Биология. В 3-х томах. Т. 1

Строение типичной бактериальной клетки показано на рис. 2.3. На рис. 2.4 представлена электронная микрофотография среза палочковидной бактерии. Можно видеть, насколько просто устроена бактериальная клетка, особенно если сравнить ее с клетками эукариот (рис. 7.5 и 7.6).

Рис. 2.3. Обобщенная схема строения клетки палочковидной бактерии. Справа перечислены структуры, встречающиеся в каждой клетке, слева — встречающиеся не во всех клетках. Жгутик бывает один, как у Rhizobium, или несколько, как у Azotobacter; обычно он длиннее клетки. Капсула может быть слизистой, как у Azotobacter; если капсула рыхлая, то она называется слизистым слоем. Трубчатые или мешковидные фотосинтетические мембраны, содержащие пигменты, представляют собой впячивания плазматической мембраны; у фотосинтезирующих бактерий, например у Chromatium, такие мембраны рассеяны по всей цитоплазме. Число пилей, или фимбрий, может достигать от одной до нескольких сотен, как, например, у Escherichia coli, Salmonella. Мезосома представляет собой многоскладчатое впячивание плазматической мембраны, как, например, у Bacillus subtilis. Клеточная стенка жесткая и содержит муреин. Рибосомы, располагающиеся по всей цитоплазме, по размеру меньше, чем у эукариот. Из запасных питательных веществ в бактериальных клетках можно обнаружить липиды, гликоген, полифосфаты (волютиновые гранулы). Цитоплазма не содержит никаких органелл; содержит ферменты и т. п

Рис. 2.4. Электронная микрофотография среза типичной палочковидной бактерии Bacillus subtilis. В светлых зонах находится ДНК. × 50000

Капсулы и слизистые слои

Капсулы и слизистые слои — это слизистые или клейкие выделения некоторых бактерий; такие выделения хорошо видны после негативного контрастирования (когда окрашивают не препарат, а фон). Капсула представляет собой относительно толстое и компактное образование, а слизистый слой намного рыхлее. В некоторых случаях слизь служит для формирования колоний из отдельных клеток. И капсула, и слизистые слои служат дополнительной защитой для клеток. Так, например, инкапсулированные штаммы пневмококков свободно размножаются в организме человека и вызывают воспаление легких, а некапсулированные штаммы легко атакуются и уничтожаются фагоцитами и поэтому совершенно безвредны.

Клеточная стенка

Клеточная стенка придает клетке определенную форму и жесткость. Ее хорошо видно на срезе (рис. 2.4). Как и у растений, клеточная стенка бактерий препятствует осмотическому набуханию и разрыву клеток, когда они, как это часто случается, попадают в гипотоническую среду (Приложение разд. П.1.5). Вода, другие малые молекулы и разные ионы легко проникают через крошечные поры в клеточной стенке, но через них не проходят крупные молекулы белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, клеточная стенка обладает антигенными свойствами, которые ей придают содержащиеся в ней белки и полисахариды.

По строению клеточной стенки бактерий можно разделить на две группы. Одни окрашиваются по Граму, поэтому их называют грамположительными, а другие обесцвечиваются при отмывке красителя (разд. 2.7), и поэтому их называют грамотрицательными. В клеточной стенке и тех и других есть особая жесткая решетка, состоящая из муреина. Молекула муреина представляет собой правильную сеть из параллельно расположенных полисахаридных цепей, сшитых друг с другом короткими цепями пептидов. Таким образом, каждая клетка окружена сетевидным мешком, составленным всего из одной молекулы. (Полисахаридная часть муреина описана в табл. 5.7).

У грамположительных бактерий, например у Lactobacillus, в муреиновую сетку встроены другие вещества, главным образом полисахариды и белки. Так вокруг клетки создается сравнительно толстая и жесткая упаковка. У грамотрицательных бактерий, скажем у Escherichia coli или у Azotobacter, клеточная стенка гораздо тоньше, но устроена она сложнее. Муреиновый слой у этих бактерий снаружи покрыт мягким и гладким слоем липидов. Это защищает их от лизоцима. Лизоцим обнаружен в слюне, слезах и других биологических жидкостях, а также в белке куриного яйца. Он катализирует гидролиз определенных связей между остатками углеводов и таким образом расщепляет полисахаридную основу муреина. Клеточная стенка разрывается, и, если клетка находится в гипотоническом растворе, происходит ее лизис (клетка осмотически набухает и лопается). Липидный слой придает клетке устойчивость и к пенициллину. Этот антибиотик препятствует образованию сшивок в клеточной стенке грамположительных бактерий, что делает растущие клетки более чувствительными к осмотическому шоку.

Жгутики

Многие бактерии подвижны, и эта подвижность обусловлена наличием у них одного или нескольких жгутиков. Жгутики у бактерий устроены гораздо проще, чем у эукариот (разд. 17.6.2, табл. 2.1), и по своей структуре напоминают одну из микротрубочек эукариотического жгутика. Жгутики состоят из одинаковых сферических субъединиц белка флагеллина (похожего на мышечный актин), которые расположены по спирали и образуют полый цилиндр диаметром около 10-20 нм. Несмотря на волнистую форму жгутиков, они довольно жестки.

Жгутики приводятся в движение посредством уникального механизма. Основание жгутика, по-видимому, вращается так, что жгутик как бы ввинчивается в среду, не совершая беспорядочных биений, и таким образом продвигает клетку вперед. Это, очевидно, единственная известная в природе структура, где используется принцип колеса. Другая интересная особенность жгутиков — это способность отдельных субъединиц флагеллина спонтанно собираться в растворе в спиральные нити. Спонтанная самосборка — очень важное свойство многих сложных биологических структур. В данном случае самосборка целиком обусловлена аминокислотной последовательностью (первичной структурой) флагеллина.

Подвижные бактерии могут передвигаться в ответ на определенные раздражители, т. е. они способны к таксису. Так, например, аэробные бактерии обладают положительным аэротаксисом (т. е. плывут туда, где среда богаче кислородом), а подвижные фотосинтезирующие бактерии — положительным фототаксисом (т. е. плывут к свету).

Жгутики легче всего рассмотреть в электронном микроскопе (рис. 2.5), применив технику напыления металлом (разд. П.2.5).

Рис. 2.5. Микрофотография палочковидной бактерии, полученная с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Хорошо видны клеточная стенка, фимбрии и длинные волнистые жгутики, × 28000

Пили, или фимбрии

На клеточной стенке некоторых грамотрицательных бактерий видны тонкие выросты (палочковидные белковые выступы), которые называются пили или фимбрии (рис. 2.5). Они короче и тоньше жгутиков и служат для прикрепления клеток друг к другу или к какой-нибудь поверхности, придавая специфическую "липкость" тем штаммам, которые ими обладают. Пили бывают разного типа. Наиболее интересны так называемые F-пили, которые кодируются специальной плазмидой (разд. 2.2.4) и связаны с половым размножением бактерий.

Плазматическая мембрана, мезосомы и фотосинтетические мембраны

Как у всех клеток, протоплазма бактерий окружена полупроницаемой мембраной. По структуре и функциям плазматические мембраны бактерий не отличаются от мембран эукариотических клеток (разд. 7.2.1). У некоторых бактерий плазматическая мембрана впячивается внутрь клетки и образует мезосомы и (или) фотосинтетические мембраны.

Мезосомы — складчатые мембранные структуры (рис. 2.3 и 2.4), на поверхности которых находятся ферменты, участвующие в процессе дыхания. Следовательно, мезосомы можно назвать примитивными органеллами. Во время клеточного деления мезосомы связываются с ДНК, что, по-видимому, облегчает разделение двух дочерних молекул ДНК после репликации и способствует образованию перегородки между дочерними клетками.

У фотосинтезирующих бактерий в мешковидных, трубчатых или пластинчатых впячиваниях плазматической мембраны находятся фотосинтетические пигменты (в том числе бактериохлорофилл). Сходные мембранные образования участвуют и в фиксации азота.

Генетический материал

ДНК бактерий представлена одиночными кольцевыми молекулами длиной около 1 мм. Каждая такая молекула состоит примерно из 5·10⁶ пар нуклеотидов. Суммарное содержание ДНК (геном) в бактериальной клетке намного меньше, чем в эукариотической, а следовательно, меньше и объем закодированной в ней информации. В среднем такая ДНК содержит несколько тысяч генов, что примерно в 500 раз меньше, чем в клетке человека (см. также табл. 2.1 и рис. 2.3).

Рибосомы

См. табл. 2.1 (биосинтез белка) и рис. 2.3.

Споры

Некоторые бактерии (в основном принадлежащие к роду Clostridium или Bacillus) образуют эндоспоры, т. е. споры, находящиеся внутри клетки. Эндоспоры — толстостенные долгоживущие образования, крайне устойчивые к нагреванию и коротковолновому излучению. Они по-разному располагаются внутри клетки, что служит очень важным признаком для идентификации и систематики таких бактерий (рис. 2.6). Если покоящаяся, устойчивая структура образуется из целой клетки, то она называется цистой. Цисты образуют некоторые виды Azotobacter.

Рис. 2.6. Различные формы бактерий на примере нескольких наиболее распространенных типов полезных и болезнетворных микробов.

А. Кокки (сферические)

Кокки

Стафилококки (напоминают виноградную гроздь)

Пример — Staphylococcus aureus, живущий в носоглотке; разные штаммы стафилококков вызывают фурункулез, воспаление легких, пищевые отравления и другие заболевания.

Стрептококки (образуют цепочки клеток)

Пример — многие виды Streptococcus; некоторые вызывают инфекционные заболевания верхних дыхательных путей; например, S. pyogenes вызывает ангину и скарлатину; S. thermophilus придает йогурту его пикантный вкус; S. lactis — см. разд. 2.3.4

Диплококки (две клетки в одной капсуле)

К этому роду относятся елинственный вид Diplococcus pneumoniae (пневмококк), возбудитель пневмонии[3].

Б. Бациллы (палочковидные)

Одиночные палочки

Примеры — Escherichia coli (обычный кишечный симбионт); Lactobacillus см. разд. 2.3.4; Salmonella typhi — возбудитель брюшного тифа.

Палочки, образующие цепочки клеток

Примеры — Azotobacter, азотфиксирующая бактерия; Bacillus anthracis — возбудитель сибирской язвы.

Бациллы с эндоспорами (споры находятся в разном положении, имеют разные размеры и форму)

Овальная спора

Находится в центре и не вызывает набухания клетки, например у Bacillus anthracis — возбудителя сибирской язвы.

Сферическая спора

Находится на конце материнской клетки, придает ей характерную форму барабанной палочки, например у Clostridium tetani — возбудителя столбняка.

Сферическая спора

Спора находится в субтерминальном положении, вызывая набухание клетки, например у Clostridium botulinum (споры могут занимать и центральное положение) — возбудителя смертельного пищевого отравления — ботулизма.

В. Спириллы (спиралевидные)

Спиральная палочка с одним жгутиком

Пример — Spirillum; Форма клеток у спирохет очень схожа, но есть различия по спосубу передвижения, например Treponema pallidum — возбудитель сифилиса.

Г. Вибрионы (короткие палочки, всегда изогнутые в виде запятой)

Вибрион

Пример — Vibrio cholerae — возбудитель холеры; имеет один жгутик.

Индивидуальный рост и бесполое размножение клеток

Отношение поверхность/объем у бактериальных клеток очень велико. Это способствует быстрому поглощению питательных веществ из окружающей среды за счет диффузии и активного транспорта. В благоприятных условиях бактерии растут очень быстро. Рост прежде всего зависит от температуры и рН среды, доступности питательных веществ и концентрации ионов. Облигатным аэробам обязательно нужен еще и кислород, а облигатным анаэробам, наоборот, нужно, чтобы его совсем не было. Достигнув определенных размеров, бактерии переходят к бесполому размножению (бинарному делению), т. е. начинают делиться с образованием двух дочерних клеток. Переход к делению диктуется отношением объема ядра к объему цитоплазмы. Перед клеточным делением происходит репликация ДНК, во время которой мезосомы удерживают геном в определенном положении (рис. 2.3 и 2.4). Мезосомы могут прикрепляться и к новым перегородкам между дочерними клетками и каким-то образом участвовать в синтезе веществ клеточной стенки. У самых быстрорастущих бактерий деление происходит через каждые 20 мин; интервал между делениями называется временем генерации.

Рост популяции

2.1. Рассмотрим ситуацию, когда одиночная бактериальная клетка помещена в питательную среду и находится в условиях, оптимальных для роста. Перепишите табл. 2.2. Заполните ее для случая, когда эта клетка и все ее потомки делятся, допустим, каждые 20 мин.

На основе полученных вами данных постройте две кривые. По горизонтальной оси отложите время, а по вертикальной — либо число клеток (кривая А), либо десятичный логарифм этого числа (кривая Б). Что вы можете сказать о форме этих кривых?

Когда число клеток увеличивается, как показано в табл. 2.2, говорят о логарифмическом, экспоненциальном или геометрическом росте. В этом случае мы получаем экспоненциальный ряд чисел. Это гораздо проще понять, если посмотреть на строку В в табл. 2.2, где число бактерий выражено в виде числа 2, возведенного в соответствующую степень. Показатель степени можно назвать логарифмом или экспонентой числа 2. Логарифмы или экспоненты образуют линейный ряд (0, 1, 2, 3 и т. д.), соответствующий числу генераций.

Таблица 2.2. Рост бактерий в модельной популяции

Вернемся к табл. 2.2 и посмотрим, как числа, расположенные в строке А, превращаются в логарифмы по основанию 2:

Таблица 2.2. Рост бактерий в модельной популяции

Сравните строки А и Г. Однако обычно пользуются десятичными логарифмами (см. строку Б). В этом случае 1=10⁰, 2=10^0'3, 4=10^0'6 и т. д.

Кривая, изображенная на графике А, называется логарифмической или экспоненциальной кривой. Такую кривую можно преобразовать в прямую, построив график изменения логарифма числа клеток во времени. Тогда в идеальных условиях рост бактерий теоретически должен быть экспоненциальным. Сравним эту математическую модель с кривой роста реальной популяции бактерий, которая изображена на рис. 2.7. Можно отметить четыре фазы роста. Во время лаг-фазы бактерии адаптируются к новой среде обитания, и поэтому максимальная скорость роста не достигается. В этот период у бактерий могут, например, синтезироваться новые ферменты, необходимые для усвоения тех питательных веществ, которые содержатся в новой среде.

Рис. 2.7. Типичная кривая роста популяции бактерий

Логарифмическая фаза — это такая фаза, когда бактерии растут с максимальной скоростью, число клеток увеличивается почти экспоненциально, а кривая роста идет прямолинейно. Затем рост колонии начинает замедляться, и культура входит в стационарную фазу, когда скорость роста равна нулю и когда резко возрастает конкуренция за пищевые ресурсы. Образование новых клеток замедляется, а затем совсем прекращается. Увеличение числа клеток компенсируется одновременной гибелью других клеток, поэтому суммарная численность живых клеток остается постоянной. Переход к этой фазе обусловлен действием многих факторов: истощением среды, накоплением токсичных "шлаков", образующихся в процессе обмена веществ, а в случае аэробных бактерий еще и уменьшением содержания кислорода в среде.

Во время последней фазы — фазы замедления роста — ускоряется гибель клеток и прекращается их размножение. Способы подсчета числа бактерий описаны в конце этой главы.

2.2. Какую кривую роста мы получим, если возьмем пробу бактерий из культуры, достигшей стационарной фазы роста, перенесем ее в свежую среду и затем оценим рост бактериальной популяции?

2.3. Культура бактерий была помещена в питательный раствор и инкубировалась в нем при 30°С. Сразу же после посева и через интервалы, указанные в табл. 2.3, было определено число бактерий в культуре.

Таблица 2.3. Рост культуры бактерий при 30°С

Используя эти цифры, постройте график и разберитесь, что произошло. Посмотрите на полученные кривые и скажите, чем, по вашему мнению, вызваны наблюдаемые изменения численности бактерий. (Экзаменационная работа "А"-уровня, вопрос 11, Оксфорд, лето 1976 г.)

2.4. Каково "время генерации" бактерий в задаче 2.3?

Половое размножение, или генетическая рекомбинация

У бактерий наблюдается и половое размножение, но в самой примитивной форме. Половое размножение бактерий отличается от полового размножения эукариот тем, что у бактерий не образуются гаметы и не происходит слияния клеток. Однако главнейшее событие полового размножения, а именно обмен генетическим материалом, происходит и в этом случае. Этот процесс называется генетической рекомбинацией. Часть ДНК (очень редко вся ДНК) клетки-донора переносится в клетку-реципиент, ДНК которой генетически отличается от ДНК донора. При этом перенесенная ДНК замещает часть ДНК реципиента. В процессе замещения ДНК участвуют ферменты, расщепляющие и вновь соединяющие цепи ДНК. При этом образуется ДНК, которая содержит гены обеих родительских клеток. Такую ДНК называют рекомбинантной. У потомства, или рекомбинантов, наблюдается заметное разнообразие признаков, вызванное смешением генов. Такое разнообразие признаков очень важно для эволюции и является главным преимуществом полового размножения.

Известны три способа получения рекомбинантов. Это — в порядке их открытия — трансформация, конъюгация и трансдукция.

При трансформации клетки донора и реципиента не контактируют друг с другом. Этот процесс открыл в 1928 г. Гриффит (Griffith), работая с пневмококками-бактериями, вызывающими пневмонию. У пневмококков имеются колонии двух типов, которые различаются по внешнему виду. Одни колонии — шероховатые (R-от англ. rough — шероховатый), другие — гладкие (S-от англ. smooth — гладкий, ровный). R-штаммы не патогенны и не образуют капсулы; S-штаммы патогенны, и у них имеются толстые капсулы (разд. 2.2.2). Гриффит обнаружил, что если мышам ввести живые R-клетки и мертвые (убитые нагреванием) S-клетки, то мыши погибают через несколько дней, а в крови у них можно обнаружить живые S-клетки. На этом основании Гриффит сделал вывод, что из мертвых S-клеток высвобождается какой-то фактор, который придает R-клеткам способность образовывать капсулу и предохраняет их от разрушения в организме животного-хозяина. Оказалось, что такая "трансформация" наследуется. Поскольку молекулы "наследственности" в то время еще не были известны (хотя, правда, и предполагали, что это белки), очень много усилий было потрачено на то, чтобы идентифицировать трансформирующий фактор.

В 1944 г. Эвери, Мак-Леоду и Мак-Карти (Avery, MacLeod, McCarty) удалось выделить и идентифицировать этот фактор. К изумлению исследователей им оказалась ДНК, а не белок. Так были получены первые прямые данные о том, что генетическим материалом является ДНК.

Ныне известно, что при трансформации из клетки-донора выходит небольшой фрагмент ДНК, который активно поглощается клеткой-реципиентом и включается в состав ее ДНК, замещая в ней похожий, хотя и не обязательно идентичный фрагмент. Трансформация наблюдается лишь у немногих бактерий, в том числе и у некоторых так называемых "компетентных" штаммов пневмококков, у которых ДНК может проникать в клетку-реципиент. Возможный механизм трансформации изображен на рис. 2.8.

Рис. 2.8. Один из возможных способов трансформации. Точный механизм активного поглощения ДНК донора неизвестен. 1 — ДНК донора; 2 — активное поглощение; 3 — ДНК донора становится одноцепочечной (вторая цепь разрушается); 4 — цепь ДНК донора замещает сходную, но не идентичную цепь ДНК реципиента; 5 — вытесненный фрагмент реципиентной ДНК затем разрушается; 6 — гибридная ДНК; 7 — репликация гибридной ДНК

Конъюгация — это перенос ДНК между клетками, непосредственно контактирующими друг с другом. В отличие от трансформации и трансдукции при этом может обмениваться значительная часть до-норной ДНК. Этот процесс был открыт в 1946 г. у Escherichia coli. Был проведен такой опыт. Обычно клетки Е. coli синтезируют все необходимые им аминокислоты, если в среде содержится достаточно глюкозы и неорганических солей. В результате облучения бактерий иногда образуются мутанты. Были выбраны два мутанта: мутант, не способный синтезировать витамин биотин и аминокислоту метионин, и мутант, не способный синтезировать аминокислоты треонин и лейцин. В среду, не содержавшую все эти четыре фактора роста, помещали по 108 клеток каждого штамма. Теоретически клетки не должны были расти в такой среде. Однако все же было получено несколько сотен колоний (каждая колония возникает всего из одной начальной клетки), причем оказалось, что в таких клетках имеются все гены, необходимые для образования этих четырех факторов роста. Следовательно, произошел какой-то обмен генетической информацией, но выделить вещество, ответственное за этот процесс, в то время не удалось. В конце концов было установлено (при помощи электронного микроскопа), что клетки Е, coli могут непосредственно контактировать друг с другом, т. е. конъюгировать (рис. 2.9).

Рис. 2.9. Микрофотография конъюгирующих бактерий (одной 'мужской' и двух 'женских' особей), полученная с помощью просвечивающего электронного микроскопа. × 19475

Донорная способность клеток определяется генами, находящимися в небольшой кольцевой молекуле ДНК, которую называют половым фактором или F-фактором (F — первая буква от англ. fertility — плодовитость). Это — своеобразная плазмида (см. ниже), которая кодирует белок специфических фимбрий, называемых F-пилями или половыми пилями. F-пили облегчают контакт клеток друг с другом. Молекула ДНК состоит из двух цепей. При конъюгации одна из цепей двухцепочечной ДНК F-фактора проникает через половую фимбрию из клетки-донора (F⁺) в клетку-реципиент (F^-). Этот процесс схематически показан на рис. 2.10. Видно, что в клетке-доноре сохраняется F-фактор, который реплицируется в ней, пока в клетке-реципиенте синтезируется ее собственная копия. Так постепенно вся популяция клеток становится F⁺-клетками. Клетки-доноры могут спонтанно утрачивать F-фактор и становиться, таким образом, F^--клетками.

Рис. 2.10. Конъюгация и перенос F-фактора из клетки в клетку. 1, 2 и 3 обозначают последовательность этапов переноса. 1 — раскручивающийся и одновременно реплицирующийся F-фактор; 2 — одноцепочечный F-фактор проникает в клетку-реципиент через F-фимбрию; 3 — F-фактор с синтезирующейся комплементарной цепью

F-фактор интересен еще и потому, что иногда (примерно в 1 случае из 100000) он встраивается в молекулу основной ДНК клетки-хозяина. Тогда при конъюгации переносится не только F-фактор, но также и остальная ДНК. Этот процесс занимает примерно 90 мин, но клетки могут расходиться и раньше, до полного обмена ДНК. Такие штаммы постоянно передают всю или большую часть своей ДНК другим клеткам. Эти штаммы называют Hfr-штаммами (от англ. Н = High — высокая, f = frequency — частота, г т recombination — рекомбинация), потому что донорная ДНК таких штаммов рекомбинирует с ДНК реципиента.

При трансдукции небольшой двухцепочечный фрагмент ДНК попадает из клетки-донора в клетку-реципиент вместе с бактериофагом (одна из групп вирусов, см. разд. 2.5). Возможный механизм трансдукции изображен на рис. 2.11.

Рис. 2.11. Механизм трансдукции

Некоторые вирусы способны встраивать свою ДНК в ДНК бактерий; такая встроенная ДНК реплицируется одновременно с ДНК хозяина и передается от одного поколения бактерий к другому. Время от времени такая ДНК активируется и начинает кодировать образование новых вирусов. ДНК хозяина (бактерии) разрывается, а высвобожденные фрагменты иногда захватываются внутрь новых вирусных частиц, порой даже вытесняя ДНК самого вируса. Такие новые "вирусы", или трансдуцирующие частицы, затем переносят ДНК в клетки других бактерий.

Плазмиды и эписомы

Плазмиды и эписомы — это небольшие фрагменты ДНК, отличающейся от основной массы ДНК. Они часто реплицируются вместе с ДНК хозяина, но не нужны для выживания его клетки.

Сначала было принято различать эписомы и плазмиды: эписомы внедряются в ДНК хозяина, а плазмиды — нет. К эписомам относятся F-факторы и так называемые умеренные фаги (разд. 2.5.4). Сейчас обе группы называют одним общим термином "плазмиды". Плазмиды широко распространены в природе, и в последние годы их считают внутриклеточными паразитами или симбионтами, устроенными еще проще, чем вирусы. Вопрос о том, можно ли вирусы считать живыми организмами, мы обсудим в разд. 2.5.2. Что касается плазмид, то здесь дело обстоит еще сложнее — ведь они представляют собой только молекулы ДНК.

Плазмиды придают своим клеткам-хозяевам целый ряд особых свойств. Некоторые плазмиды являются "факторами резистентности" (R-плазмиды, или R-факторы)[4], т. е. факторами, придающими устойчивость к антибиотикам. Примером может служить пенициллиназная плазмида стафилококков, которая трансдуцируется различными бактериофагами. В этой плазмиде содержится ген, кодирующий фермент пенициллиназу, которая разрушает пенициллин и, таким образом, придает устойчивость к пенициллину. Передача и распространение таких факторов среди бактерий (в результате полового размножения) очень мешают врачам. Другие плазмидные гены определяют устойчивость к дезинфицирующим средствам; способствуют таким заболеваниям, как стафилококковая импетиго; помогают молочнокислым бактериям превращать молоко в сыр; придают способность усваивать такие сложные вещества, как углеводороды, что можно использовать для борьбы с загрязнениями океана или для получения кормового белка из нефти.

В заключение следует сказать, что половое размножение (в любой форме) — довольно редкое событие у бактерий. Но поскольку число бактерий в каждой колонии огромно, половое размножение наблюдается сравнительно часто. Такое размножение более примитивно, чем у эукариот; полный обмен геномами (суммарной ДНК) происходит только при конъюгации, что действительно встречается лишь изредка. Половое размножение бактерий имеет особое значение потому, что именно таким путем передается устойчивость к антибиотикам и дезинфицирующим средствам.

Новые источники питания

В последние годы появился новый источник пищи; это так называемый белок одноклеточных, который получают из микроорганизмов. Использование микроорганизмов для этого дает целый ряд преимуществ: не нужно больших площадей для посевов, не нужно помещений для скота; микроорганизмы быстро растут на самых дешевых или побочных продуктах сельского хозяйства или промышленности (например, на нефтепродуктах, метаноле или бумаге). Белок одноклеточных можно использовать на корм скоту вместо продуктов, которые годятся людям. Так, например, в США фермеры скармливают животным очень много зерна, и замена этих кормов на белок одноклеточных поможет сохранить эти продукты сельского хозяйства для людей.

Сырье и ферментная технология

Бактерий можно использовать для создания новых способов получения многих важных для промышленности веществ, в том числе спиртов, кетонов, органических кислот, Сахаров и полимеров. Ферменты, выделенные из бактерий, можно применять для химической трансформации веществ, например для превращения метана в оксид этилена. Громадное преимущество процессов, контролируемых ферментами, заключается в возможности получить при обычных давлении и температуре те же результаты, что и на традиционных химических заводах, но с меньшими затратами и без большого риска, связанного с необходимостью поддерживать очень высокие давление и температуру.

Генетическая инженерия

Наши знания по вопросам генетики и молекулярной биологии растут с каждым днем. Это связано прежде всего с работами на микроорганизмах, и особенно на таких, как бактерия Escherichia coli. Термин "генетическая инженерия" вполне можно отнести и к такому издавна известному приему, как селекция, однако возник этот термин только в связи с появлением возможности проводить прямые манипуляции с индивидуальными генами. Стандартная процедура схематически представлена на рис. 2.12. Следует, правда, заметить, что эту схему можно понять, лишь имея некоторое представление и о ДНК, и о генетике (гл. 22 и 23).

Рис. 2.12. Схема опыта по генетической инженерии (в самых общих чертах). Вектором может быть не только плазмида, но и вирус, но в этом случае на конечных этапах происходит 'трансдукция', а не 'трансформация'

Одно из достижений генетической инженерии — это перенос генов, кодирующих синтез инсулина у человека, в клетки бактерий. С тех самых пор, как выяснилось, что причиной сахарного диабета является нехватка гормона инсулина, всем больным диабетом стали давать инсулин, который получали из поджелудочной железы после забоя животных. Инсулин — это белок, и поэтому было много споров о том, можно ли встроить гены этого белка в клетку бактерий и можно ли выращивать такие бактерии в промышленных масштабах, чтобы использовать их как намного более дешевый и более удобный источник гормона. Даже при удачном переносе генов существует одна скрытая трудность, которая связана с возможными различиями в механизмах регуляции синтеза белка у эукариот и прокариот. В настоящее время удалось успешно перенести гены человеческого инсулина и уже началось промышленное получение этого гормона.

Другим важным для человека белком является интерферон, который обычно образуется в ответ на вирусную инфекцию. Ген интерферона удалось перенести в клетки бактерий, и, заглядывая в будущее, можно, по-видимому, сказать, что бактерии будут широко применяться как "фабрики" для производства целого ряда таких продуктов эукариотических клеток, как гормоны, антибиотики, ферменты и вещества, необходимые в сельском хозяйстве. Возможно, что вместо бактерий можно использовать и дрожжи (эукариоты). Не исключено, что полезные гены прокариот удастся включить в клетки эукариот, например ввести гены азотфиксирующих бактерий в клетки полезных сельскохозяйственных растений. Это имело бы чрезвычайно большое значение для производства сельскохозяйственной продукции, так как позволило бы резко уменьшить или даже совсем обойтись без внесения в почву нитратных удобрений, на которые расходуются баснословные суммы денег и которыми загрязняются близлежащие реки и озера.

Размеры

Вирусы — это мельчайшие живые организмы, размеры которых варьируют в пределах примерно от 20 до 300 нм; в среднем они раз в пятьдесят меньше бактерий. Как уже говорилось, вирусы нельзя увидеть с помощью светового микроскопа (так как их размеры меньше полудлины световой волны), и они проходят через фильтры, которые задерживают бактериальные клетки.

Часто задают вопрос: "А являются ли вирусы живыми?" Если живой считать такую структуру, которая обладает генетическим материалом (ДНК или РНК) и которая способна воспроизводить себя, то можно сказать, что вирусы живые. Если же живой считать структуру, обладающую клеточным строением, то ответ должен быть отрицательным. Следует также отметить, что вирусы не способны воспроизводить себя вне клетки-хозяина. Они находятся на самой границе между живыми и неживыми, и это лишний раз напоминает нам, что существует непрерывный спектр все возрастающей сложности, который начинается с простых молекул и кончается сложнейшими замкнутыми системами клеток.

Поведение

Вирусы могут воспроизводить себя только внутри живой клетки, поэтому они являются облигатными паразитами. Обычно они вызывают явные признаки заболевания. Попав внутрь клетки-хозяина, они "выключают" (инактивируют) хозяйскую ДНК и, используя свою собственную ДНК или РНК, дают клетке команду синтезировать новые копии вируса (разд. 2.5.3). Вирусы передаются из клетки в клетку в виде инертных частиц.

Строение

Вирусы устроены очень просто. Они состоят из фрагмента генетического материала, либо ДНК, либо РНК, составляющей сердцевину вируса, и окружающей эту сердцевину защитной белковой оболочки, которую называют капсидом. Полностью сформированная инфекционная частица называется вирионом. У некоторых вирусов, таких, как вирусы герпеса или гриппа, есть еще и дополнительная липопротеидная оболочка, которая возникает из плазматической мембраны клетки-хозяина. В отличие от всех остальных организмов вирусы не имеют клеточного строения.

Оболочка вирусов часто бывает построена из идентичных повторяющихся субъединиц — капсомеров. Из капсомеров образуются структуры с высокой степенью симметрии, способные кристаллизоваться. Это позволяет получить информацию об их строении как с помощью кристаллографических методов, основанных на применении рентгеновских лучей, так и с помощью электронной микроскопии. Как только в клетке-хозяине появляются субъединицы вируса, они сразу же проявляют способность к самосборке в целый вирус. Самосборка характерна и для многих других биологических структур, она имеет фундаментальное значение в биологических явлениях. На рис. 2.13 представлена упрощенная схема, которая показывает общее строение вирусов.

Рис. 2.13. Схематический разрез вируса, имеющего капсомерное строение

Икосаэдры и додекаэдры (например, у аденовирусов, вируса полиомы/папилломы, вируса полиомиелита). У икосаэдра имеется 20 треугольных граней, 12 вершин и 30 ребер. Правильный икосаэдр показан на рис. 214, А. Ультраструктуру вирусов можно рассмотреть с помощью негативного контрастирования. Краситель проникает между частицами и позволяет рассмотреть все особенности их поверхности. Как видно из рис. 2.14, Б и В, у аденовируса каждая из 20 граней состоит из нескольких капсомеров. В сумме число капсомеров составляет 252 (240 шестиугольных и 12 пятиугольных по вершинам икосаэдра). У разных вирусов это число варьирует. Так, например, у бактериофага φХ174 оно равно 12, у вируса герпеса — 162, у вируса полиомы — 42. У всех этих вирусов по 12 пятиугольных капсомеров, при этом у бактериофага шестиугольных капсомеров нет вообще, и образуется структура, которая называется додекаэдром.

Рис. 2.14. А. Геометрическая модель икосаэдра. Б. Частица аденовируса икосаэдрической формы с угловыми шипами. Электронная микрофотография негативно контрастированного препарата. × 480000. В. Рисунок, сделанный с трехмерной модели аденовируса. Капсид состоит из 252 капсомеров, 12 находятся по углам икосаэдра, а 240 — на гранях и ребрах. Аденовирусы — это ДНК — содержащие вирусы, которые были выделены из клеток самых разных млекопитающих и птиц. Они поражают лимфоидную ткань и вызывают у человека различные респираторные заболевания

Спиральная симметрия. Лучшей иллюстрацией спиральной симметрии может служить вирус табачной мозаики (ВТМ), содержащий РНК (рис. 2.15). 2130 одинаковых белковых субъединиц составляют вместе с РНК единую целостную структуру — нуклеокапсид. У некоторых вирусов, например у вирусов свинки и гриппа, нуклеокапсид окружен оболочкой.

Рис. 2.15. Строение палочковидного вируса табачной мозаики (на рисунке изображена часть этого вируса). В основу рисунка положены данные по дифракции рентгеновских лучей и результаты биохимических и электронно-микроскопических исследований

Бактериофаги. Вирусы, которые нападают на бактерий, образуют группу так называемых бактериофагов. У некоторых бактериофагов имеется явно выраженная икосаэдрическая головка, а хвост обладает спиральной симметрией (рис. 2.16).

Рис. 2.16. А Строение бактериофага. Б. Электронная микрофотография бактериофага после негативного контрастирования частицы

Сложные вирусы. Некоторые вирусы, например рабдовирусы и вирусы оспы, имеют сложное строение.

Основные способы передачи вирусных и бактериальных болезней в принципе одинаковы, поэтому этот вопрос удобнее рассматривать вместе. Ниже описаны все способы передачи инфекции, а в табл. 2.6 и 2.7 приведены соответствующие примеры.

Капельная инфекция

Капельная инфекция — самый обычный способ распространения респираторных заболеваний. При кашле и чихании в воздух выбрасываются миллионы крошечных капелек жидкости (слизи и слюны). Эти капли вместе с находящимися в них живыми микроорганизмами могут вдохнуть другие люди, особенно в местах скопления большого количества народа, к тому же еще и плохо вентилируемых. Стандартные гигиенические приемы для защиты от капельной инфекции — правильное пользование носовыми платками и проветривание комнат.

Некоторые микроорганизмы, такие, как вирус оспы или туберкулезная палочка, очень устойчивы к высыханию и сохраняются в пыли, содержащей высохшие остатки капель. Даже при разговоре изо рта вылетают микроскопические брызги слюны, поэтому подобного рода инфекции очень трудно предотвратить, особенно если микроорганизм очень вирулентен.

Контагиозная передача (при непосредственном физическом контакте)

В результате непосредственного физического контакта с больными людьми или животными передаются сравнительно немногие болезни. Сюда прежде всего относятся венерические (т. е. передающиеся половым путем) болезни, такие, как гонорея и сифилис. В тропических странах весьма распространено заболевание, называемое фрамбезия. Эта очень похожая на сифилис болезнь передается через кожу при непосредственном контакте. К контагиозным вирусным болезням относятся трахома (болезнь глаз, очень распространенная в тропических странах), обычные бородавки и обыкновенный герпес — "лихорадка" на губах. Проказу и туберкулез вызывают бактерии из рода Mycobacterium; это тоже контагиозные бактериальные заболевания.

Переносчики инфекций

Переносчик — это любой живой организм, который разносит инфекцию. Он получает инфекционное начало от организма, называемого резервуаром или носителем. Например, блохи служат переносчиками таких бактериальных заболеваний, как эндемический сыпной тиф и чума (бубонная чума, или "черная смерть"), а резервуаром являются крысы. Вирус бешенства сохраняется и передается одним и тем же животным, например собакой или летучей мышью.

2.5. Кто является а) переносчиком и 6) резервуаром: 1) сыпного тифа и 2) желтой лихорадки (см. табл. 2.6 и 2.7)?

В этих случаях переносчик выступает в качестве второго хозяина, в теле которого может размножаться патогенный микроорганизм. Насекомые могут переносить возбудителей болезней на наружных покровах тела. Мухи, например, ползая и питаясь на испражнениях больных кишечными заболеваниями, такими, как холера, брюшной тиф или дизентерия, механически переносят возбудителей этих заболеваний на продукты, которые с большой вероятностью могут быть потреблены здоровыми людьми.

Фекальные загрязнения

При инфекционных заболеваниях пищеварительного тракта возбудители попадают в экскременты. Отсюда и три самых простых способа передачи этих болезней.

Передающиеся через воду. Классический пример таких болезней — холера, брюшной тиф (в обоих случаях возбудителями являются жгутиковые бактерии) и дизентерия. Если постоянно нарушаются элементарные правила гигиены и санитарии, экскременты больных нередко попадают прямо в источники питьевой воды или же отлагаются в речных наносах. Таким путем эти болезни быстро распространяются среди населения.

Переносимые с пищей. Пищевые продукты могут испачкаться, если их моют в нечистой воде, берут грязными руками или дают садиться на них мухам.

Загрязнение предметов. Самые разные вещи могут быть испачканы нечистотами в результате прямого загрязнения или неправильного обращения. При передаче таких вещей из рук в руки болезнь может, фигурально говоря, передаваться "из рук в рот".

Передаваемые непосредственно с пищей

Недоваренное или недожаренное мясо часто вызывает пищевые отравления. Это — результат заражения мяса сальмонеллами. Clostridium botulinum (рис. 2.6) — бактерия, вызывающая ботулизм. Это пищевое отравление часто заканчивается летальным исходом, потому что токсин С. botulinum является одним из наиболее токсичных среди известных токсинов (летальная доза для мыши составляет 5·10^-5 мкг). Эта бактерия хорошо развивается в богатых белком продуктах, в частности в мясных консервах.

Загрязнение ран

Помимо инфекций, передаваемых животными-переносчиками при укусах, можно упомянуть ряд болезней, связанных с попаданием болезнетворных бактерий в раны. Это прежде всего такие инфекции глубоких ранений, как газовая гангрена и столбняк. Оба заболевания вызываются различными видами Clostridium, обычно попадающими в раны из почвы. Многие поверхностные раны и ожоги легко инфицируются стафилококками и стрептококками.

Три следующих опыта предназначены для того, чтобы учащиеся приобрели определенные навыки по использованию микробиологических методик. Опыты 2.2 и 2.3 вытекают из опыта 2.1. Опыт 2.1 — выращивание культуры молочных бактерий. Опыт 2.2 — окрашивание бактерий для их изучения с помощью светового микроскопа. Опыт 2.3 — подсчет числа бактериальных колоний с применением метода серийных разведений.

Опыт 2.1. Определение числа бактерий в свежем и несвежем молоке

Цель эксперимента — определить, как суточное хранение молока при комнатной температуре влияет на его качество, и выяснить, почему оно скисает. Молоко — это почти полноценная пища для людей, а эксперименты покажут, что молоко служит превосходной культуральной средой и для целого ряда бактерий.

Четыре стерильные чашки Петри с питательным агаром

Микробиологическая петля

Бунзеновская горелка

Несмываемые чернила или восковой карандаш

Свежее пастеризованное молоко

Несвежее молоко (молоко, простоявшее 24 ч при комнатной температуре)

Термостат, настроенный на температуру 35°С

1. Простерилизуйте микробиологическую петлю, введя ее в пламя горелки (подержите ее там, пока она не покраснеет) (рис. 2.20, А).

Рис. 2.20. Стерилизация проволочной петли прокаливанием в пламени горелки и посев штрихом молочных бактерий на чашки Петри с питательным агаром. Наберите капельку молока в петлю. Приподнимите крышку чашки Петри ровно настолько, насколько необходимо, и нанесите штрихи, как изображено на рисунке, стараясь не поцарапать поверхность агара. Каждая линия обозначает одно движение проволочной петли. После каждых шести штрихов прокалите и охладите петлю

2. Дайте петле остыть и затем окуните ее в пробу свежего молока; молоко предварительно хорошо взболтайте.

3. Слегка приподнимите крышку стерильной чашки с агаром и осторожно распределите содержимое петли по поверхности агара, как показано на рис. 2.20, Б.

4. Закройте крышку и снова прокалите петлю в пламени горелки.

5. Пометьте чашку снизу несмываемыми чернилами (или восковым карандашом).

6. Повторите всю процедуру со второй чашкой и другой пробой свежего молока.

7. Простерилизуйте петлю снова и, дав ей остыть, окуните ее в пробу несвежего молока.

8. Распределите содержимое петли по поверхности третьей чашки и затем закройте крышку.

9. Пометьте чашку снизу несмываемыми чернилами.

10. Повторите всю процедуру с четвертой чашкой и второй пробой несвежего молока.

11. Поставьте ваши четыре чашки в термостат при 35°С на 3 сут. Прежде чем ставить чашки в термостат, переверните их вверх дном, чтобы капли конденсата не падали сверху на культуру. После инкубации склейте половинки каждой чашки липкой лентой, чтобы культура не пропала.

12. Опишите внешний вид колоний и сравните ваши результаты с описанием из разд. 2.7.1.

1. Студенты могут заполнить чашки самостоятельно, если есть стерильные пробирки Мак-Картни с питательным агаром.

2. При посеве штрихом число бактерий в каждом следующем штрихе постоянно уменьшается. Этот метод удобнее применять, когда количество бактерий в пробе велико, как, например, в молоке. Его обычно используют для получения чистых колоний бактерий из смешанной культуры.

3. После инкубации чашки можно положить в холодильник и держать там, пока они не понадобятся. Охлаждение препятствует дальнейшему росту бактерий.

4. Когда чашки станут больше не нужны, их следует положить в пакет одноразового использования, проавтоклавировать 15 мин и только затем выбросить.

5. С молоком можно провести и другие опыты. Эксперимент, описанный выше, самый простой. Можно, например, оценить влияние охлаждения. Можно также исследовать влияние пастеризации на содержание бактерий в молоке, тем более если нетрудно получить сырое (непастеризованное) молоко (допустим, прямо с молочной фермы). Для пастеризации молоко разливают по стерильным пробиркам, затыкают пробирки ватными пробками, а затем прогревают в течение 35 мин при 63°С на водяной бане. Третий вариант опыта заключается в том, что берут несколько чашек и инкубируют их при 10°С, а не при 35°С. Такая низкая температура благоприятна для роста Streptococcus lactis и не способствует росту Lactobacillus.

Опыт 2.2. Окрашивание бактерий для изучения их с помощью светового микроскопа

Фазово-контрастный микроскоп позволяет видеть живые клетки, однако чаще все же клетки предварительно фиксируют и окрашивают. Одна из основных методик окрашивания, позволяющая идентифицировать бактерии, — это методика окрашивания по Граму. Этот метод разработал в 1884 г. датский врач Христиан Грам. До окрашивания все клетки бесцветны. После окрашивания грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый, а грамотрицательные — в красный цвет. Мы уже говорили в разд. 2.2.2 ("Клеточная стенка"), чем эти бактерии отличаются друг от друга.

Основной краситель — кристаллический фиолетовый (0,5%-ный водный раствор)

Раствор Люголя

Ацетон — спирт (ацетон: абсолютный спирт в соотношении 50:50) для отмывания красителя

Сафранин (1%-ный водный раствор) для контрастирования

Проволочная петля

Бунзеновская горелка

Тщательно вымытые предметные стекла (протереть спиртом)

Пинцет

Штатив для окрашивания, пристроенный над кюветой или чашкой

Промывалка с дистиллированной водой

Фильтровальная бумага

Иммерсионное масло и микроскоп с иммерсионным объективом

(Стадии 1-6 должны занять не более 5 мин.) (Из кн.: Bacteriology, Humphries, J., John Murray, 1974.)

1. Приготовьте мазок бактерий на предметном стекле. Для этого прокалите проволочную петлю в пламени горелки и охладите ее. Капните 1-2 капли водопроводной воды в центр чистого стекла. Слегка коснитесь петлей выбранной вами бактериальной колонии, полученной в предыдущем опыте; чтобы не загрязнить культуру, чашку приоткрывайте как можно меньше. Перенесите клетки на предметное стекло и осторожно помешайте каплю петлей. Размажьте клетки в виде тонкой пленки по стеклу, чтобы получилось пятно площадью около 3×1 см. Снова прокалите петлю. Очень важно добиться нужной толщины мазка. Мазок должен чуть-чуть опалесцировать и чаще оказывается слишком толстым, а не слишком тонким. Необходимо также, чтобы толщина мазка по всей поверхности была одинакова. Дайте мазку полностью высохнуть на воздухе (несколько минут).

2. Зафиксируйте мазок. Возьмите стекло пинцетом и в горизонтальном положении проведите его три раза через желтую часть пламени горелки. Очень важно не перегреть стекло. Простейший способ проверки правильности нагрева — после каждого проведения через пламя слегка коснуться стеклом руки. Если неприятного ощущения нет, то все делается верно. При фиксации бактериальные клетки гибнут в результате коагуляции цитоплазмы; кроме того, клетки прилипают к стеклу.

3. При окрашивании очень легко запачкать стол, поэтому процедуру лучше проводить на штативе, пристроенном над кюветой или кристаллизатором. Штатив можно сделать из двух стеклянных или металлических палочек, положенных строго горизонтально на края кюветы или кристаллизатора на расстоянии 5 см друг от друга. Всю систему проще всего настроить, если закрепить палочки пластилином. Залейте стекло раствором кристаллического фиолетового и оставьте на 30 с.

4. Смойте краситель раствором Люголя; залейте стекло этим раствором и оставьте на 30 с. Смойте йод дистиллированной водой из промывалки.

5. Промойте стекло смесью ацетона со спиртом, пока не перестанет отходить краситель (примерно 3 с); после этого немедленно промойте стекло водой, чтобы препарат совсем не обесцветился. Если нужно, повторите эту процедуру (умение определять продолжительность отмывки приходит с опытом).

6. Залейте стекло сафранином и оставьте на 1 мин. Отмойте краситель водой. Осторожно просушите стекло между слоями чистой фильтровальной бумаги и дайте ему окончательно высохнуть на воздухе.

7. Капните на мазок каплю иммерсионного масла и рассмотрите препарат с помощью иммерсионного объектива (разд. П.2.3.2).

Совпадают ли ваши наблюдения с тем, что написано в разд. 2.7.1 о численности бактерий в молоке?

Опыт 2.3. Сравнение численности бактерий в свежем и несвежем молоке

Если одиночную клетку бактерии поместить на питательный агар, она образует целую колонию, которая в отличие от исходной клетки видна невооруженным глазом. Этим можно воспользоваться для подсчета бактерий.

Простерилизуйте оборудование. Первая часть опыта основана на использовании метода серийных разведений. Число бактерий в молоке огромно, поэтому для подсчета удобнее брать пробу небольшого объема и разводить ее в известное число раз. Готовят серию разведений. Во второй части опыта из каждого разведения берут пробу для выращивания. Для подсчета числа бактерий в конкретном объеме молока используют ту пробу, где после выращивания на агаре получается наиболее подходящее число колоний (достаточно большое, но при этом отдельные колонии не перекрывают друг друга).

Шесть стерильных чашек с питательным агаром

Восемь градуированных пипеток на 1 см³

Градуированная пипетка на 10 см³

Шесть пробирок и штатив для них

Вата

Несмываемые чернила

Бунзеновская горелка

100 см³ дистиллированной воды

Свежее молоко

Несвежее молоко

70%-ный спирт

Алюминиевая фольга

Стеклянный шпатель

1. Все шесть пробирок закройте ватными пробками, обернутыми алюминиевой фольгой.

2. Все восемь градуированных пипеток на 1 см³ и одну градуированную пипетку на 10 см³ закройте сверху небольшим комочком ваты и заверните каждую пипетку отдельно в алюминиевую фольгу.

3. Положите пробирки и пипетки в суховоздушный термостат, нагретый до 160°С, и оставьте их там на 60 мин. (В таком термостате нельзя стерилизовать бутыли со средой и водой.)

4. Перед использованием дайте оборудованию остыть.

1. Подпишите шесть стерильных, закрытых пробками пробирок, пометив их C1, C2, С3 и H1, H2, Н3. Снимите с пробок обертку из фольги.

2. Подпишите снизу шесть стерильных чашек с питательным агаром, обозначив их C1, C2, С3 и H1, H2, Н3.

3. В каждую из шести пробирок внесите по 9,9 см³ стерильной дистиллированной воды. Для этого воспользуйтесь следующими приемами.

а) Мизинцем и безымянным пальцем одной руки зажмите ватную пробку колбы со стерильной дистиллированной водой и выньте ее из колбы.

б) Одной рукой держите колбу и пробку, а в другую возьмите стерильную пипетку на 10 см³ и наберите из колбы 9,9 см³ стерильной дистиллированной воды.

в) Закройте колбу пробкой.

г) Точно таким же способом, как в пункте а, выньте пробку из первой пробирки.

д) Перенесите 9,9 см³ воды в эту пробирку.

е) Закройте пробирку пробкой.

ж) Проделайте эту же операцию с остальными пятью пробирками.

4. Хорошо встряхните пробу свежего молока и, взяв стерильную пипетку на 1 см³, перенесите 0,1 см³ такого молока в пробирку С1. Пробку вынимают и помещают обратно так же, как и раньше. Получается разведение в 100 раз.

5. Чтобы проба хорошо перемешалась, осторожно встряхните пробирку.

6. Возьмите новую пипетку и перенесите 0,1 см³ из пробирки С1 на стерильную чашку, помеченную С1, лишь слегка приподнимая крышку чашки.

7. Простерилизуйте стеклянный шпатель; для этого окуните его в 70%-ный спирт, дайте избытку спирта стечь и затем подержите вертикально в пламени бунзеновской горелки.

8. Дайте шпателю остыть и холодным шпателем размажьте пробу по поверхности чашки.

9. Снова простерилизуйте шпатель.

10. Взяв ту же пипетку, что использовалась в п. 6, перенесите 0,1 см³ из пробирки С1 в пробирку С2, вынимая и возвращая ватные пробки на место, как указано выше.

11. Чтобы проба хорошо перемешалась, встряхните пробирку С2. Получается разведение в 10000 раз.

12. Повторите все операции, начиная с п. 6 и кончая п. 9, взяв вместо С1 пробирку С2.

13. Повторите операции пп. 10 и 11, взяв С3 вместо С2. Это даст нам разведение в 1000000 раз. Повторите операции пп. 6-9, взяв С3 вместо С1.

14. Тем же методом посева штрихом приготовьте пробы несвежего молока, взяв чашки H1, H2 и Н3.

15. Переверните приготовленные чашки (шесть штук) вверх дном и поставьте примерно на 3 сут. в термостат при 35°С.

16. Затем приклейте липкой лентой крышки к чашкам, чтобы избежать возможного распространения патогенных микроорганизмов.

17. Оцените рост бактерий на чашках. Подсчитайте, где удастся, число индивидуальных колоний. Запишите полученные результаты в виде таблицы и рассчитайте по ним число бактерий в 1 см³ неразбавленного молока.

Посмотрите примечания 3 и 4 в конце описания опыта 2.1.