Кислород. Молекула, изменившая мир

Глава десятая. Машина по производству антиоксидантов. Сто и один способ жить в окружении кислорода

Правительства занимаются определениями таких понятий, как «безработный», «грамотность» или «отмена налога». Оппозиционно настроенные ораторы и редакторы газет обсуждают точность этих определений. Слова летают взад и вперед — громкие, но пустые. Считается, что ученые стоят выше этого. Научные термины не допускают оппозиции: они четко определены и поддаются анализу, правда, часто их невозможно произнести. Ученые пытаются сформулировать определения с помощью математических символов и счастливы только тогда, когда термин хорошо вписывается в уравнение. Но даже в такой безупречной науке, как математика, желаемая точность не всегда достижима. Проклятый «фактор неопределенности» символизирует нежелание природы поддаваться классификации.

В биологии проблема определений стоит гораздо острее, чем в математике. Биологи крайне редко используют слово «доказательство» — оно требует слишком высокой точности. Вpачи не любят слово «исцеление». Кто знает? Гораздо удобнее сказать «ремиссия», поскольку это мало что означает: «сейчас болезнь отступила, насколько я понимаю, но, вернется ли она, сказать не могу». Природа ловко обходит придуманные нами определения. Как дать определение жизни? Наверное, важно подчеркнуть способность к воспроизведению и наличие метаболизма. А вирус — живой или нет? У него нет собственного метаболизма, так что он не попадает под стандартное определение. А если вы сумеете найти определение жизни, под которое вирус попадает, куда отнести прионы, которые представляют собой просто белки? Как дать определение старению? Неуклонное ослабление жизненных функций, ведущее к смерти? Описание это или определение? Если мы не можем дать определение жизни, как описать смерть? Если прион неживой, значит, он мертвый? Следовательно, его нельзя убить?

Я не собираюсь окунаться в море семантики. Конечно, всегда находятся решения, хотя простыми они бывают редко. Сейчас я хочу дать широкое определение «антиоксиданта». В главе 9 мы обсуждали, насколько это сложно. Все дело в точности определения: насколько точно мы можем определить столь скользкое понятие?

Первое определение понятия «антиоксидант» пришло из химии. Как и подобает науке, оперирующей символами, понятие антиоксиданта в химии имело строгий и однозначный смысл. Антиоксидант — это донор электронов, который предотвращает окисление вещества (или потерю им электронов). Слово это появилось в 1940-х гг. в пищевой промышленности. Жиросодержащие продукты, такие как сливочное масло, на воздухе становятся прогорклыми. Говоря техническим языком, они «переокисляются». Переокисление — это цепная реакция под действием свободных радикалов кислорода, таких как гидроксильный радикал, которые атакуют липиды в погоне за электронами. Они могут утащить электрон и сбежать или увязнуть в липиде, как игрок в регби, который завладел мячом, но не может выйти из схватки. Но в любом случае липид теряет электрон. Он становится свободным радикалом и сам атакует соседей, пытаясь отобрать у них электрон. Такая цепная реакция в липидах масла распространяется, как пожар. Антиоксидант останавливает процесс, «удаляя» свободные радикалы. Он отдает электрон и останавливает развитие цепной реакции. Поэтому в пищевые продукты традиционно добавляют такие антиоксиданты, как бутилгидроксианизол.

Приведенное выше точное определение годится для химии или пищевой промышленности, но не для биологии. В присутствии железа донор электронов может быть как антиоксидантом, так и прооксидантом. Все зависит от контекста. Поэтому в данной главе я предлагаю проанализировать контекст и не учитывать детали — оставить редукционистский подход и посмотреть, как работает синтез. Это позволит понять, как целые организмы — одноклеточные или многоклеточные — противостоят окислению. Мы будем проводить анализ не только на уровне химических реакций, но и на уровне морфологии и поведения.

Защититься от окислительного стресса можно пятью способами: спрятаться в укрытие, применить антиоксидантные ферменты, устранить свободные радикалы, осуществить репарацию и запустить индуцируемые стрессом peaкции. Некоторые организмы, особенно те, что прячутся от кислорода, пользуются лишь одним или двумя механизмами, тогда как другие, включая нас с вами, вынуждены применять все средства защиты. Мы — настоящие машины по производству антиоксидантов. Чтобы увидеть, как работает эта защита, мы обсудим принцип действия каждого механизма. Это далеко не исчерпывающий анализ — я выделю только некоторые аспекты влияния этих механизмов на наше с вами физическое и физиологическое устройство.

Самый простой способ защититься от токсичного кислорода — спрятаться от него. Малюсеньким бактериям укрыться легко. Некоторые строго анаэробные бактерии, которые погибают в присутствии даже следовых количеств кислорода, прячутся внутри других клеток. Пример крайней нетерпимости — метаногенные бактерии, которые живут в желудке крупного рогатого скота и овец. Как матрешки, они скрываются внутри симбиотических микробов, которые расщепляют целлюлозу из травы, а те, в свою очередь, прячутся в желудке животных.

Кишечник различных животных — от поедающих древесину термитов до слонов — весьма комфортабельное место, предоставляющее укрытие многим анаэробным микробам. У нас в кишечнике живут большие колонии так называемых комменсальных (симбиотических) бактерий, которые обычно безвредны или даже полезны, но иногда могут оказаться столь же зловредными, как издаваемый ими запах. Считается, что метаболическая емкость всей популяции кишечных бактерий равна метаболической емкости печени. Непереваренные органические вещества и бактерии впитывают кислород, так что в толстой кишке создаются почти аноксические условия с концентрацией кислорода ниже 0,1% атмосферного уровня. В таких условиях анаэробные бактерии, такие как Bacteroides, в сотни раз превосходят по численности своих аэробных родственников.

Конечно, гораздо шире распространены свободноживущие анаэробные бактерии, которые защищаются от кислорода, создавая вокруг себя буферную зону. Хороший пример — сульфатредуцирующие бактерии, которые в качестве побочного продукта метаболизма выделяют сероводород (см. главы 3 и 4). Сероводород взаимодействует с кислородом с образованием сульфата, что одновременно пополняет запасы сырьевого материала для сульфатредуцирующих бактерий и устраняет растворенный кислород. Так бактериям удается избежать контакта с внешним миром и поддерживать вокруг себя постоянные условия. Эволюция сульфатредуцирующих бактерий началась, возможно, еще 2,7 млрд лет назад, и на протяжении более 2 млрд лет они занимали доминирующее положение в глубинах океана. Их и теперь можно обнаружить в водах Черного моря и вообще в любой застойной и зловонной тине, в том числе в нашем кишечнике. Их способность обустраивать мир по своему вкусу сравнима, пожалуй, только со способностью цианобактерий, которые на протяжении 3,5 млрд лет использовали солнечный свет, наполняя воздух кислородом. Эти две группы бактерий противоположны, как библейские силы света и тьмы. Сульфатредуцирующие бактерии прячутся от света и воздуха в темноте и зловонии подземного мира. Однако их ядовитые выбросы помогают поддерживать экологическое разнообразие. Как противопоставление света и тьмы в рамках многих религий определяет мир, где мы с вами соответствуем земному уровню морали, так и противоположные полюса живого мира создают целый спектр условий, в которых расселяются все бесчисленные формы жизни.

Многие одноклеточные организмы не защищаются от кислорода, но быстро перемещаются из тех мест, где его концентрация особенно высока, в экологические ниши, созданные сульфатредуцирующими и подобными им бактериями. В главе 3 мы обсуждали, что свободноживущие ресничные организмы активно уплывают от кислорода. Вообще говоря, это довольно сложная реакция. Для ее реализации клетки должны иметь датчики, определяющие концентрацию кислорода в окружающей среде. Собранная информация сопрягается с движением ресничек. Датчики представляют собой белки, напоминающие по структуре гемоглобин. Гемовые белки прекрасно подходят для этой цели, поскольку их физические свойства изменяются в присутствии кислорода (гемоглобин меняет цвет от алого до темно-красного). Представители всех трех доменов жизни используют гемовые белки в качестве датчиков кислорода, так что, вероятно, и последний универсальный общий предок (LUCA, см. главу 8) использовал их для той же цели.

В описанной ситуации гемовые белки выступают в роли антиоксидантов: они удерживают концентрацию кислорода в приемлемых пределах. Даже если клетки не движутся, как в клубеньках бобовых растений (см. главу 8), гемовые белки выполняют антиоксидантную функцию, связывая избыток кислорода и высвобождая его очень медленно, чтобы поддерживать вокруг себя постоянно низкую концентрацию.

Некоторые микробы защищаются от кислорода, физически экранируя себя от этой напасти. Самым простым экраном может служить слой мертвых клеток — как мертвое тело погибшего товарища может защитить солдата от пули. Именно так защищаются анаэробные клетки, обитающие в строматолитах (cм. главу 3), состоящих из множества слоев мертвых клеток. Они живут так на протяжении 3,5 млрд лет.

Более сложный способ защиты состоит в секреции слизи. Все свободноживущие аэробные микроорганизмы окружают себя капсулой слизи; для них это так же нормально, как для краба — жить в панцире. Слизь имеет ряд преимуществ перед известковой оболочкой. Джеймс Лавлок не смог преодолеть этот уровень защиты бактерий, когда в начале 1950-х гг. пытался стерилизовать больничное оборудование с помощью жестких ультрафиолетовых лучей. Ему удалось уничтожить бактерии, не имеющие слизистой оболочки, но даже при очень высокой интенсивности ультрафиолетового излучения, в сотни раз превышающей нормальный атмосферный уровень, эта обработка не оказала никакого влияния на бактерии, защищенные слизью. В главе 6 мы говорили о том, что излучение повреждает клетки путем образования свободных радикалов из воды. Слизь защищает клетки от свободных радикалов и отчасти позволяет объяснить удивительную способность клеток выживать в космическом пространстве и в других средах с высоким уровнем излучения. Выжить в космосе с помощью субстанции, которую мы обычно рассматриваем не иначе, как симптом простуды! Изображение отвратительных пришельцев из фильмов ужасов, возможно, имеет под собой гораздо более явный биологический фундамент, чем предполагали их создатели. Наверное, вы не очень сильно удивитесь, когда узнаете, что слизь ограничивает распространение свободных радикалов гораздо более изобретательным способом, чем просто за счет повышения вязкости.

Бактериальная слизь — это смесь длинноцепочечных полимеров, отчасти аналогичных пластмассам, имеющих одно общее свойство: все они несут на себе отрицательный заряд. Поэтому слизь прочно связывает положительно заряженные ионы, такие как железо и магний, вытягивая их из их окружения. Это сродство настолько велико, что некоторые бактерии применяются в промышленном масштабе для извлечения тяжелых металлов из сточных вод.

Какое преимущество дает бактерии металлический жакет? Ответ может показаться неожиданным. В главе 6 мы говорили о том, что пероксид водорода и супероксидный радикал не очень активны и до вступления в реакцию могут диффундировать на некоторое расстояние. Они представляют опасность только в присутствии ионов металлов, могущих катализировать образование чрезвычайно реакционноспособных гидроксильных радикалов. Учитывая способность металлов катализировать опасные свободнорадикальные peaкции, наличие металлического жакета может показаться недостатком, а не достоинством, поскольку связано с постоянной опасностью. Однако, накапливая железо вокруг себя, бактерии удерживают свободные радикалы на определенном расстоянии, не позволяя им войти внутрь клетки. Слизь приносится в жертву, а железо превращается в биологически неактивную ржавчину. Эффект такой же, как от взрыва бомбы на безопасном расстоянии. Кроме того, такой контролируемый взрыв уничтожает захватчиков, таких как бактериофаги (вирусы бактерий), и даже клетки иммунной системы, которые пытаются поглотить бактерии. Таким образом, существует прямая корреляция между толщиной слизистой оболочки и инфицирующей способностью некоторых бактерий.

По мере накопления ионов металлов слизистая оболочка утолщается. В конечном итоге бактерии погибают под тяжестью своего инкрустированного жакета. Иногда в полосатых железных горах обнаруживают микроскопические пустоты, которые, возможно, образованы телами бесчисленного множества инкрустированных железом бактерий. Сами бактерии растворились, остались только их металлические оболочки — свидетельства массовых захоронений.

Не только микробы используют такие «примитивные» методы защиты. Эквивалентный механизм работает в организме каждого из нас. Мы тоже прячемся под слоем мертвых клеток, который называем кожей. Как ресничные, мы используем гемовые белки в качестве датчиков, чтобы поддерживать внутреннее содержание кислорода на постоянном уровне. Как сульфатредуцирующие бактерии, мы применяем серу для создания кислородного буфера (мы поговорим об этом позднее). Мы секретируем слизь для защиты носовых ходов, дыхательных путей и легких от кислорода и бактериальных инфекций. Как клетки анаэробных бактерий скрываются от кислорода в кишечнике, так и наши с вами клетки «прячутся» внутри организма, где концентрация кислорода намного ниже, чем в опасном окружающем мире.

В этом смысле мы вполне можем считать гигантизм (см. главу 5) проявлением антиоксидантной защиты. Увеличение размера тела позволяет компенсировать повышение концентрации кислорода в воздухе, особенно в организме животных с ограниченной диффузией кислорода, как у гигантской стрекозы. Увеличение размера тела приводит к снижению концентрации кислорода в конечных пользователях — митохондриях. Как мы обсуждали в главе 8, оптимальная концентрация кислорода для митохондрий не намного выше предельно высокой концентрации для сульфатредуцирующих бактерий. Если уровень кислорода во внешней среде растет, увеличение размера позволяет сдерживать этот рост внутри организма и поддерживать там концентрацию кислорода на прежнем уровне.

Сами митохондрии тоже участвуют в сохранении этого равновесия. Когда-то они были свободноживущими бактериями, нашедшими пристанище и защиту внутри более крупных клеток. Однако соглашение было двусторонним: интернализованные бактерии получили защиту, но за счет активного дыхания снизили концентрацию кислорода в хозяйской клетке. Теперь эта связь намного сложнее, но митохондрии по-прежнему уменьшают содержание кислорода в клетке. Если митохондрии работают плохо, а кровь продолжает поставлять кислород с прежней скоростью, клетки подвергаются окислению. По мере старения организма митохондрии работают все хуже и клетки окисляются все сильнее. Такое окисление часто связывают с утечкой свободных радикалов из дефектных митохондрий, но оно может быть результатом повышения концентрации кислорода в остальных отделах клетки из-за ослабления потребления кислорода митохондриями.

Дышащие кислородом организмы не могут от него прятаться. Им требуется постоянный приток кислорода, который является их главным или единственным источником энергии. Поэтому прятаться не только невозможно, но и опасно. Необходимо найти другое решение для предотвращения или ограничения опасного воздействия свободных радикалов с помощью антиоксидантных ферментов или его устранения (второй и третий способы защиты от свободных радикалов из нашего списка). Сначала я расскажу о ферментах.

Два самых важных антиоксидантных фермента — супероксиддисмутаза и каталаза. Почти все без исключения организмы, проводящие какое-то время на воздухе, имеют гены этих двух ферментов. Наличие данных ферментов практически во всех аэробных клетках подчеркивает парадокс цианобактерий. Эти бактерии были первыми фотосинтезирующими организмами, расщепляющими воду и производящими кислород. Если они эволюционировали в лишенном кислорода мире, они должны были подвергаться опасному воздействию токсичного продукта собственного метаболизма. Ошибочность этого стандартного довода мы обсуждали в главе 7. Мы видели, что, скорее всего, цианобактерии уже были защищены от кислорода супероксиддисмутазой и каталазой. Эти и другие ферменты возникли как реакция на образование активных промежуточных соединений кислорода под действием ультрафиолетового излучения в самом начале развития жизни на Земле. Мы с вами обсудили наблюдения, подтверждающие наличие таких ферментов в клетках последнего универсального общего предка.

Супероксиддисмутаза (СОД) занимает особое место в биохимии свободных радикалов. В начале 1950-х гг., когда ученые впервые выдвинули гипотезу о влиянии свободных радикалов на старение и развитие заболеваний, доказать эту гипотезу было очень сложно. Свободные радикалы очень недолговечны. На протяжении многих лет об их существовании судили только по причиненному ими вреду, что является доказательством столь же ненадежным и противоречивым, как использование гигантских отпечатков на снегу для доказательства существования снежного человека. И вот в 1968 г. Джo Маккорд и Ирвин Фридович из Университета Дьюка в Северной Каролине показали, что сине-зеленый белок гемокупреин, долгое время считавшийся инертным отложением меди, обладает каталитической активностью. Он превращает супероксидные радикалы (О₂^-+) в пероксид водорода (Н₂О₂) и кислород. Несмотря на активные поиски, ученые не смогли найти никакого другого субстрата этого фермента. Скорость превращения супероксидного радикала под действием фермента совершенно невероятна. Эти радикалы неустойчивы и за несколько секунд взаимодействуют между собой с образованием пероксида водорода, но гемокупреин ускоряет эту естественную реакцию в миллиард раз. Это не могло быть случайностью[64]. Маккорд и Фридович переименовали фермент, назвав его супероксиддисмутазой (COД) в знаменитой статье, опубликованной в 1969 г. в Journal of Вiolоgiсаl Chemistry; по мнению многих ученых, это одно из важнейших открытий в биологии ХХ в., заслуживающее присуждения Нобелевской премии.

Это открытие изменило направление исследований. Если столь активный фермент, как СОД, эволюционировал специально для устранения супероксидных радикалов, значит, супероксидные радикалы играют важную роль в биологических системах. Внимательно поглядев вокруг, мы увидим, что свободные радикалы — нормальный элемент биологических систем и жизнь создала удивительно эффективные механизмы, чтобы с этими радикалами справляться. Ненужные приспособления со временем подвергаются мутациям, а этот механизм сохранился, следовательно, он был необходим с самого начала. Что произойдет, если COД по какой-то причине станет работать менее эффективно и допускать присутствие в клетках свободных радикалов? Старение? Смерть? Вариантов множество, и все они чрезвычайно неприятные.

Вскоре после открытия первого фермента были обнаружены и другие формы СОД. Вторую форму фермента выделили из бактерии Escherichia coli в 1970 г. опять-таки Маккордом и Фридовичем. На этот раз это был розовый марганецсодержащий фермент, но с такой же способностью устранять супероксидные радикалы. Удивительно, что многие эукариотические клетки имеют обе формы СОД. Спустя 30 лет, когда я пишу эту книгу, уже очевидно, что многие эукариоты синтезируют несколько типов СОД: обычно одна форма содержится в митохондриях, другая в цитозоле, а третья, секретируемая форма, выводится из клетки. Структура ферментов может в какой-то степени различаться, но в каталитическом центре всегда содержатся ионы металла: медь (и цинк в качестве структурного компонента), марганец, железо или никель.

Важную роль этих ферментов можно проиллюстрировать на примере так называемых «нокаутных» мышей, у которых отсутствует часть гена одной формы СОД. В 1996 г. Рассел Либовиц и его коллеги из Медицинского колледжа Бейлора в Хьюстоне сообщили, что мыши с врожденным дефектом митохондриальной формы СОД умирают через три недели после рождения. Такие мыши отличаются очень маленьким размером, выраженными признаками анемии, а также нарушением функции моторных нейронов, что приводит к слабости, быстрой утомляемости и, как выразился Либовиц, к «циркулирующему поведению»: мыши совершали круговые движения, поворачиваясь за собственным хвостом. При вскрытии выяснилось, что у них также имели место патологии сердечно-сосудистой системы и жировые отложения в печени. Митохондрии мышей, проживших более одной недели, были совершенно разрушены, особенно в тканях с высокой скоростью метаболизма, таких как сердечная мышца и головной мозг. «Нокаутные» мыши с другой мутацией того же гена не доживали и до пяти дней. У людей незначительные дефекты митохондриальной формы СОД связывают, среди прочего, с раком яичников и инсулинозависимым диабетом. Потеря цитозольной формы фермента не так страшна, хотя позднее тоже вызывает проблемы, такие как бесплодие, неврологические нарушения и рак.

Трудно подобрать более убедительные доказательства важнейшей роли СОД, однако изучение фермента еще раз показало необходимость согласованного действия разных антиоксидантов. СОД не ликвидирует токсичное вещество, а лишь позволяет в какой-то степени отсрочить решение проблемы. Продуктом реакции с участием СОД является пероксид водорода, который тоже опасен. Возникает вопрос, так ли это хорошо, если пероксид водорода накапливается в концентрации в миллиарды раз выше нормы. Известны ситуации, когда избыток СОД может представлять опасность. Например, у людей с синдромом Дауна имеется лишняя копия 21-й хромосомы. Мы не знаем точно, почему наличие дополнительной копии хромосомы приводит к таким серьезным последствиям, но знаем, что на этой хромосоме находится ген СОД, так что люди с синдромом Дауна синтезируют слишком много СОД. Синдром характеризуется окислительным стрессом, приводящим к неврологическим нарушениям. Возможно, люди с синдромом Дауна испытывают окислительный стресс именно по той причине, что у них слишком много этого фермента.

Однако в нормальных физиологических условиях весь образовавшийся пероксид водорода быстро удаляется каталазой, которая превращает его в кислород и воду. В главе 7 мы говорили о том, что существуют и другие ферменты, которые безопасным образом, без выделения кислорода, могут удалить пероксид водорода и органические пероксиды с помощью таких доноров электронов, как глутатион и витамин С. Список ферментов, способных расщеплять пероксиды, постоянно пополняется. Например, в 1988 г. Суе-Гоо Ре и его коллеги из Национального института сердца, легких и крови в США открыли новое семейство антиоксидантных ферментов, которые теперь называют пероксиредоксинами. В активном центре этих ферментов нет иона металла, зато есть два соседних атома серы, которые принимают электроны от маленького серосодержащего белка тиоредоксина. К середине 1990-х гг. похожие пероксиредоксины были выделены из представителей всех доменов жизни, так что и эти ферменты, по-видимому, уже были у LUCA. К настоящему времени известно не менее 200 генов родственных пероксиредоксинов и определена последовательность пяти человеческих генов.

Я упомянул о пероксиредоксинах еще и по той причине, что они позволяют найти ответ на давнишнюю загадку, касающуюся паразитов человека, таких как самый страшный возбудитель малярии Plasmodium falciparum и паразитический червь Fasciola hepatica. Когда эти паразиты попадают в организм человека, они подвергаются атаке кислородными радикалами, высвобождаемыми нейтрофилами и другими иммунными клетками. Эта атака настолько сильна, что может вызвать очень сильную воспалительную реакцию и жар, способные убить не только паразита, но и хозяина. Большинство паразитов защищаются с помощью антиоксидантных ферментов, таких как СОД, но, как ни странно, лишь у немногих есть каталаза для удаления пероксида водорода. В 1980-х гг. это казалось противоречием: действие СОД в отсутствии каталазы должно убивать паразитов, усиливая реакцию иммунной системы. Но этого не происходит. Паразиты одерживают верх. По-видимому, они имеют какой-то другой фермент, расщепляющий пероксид водорода. Поиски этого «недостающего звена» в конечном итоге привели к открытию пероксиредоксинов, которые с тех пор обнаружены у всех паразитов, не имеющих каталазы.

Понимание функции пероксиредоксинов помогает найти новые способы борьбы с паразитарными инфекциями. Например, одна из возможностей заключается в использовании в качестве вакцины фрагментов белков паразитов, которые отличаются от человеческих аналогов, что позволит иммунной системе атаковать один из ключевых бастионов антиоксидантной защиты паразитов.

Если перед клетками стоит задача обезвредить свободные радикалы, пока они не причинили непоправимого вреда, сочетание СОД и какого-либо фермента для удаления пероксида водорода является практически обязательным. Поскольку существует множество ферментов, способных расщеплять пероксид водорода, недостаточность каталазы переносится легче, чем недостаточность СОД. Более того, как мы видели, пероксид водорода опасен только в присутствии железа или меди, которые могут катализировать образование гидроксильных радикалов. В норме эти металлы удерживаются белками — ферритином и церулоплазмином. Микробиолог и эволюционист Томас Билински из Университета Люблина (Польша) считает, что удаление ионов металлов, возможно, является самым лучшим способом предотвращения образования гидроксильных радикалов. Но даже несмотря на все меры предосторожности, некоторое количество гидроксильных радикалов все же образуется. В главе 6 я отмечал, что скорость выведения окисленных фрагментов ДНК с мочой позволяет предположить, что ДНК ежедневно подвергается многочисленным «атакам» свободных радикалов. Даже с учетом экспериментальной ошибки следует признать, что ферментативная защита не является совершенной. Этот вывод подтверждается нашей зависимостью от таких пищевых антиоксидантов, как витамины Е и С. Технически их можно отнести к антиоксидантам, прерывающим цепные реакции, поскольку они гасят свободнорадикальные цепные реакции, уже начатые гидроксильными радикалами. Это третий механизм защиты из нашего списка.

Большинство антиоксидантов, прерывающих цепные реакции, действуют по тому же принципу, что и витамин С, — путем передачи электронов. Многие наиболее известные антиоксиданты, включая каротиноиды, флавоноиды, фенолы и танины, человек получает в составе растительной пищи. Сложно оценить участие каждой группы в поддержании антиоксидантного равновесия в организме, однако именно с этими веществами обычно связывают пользу овощей и фруктов. Но не все антиоксиданты данной группы мы получаем с пищей. Мочевая кислота, билирубин (пигмент желчи и продукт распада гема) и липоевая кислота являются продуктами нашего собственного метаболизма. Это не менее мощные антиоксиданты, чем витамины С и Е. Некоторые состояния, которые мы обычно рассматриваем в качестве патологических, например желтуха новорожденных, могут объясняться физиологической адаптацией. В частности, билирубин, накапливающийся в коже при желтухе, защищает младенца от окислительного стресса. Ребенок выходит из замкнутого и безопасного пространства матки в богатый кислородом внешний мир, но у него еще нет защиты, которую предоставляют пищевые антиоксиданты, поэтому ему нужен билирубин. Уродливый цвет синяка тоже связан с выделением билирубина, защищающего поврежденную ткань от окислительного стресса, поскольку антиоксиданты из крови могут не справиться с этой задачей.

Во многих случаях нам неизвестно точное соотношение вреда и пользы антиоксидантов, прерывающих цепные реакции. Например, мочевая кислота — это мощный антиоксидант, но в высокой концентрации она способствует развитию подагры, поскольку кристаллизуется в суставах. Иногда повышенный уровень мочевой кислоты считают фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку люди с высоким уровнем этого вещества в крови чаще других страдают от сердечных приступов. Впрочем, такая простая корреляция может оказаться ошибочной. Люди с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний обычно употребляют меньше пищевых антиоксидантов. Совершенно естественная реакция организма заключается в усилении выработки эндогенных антиоксидантов. Чем сильнее прогрессирует болезнь, тем больше мочевой кислоты нужно для ее преодоления, поэтому и наблюдается связь между тяжестью заболевания и содержанием мочевой кислоты в крови. Конечно, это лишь теоретическое рассуждение, но оно подчеркивает ошибочность линейных ассоциаций. В данном случае попытки снизить уровень мочевой кислоты в плазме без изменения рациона питания могут привести к негативным последствиям. Но если мы изменяем характер питания, мы не сможем прийти ни к какому строгому выводу относительно роли мочевой кислоты. Между количеством антиоксидантов и состоянием здоровья очень мало однозначных зависимостей.

Я уже несколько раз упоминал две небольшие серосодержащие молекулы — глутатион и тиоредоксин. Оба соединения отдают электроны, что позволяет либо регенерировать антиоксиданты, такие как витамин С, либо напрямую обезвредить пероксид водорода и органические пероксиды. Это совсем не рядовые игроки, а контролеры, стоящие на страже между генами и питанием, между здоровьем и болезнью. Пришло время познакомиться с ними поближе, поскольку именно они отвечают за два последних механизма антиоксидантной защиты из списка, который я привел в начале главы: механизм репарации и стрессовые реакции. Серу считают главным противовесом кислорода как внутри отдельных клеток, так и в более обширных экосистемах.

Я прошу прощения за единственный в книге параграф «чистой» биохимии и за слабую попытку возразить генетику Стиву Джонсу, который считает, что популяризировать биохимию невозможно. Эта тема несложная, но очень важная для понимания роли серы в молекулярных процессах в больной клетке. Я приведу единственный пример. Существует огромное множество других механизмов, которые сопрягаются с данным механизмом и либо ослабляют, либо усиливают сигнал. Тем не менее атомы серы играют очень важную роль в системе проведения сигнала и поэтому активно изучаются.

Сера в связи с водородом (-SH) входит в состав лишь одной из 20 основных аминокислот — ничем не примечательной маленькой молекулы цистеина, состоящей из 14 атомов. Единственная SH-группа цистеина называется тиогруппой (а также тиоловой, или сульфгидрильной, группой). Тиолы — очень нежные, легко окисляющиеся соединения. Я представляю их в виде одуванчиков, тихонько покачивающих желтыми серными головками. Окисление тиолов может привести к одному из двух результатов. Во-первых, при удалении атома водорода (протона и электрона) два соседних серных обрубка могут связываться друг с другом, образуя так называемую дисульфидную связь (дисульфидный мостик). В присутствии кислорода дисульфидные мостики более устойчивы, чем неокисленные тиолы, и очень важны для стабилизации трехмерной структуры внеклеточных белков. Во-вторых, тиолы могут подвергаться так называемому S-нитрозилированию, открытому в конце 1990-х гг. благодаря работам Джонатана Стемлера — последнего из биохимиков Университета Дьюка, сформировавших биохимию свободнорадикальных процессов. Стемлер и его коллеги считают, что окислительный стресс усиливает выработку еще одного свободного радикала — оксида азота (NO⁺). Сам по себе этот радикал не очень активен, но в синергизме с другими радикалами окисляет тиолы. В таком случае продуктом реакции оказывается не дисульфидная связь, а тоже вполне устойчивый S-нитрозотиол (-SNO). Образование дисульфидных мостиков или S-нитрозотиолов приводит к обратимой модификации структуры белка. Присоединение атомов водорода из глутатиона или тиоредоксина позволяет вернуть исходные тиоловые группы.

Структура белков напрямую связана с их активностью, поэтому тиогруппы определяют не только структуру белков, но и их активность. Другими словами, окислительное состояние тиолов может служить молекулярным переключателем активности белков, содержащих тиогруппы. Список белков с чувствительными тиогруппами продолжает расти, и к их числу относятся некоторые важнейшие транскрипционные факторы (белки, связывающиеся с ДНК и стимулирующие транскрипцию генов для синтеза новых белков). Способность этих факторов проникать в ядро клетки и связываться с ДНК зависит от состояния тиогрупп.

Внутри здоровой клетки содержится множество тихонько покачивающихся тиогрупп. Они находятся в неокисленном состоянии под присмотром глутатиона и тиоредоксина. Любая окисленная «по ошибке» тиогруппа тут же возвращается в исходное состояние. Глутатион и тиоредоксин образуются за счет энергии клеточного дыхания, как мы видели в главе 9 при обсуждении витамина С. В норме на это отводится небольшая часть клеточных ресурсов. Однако в условиях окислительного стресса ситуация резко изменяется.

Что происходит в клетке при окислительном стрессе? Источником стресса может быть избыток кислорода, инфекция или болезнь. Но результат один и тот же — повсюду разбегаются свободные радикалы. В работу сразу включаются антиоксиданты, такие как витамин С, обрывающие цепные реакции. Они регенерируются при участии глутатиона, но потери неизбежны. При исчерпании запаса антиоксидантов свободные радикалы производят еще более значительные разрушения. Начинают окисляться тиоловые группы белков. Некоторые восстанавливаются глутатионом и тиоредоксином, но равновесие сдвигается. Это зона вооруженного конфликта. Защитники не могут каждую ночь восстанавливать разбомбленные мосты. Уже в половине клеточных белков тиогруппы окислены, и активность этих белков выключена в ожидании конца войны. Другие белки включены. На защиту последнего бастиона, ядра, встает ополчение — транскрипционные факторы. Они связываются с ДНК в ядре и стимулируют синтез новых белков. Но каких белков? Выбор далеко не случайный. Клетке нужно принять серьезное решение: продолжить борьбу или покончить с собой (этот процесс называется апоптозом) во имя процветания всего организма. Решение зависит от вероятности успеха, в частности от количества и состояния транскрипционных факторов в ядре. Афоризм Ницше действует и на молекулярном уровне: что нас не убивает, делает нас сильнее.

Если клетка решает продолжить борьбу, а не умереть непобежденной, она применяет набор защитных мер, который одинаков у всех живых организмов — от Е. coli до человека. На настоящий момент защитная система Е. coli изучена лучше других — отчасти по той причине, что бактериальные гены организованы в функциональные кластеры, называемые оперонами. Гены в таких кластерах легче идентифицировать. Окисление тиогрупп приводит к активации двух основных транскрипционных факторов Е. соli. Один из них представляет собой содержащий тиогруппу белок под непонятным названием OxyR, другой — белок SoxRS с серой в составе железосерного кластера. В окисленном состоянии эти два фактора контролируют транскрипцию десятка генов, продукты которых усиливают антиоксидантную защиту клетки.

Список человеческих транскрипционных факторов, активность которых контролируется путем окисления тиогрупп, постоянно растет и включает в себя NFκ(каппа)В, Nrf-2, АР-1 и Р53. Для нашего рассказа самыми важными являются NFκB и Nrf-2. NFκB руководит реакцией на стресс путем активации генов нескольких «агрессивных» воспалительных молекул и нескольких защитных антиоксидантов. Nrf-2 играет исключительно защитную роль, в частности отключает гены воспалительных молекул. Таким образом, оба фактора усиливают клетку, но за счет противоположных действий. Они — как два генерала в военном штабе: один выступает за тотальную войну, другой занимает миротворческую позицию. Результат зависит от того, насколько каждому из них удастся убедить остальных членов штаба. В случае транскрипционных факторов это определяется количеством активированных белков. Если в ядро попадает 1000 белков, активированных NFκB, и только 100 белков, активированных Nrf-2, клетка начнет войну, запуская воспалительную реакцию против захватчиков и усиливая собственную защиту. Если побеждает Nrf-2, клетка выстраивает баррикады и ждет нападения. В любом случае дополнительная защита обеспечивает немедленное преимущество, но также позволяет оказывать сопротивление в будущем, вне зависимости от характера нападения. Предупрежден — значит, вооружен.

Каковы же продукты этих защитных генов? Некоторые из них пока не идентифицированы, с другими мы уже знакомы. Как можно догадаться, активизируется синтез СОД, каталазы и других антиоксидантных ферментов. Новые метаболические белки сопрягают клеточное дыхание с регенерацией глутатиона и тиоредоксина. Синтезируются дополнительные, находящие и связывающие свободное железо белки, а кроме того, ряд индуцируемых стрессом белков («стрессовых белков»), которые занимаются спасением того, что можно спасти, как спасательная служба после бомбардировки. Безнадежно испорченные белки направляются на расщепление и реутилизацию. Те, что повреждены, но подлежат восстановлению, упаковываются правильным образом при помощи белков-шаперонов. Другие белки занимаются починкой ДНК, отщепляя окисленные фрагменты, заменяя негодные участки и зашивая разрывы.

Все эти действия направлены на восстановление нормального физиологического состояния клетки, однако (за исключением активности антиоксидантных ферментов) неэффективны в случае длительных военных действий. Впрочем, существуют белки, которые могут подготовить клетку к будущим нападениям. Два самых мощных — металлотионеин и один из вариантов гемоксигеназы, стрессовый белок НО-1. Эти белки усиливают сопротивляемость клетки по отношению к целому спектру возможных неприятностей — от загрязнения тяжелыми металлами до ионизирующего излучения и инфекции, — которые связаны между собой тем, что могут вызывать окислительный стресс. Эти белки — более мощная защита, чем любые пищевые антиоксиданты, однако их включение требует введения «комендантского часа», сопряженного с прекращением нормальной физиологической деятельности клетки.

К сожалению, арьергардный бой может приводить к неожиданным последствиям: антиоксиданты в составе пищевых добавок способны усиливать некоторые заболевания. Дело в том, что сигналом к синтезу металлотионеина и гемоксигеназы служит окисление тиогрупп. Тиогруппы окисляются тогда, когда заканчиваются запасы антиоксидантов. Поэтому прием антиоксидантов может подавить сигнал путем восстановления тиогрупп, что лишает клетку ее самых надежных союзников. Это не пустая фантазия и не метафора. Роберто Моттерлини и Роберта Форести из Института медицинских исследований в Нортвик Парке в Лондоне показали, что добавление антиоксидантов к клеткам, находящимся в состоянии окислительного стресса (особенно антиоксидантов, способных регенерировать тиогруппы, таких как N-ацетилцистеин), мешает клетке синтезировать гемоксигеназу и делает ее более уязвимой. В человеческом организме подавление или прекращение синтеза гемоксигеназы может вызвать катастрофические последствия.

О важности таких ферментов можно судить по одному удивительному случаю, о котором сообщали исследователи из Университета Канадзавы (Япония) в 1999 г. Это первый зарегистрированный случай недостаточности гемоксигеназы у человека. У несчастного шестилетнего мальчика наблюдалось замедление роста, дефект свертывания крови, гемолитическая анемия и серьезное поражение почек. И все эти беды были связаны с отсутствием одного фермента, который синтезируется только во время окислительного стресса. Похожие проблемы возникают и у животных. Кеннет Посс и Сусуми Тонегава из Массачусетского технологического института показали, что «нокаутные» мыши с дефектной гемоксигеназой страдают от серьезных воспалительных заболеваний, напоминающих гемохроматоз у человека (избыточное содержание железа в организме, см. главу 9). У лишенных гемоксигеназы мышей наблюдается значительное накопление железа в тканях и органах, приводящее к патологическому увеличению селезенки, фиброзу печени, различным иммунным нарушениям, потере веса, ограничению подвижности и преждевременной смерти. Кроме того, у них на 25% уменьшен размер семенников по сравнению с нормальными животными из того же помета и отсутствует либидо, что характерно и для людей с наследственным гемохроматозом.

Поскольку недостаточность гемоксигеназы имеет столь серьезные последствия, возникает вопрос, не является ли некоторая степень окислительного стресса нормой. В таком случае уровень гемоксигеназы должен изменяться по механизму саморегуляции. Как мы увидим в главе 15, постоянно высокий уровень гемоксигеназы, возможно, оказывает благотворное влияние на состояние нашего здоровья в старости.

Мы прошли долгий путь, начав с обсуждения функций витамина С. Я надеюсь, эта глава позволила вам рассеять представление об антиоксидантах как о пищевых добавках, которые помогают жить вечно. Все наше тело — машина по производству антиоксидантов, начиная от отдельной клетки и заканчивая организмом в целом. Осознать это мешает наше глубоко укоренившееся, наивное желание найти единственную цель, но в биологии так бывает редко. Мы привыкли считать, что машина нужна, чтобы ездить, работа — чтобы зарабатывать деньги, жизнь — чтобы жить. Для нас митохондрии — аппарат для выработки энергии, гемоглобин — белок для доставки кислорода, а витамин С — антиоксидант для защиты от свободных радикалов. Я сравнивал кожу со слоем мертвых клеток в строматолите. Это сравнение вполне оправданно. Мы не можем дышать через кожу, как рептилии. Однако кожа — еще и барьер, предотвращающий испарение жидкости и проникновение инфекции, а также важный эстетический элемент. Очень немногие структуры или молекулы служат всего для одной-единственной цели, по крайней мере в биологии, и следует избавляться от привычки искать эту единственную цель. Кроме того, не нужно пытаться всегда давать четкое (и, следовательно, одномерное) определение различных понятий.

В главе 9 мы говорили о том, что витамин С выполняет разные функции, за которыми стоит одно и то же молекулярное действие. То же самое можно сказать о СОД, каталазе или гемоксигеназе. На молекулярном уровне их действие всегда одинаковое, но результаты могут быть разными и служить для решения совершенно разных задач. Например, действие СОД очень простое — удаление супероксидных радикалов. Но результат — не только антиоксидантная защита, но и передача сигнала. Если скорость образования свободных радикалов превышает скорость их удаления при участии СОД, некоторые радикалы могут окислять тиогруппы в белках, заставляя транскрипционные факторы немедленно перемещаться в ядро. В ядре эти факторы связываются с ДНК и стимулируют синтез новых белков, которые помогают восстановить нормальное состояние клетки. Другими словами, клетка адаптируется к небольшим изменениям условий, таким как незначительное усиление окислительного стресса, путем изменения белкового состава. Поможем ли мы клетке, если блокируем этот путь за счет приема избытка СОД или других антиоксидантов? Кто знает. Мы уже видели, что такое действие может вызвать негативный эффект: окисление тиогрупп активирует синтез гемоксигеназы. Если концентрация гемоксигеназы зависит от окислительного состояния клетки, нарушение этого хрупкого равновесия может притупить ответ организма на внезапные сильные изменения, например при инфекционном заболевании. Возможно, именно поэтому так сложно подтвердить обнаруженное Полингом защитное действие витамина С при обычной простуде. Вред от подавления синтеза таких стрессовых белков, как гемоксигеназа, может пересиливать всю пользу витамина С.

Но при всей неопределенности нельзя отрицать, что употребление в пищу овощей и фруктов оказывает на человеческий организм благотворное влияние. И если это имеет какое-то отношение к работе антиоксидантов, приходится признать, что наша с вами машина по производству антиоксидантов далека от совершенства. Возможно, дополнительные антиоксиданты ликвидируют оставшиеся свободные радикалы, которые в противном случае могли бы повреждать ДНК и белки, снижая жизнеспособность клеток и всего организма в целом. Однако может оказаться, что польза фруктов связана совсем с другими факторами, например со слабыми токсинами, стимулирующими образование стрессовых белков. Токсины предохраняют фрукты от поедания раньше времени или не теми животными, для которых они предназначены. Возможно, именно комбинация антиоксидантов и слабых токсинов объясняет пользу фруктов, и совершенно очевидно, что этот благотворный эффект невозможно воспроизвести с помощью пищевых добавок.

Полстолетия назад пионер в области свободнорадикальных процессов в биологии Ребека Гершман задавалась вопросом, не может ли постепенное ослабление антиоксидантной защиты быть одним из факторов, вызывающих старение и смерть. Эта идея лежит в основе свободнорадикальной теории старения. Я надеюсь, вы поняли, что наша антиоксидантная защита гораздо сложнее, чем могли предположить Гершман или даже Полинг. Осознание этой сложности — результат активного развития молекулярной биологии. Но мы все еще не знаем, можно ли замедлить старение, предотвращая ослабление антиоксидантной защиты, или некоторая степень ослабления необходима для сопротивления стрессу. Если прерывание цепных реакций не столь важно, как реакция на стресс, нельзя ли замедлить старение путем прямого воздействия на стрессовые реакции? Вооружившись новыми знаниями о роли антиоксидантов, мы рассмотрим эти вопросы в следующих четырех главах.