растения имеется метаболический путь, называемый фотодыханием. Можно дать такое определение: фотодыхание — это зависимое от света потребление кислорода с выделением двуокиси углерода на свету. Оно не имеет никакого отношения к обычному дыханию (которое теперь иногда называют темновым дыханием, чтобы избежать путаницы) и похоже на него лишь тем, что здесь тоже используется кислород и тоже выделяется СО₂. Фотодыхание — светозависимый процесс, так как рибулозобисфосфат — один из продуктов цикла Кальвина — образуется только тогда, когда идет фотосинтез. Назначение фотодыхания — вернуть в цикл хотя бы часть углерода из гликолата, который накапливается в избытке. Схема этого процесса представлена на рис. 9.28. Многие детали здесь для нас несущественны, но следует отметить четыре главных факта:

Рис. 9.28. А Путь фотодыхания. Обратите внимание, что в этом процессе используется кислород и образуется двуокись углерода. Кроме того, используется еще и РиБФ, а он образуется только на свету в процессе фотосинтеза. Б. Электронная микрофотография, демонстрирующая типичную для клеток мезофилла тесную связь между хлоропластами, пероксисомами и митохондриями, × 38700

1. Кислород используется а) при окислении гликолата до глиоксилата в пероксисомах и 6) при окислении глицина до серина в митохондриях.

2. Когда глицин окисляется до серина, углерод бесполезно теряется в виде СО₂.

3. Бесполезно теряется и энергия, так как расходуются НАДФ·Н₂ и АТФ. Хотя во время превращения глицина в серии и синтезируется АТФ, процесс в целом идет с затратой энергии.

4. В процессе участвуют три разные органеллы — хлоропласты, пероксисомы и митохондрии. Пероксисомы были кратко описаны в гл. 7 (рис. 7.6).

В итоге из двух молекул гликолата (2×2 атома С) образуется одна молекула фосфоглицерата, состоящая из трех атомов С; таким образом, из гликолата — этого "отхода производства" — извлекаются три атома углерода из каждых четырех. Поскольку такие промежуточные продукты, как глицин, могут эффективнее синтезироваться иными способами, данный путь, по-видимому, не имеет никаких других функций, кроме только что рассмотренной.

Теряющийся при этом углерод — это тот углерод, на фиксацию которого уже была затрачена энергия. К тому же аммиак, который выделяется при окислении глицина в серии, надо снова включать в состав аминокислот с затратой АТФ.

9.37. Каким образом сведения о фотодыхании помогают объяснить влияние концентрации СО₂ и кислорода на скорость фотосинтеза?

9.38. Какие условия среды способствуют фотодыханию?

Краткое резюме по фотодыханию

1. Фотодыхание — это светозависимое поглощение кислорода и выделение СО₂.

2. Оно не имеет никакого отношения к обычному ("темновому") дыханию.

3. Оно происходит в результате того, что рибулозобисфосфат-карбоксилаза взаимодействует не только с СО₂, но и с молекулярным кислородом; в результате образуется совсем ненужный гликолат. Все остальные реакции этого пути служат лишь для возвращения части углерода из гликолата.

4. Две молекулы гликолата (содержащие четыре атома углерода) превращаются в одну молекулу фосфоглицерата (с тремя атомами углерода), и при этом расходуется энергия. Участие кислорода приводит к тому, что четвертый атом углерода бесполезно теряется в виде СО₂.

5. Фотодыхание снижает потенциальную урожайность С₃-растений на 30-40%.

В 1965 г. было показано, что у одного из тропических растений — сахарного тростника — первыми продуктами фотосинтеза, по-видимому, являются кислоты, содержащие четыре атома углерода (яблочная, щавелевоуксусная и аспарагиновая), а не С₃-кислота (фосфоглицериновая), как у хлореллы и у большинства растений умеренной зоны. С тех пор было выявлено много других растений, главным образом тропических (и в том числе имеющих важное хозяйственное значение), у которых наблюдалась точно такая же картина; они были названы С₄-растениями. Из однодольных к ним принадлежат, например, кукуруза (Zed), сорго (Sorghum), сахарный тростник (Sacchamm), просо (Eleusine), а из двудольных — Amaranthus и некоторые виды Euphorbia. Растения, у которых первым продуктом фотосинтеза является С₃-кислота (ФГК), называют С₃-растениями. Биохимию именно таких растений мы до сих пор и рассматривали в этой главе.

В 1966 г. австралийские исследователи Хэтч и Слэк показали, что С₄-растения гораздо эффективнее поглощают двуокись углерода, чем С₃-растения: в экспериментальной камере они снижали концентрацию СО₂ в газовой фазе до 0,1 ч. на млн., а С₃-растения-только до 50-100 ч. на млн. Это говорит о том, что у С₄-растений низкая углекислотная точка компенсации. У таких растений практически незаметно фото дыхание.

Этот новый путь превращений углерода у С₄-растений называют путем Хэтча-Слэка. Хотя этот процесс несколько различен у разных видов, мы рассмотрим, как он идет у типичного С₄-растения — кукурузы. Для С₄-растений характерно особое анатомическое строение листа: все проводящие пучки у них окружены двойным слоем клеток. Хлоропласты клеток внутреннего слоя — обкладки проводящего пучка — отличаются по форме от хлоропластов в клетках мезофилла, из которых состоит наружный слой (диморфизм хлоропластов). На рис. 9.29, А и Б показано, как выглядит эта так называемая "кранц-анатомия" (от нем. Kranz — корона, венец, кольцо; при этом имеются в виду два клеточных слоя, на срезе имеющие вид колец). Ниже мы рассмотрим биохимические реакции С₄-пути (см. рис. 9.30).

Рис. 9.29. А. 'Кранц-анатомия', характерная для С₄-растений. Микрофотография поперечного среза листа росички кроваво-красной (Digitaria sanguinalis), демонстрирующая диморфизм хлоропласте в клетках мезофилла и клетках обкладки проводящих пучков. В клетках мезофилла видны многочисленные граны, а в клетках обкладки проводящих пучков содержатся только отдельные рудиментарные граны. В обоих случаях видны зерна крахмала, × 4000. Б. Электронная микрофотография листа кукурузы. В клетках мезофилла и в клетках обкладки проводящих пучков видны хлоропласты двух типов, × 9900

Рис. 9.30. Упрощенная схема С₄-пути, сопряженного с фиксацией двуокиси углерода. Показано, как двуокись углерода попадает из воздуха в клетки обкладки проводящих пучков и как происходит ее окончательная фиксация в составе С₃-кислоты — ФГК

Путь Хэтча-Слэка

Это путь, связанный с транспортировкой СО₂ и водорода из клеток мезофилла в клетки обкладки проводящего пучка. В этих клетках двуокись углерода фиксируется точно так же, как и у С₃-растений (рис. 9.30), а водород используется для ее восстановления.

Фиксация двуокиси углерода в клетках мезофилла. СО₂ фиксируется в цитоплазме клеток мезофилла в соответствии с уравнением:

Акцептором СО₂ служит фосфоенолпируват (ФЕП), а не рибулозобисфосфат (РиБФ), а вместо РиБФ-карбоксилазы в этой реакции участвует ФЕП-карбоксилаза. У этого фермента есть два громадных преимущества перед РиБФ-карбоксилазой. Во-первых, у него более высокое сродство к СО₂, и, во-вторых, он не взаимодействует с кислородом и поэтому не участвует в фотодыхании. Образующийся оксалоацетат превращается в малат или аспартат, которые содержат по 4 атома углерода. У этих кислот две карбоксильные (-СООН) группы, т. е. это дикарбоновые кислоты.

Малатный шунт. Через плазмодесмы в клеточных стенках малат переходит в хлоропласты клеток обкладки проводящих пучков. Там он используется для образования СО₂ (путем декарбоксилирования), водорода (за счет окисления) и пиру вата. Выделяющийся при этом водород восстанавливает НАДФ до НАДФ·Н₂.

Регенерация акцептора СО₂. Пируват возвращается в клетки мезофилла и используется там для регенерации ФЕП путем присоединения фосфатной группы от АТФ к пирувату. На это расходуется энергия двух высокоэнергетических фосфатных связей.

Итоговая "стоимость" С4-пути

На транспорт СО₂ и водорода из клеток мезофилла в хлоропласты клеток обкладки проводящих пучков расходуются две высокоэнергетические фосфатные связи.

Повторная фиксация двуокиси углерода в клетках обкладки проводящих пучков

В хлоропластах клеток обкладки проводящих пучков образуются СО₂, НАДФ·Н₂ и пируват (см. выше о малатном шунте). Затем СО₂ повторно фиксируется РиБФ-карбоксилазой в обычном С₃-пути, где используется также и НАДФ·Н₂.

Поскольку каждая молекула СО₂ должна связаться дважды, затраты энергии при С₄-фотосинтезе примерно вдвое больше, чем при С₃-фотосинтезе. На первый взгляд транспорт СО₂ в С₄-пути кажется бессмысленным. Однако двуокись углерода настолько эффективно фиксируется ФЕП-карбоксилазой клеток мезофилла, что в клетках обкладки проводящих пучков накапливается очень большое количество СО₂. А это значит, что РиБФ-карбоксилаза работает в более выгодных условиях, чем у С₃-растений, где такой же фермент функционирует при обычной атмосферной концентрации СО₂. Тому есть две причины: во-первых, РиБФ-карбоксилаза, как и любой фермент, более эффективно работает при высокой концентрации субстрата, и, во-вторых, подавляется фотодыхание, так как СО₂ конкурентно вытесняет кислород из активного центра.

Поэтому главное преимущество С₄-фотосинтеза состоит в том, что значительно возрастает эффективность фиксации СО₂, а углерод не теряется бесполезно в результате фотодыхания. Этот путь скорее дополняет, а не заменяет обычный С₃-путь. В результате фотосинтез у С₄-растений более эффективен, так как в обычных условиях скорость фотосинтеза лимитируется скоростью фиксации СО₂. С₄-растения потребляют больше энергии, но энергия, как правило, не бывает лимитирующим фактором фотосинтеза; такие растения обычно растут в странах, где интенсивность освещения очень высока, а хлоропласты у них видоизменены так, чтобы еще лучше использовать доступную им энергию (см. ниже).

Хлоропласты клеток мезофилла и обкладки проводящих пучков

Важнейшие различия между хлоропластами в клетках мезофилла и в клетках обкладки проводящих пучков перечислены в табл. 9.7, отчасти они видны и на рис. 9.29.

Таблица 9.7. Особенности хлоропластов мезофилла и хлоропластов обкладки проводящих пучков у С₄-растений

9.39. Какие хлоропласты лучше приспособлены для световых, а какие — для темновых реакций?

9.40. Почему отсутствие гран в хлоропластах обкладки проводящих пучков дает определенную выгоду?

9.41. Малатный шунт — это фактически насос для перекачки СО₂ и водорода. Какие преимущества он дает?

9.42. а) Как скажется понижение концентрации кислорода на С₃-фотосинтезе? б) А как — на С₄-фотосинтезе? Объясните ваши ответы.

Атмосфера содержит 79% азота. Это довольно инертный элемент, и поэтому он сравнительно редко встречается в связанном состоянии. Азот — необходимый компонент аминокислот и белков. Никакой другой элемент так не ограничивает ресурсы питательных веществ в экосистемах, как азот. Он может стать доступным для живых организмов только в связанной форме, т. е. в результате азотфиксации. Способность связывать азот присуща лишь некоторым прокариотам, но возможно, что с помощью методов генетической инженерии когда-нибудь удастся встроить необходимые для этого гены и в зеленые растения. Круговорот азота в природе представлен на рис. 9.31.

Рис. 9.31. Круговорот азота

Фиксация азота

Для фиксации азота необходима затрата энергии, так как молекула азота состоит из двух атомов, и ее нужно сначала расщепить. У азотфиксаторов в этой реакции участвует специальный фермент нитрогеназа, который использует энергию АТФ. Неферментативное разделение атомов азота возможно только при громадной затрате энергии; это происходит при промышленном получении соединений азота, а в атмосфере — под действием космического излучения или при вспышке молнии.

Азот очень важен для плодородия почвы. А так как потребность в продуктах сельского хозяйства весьма велика, промышленность ежегодно производит колоссальное количество аммиака, который в основном используется для получения таких азотных удобрений, как нитрат аммония (NH₄NO₃) и мочевина [CO(NH₂)₂]. В наши дни искусственным путем получают примерно столько же соединений азота, сколько их образуется в природе. Мы до сих пор как следует не знаем, к чему может привести постепенное накопление соединений азота в биосфере, которое происходит на наших глазах. С некоторыми трудностями мы уже столкнулись: это прежде всего загрязнение озер и рек азотными удобрениями и вызванное им нарушение солевого баланса. Все это может привести к тому, что жизнь в водоемах полностью прекратится.

В атмосфере под действием ионизирующих факторов образуется сравнительно небольшое количество связанного азота (5-10%). Это в основном различные окислы азота; они растворяются в каплях дождя и превращаются в нитраты.

Вероятно, самый богатый естественный источник связанного азота — это бобовые растения, такие, как клевер, соя, люцерна и горох. На их корнях имеются характерные вздутия, называемые клубеньками, которые образуются под воздействием колоний азотфиксирующих бактерий (рода Rhizobium), живущих внутри растительных клеток. Это симбиотическая связь, так как растение получает от бактерий азот в виде аммиака, а бактерии в свою очередь пользуются энергетическими запасами растения и получают от него углеводы и другие питательные вещества. На данном участке земли бобовые растения иногда связывают в 100 раз больше азота, чем свободноживущие почвенные бактерии и сине-зеленые водоросли. Поэтому не удивительно, что бобовые часто используются для обогащения почвы азотом, тем более что это дает двойную выгоду, так как мы получаем еще и корм для скота.

9.43. Фермеры часто говорят, что бобовые "очень жадны к хорошей почве", подразумевая под этим те высокие требования, которые эти растения предъявляют к запасу минеральных веществ в почве. Почему это так и должно быть?

Все азотфиксаторы включают азот в аммиак, но он сразу же используется для образования органических веществ, в основном для синтеза белков.

Распад органического материала и нитрификация

Большинство растений получает нитрат из почвы, а животные в свою очередь должны прямо или опосредованно получать азот от растений. На рис. 9.31 показано, как сапрофитные бактерии и грибы возвращают азот белков, содержащихся в мертвых растениях и животных, в общий круговорот в форме нитратов. Такое превращение происходит в результате последовательного окисления азотистых соединений, а для этого нужны аэробные бактерии и кислород. После гибели живого организма его белки разлагаются до аминокислот, а затем до аммиака. Точно так же расщепляются и азотистые соединения экскрементов и различных выделений животных. Затем хемосинтезирующие бактерии (разд. 9.10) окисляют аммиак до нитрата. Этот процесс называется нитрификацией.

9.44. К какому типу питания вы отнесете бактерии и грибы, которые являются редуцентами?

Денитрификация

Денитрифицирующие бактерии осуществляют процесс, обратный нитрификации, — денитрификацию, которая может уменьшать плодородие почвы. Денитрификация происходит только в анаэробных условиях, когда бактерии используют нитрат как окислитель (акцептор электронов), заменяющий кислород в реакциях окисления органических веществ. Сам нитрат при этом восстанавливается. Такие бактерии относятся к факультативным анаэробам. Не следует думать, что денитрифицирующие бактерии ставят под угрозу существование жизни на Земле. Как полагают, не будь процессов денитрификации, большая часть атмосферного азота находилась бы сейчас в океане или была бы связана в осадочных породах.

9.45. Какие природные условия благоприятны для денитрификации?

9.46. Почему хороший дренаж и вспашка повышают плодородие почвы?

Насекомоядные растения

Насекомоядные (или плотоядные) растения — это зеленые растения, которые специально приспособлены для того, чтобы ловить и затем переваривать различных мелких животных, в основном насекомых. Так они дополняют свое обычное автотрофное питание (фотосинтез) одной из форм гетеротрофного питания. Как правило, такие растения встречаются в местах, бедных азотом, поэтому животная пища им нужна в первую очередь как источник азотистых соединений. Приманив насекомое окраской, ароматом или сладкими выделениями, растение тем или иным способом удерживает его, а затем выделяет специальные ферменты и происходит внеклеточное пищеварение. Образующиеся при этом продукты, прежде всего аминокислоты, всасываются и усваиваются.

У некоторых видов выработались очень интересные ловчие механизмы, это особенно относится к венериной мухоловке (Dionaea muscipula), кувшиночникам (Nepenthes) и росянкам (Drosera). Большинство таких растений обитает в тропиках и субтропиках. В Великобритании их очень мало, примером может служить росянка. Она встречается на мокрых пустошах и торфяниках, заросших вереском, т. е. в тех местах, где почва, как правило, кислая, а минеральных элементов недостаточно. Мы не будем здесь касаться устройства ловушек у разных растений.

Микориза

Микориза — это ассоциация гиф гриба с высшим растением, которая обычно встречается на корнях сосудистых растений. Как и насекомоядные виды, растения с микоризой часто растут в местах, бедных питательными веществами. Связи в микоризе, как правило, симбиотические; мы подробно рассматривали их в разд. 3.1.1.

Корневые клубеньки

В разд. 9.11.1 мы уже говорили, как происходит азотфиксация в корневых клубеньках бобовых растений. Бактерии, обитающие в клубеньках, проникают внутрь клеток паренхимы корня и стимулируют их рост и деление, в результате чего и образуются специфические вздутия — клубеньки.