Биология. В 3-х томах. Т. 1 - читать бесплатно онлайн полную версию книги автора Найджел Грин (Глава 6. Ферменты) #9

Глава 6. Ферменты

Ферменты — это белковые молекулы, синтезируемые живыми клетками. В каждой клетке имеются сотни различных ферментов. С их помощью осуществляются многочисленные химические реакции, которые могут с большой скоростью идти при температурах, подходящих для данного организма, т. е. в пределах от 5 до 40°С. Чтобы эти реакции с той же скоростью протекали вне организма, потребовались бы высокие температуры и резкие изменения некоторых других условий. Для клетки это означало бы гибель, ибо вся работа клетки строится таким образом, чтобы избежать любых сколько-нибудь заметных изменений в нормальных условиях ее существования. Ферменты, следовательно, можно определить как биологические катализаторы, т. е. как вещества, ускоряющие реакции. Они абсолютно необходимы, потому что без них реакции в клетке протекали бы слишком медленно и не могли поддерживать жизнь.

Ферментативные реакции подразделяются на анаболические (реакции синтеза) и катаболические (реакции распада). Совокупность всех этих реакций в живой клетке или в живом организме составляет то, что мы называем метаболизмом. Метаболизм, таким образом, слагается из анаболизма и катаболизма. Примером фермента, участвующего в анаболизме, может служить глутаминсинтетаза:

(АТФ — аденозинтрифосфат; АДФ — аденозиндифосфат; Ф_н — неорганический фосфат). В качестве примера фермента, участвующего в катаболизме, можно назвать мальтазу:

Обычно для того чтобы превратить данное исходное вещество через ряд промежуточных соединений в продукт (или продукты), несколько ферментов действуют последовательно один за другим. Такая последовательность реакций составляет так называемый метаболический путь. В клетке работает одновременно много метаболических путей. Реакции протекают согласованно, подчиняясь строгой регуляции, что объясняется специфической природой ферментов. Один фермент обычно катализирует только одну реакцию. Таким образом, ферменты служат для регулирования происходящих в клетке реакций и обеспечивают надлежащую их скорость.

6.1. Катализ и энергия активации

Биологические катализаторы (т. е. ферменты) характеризуются следующими основными свойствами: все ферменты представляют собой глобулярные белки; они увеличивают скорость реакции, но сами в этой реакции не расходуются; их присутствие не влияет ни на природу, ни на свойства конечного продукта (или продуктов) реакции; очень малое количество фермента вызывает превращение больших количеств субстрата; активность ферментов меняется в зависимости от рН, температуры, давления и от концентраций как субстрата, так и самого фермента; катализируемая реакция обратима; ферменты обладают специфичностью, т. е. один фермент катализирует обычно только одну реакцию.

Представим себе смесь бензина и кислорода. Реакция между этими двумя веществами с термодинамической точки зрения возможна, но она не пойдет без затраты некоторого количества энергии, поступившей, например, в форме простой искры. Энергия, необходимая для того, чтобы заставить субстраты вступить в реакцию, называется энергией активации [Е_а]. Чем больше требуемая энергия активации, тем ниже скорость реакции при данной температуре. Ферменты, действуя как катализаторы, снижают энергию активации, которая требуется для того, чтобы могла произойти реакция (рис. 6.1). Они повышают общую скорость реакции, не изменяя в сколько-нибудь значительной степени температуру, при которой эта реакция протекает.

Рис. 6.1. Энергетические барьеры катализируемой и некатализируемой реакций (см. также приложение 1)

Фермент, соединяясь с субстратом, образует короткоживущий фермент-субстратный комплекс (рис. 6.2). В таком комплексе шансы на то, что реакция произойдет, значительно возрастают. По завершении реакции фермент-субстратный комплекс распадается на продукт (или продукты) и фермент. Фермент в реакции не изменяется: по окончании реакции он остается таким же, каким был до нее, и может теперь взаимодействовать с новой молекулой субстрата:

Рис. 6.2. А. Схематическое изображение фермент-субстратного комплекса (субстрат присоединяется к ферменту в активном центре последнего). Б. Положение аминокислотных остатков, образующих активный центр фермента, в первичной структуре ферментного белка

6.1.1. Механизм действия ферментов

Результаты тщательных исследований показали, что молекулы большинства ферментов во много раз больше, чем молекулы тех субстратов, которые атакует данный фермент, и что в контакт с субстратом в фермент-субстратном комплексе вступает лишь очень небольшая часть молекулы фермента — обычно от 3 до 12 аминокислотных остатков. Эту ее часть называют активным центром фермента. Именно здесь происходит связывание субстрата или субстратов (рис. 6.2). Роль остальных аминокислотных остатков, составляющих основную массу фермента, состоит в том, чтобы обеспечить его молекуле правильную глобулярную форму, которая, как мы увидим далее, очень важна для того, чтобы активный центр фермента мог работать наиболее эффективно (рис. 6.3).

Рис. 6.3. Третичная структура рибонуклеазы. В образовании активного центра участвуют аминокислотные остатки 12 и 119 (остатки гистидина), а также 7 и 41 (остатки лизина). Рибонуклеаза катализирует гидролитическое расщепление рибонуклеиновых кислот до нуклеотидов. (По Kartha, Bello, Harker (1967), Nature, 213, 864.)

Ферменты обладают очень высокой специфичностью. Фишер (Fischer) в 1890 г. высказал предположение, что эта специфичность обусловливается особой формой молекулы фермента, точно соответствующей форме молекулы субстрата (или субстратов). Эту гипотезу часто называют гипотезой "ключа и замка": субстрат сравнивается в ней с "ключом", который точно подходит по форме к "замку", т. е. к ферменту (рис. 6.4).

Рис. 6.4. Фишеровская гипотеза 'ключа и замка' (1890 г.). Последовательность событий при связывании субстрата с ферментом

Фермент-субстратный комплекс — это "активированное" состояние, ведущее к образованию продуктов реакции. Образовавшиеся продукты по форме уже не соответствуют активному центру. Они отделяются от него (поступают в окружающую среду), после чего освободившийся активный центр может принимать новые молекулы субстрата.

В 1959 г. новую интерпретацию гипотезы "ключа и замка" предложил Кошланд (Koshland). На основании данных, позволявших считать ферменты и их активные центры физически более гибкими, чем это казалось вначале, он высказал мысль о динамическом взаимодействии между ферментом и субстратом. Согласно этому представлению, субстрат, соединяясь с ферментом, вызывает какие-то изменения в структуре последнего. Аминокислотные остатки, составляющие активный центр фермента, принимают определенную форму, которая дает возможность ферменту наиболее эффективным образом выполнять свою функцию (рис. 6.5). Эту гипотезу называют гипотезой индуцированного соответствия. Подходящей аналогией в этом случае может служить перчатка, которая при надевании на руку соответствующим образом изменяет свою форму. С выяснением отдельных деталей механизма различных реакций в эту гипотезу вносятся уточнения. Выяснилось, например, что молекулы субстрата в некоторых случаях несколько изменяют свою форму еще до того, как вступить в соединение с ферментом.

Рис. 6.5. Схема, иллюстрирующая кошландовскую гипотезу 'индуцированного соответствия' А Соединяясь с ферментом, субстрат вызывает в нем изменение, в результате которого активные группы фермента сближаются. Б. Более мелкие или более крупные молекулы не способны взаимодействовать с ферментом. (По J. С. Marsden, С. F. Stoneman (1977), Enzymes and equilibria, Heinemann Educational Books.)

6.2. Кофакторы ферментов

Многим ферментам для эффективной работы требуются те или иные небелковые компоненты, называемые кофакторами. Кофакторы были открыты, когда обнаружилось, что есть вещества, присутствие которых совершенно необходимо для проявления каталитической активности ферментов, хотя сами они в отличие от ферментов сохраняют стабильность при довольно высоких температурах. Роль кофакторов могут играть различные вещества — от простых неорганических ионов до сложных органических молекул; в одних случаях они остаются неизменными в конце реакции, в других — регенерируют в результате того или иного последующего процесса. Комплекс фермента с кофактором носит название голофермент, а ферментная часть этого комплекса, без кофактора, называется апоферментом. Кофакторы подразделяются на три типа: неорганические ионы, простетические группы и коферменты. Функцию кофакторов выполняют многие органические молекулы; некоторые из них близки к витаминам. Такая молекула может быть связана с ферментом прочно (в этом случае ее называют простетической группой) или слабо (и тогда ее называют коферментом). И в том и в другом случае эта молекула действует как переносчик групп атомов, отдельных атомов или электронов, которые передаются по всему метаболическому пути от одного метаболита к другому.

6.2.1. Неорганические ионы (активаторы ферментов)

Предполагают, что эти ионы заставляют молекулы фермента или субстрата принять форму, способствующую образованию фермент-субстратного комплекса. Тем самым увеличиваются шансы на то, что фермент и субстрат действительно прореагируют друг с другом, а следовательно, возрастает и скорость реакции, катализируемой данным ферментом. Так, например, активность амилазы слюны повышается в присутствии хлорид-ионов.

6.2.2. Простетические группы (например, ФАД, ФМН, биотин, гем)

Данная органическая молекула занимает такое положение, в котором она может эффективно содействовать каталитической функции своего фермента. Поясним это на примере флавинадениндинуклеотида (ФАД). ФАД содержит рибофлавин (витамин В₂), который является водород-акцепторной частью его молекулы (рис. 6.6). Функция ФАД связана с окислительными путями клетки, в частности с процессом дыхания, в котором ФАД играет роль одного из переносчиков в дыхательной цепи (гл. 11):

Рис. 6.6. Витамин как компонент простетической группы (представлена структура ФАД — флавинадениндинуклеотида)

Конечный результат: 2Н переносятся от А к В. В качестве связующего звена между А и В действует голофермент.

Гем

Гем — это железосодержащая простетическая группа. Его молекула имеет форму плоского кольца, в центре которого находится атом железа (порфириновое кольцо, такое же, как у хлорофилла). Гем выполняет в организме ряд биологически важных функций.

Перенос электронов. В качестве простетической группы цитохромов (см. дыхательную цепь в гл. 11) гем выступает как переносчик электронов. Присоединяя электроны, железо восстанавливается до Fe(II), а отдавая их, окисляется до Fe(III). Гем, следовательно, принимает участие в окислительно-восстановительных реакциях за счет обратимых изменений валентности железа.

Перенос кислорода. Гемоглобин и миоглобин — два гемсодержащих белка, осуществляющих перенос кислорода. Железо находится в них в восстановленной [Fe(II)] форме (разд. 14.13.1).

Каталитическая функция. Гем входит в состав каталаз и пероксидаз, катализирующих расщепление пероксида водорода до кислорода и воды. Содержится он также и в некоторых других ферментах.

6.2.3. Коферменты (например, НАД, НАДФ, кофермент А, АТФ)

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) (рис. 6.7)

Рис. 6.7. Витамин как компонент кофермента (представлены структуры НАД, НАДФ и АТФ)

НАД — производное витамина, известного под названием "никотиновая кислота", — может существовать как в окисленной, так и в восстановленной форме. В окисленной форме НАД при катализе играет роль акцептора водорода:

где е₁ и е₂ — две различные дегидрогеназы.

Конечный результат: 2Н переносятся от А к В. Здесь в качестве связующего звена между двумя различными ферментными системами е₁ и е₂ действует кофермент.

6.3. Скорость ферментативных реакций

Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта.

Скорость определяют по углу наклона касательной к кривой на начальной стадии (а на рис. 6.8) реакции. Чем круче наклон, тем больше скорость. Со временем скорость реакции обычно снижается, по большей части в результате снижения концентрации субстрата (см. следующий раздел).

Рис. 6.8. Скорость ферментативной реакции

6.4. Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций

При изучении влияния какого-либо фактора на скорость ферментативной реакции все прочие факторы должны оставаться неизменными и по возможности иметь оптимальное значение. Измерять следует только начальные скорости, как указано выше.

6.4.1. Концентрация фермента

При высокой концентрации субстрата и при постоянстве других факторов, таких, как температура и рН, скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента (рис. 6.9). Катализ осуществляется всегда в условиях, когда концентрация фермента гораздо ниже концентрации субстрата. Поэтому с возрастанием концентрации фермента растет и скорость ферментативной реакции.

Рис. 6.9. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента

Опыт 6.1. Изучение влияния концентрации фермента на гидролиз сахарозы, катализируемый сахаразой (инвертазой)

Материалы и оборудование

2%-ный раствор сахарозы

1, 0,75 и 0,5%-ный растворы сахаразы (инвертазы)

Реактив Бенедикта

12 пробирок со штативом

Водяные бани с температурой 38 и 100°С

Стеклянные палочки

Таймер

Дистиллированная вода

Этикетки

Бунзеновская горелка

Методика

1. Добавьте 2 мл прозрачного синего реактива Бенедикта к 2 мл прозрачного бесцветного 1%-ного раствора сахаразы. Нагрейте смесь на водяной бане при 100°С в течение 5 мин (реакция Бенедикта).

2. Повторите процедуру 1 с 2 мл прозрачного бесцветного 2%-ного раствора сахарозы, а затем с 2 мл дистиллированной воды.

3. 5 мл 1%-ного раствора сахаразы доведите до кипения.

4. В восемь чистых сухих пробирок с этикетками 1-8 влейте по 1 мл реактива Бенедикта.

5. Влейте 5 мл 2%-ного раствора сахарозы в пробирку с этикеткой S и поместите на водяную баню, в которой на протяжении всего эксперимента поддерживается температура 38°С.

6. Влейте 5 мл 1%-ного раствора сахаразы в пробирку с этикеткой Е и поместите на водяную баню с температурой 38°С.

7. Выдержите обе пробирки вместе с их содержимым на водяной бане в течение 5 мин для того, чтобы они приобрели нужную температуру.

8. Добавьте раствор фермента к раствору сахарозы и переверните пробирку, чтобы хорошо перемешать эти два раствора.

9. Сразу же включите отсчет времени и вновь поставьте пробирку, содержащую реакционную смесь, на водяную баню.

10. В течение всего опыта непрерывно перемешивайте реакционную смесь.

11. После 30 с инкубации перенесите 1 мл смеси в пробирку 1.

12. С интервалами в 30 с отберите такие же пробы и перенесите их по очереди в пробирки 2-8.

13. Нагрейте пробирки 1-8 на водяной бане с температурой 100°С в течение 5 мин. Отметьте время первого появления кирпично-красного осадка, свидетельствующего о положительной реакции на редуцирующий сахар.

14. Повторите тот же эксперимент, использовав на этот раз прокипяченный раствор фермента (см. п. 3).

15. Повторите всю последовательность процедур дважды: с 0,75%-ным и 0,5%-ным растворами сахаразы.

16. Зафиксируйте наблюдения и объясните полученные результаты.

6.4.2. Концентрация субстрата

При данной концентрации фермента скорость ферментативной реакции возрастает с увеличением концентрации субстрата (рис. 6.10). Теоретическая максимальная скорость реакции V_max никогда не достигается, но наступает момент, когда дальнейшее увеличение концентрации субстрата уже не влечет за собой сколько-нибудь заметного изменения скорости реакции. Это следует объяснить тем, что при высоких концентрациях субстрата активные центры молекул фермента в любой данный момент оказываются практически насыщенными. Таким образом, сколько бы ни было в наличии избыточного субстрата, он может соединиться с ферментом лишь после того, как образовавшийся ранее фермент-субстратный комплекс диссоциирует на продукт и свободный фермент. Поэтому при высоких концентрациях субстрата скорость ферментативной реакции лимитируется и концентрацией субстрата, и временем, которое требуется для диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Рис. 6.10. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

6.4.3. Температура

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции может быть выражено через температурный коэффициент Q₁₀:

В пределах 0-40°С Q₁₀ ферментативной реакции равен 2. Иными словами, при каждом повышении температуры на 10°С скорость ферментативной реакции удваивается. С повышением температуры движение молекул ускоряется, и у молекул реагирующих веществ оказывается больше шансов столкнуться друг с другом. Увеличивается, следовательно, и вероятность того, что реакция между ними произойдет. Температура, обеспечивающая наибольшую активность, называется оптимальной температурой. За пределами этого уровня скорость ферментативной реакции снижается, несмотря на увеличение частоты столкновений. Происходит это вследствие разрушения вторичной и третичной структур фермента, иными словами, вследствие того, что фермент претерпевает денатурацию (рис. 6.11).

Рис. 6.11. Влияние температуры на активность такого фермента, как амилаза слюны

6.1. Объясните, каким образом денатурация фермента может повлиять на его каталитическую активность.

Когда температура приближается к точке замерзания или оказывается ниже ее, ферменты инактивируются, но денатурации при этом не происходит. С повышением температуры их каталитическая активность вновь восстанавливается.

В наше время для длительного хранения пищевых продуктов широко используют такой способ, как быстрое их замораживание. Оно предотвращает рост и размножение микроорганизмов, а также инактивирует их пищеварительные ферменты, так что они оказываются уже не в состоянии вызвать разложение пищевых продуктов. Инактивируются также и ферменты, находящиеся в самих пищевых продуктах. Замороженные продукты не должны размораживаться до того момента, как они понадобятся.

Опыт 6.2. Изучение распределения каталазы в намоченных семенах гороха и влияния температуры на активность этого фермента

Каталаза — это фермент, катализирующий разложение пероксида водорода с образованием молекулярного кислорода, выделяющегося в виде пузырьков газа:

Пероксид водорода образуется в некоторых растительных и животных клетках в качестве побочного продукта метаболизма. Соединение это токсично для клеток, и каталаза обеспечивает эффективное его удаление. Каталаза — один из наиболее быстро работающих ферментов: при 0°С одна молекула каталазы разлагает в 1 с до 40000 молекул пероксида водорода. Локализуется каталаза в микротельцах (гл. 7) и пероксисомах (гл. 7 и 9).

Материалы и оборудование

Горсть намоченного гороха

Раствор пероксида водорода

Пробирки со штативом

Водяные бани с температурой 40, 60, 70, 80 и 100°С

Часы

Термометр

Скальпели, ножницы и пинцеты

Держатель для пробирок

Стеклянная палочка

Белая кафельная плитка

Методика

1. Убедитесь в наличии каталазы. Для этого разомните одну горошину и нанесите на нее несколько капель пероксида водорода.

2. Снимите с гороха кожуру и проверьте на каталазу по отдельности кожуру и семядоли.

3. Поставьте две пробирки с дистиллированной водой на водяную баню с температурой 40°С.

4. Прокипятите в отдельной пробирке три целые горошины, а затем поместите их в одну из пробирок на водяной бане.

5. В другую пробирку на водяной бане положите три горошины, не подвергавшиеся кипячению.

6. Выдержите пробирки на водяной бане в течение времени, достаточного для того, чтобы они приняли ее температуру (около 10 мин).

7. Проверьте каждую из горошин на каталазную активность.

8. Повторите тот же эксперимент при 50, 60, 70, 80 и 100°С.

9. Зафиксируйте наблюдения и объясните полученные результаты.

6.2. Ознакомьтесь с рис. 6.12. Что вы можете сказать по поводу формы трех кривых, описывающих ход ферментативной реакции при разных температурах?

Рис. 6.12. Ход ферментативной реакции при разных температурах

6.4.4. рН

При постоянной температуре любой фермент работает наиболее эффективно в узких пределах рН. Оптимальным считается то значение рН, при котором реакция протекает с максимальной скоростью (рис. 6.13 и табл. 6.1). При более высоких и более низких рН активность фермента снижается. Сдвиг рН меняет заряд ионизированных кислотных и основных групп, от которого зависит специфичная форма молекул фермента (разд. 5.5.4). В результате изменяется форма молекул фермента, и в первую очередь форма его активного центра. При слишком резких сдвигах рН фермент денатурирует. Свойственный данному ферменту оптимум рН не всегда совпадает с рН его непосредственного внутриклеточного окружения. Это позволяет предположить, что среда, в которой находится фермент, в какой-то мере регулирует его активность.

Рис. 6.13. Зависимость активности фермента от рН

Таблица 6.1. Оптимумы рН для некоторых ферментов

Опыт 6.3. Изучение влияния различных значений рН на активность фермента

Материалы и оборудование

Реактив Бенедикта

Буферные растворы с рН 3, 5, 7, 9 и 11

1%-ный раствор крахмала

Водяная баня с температурой 38°С

Бунзеновская горелка

Асбест

Держатель для пробирок, штатив с пробирками

Градуированные пипетки на 5 мл

Термометр

Таймер

Дистиллированная вода

Исходный раствор слюны

Амилаза (такая же, как та, которая содержится в слюне)

Методика

1. Сполосните рот 5 мл дистиллированной воды и выплюньте эту воду.

2. Наберите в рот 10 мл дистиллированной воды, пополощите в течение 1 мин и эту жидкость соберите.

3. Доведите объем этого раствора амилазы слюны до 40 мл дистиллированной водой.

4. Проверьте растворы амилазы, крахмала и буферные растворы на присутствие в них редуцирующих Сахаров с помощью реактива Бенедикта.

5. Пометьте этикеткой "рН 3" одну из пробирок и внесите в нее 2 мл раствора крахмала.

6. Добавьте в ту же пробирку 2 мл буферного раствора с рН 3 и тщательно перемешайте оба раствора.

7. Прокипятите не менее 4 мл раствора фермента и влейте 4 мл этого раствора в пробирку с соответствующей этикеткой.

8. В другую пробирку, также снабженную этикеткой, влейте 4 мл раствора фермента, не подвергавшегося кипячению; поставьте все три пробирки на водяную баню и выждите некоторое время (около 1 мин) для того, чтобы они успели нагреться до 38°С.

9. Влейте небольшое количество реактива Бенедикта в каждую из 11 пробирок и пометьте их цифрами 1-11.

Три следующие операции (10-12) провести очень быстро:

10. Когда растворы на водяной бане примут ее температуру, влейте забуференный раствор крахмала в некипяченый раствор фермента.

11. Хорошо перемешайте оба раствора, переворачивая пробирку, а затем снова поставьте пробирку на водяную баню.

12. Включите отсчет времени и сразу же перенесите небольшое количество реакционной смеси (примерно равное по объему взятому реактиву Бенедикта) в пробирку 1.

13. На протяжении всего опыта энергично встряхивайте смесь.

14. По истечение 1 мин перенесите в пробирку 2 вторую порцию реакционной смеси (приблизительно того же объема, что и первая).

15. Повторяйте ту же процедуру с интервалами 1 мин в течение еще 9 мин (т. е. заполните отобранными пробами пробирки 3-11).

16. Отметьте для пробирок 1-11 продолжительность инкубации, требуемой для появления первых признаков положительной реакции Бенедикта (выпадения кирпично-красного осадка).

17. Повторите тот же опыт с прокипяченным раствором фермента, начиная от п. 7.

18. Повторите весь опыт целиком с каждым из остальных буферных растворов.

19. Постройте график зависимости времени гидролиза от рН и объясните полученные результаты.

6.3. а) Укажите оптимальное значение активности фермента В на рис. 6.14.

Рис. 6.14. Влияние рН на активность трех ферментов — А, В, и С

б) Назовите в качестве примера какие-либо известные вам ферменты, активность которых могла бы характеризоваться: 1) кривой А и 2) кривой В.

в) Почему активность фермента С снижается между рН 8 и 9?

г) Почему регуляция активности ферментов путем изменения рН важна in vivo?

д) К раствору пероксида водорода добавляли при разных значениях рН по 1 мл раствора каталазы и отмечали время, за которое удавалось собрать 10 мл О₂. При этом были получены следующие результаты:

Представьте эти результаты в виде графика и объясните их.

6.5. Ингибирование ферментов

Известны различные низкомолекулярные соединения, которые могут тормозить ферментативные реакции. Такие соединения называются ингибиторами ферментов. Ингибирование бывает обратимым и необратимым.

6.5.1. Обратимое ингибирование

При определенных условиях ингибитор может быть легко отделен от фермента.

Конкурентное обратимое ингибирование

В этом случае вещество, по своей структуре близкое к обычному субстрату фермента, соединяется с активным центром фермента, но не может прореагировать с ним. Находясь здесь, оно преграждает доступ к активному центру любой молекуле настоящего субстрата. Поскольку в этом случае ингибитор и субстрат конкурируют за место на активном центре фермента, эту форму ингибирования называют конкурентным ингибированием. Оно обратимо, так как при увеличении концентрации субстрата скорость реакции возрастает.

6.4. Почему при этих условиях скорость реакции возрастет?

Рис. 6.15 иллюстрирует один из примеров конкурентного ингибирования.

Рис. 6.15. Пример конкурентного ингибирования. А. Фермент сукцинатдегидрогеназа катализирует превращение янтарной кислоты в фумаровую. Б. Конкурентное ингибирование фермента малоновой кислотой

Явление конкурентного ингибирования используется в химиотерапии. Цель химиотерапии — уничтожить при помощи тех или иных химических препаратов возбудителя болезни, не повреждая при этом ткани организма-хозяина. Во время второй мировой войны для борьбы с инфекционными заболеваниями широко применялись сульфаниламидные препараты, или сульфаниламиды, — производные сульфаниловой кислоты. Сульфаниламиды по своей химической структуре близки к парааминобензойной кислоте (ПАБК) — необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК требуется бактериям для синтеза фолиевой кислоты, которая служит у них кофактором фермента. Действие сульфаниламидов связано с нарушением синтеза фолиевой кислоты из ПАБК.

Животные клетки не чувствительны к сульфаниламидам, хотя им для некоторых реакций и требуется фолиевая кислота. Объясняется это тем, что они используют преобразованную фолиевую кислоту; метаболический путь, который обеспечивал бы ее синтез, у животных отсутствует.

Неконкурентное обратимое ингибирование

Ингибиторы этого рода не родственны по своей структуре субстрату данного фермента; в образовании комплекса с ингибитором участвует в этом случае не активный центр фермента, а какая-нибудь другая часть его молекулы (рис. 6.16). Образование комплекса влечет за собой изменение глобулярной структуры фермента, и, хотя настоящий субстрат при этом к ферменту все же присоединяется, катализ тем не менее оказывается невозможным. В качестве примера можно привести цианид. Он связывается с ионами металлов, выполняющими у некоторых ферментов роль простетической группы (в частности, с ионами меди цитохромоксидазы), и подавляет активность этих ферментов. С повышением концентрации ингибитора скорость ферментативной реакции все более снижается. К моменту насыщения ингибитором она оказывается практически равной нулю.

Рис. 6.16. Проявление неконкурентного ингибирования. А. Нормальная реакция. Б. Неконкурентное ингибирование

6.5.2. Необратимое ингибирование

Рис. 6.17. Необратимое ингибирование фермента йодуксусной кислотой

Некоторые ферменты полностью ингибируются очень малыми концентрациями ионов тяжелых металлов, например ионов ртути (Hg²⁺), серебра (Ag⁺) и мышьяка (As⁺), или йодуксусной кислотой. Эти вещества необратимо соединяются с сульфгидрильными группами (-SH) и вызывают осаждение ферментного белка.

6.5. Как повышение концентрации субстрата должно повлиять на скорость реакции между ингибитором этого типа и субстратом?

Диизопропилфторфосфат (ДФФ) — соединение из группы нервнопаралитических отравляющих веществ — образует фермент — ингибиторный комплекс, связываясь с остатком аминокислоты серина, находящимся в активном центре фермента ацетилхолинэстеразы. Этот фермент инактивирует ацетилхолин, играющий роль нейромедиатора. Одна из функций ацетилхолина заключается в обеспечении передачи нервного импульса от одного нейрона к другому через синаптическую щель (разд. 16.1). Почти сразу после передачи очередного импульса ацетилхолинэстераза инактивирует ацетилхолин, расщепляя его на холин и уксусную кислоту. Освободившийся нейрон готов к передаче следующего импульса. Если ацетилхолинэстераза ингибирована, то ацетилхолин накапливается, нервные импульсы следуют один за другим и мышца длительное время не расслабляется. В конце концов наступает паралич или смерть. Некоторые из применяемых в настоящее время инсектицидов (например, паратион) оказывают такое же действие на насекомых.

6.6. Аллостерические ферменты

Аллостерическими называют ферменты, активность которых регулируется не их субстратами, а другими веществами, присоединяющимися к ферментам в особых участках, удаленных от их активного центра. Эти вещества влияют на активность фермента, вызывая обратимое изменение в структуре его активного центра. Называются такие вещества аллостерическими эффекторами. В зависимости от характера влияния, которое они оказывают, увеличивая или уменьшая сродство фермента к субстрату, эффекторы подразделяются на аллостерические активаторы (ускоряющие реакцию) и аллостерические ингибиторы (тормозящие реакцию). Примером аллостерического фермента может служить фосфофруктокиназа, катализирующая фосфорилирование фруктозо-6-фосфата с образованием фруктозо-1,6-бисфосфата. Эта реакция протекает во время гликолиза, составляющего одну из стадий процесса дыхания. АТФ, если его концентрация высока, аллостерически ингибирует фосфофруктокиназу. Когда же клеточный метаболизм усиливается, а значит, расходуется АТФ и его общая концентрация падает, данный метаболический путь снова вступает в действие (рис. 6.18 и 6.19).

Рис. 6.18. Возможный механизм аллостерического воздействия АТФ на фосфофруктокиназу. (По D. Harrison (1975), Patterns in Biology, Arnold.)

Рис. 6.19. Схема, поясняющая, как работает аллостерический фермент

6.6.1. Ингибирование конечным продуктом (ингибирование по принципу отрицательной обратной связи — ретроингибирование)

Когда конечный продукт какого-либо метаболического пути начинает накапливаться, он может действовать как аллостерический ингибитор на фермент, контролирующий первый этап этого пути. При этом снижается сродство данного фермента к его субстрату и соответственно уменьшается или вовсе приостанавливается дальнейшее образование самого конечного продукта. Это явление — ингибирование конечным продуктом (рис. 6.20) — представляет собой пример механизма, регулирующего один из аспектов метаболической активности по принципу отрицательной обратной связи (разд. 18.1).

Рис. 6.20. Ингибирование конечным продуктом. Специфические ферменты, катализирующие отдельные этапы данного метаболического пути, обозначены буквами e₁-e₄

6.7. Регуляция метаболизма

В типичной клетке содержится свыше 500 различных ферментов. Их активность и концентрация все время колеблются. Как же в таком случае осуществляется регулирование и как достигается согласованность всего процесса метаболизма? Ответ на этот вопрос следует искать в специфичности действия ферментов, в их пространственной организации и в их функциональном взаимодействии с другими клеточными компонентами. В клетке существует два типа метаболических путей, на которых четко прослеживаются перечисленные особенности: линейные и разветвленные метаболические пути.

6.7.1. Линейный метаболический путь

Некоторые ферменты действуют организованно, будучи объединены друг с другом в мультиферментные комплексы. Обычно такие ферменты связаны с мембранами (рис. 6.21, А). Линейное расположение ферментов создает возможность для саморегуляции путем ингибирования по принципу отрицательной обратной связи, так что скорость данного метаболического пути регулируется концентрацией его конечного продукта. Такая тесная связь, кроме того, снижает до минимума воздействия других реакций. Каждый фермент взаимосвязан с соседними: продукт одного из них становится субстратом следующего фермента в цепи и так продолжается до тех пор, пока процесс не завершится образованием конечного продукта.

Рис. 6.21. Мультиферментные системы. А. Мультиферментная система, связанная с мембраной. Б. Диссоциированная мультиферментная система, продуктами которой в зависимости от условий в клетке могут быть В, С, D и Е

6.7.2. Разветвленный метаболический путь

Такой путь может привести к разным конечным продуктам. Какой именно из них образуется, зависит от условий, существующих в клетке в данный момент (рис. 6.21, Б). Ингибирование по принципу обратной связи участвует в регулировании образования конечного продукта. Здесь также действуют мультиферментные системы, однако ферменты находятся в растворе и тесно друг с другом не связаны.

6.6. Ниже изображена мультиферментная система:

а) Известно, что е₁ специфичен для А и что конечный продукт X ингибирует e₁. Зная это, что можно сказать о том, в каких участках молекулы фермента связываются А и X?

б) Как может избыток X регулировать данный метаболический путь?

в) Как называется тип регуляции, действующей в этой системе?

г) Почему на любом метаболическом пути должно действовать несколько ферментов?

6.7. Перечислите характерные свойства ферментов.

Таблица 6.2. Некоторые примеры использования ферментов в промышленности[21]

6.8. Классификация ферментов

В 1961 г. специальной комиссией Международного биохимического союза была предложена систематическая номенклатура ферментов. Ферменты были подразделены на шесть групп в соответствии с общим типом реакции, которую они катализируют. Каждый фермент получил систематическое наименование, точно описывающее катализируемую им реакцию. Однако, поскольку многие из этих систематических названий оказались очень длинными и сложными, каждому ферменту было присвоено также и "тривиальное", рабочее название, предназначенное для повседневного употребления. Рабочее название состоит из названия субстрата, на который действует данный фермент, указания на тип катализируемой реакции и окончания "-аза". (Пример: рибулозобисфосфаткарбоксилаза; здесь субстрат-рибулозобисфосфат (+ СО₂), а тип реакции — карбоксилирование (добавление СО₂). Классификация ферментов по группам приведена в табл. 6.3.)