Эпигенетика

1.1. Сходство растений и животных по организации (эпи)генома

Как только биология сформировалась как наука, животные и растения были разделены на два царства, и это деление традиционно утвердилось при обучении биологов зоологии или ботанике. Для такого разделения нашлись и подходящие аргументы, такие, например, как гетеротрофная (нуждающаяся в органической материи) выработка энергии у животных против автотрофной у растении, подвижность по сравнению с неподвижным образом жизни растений, потенциально мигрирующие и эластичные клетки животных против неподвижных и жестких клеток растений. Однако за последние десятилетия генетики и молекулярные биологи обнаружили существенные сходства между животными и растениями, которые оказались весьма удивительными в свете долгого эволюционного размежевания между ними. Общими для тех и других являются половое размножение путем мейоза или оплодотворения и регуляция индивидуального развития некоторыми главными генами, которые контролируют деление и размножение клеток некими родственными факторами, а также восприятие факторов среды с помощью сходных сигнальных каскадов. Это сходство распространяется и на многие черты организации генома и эпигенома.

Поразительное сходство выявляется между теми растениями и животными, которые сравнимы по размеру и степени сложности организации генома и по доле гетерохроматина. Как и у многих других эукариот, эу- и гетерохроматин характеризуются специфическим ацетилированием и метилированием гистонов, кроме того в гетерохроматине животных и растений ДНК еще значительно метилирована. При сравнении геномной организации и эпигенетической регуляции у разных модельных систем (организмов) выяснилось, что у растений и животных существует гораздо больше общих черт, чем у разных животных (табл. 9.1). Поэтому с антропоцентрической точки зрения адресованные животным и растениям вопросы могут быть очень сходными, а полученная базовая информация часто может быть обоюдно использована и для тех, и для других.

1.2. Растения предоставляют дополнительные направления эпигенетических исследований

Наряду с общими для животных и растений элементами растения приобрели некие особенности, относящиеся к эпигенетическим феноменам. В то время как у животных оплодотворение осуществляется путем слияния двух гаплоидных клеток, которые возникли в результате непосредственно предшествующего мейоза, у растений существует гаплоидная (гаметофит) фаза роста между мейозом и оплотворением (рис. 9.1). Гаметофит представляет собой прорастающее пыльцевое зерно (мужская линия) и эмбриональный мешок (женская линия), каждый из которых имеет несколько гаплоидных ядер, которые образуются из мейотических продуктов вследствие двух или трех последовательных митозов, соответственно. На стадии гаметофита утрата генетической или эпигенетической информации не может компенсироваться информацией на гомологичных хромосомах или аллелях. Хотя исчерпывающие исследования в этой области знаний еще не проведены, тем не менее доказательств массивной утраты эпигенетических признаков во время гаметогенеза у растений, в отличие от животных, еще нет. Это может объяснить, почему у растений эпигенетические изменения часто передаются в результате мейоза.

(At) Arabidopsis thaliana, (Cb) Caenorhabditis briggsae, (Ce) Caenorhabditis elegans, (Dm) Drosophila melanogaster, (Hs) Homo sapiens, (Os) Oryza saliva, (Pp) Pristionchus pacificus.

^a Repeat-индуцированная точечная мутация, см. главу 6.

⁶ Хромосомная или геномная специфичность.

^в Мутированная Dnmt2.

^г Dnmt2 (Рр) и MBD-доменные белки (Се. СЬ, Рр). ^д Dnmt2 (Рр) и MBD-доменные белки.

Другая определенная отличительная черта растений — менее четко очерченная зародышевая линия и ее отделение от соматических клеток только на поздней стадии развития (рис. 9.1). У растений в точках роста на кончиках побегов и корней имеются апикальные меристемы, из которых образуются новые ткани и органы. Апикальная меристема побега дает начало цветкам, которые образуют гаметы для полового размножения, могут вырастать и дополнителные латеральные меристемы и образовывать цветы. У многих растений появились специализированные органы — ризомы, клубни или луковицы, которые имеют меристемы. Эти механизмы вегетативного размножения могут быть даже более общими и эффективными, чем размножение семенами. Зародыши могут образоваться не только в результате развития оплодотворенной яйцеклетки, но и из соматической ткани (соматический эмбриогенез). В тканевой культуре некоторые дифференцированные соматические клетки могут дедифференцироваться и перепрограммироваться в сторону альтернативной дифференцировки. Поэтому соматическое клонирование, пока еще мало эффективное у животных, широко распространено у многих видов растений, и с годами могут быть воспроизведены бесчисленные «зеленые Долли». Однако у клонированных казалось бы генетически униформных популяций растений набюдается выраженная фенотипическая изменчивость. Эта так называемая «сомаклональная вариабельность» имеет четкую эпигенетическую основу и потенциально может быть использована в селекции и адаптации растений (см. обзор Kaeppler et al., 2000)

^{Рис. 9.1. Особенности жизненного цикла растения}

^{Растения могут размножаться половым путем (образование гамет, оплодотворение и образование семян (правая часть рисунка) и бесполым (соматическим) путем (вегетативное размножение, де- и редифференцировка или эмбриогенез (левая часть рисунка). Тело высшего растения (корни, стебель, цветок) — диплоидный спорофит. При мейозе число хромосом уменьшается вдвое. Если у животных продукты мейоза образуют гаметы без дальнейшего деления и они сливаются с образованием диплоидного ядра, то у растений образуются гаплоидные мужской или женский гаметофиты в результате двух или трех митотических делений, соответственно. В конечном итоге пыльцевая трубка содержит одно вегетативное (белое) и два генеративных (черные) ядра. Два генеративных ядра оплодотворяют яйцеклетку (черная) и формируется центральная клетка с диплоидным ядром, произошедшим в результате слияния двух полярных ядер (желтые) Таким образом, в результате этого двойного оплодотворения и образуются диплоидный зародыш и триплоидный эндосперм, который снабжает развивающийся зародыш питанием. После прорастания семени зародыш дает начало новому спорофиту. Кроме того, большинство растений способны размножаться вегетативно благодаря активации покоящихся латеральных меристем, выросту специализированных корневых структур (клубни), амплификации в тканевых культурах или даже регенерации из индивидуальных соматических клеток после удаления клеточной стенки (протопласты). У растений часто наблюдается эндоредупликация, которая приводит к образованию полиплоидных клеток или тканей Химерные растения можно получить с помощью прививки. Поэтому генетическая и эпигенетическая информация у растений проходит гораздо меньше четко определенных путей развития зародышевой линии, чем у животных}

Еще одна отличительная черта растений — существование плазмодесм (цитоплазматические мостики между клетками), которые проницаемы для небольших молекул, некоторых белков, РНК и вирусной геномной информации. Несмотря на большую взаимосвязанность, побеги растений можно срезать и привить на генетически отличные подвои (рис. 9.1). Это приведет к образованию химер, у которых вегетативные и генеративные ткани генетически различны. Поэтому хотя эпигенетические признаки и передаются по зародышевой линии, у растений они более изменчивы и обратимы, чем у животных.

Растения более толерантны к полиплоидии (умножение полного хромосомного набора), чем животные. У растений встречается множество диких и культурных полиплоидных видов (пшеница, хлопчатник, картофель, арахис, сахарный тростник, табак и другие). Полиплоидность дает им некоторые преимущества. При исследовании нуклеотидных последовательностей многих растительных геномов, включая маленький геном Arabidopsis thaliana, получены четкие доказательства дупликации исходного генома и генов. Даже диплоидные растения могут иметь полиплоидные клетки, которые возникают гораздо чаще, чем некоторые высокоспециализированные полиплоидные клетки у млекопитающих. Образование полиплоидов часто связано со значительными генетическими и эпигенетическими изменениями (см. обзор Adams and Wendel, 2005). Некоторые из этих изменений могут произойти на протяжении одного или нескольких поколений и они важны для быстрой адаптации и эволюции растений.

1.3. Растения лучше выносят некоторые методологические манипуляции, которые очень трудно применимы к млекопитающим

У животных генетические манипуляции ограничены из-за процедур, требующих генерацию мутаций и спаривание для получения гомозиготных генотипов, которые обязательны для проявления рецессивных признаков. Напротив, у растений возможен эффективный мутагенез путем химических или физических обработок или в основном с помощью хаотичных вставок помеченных трансгенов или транспозируемых элементов. Вследствие самоопыления

в последующем поколении легко появляются потомки с гомозиготными мутациями растения и расщеплением признаков по закону Менделя. Поиск мутаций в эпигенетических регуляторах основан на восстановлении экспрессии у эпигенетически инактивированных маркерных генов или снижении активности стабильно активных репортерных генов. В дополнение к такой прямой объективной методологии, быстро растущие коллекции инсерционных мутантов с определенными сайтами интеграции позволяют осуществлять обратный генетический анализ мутационных эффектов в избранных определенных генах-ортологах эпигенетических регуляторов у других модельных организмов (табл. 9.2).

^{Рис. 9.2. Изучение эпигенетического контроля у растений}

^{Гены, кодирующие окраску тканей у растений, позволяют довольно просто и недорого анализировать экспрессию генов in vivo (а) Экспрессия гена дигидрофлавонолредуктазы (DFR) отвечает за темнопурпурную окраску цветков петунии, а при замалчивании промотора этого гена цветки становятся пестрыми, светлоокрашенными (любезно предоставлено Kooter) (б) У Arabidopsis с экспрессией гена (CHS) халконсинтетазы семена имеют темную оболочку, а после замалчивания этого гена в результате интеграции гомологичного трансгена они становятся желтыми (любезно предоставлено lan Fumer). (в) Растения кукурузы с В-1 геном имеют пурпурную пигментацию, а растения с парамутагенным инактивированным В’ геном зеленые, (г) Початок кукурузы с сегрегированной вставкой транспозона (Spm) в гене В-Peru, необходимом для образования антоцианового пигмента. Пурпурные зерна представляют собой ревертанты, у которых в гене зародышевой линии вырезан Spm элемент. Сильно пятнистые зерновки содержат активный Spm элемент, который часто индуцирует соматическое вырезание соответствующих секторов при созревании зерновки. Зерна с редкими небольшими пурпурными участками представляют собой зерновки, у которых Spm элемент эпигенетически зарепрессирован (любезно предоставлено Vicky Chandler), (д) Темная окраска соевых бобов (в середине рисунка) уменьшается у культивируемых разновидностей сои (слева) в результате природного посттранскрипционного сайленсинга CHS гена, она может частично восстанавливаться при заражении родительского растения вирусом с PTGS супрессорным белком, обусловливающим пеструю окраску (справа), (е) Эпигенетическая регуляция может отражаться и в морфологии растений: сниженное функционирование субъединицы фактора сборки хроматина приводит к образованию «сросшегося» стебля у Arabidopsis, (ж) реактивация (снятие сайленсинга) трансгенного маркера устойчивости у Arabidopsis может быть выявлена по росту растения на селективной среде (с, перепечатано с разрешения Chandler et al., 2000 [Springer Science and Business Media]; д перепечатано с разрешения Senda etal., 2004 [©American Society of Plant Biologists].)}

Число членов в семействе гомологичных генов может быть весьма различным у животных и растений. Вследствие функциональной избыточности некоторые мутации могут быть не столь серьезны как у животных, так и у растений. Это важно, если потеря функции сопровождается утратой индивидуума до анализа в раннем развитии. Экспрессию относительно мало значимых генов, например, отвечающих за окраску растительных тканей, можно просто и недорого выявлять in vivo (рис. 9.2а—д). К тому же тысячи растений могут быть проанализированы в селекционных опытах путем выявления экспрессии эндогенных или трансгенных черт (рис. 9.2ж).

Знание нуклеотидной последовательности генома A. thaliana, наряду с анализом некоторых больших коллекций инсерционных мутантов, и простой мутагенез сделали это растение прекрасной моделью для изучения эпигенеза у растений. Последующие рассуждения касаются эпигенетических модификаторов, функции которых стали известны в результате анализа мутантов, дефектных по трансгенному сайленсингу (замалчиванию генов) и благодаря биоинформационной идентификации гомологии с генами, необходимыми для сайленсинга у других организмов, и обнаружению сходных фенотипов развития у других дефектных по сайленсингу мутантов Arabidopsis в результате прямого и обратного скрининга (табл. 2). Для ознакомления с полным перечнем хроматиновых генов Arabidopsis, риса и кукурузы читатель может быть адресован к Plant Chromatin Database (http://www.chromdb.org).

1.4. Исследование растений внесло самый значимый вклад в эпигенетику

Самый ощутимый вклад в эпигенетику при исследовании различных растительных моделей внесли сведения из семеноводства. Определенные данные о различии организации эу- и гетерохроматина были получены в результате цитологического анализа мхов (Heitz, 1928). Первым доказательством так называемой неменделевской генетики (см. обзор Chandler and Stam, 2004) было обнаружение наследуемой, но обратимой экспрессии генов при взаимодействии аллелей у томатов и кукурузы, позднее названной парамутацией; это же выявлено теперь и у млекопитающих. Постоянное появление у растений цветков с измененной симметрией («peloria» или монстры) описано еще Карлом Линнеем; сегодня это могло бы объясняться образованием эпиаллели — стабильной эпигенетической модификацией регуляторного гена с такой же нуклеотидной последовательностью, как и у экспрессируемого гена (Cubas et al., 1999). В результате цитологического анализа растений выявлены существенные изменения во вторичной организации хромосом, которые оказались связанными с ядрышковым доминированием, с замолканием одного из наборов родительских генов рибосомных РНК у межвидовых гибридов, что определяется эпигенетической регуляцией (Pikaard, 2000). Пионерские исследования лауреата Нобелевской премии Барбары МакКлинток и других ученых транспозиции генетических элементов у кукурузы выявили множественные связи между генетикой и эпигенетической регуляцией (Fedoroff and Chandler, 1994). На самом деле именно анализ теперешних транспозонов и их дегенерированных останков послужил основанием для выявления эпигенетических модификаций в растительных геномах (раздел 3.4).

Когда техника трансгеноза стала уже рутинной в конце 1980 годов, благодаря использованию генетических маркеров были неожиданно достигнуты значительные успехи в исследовании эпигенетики табака, петуньи и арабидопсиса (Jorgensen, 2003; Matzke and Matzke, 2004). Была сформулирована концепция гомологичного замалчивания генов, когда стало ясно, что замалчивание генов часто коррелирует с наличием множественных копий связанных или несвязанных трасгенов. Разные случаи гомологичного замолкания генов обусловлены либо усиленным обменом мРНК (посттранскрипционное замалчивание генов, ПЗГ, PTGS) или репрессией транскрипции (транскрипционное замалчивание генов, ТЗГ. TGS). Оба эти процесса коррелировали с увеличением цитозинового метилирования молчащих генов. Наиболее яркий пример ПЗГ у трансгенной петунии вначале был назван «косупрессией». Были осуществлены попытки изменить окраску цветков путем усиления экспрессии генов халконсинтазы (CHS), определяющих пурпурную окраску лепестков, от пестрой до почти полностью белой. Потеря окраски была обусловлена скоординированным замалчиванием CHS трансгена и эндогенного CHS гена (Jorgensen, 2003). ПЗГ связано с интерферирующими РНК (PHKi), которые позже выявлены у Caenorhabditis elegans и других организмов (раздел 3.2).

В середине 1990-х годов была выявлена связь между ПЗГ и устойчивостью к вирусам. ПЗГ оказалось природным механизмом защиты растений от несанкционированной репликации вирусов, которые могут быть как индукторами, так и мишенью для ПЗГ. Это было установлено в опытах по замалчиванию генов у растений путем использования специально сконструированных вирусных векторов с последовательностями, гомологичными генам-мишеням, что и приводило к индуцированному вирусом замалчиванию генов ((VIGS; Burch-Smith et al., 2004). Наряду с этим было открыто метилирование ДНК, направляемое РНК (RdDM) у зараженных вироидами растений. Это послужило первым указанием на то, что РНК, воздействуя на ДНК по принципу обратной связи, может вызывать эпигенетические модификации (Wassenegger et al., 1994). Этот принцип был успешно использован для транскрипционной инактивации и метилирования промоторов с помощью специальных двутяжевых РНК (раздел 3.4, Управляемое РНК метилирование ДНК).

Ранее мы уже упоминали многие компоненты систем эпигенетической регуляции у растений, которые были выявлены в результате анализа мутаций у арабидопсиса (табл. 9.2). Однако результаты скрининга мутантов могут выявлять не все эпигенетические модификаторы из-за функционального разнообразия больших семейств генов или летальных последствий утраты существенных генетических компонентов.

2.1. Регуляторы метилирования ДНК у растений

Метилирование 5-го углеродного остаткав цитозине ДНК— признак эпигенетической инактивации и гетерохроматина у растений и животных (табл. 18.1). Однако у растений метилирование ДНК имеет ряд уникальных черт в отношении характера (профиля) метилирования ДНК. ферментов ДНК-метилтрансфераз и возможности обратимости метилирования в неделящихся клетках (Chan et al., 2005). В этом разделе мы описываем белки, необходимые для генерации, поддержания, интепретации и «стирания» картины метилирования ДНК Специальные компоненты для PHК-направляемого метилирования ДНК представлены в разделе 3.4.

Различают de novo и поддерживающее метилирования ДНК De novo метилирование осуществляет модификацию прежде неметилированных последовательностей ДНК (рис. 18.1). У растений это метилирование может затрагивать CpG, CpNpG и CpNpN последовательности (где N - А, Т или С). В отличие от растений у животных метилирование ДНК, в основном ограничивается CpG динуклеотидами и пока нет сведений о существенном метилировании цитозиновых остатков в асимметричных CpNpN сайтах. Хотя природа сигналов, запускающих de novo метилирование ДНК, в основном пока еще неизвестна, однако у растений эту роль могут выполнять двутяжевые РНК (раздел 3.4). Поддерживающее метилирование сохраняет картину (pattern) метилирования генома при репликации ДНК и особенно эффективно затрагивает CpG и CpNpG нуклеотидные последовательности, обладающие палиндромной симметрией. Поддерживающему метилированию подвержены полуметилированные ДНК после репликации или репарации, у которых «гидом» для узнавания метилируемых сайтов в новообразованной цепи служат метилированные цитозиновые остатки в материнской цепи. Хотя считается, что у растений de novo и поддерживающее метилирования ДНК осуществляются разными ферментами, тем не менее, есть мнение и о том, что ферменты с различной сайтовой (CpG или не CpG) специфичностью могут часто делать то и другое.

У растений имеются три консервативных семейства ДНК-метилтрансфераз. Ферменты из семейства МЕТ1 ДНК-метилтрансфераз — гомологи животных ДНК-метилтрансфераз типа Dnmt1 (глава 18) в основном являются поддерживающими CpG метилирование ДНК ферментами, хотя одна из них участвует в de novo CpG метилировании при направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 3.4). Класс Dnmt2 ферментов, из которых один закодирован в геноме арабидопсиса, представлен семейством наиболее широко распространенных и высоко консервативных ДНК-метилтрансфераз (табл. 9.2), функция которых все еще не известна. Растительные DRM (domains rearranged methyltransferases) ДНК-метилтрансферазы и их гомологи ферментов (группа Dnmt3) млекопитающих обычно рассматриваются как de novo метилтрансферазы. Эти ферменты катализируют метилирование цитозиновых остатков во всех контекстах и участвуют в направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 4). Как это следует из названия, домены в этих ферментах реаранжированы: в отличие от Dnmt3 у DRM белков домены I-V следуют за доменами VI-X. Это может придавать этим ферментам способность метилировать асимметричные CpNpN нуклеотидные последовательности, которые в клетках млекопитающих не метилируются. Специфичная для растений хромометилаза СМТЗ модифицирует цитозиновый остаток в тринуклеотиде CpNpG. Подобно ферменту МЕТ1 эта метилтрансфераза участвует как в de novo, так и в поддерживающем метилировании ДНК. Истинная функция СМТЗ все еще не совсем ясна, хотя известно, что утрата ее активности у соответствующих мутантов сопровождается реактивацией некоторых молчащих транспозонов (Chan et al., 2005).

В отличие от млекопитающих, у которых dnmtl и dnmt3 мутанты погибают во время эмбрионального развития или сразу же после рождения животного, растительные мутанты met1, cmt3 и drm жизнеспособны и обычно даже фертильны. Такая жизненность дефектных по ДНК-метилтрансферазам растительных мутантов позволяет более экстенсивно анализировать роль таких мутаций во время развития и половой репродукции растений, что вообще невозможно сделать в отношении млекопитающих (Chan et al., 2005).

Эпигенетическая регуляция свидетельствует о том, что активное или неактивное состояния генов потенцильно обратимы. Метилирование ДНК разрешает такую обратимость, потому что оно может пассивно или активно утрачиваться. Пассивная утрата происходит, когда метилирование невозможно в течение нескольких раундов репликации. Напротив, активное деметилирование может протекать в неделящихся клетках при наличии соответствующих энзиматических активностей. Относительно недавние сведения из биохимии животных указывают на то, что активное деметилирование может осуществляться под действием ДНК-гликозилаз, которые обычно участвуют в эксцизионной репарации ДНК путем выстригания оснований (Kress et al., 2001). Интерес к этому механизму вспыхнул вновь после открытия у арабидопсиса Demeter (DME) и репрессора сайленсинга (ROS1), которые представляют собой крупные белки с ДНК-гликозилазными доменами. ROS1 ген был идентифицирован при скрининге мутаций, приводящих к эпигенетической down-регуляции и гирперметлированию стабильно экспрессируемого репортерного гена (Gong et al., 2002). ROS1 белок гидролизовал (никировал) метилированную, но не неметилированную ДНК, что совпадало с его ролью в удалении метилированных цитозиновых остатков из ДНК путем выстригания основания при эксцизионной репарации ДНК. ROS1 экспрессируется конститутивно и поэтому в принципе может участвовать в утрате метилированных оснований у ДНК в неделящихся клетках на всех этапах развития (Kapoor et al., 2005а). Напротив, DME активность выявлена только в женском гаметофите, где она активирует фактор импринтинга Medea (МЕА) в зависимости от активности ДНК-гликозилазного домена (Choi et al., 2002). CG метилтрансфераза MET1 является антагонистом DME. Это указывает на то, что DME белок на самом деле нужен для деметилирования CG динуклеотидов (Hsieh and Fisher, 2005). У Arabidopsis имеются еще два уникальных для растений неохарактеризованные пока представителя семейства DME/ROS1. Такая своеобразная экспансия генов этого семейства указывает на то, что обратимое замалчивание генов путем активного деметилирования ДНК важно для физиологии растений, для их развития или адаптации к условиям среды.

Считается, что MBD белки с метил-ДНК связывающим доменом участвуют в трансдукции собственно характера метилирования ДНК в измененную транскрипционную активность. У млекопитающих MBD белки связываются с метилированной ДНК и рекрутируют деацетилазы гистонов для усиления сайленсинга транскрипции. Arabidopsis имеет 12 MBD-содержащих генов по сравнению с 11 генами у млекопитающих, пятью генами у Drosophila, двумя генами у С. elegans и с отсутствием их в геномах грибов (Hung and Shen, 2003). Несмотря на то, что еще мало известно о функциях MBD белков у Arabidopsis, тем не менее нокдаун с помощью PHKi одного из них, AtMBD 11, связан с плейотропными эффектами при развитии растений (Springer and Kaeppler, 2005). Ни один из MBD белков Arabidopsis не идентифицирован при генетическом скрининге, возможно из-за функциональной избыточности. Кроме того, несмотря на консерватизм аминокислотных последовательностей ДНК-метилтрансфераз у растений и животных, MBD-содержащие белки у представителей этих двух царств дивергировали целиком вне метил-CG-связывающего домена. Тем самым, хотя животные и растения используют для создания и поддержания картины метилирования генома родственные ферменты, они могут иметь возникшие в эволюции разные пути интерпретации этих картин с помощью определенных MBD белков (Springer and Kaeppler, 2005).

Метилирующие ферменты нуждаются в активированных метильных группах обычно в виде S-аденозилметионина. Поэтому удивительно, как это ранее биохимические пути образования этого кофактора рассматривались вне связи с эпигенетической регуляцией. Только недавно выявлено, что мутация (hogl) гена арабидопсиса, кодирующего S-аденозил-Т-гомоцистеингидролазу, отвечает за определенные эпигенетические дефекты (Rocha et al., 2005).

2.2. Ферменты модификации гистонов

Подобно другим организмам (табл. 9.1), растения имеют ферменты, которые посттрансляционно модифицируют аминоконцевые хвосты гистонов, что предполагает существование гистонового кода (Loidl, 2004). У растений модифицирующие гистоны ферменты часто кодируются относительно большими семействами генов. Полезная информация о большинстве этих генов все еще очень мала. Существуют, по крайней мере, две известные модификации гистонов — ацетилирование/деацетилирование и метилирование.

Разнонаправленное действие гистоновых ацетилтрансфераз (HATs) и деацетилаз (HDACs) обеспечивает обратимость этой модификации гистонов, т.е. их эпигенетического маркирования. Такая обратимость модификаций часто усиливается и тем, что в дополнение к гипоацетилированию гистонов молчащие гены еще и метилированы по CpG сайтам, из которых метилированные остатки цитозина потенциально могут быть удалены под действием ДНК-гликозилаз (раздел 2.1, подраздел «Активное CG деметилирование и ДНК-гликозилазы»). У Arabidopsis имеется 18 предполагаемых HDACs и 12 предполагаемых HATs (Pandey et al., 2002). Это больше, чем у других нерастительных эукариот; примерно такое же количество таких ферментов выявлено у млекопитающих. Эти ферменты консервативны у всех эукариот. У растений имеется одно из специфичных для них семейств белков, функциональная роль которых не известна. При генетическом скрининге обнаружены только два гена этого консервативного семейства: HDA1 и HDA6 (табл. 9.2). HDA6 участвует в поддерживающем CpG метилировании, индуцированном РНК, и модификации повторяющихся последовательностей, но почти не влияет на развитие. На это указывает нормальный фенотип у соответствующих дефектных мутантов. В отличие от этого сниженная экспрессия HDA1 сопровождается плейотропными эффектами при развитии. У Arabidopsis ни одна из HAT не найдена при генетическом скринировании, что могло бы указывать на функциональную их избыточность или участие в активации молчащих генов.

Белки, метилирующие лизиновые остатки в гистонах (упоминающиеся в этой книге как гистоновые лизин метилтрансферазы или HKMTs) и другие, содержат общий SET домен (SU(VAR)/E(Z)/TRX). Благодаря тому, что они обладают способностью метилировать гистон H3 или Н4 по разным лизиновым остаткам, различные комплексы белков с SET доменами играют заметную роль в промотировании или ингибировании транскрипции специфических генов и формировании гетерохроматина. Некоторые белки с SET доменом являются членами так называемых групп поликомб (PcG) и триторакс (trxG), они соответственно поддерживают транскрипционно неактивное или активное состояние гомеотических генов при развитии растений и животных (главы 11 и 12). Другие SET доменные белки, такие как SU(VAR)3-9, участвуют в поддержании конденсированного состояния гетерохроматина особенно часто в областях повторяющихся последовательностей ДНК путем метилирования гистона H3 по лизину 9 (H3K9). В геноме Arabidopsis закодировано 32 SET доменных белка, из которых экспрессируются 30. Они могут быть сгруппированы в виде четырех консервативных семейств: E(Z), TRX, ASH1 и SU(VAR)3-9; имеется также небольшое пятое семейство белков, которое выявлено только у дрожжей и растений (Baumbusch et al., 2001; Springer et al., 2003). Число экспрессируемых SET доменных белков у Arabidopsis относительно велико по сравнению с 14 белками у Drosophila и четырьмя белками у делящихся дрожжей. У мышей насчитывается 50 SET доменных белков. В дополнение к экспансии SET доменных белков в результате полиплоидии, у Arabidopsis существенную роль в амплификации членов группы SU(VAR)3-9 играет ретротранспозиция. Вне SET домена соответствующие растительные и животные белки не всегда уж столь консервативны. Дивергированные области белков предназначены для белок-белковых взаимодействий, это указывает на то, что растительные S ET доменные белки могли бы функционировать в других белковых комплексах, отличных от комплексов животных белков.

Хотя и неполная, доступная функциональная информация о SET доменных белках Arabidopsis указывает на то, что эти белки участвуют в регуляции активности хроматина и в эпигенетической наследственности. Первыми двумя генами SET доменных белков, идентифированными при генетическом скринировании, оказались Curly leaf ген (CLF) и ген Medea/независимое от оплодотворения образование семян (MEA/FIS1), которые являются негативными регуляторами, родственными гену E(Z) Drosophila. Будучи SET доменными белками, МЕА, CLF и E(Z) заодно являются также и PcG белками (раздел 2.3. Другие белки из группы polycomb). Мутации гена CLF приводят к изменению морфологии листа и гомеотическим изменениям в развитии цветка. MEA/FIS1 регулирует гаметофит-специфическую экспрессию генов и служит фактором импринтинга, который ингибирует развитие эндосперма без оплодотворения (Schubert et al., 2005). Наоборот, ген trithorax 1 (АТХ1) у Arabidopsis работает как активатор цветочных гомеотических генов, по-видимому, вследствие его способности катализировать метилирование четвертого лизинового остатка в гистоне H3 (H3K4), а это часто служит признаком транскрипционной активности хроматина (Hsieh and Fischer, 2005).

Криптонит/гомолог 4 супрессора 3-9 пестролистности (Suppressor of variegation 3-9 homolog 4 (КУР/ SUVH4) идентифицирован как супрессор эпигенетического сайленсинга двух эндогенных генов (Jackson et al., 2002; Malagnac et al., 2002). KYP/SUVH4 катализирует моно- и диметилирование гистона H3 по остатку лизина 9 (H3K9me2/me3) и действует вместе с ДНК-метилтрансферазой СМТЗ для поддержания CpNpG метилирования ряда последовательностей в геноме Arabidopsis. KYP/SUVH4 играет небольшую роль в образовании гетерохроматина (Chan et al., 2005). В отличие от этого гомолог 2 супрессора пестролистности 3-9 (SUVH2), идентифицированный при скрининге компонентов реактивации молчащего трансгена, обладает главной метилирующей активностью, модифицирующей гистон H3 по 9 (H3K9) и 27 (H3K27) остаткам лизина в гетерохроматине Arabidopsis (Naumann et al., 2005).

Лизиновые остатки в гистонах Н3 и Н4 могут быть моно-, ди- и триметилированными. Это сильно увеличивает комбинаторную сложность этих модификаций, определяет состояние гетерохроматина у разных организмов. Например, H3K9me3 служит отличительной чертой гетерохроматина у животных и грибов, а у Arabidopsis это — эпигенетический маркер эухроматина. Наоборот, H3K9mel и H3K9me2 — преимущественные маркеры неактивного хроматина у Arabidopsis, а у млекопитающих это показатели эухроматина. Происхождение этих различий и как они соотносятся с постулированным гистоновым кодом следует еще определить. Кроме этого, еще предстоит расшифровать и сильно взаимно перепутанные связи между специфическими модификациями гистонов и характером метилирования (Tariq and Paszkowski, 2004).

В отличие от ацетилирования гистонов, которое может динамично регулироваться противоположными активностями HDACs и HATs, метилирование гистонов до недавнего времени рассматривалось как перманентный эпигенетический маркер. Однако недавно у млекопитающих была найдена деметилаза метилированного лизина, LSD1, которая может деметилировать H3K4mel и H3K4me2, но не H3K4me3 (глава 10). В геноме Arabidopsis закодированы четыре предполагаемые LSD гомолога. Это указывает на то, что по-крайней мере некоторые метилирования гистонов у растений могут быть обратимыми.

2.3. Другие белки хроматина

PcG белки сначала были идентифицированы у Drosophila как факторы, необходимые для поддержания репрессии гомеотических генов (глава 11). У животных экспрессия генов подавляется структурно иными PcG белками, объединенными в мультибелковый комплекс. У растений и нематоды С. elegans нет комплекса PRC1, он имеется у Drosophila и млекопитающих. У растений и животных найден комплекс PRC2, он осуществляет преимущественно метилирование 27-го лизинового остатка у гистона H3 (H3K27) с помощью гистон-метилтрансфразной активности S ET домена и PcG белка E(Z).

У Arabidopsis гомологи основных компоннтов PRC2 найдены путем скринирования мутантов, полученных для анализа механизмов развития растения. У Drosophila PRC2 компоненты закодированы в виде единичных генов. Наоборот, у растений арабидопсиса эти гены содержатся по крайней мере в составе трех PRC2 комплексов -FIS (fertilization independent seeds, образование семян без оплодотворения), EMF (embryonic flower, эмбриональный цветок) и VRN (vernalization, яровизация), все они различаются по специфичности мишеней их воздействия (Schubert et al., 2005: рис. 11.2).

FIS гены идентифицированы при скрининге таких мутантов, у которых происходит частичное развитие семян независимо от оплодотворения. У них основной мишенью является MADS-box, содержащие транскрипционный фактор PHERES (Kohler et al., 2005). Компоненты EMF комплекса выявлены по их общей способности подавлять экспрессию таких цветочных гомеотических генов, как Agamous и Apeiala. Ген VRN2 из семейства VRN идентифицирован по его участию в эпигенетической памяти яровизации, которая определяется как выход семян из состояния покоя под воздействием холода.

Растения вынуждены программировать свою репродукцию во время соответствующего сезона, и в областях с умеренным климатом это осуществляется вследствие зацветания только после продолжительного холодового периода. Такая эпигенетическая память зимы нуждается в VRN2, который поддерживает индуцируемую холодом репрессию транскрипции гена, кодирующего ингибитор цветения FLC в последующие периоды при более высоких температурах. У мутантов vrn2 в FLC отсутствует H3K27me2, что согласуется с ролью комплекса PRC2 в метилировании гистонов (Schubert et al., 2005).

Родительский импринтинг свойствен лишь цветковым растениям и млекопитающим (табл. 9.1), этот эпигенетический феномен характеризуется тем. что материнские и отцовские гены экспрессируются по-разному. С учетом теории родительского конфликта в эволюции импринтинга (глава 19) импринтинг у цветковых растений и животных, по-видимому, отражает тот факт, что у этих организмов существует специфическая материнская ткань, которая поставляет питание для развивающегося зародыша. У млекопитающих это — плацента, а у растений триплоидный эндосперм — дифференцированная ткань, которая содержит один отцовский и два материнских генома (рис. 9.1). Явление родительского импринтинга одного гена впервые было выявлено в эндосперме кукурузы (Allemanand Doctor, 2000). В эндосперме Arabidopsis импринтирована экспрессия двух генов — МЕА и FWA (контролирует время цветения). В этих случаях активируются две материнские копии, по-видимому, вследствие катализируемого DME активного деметилирования CpG сайтов в женском гаметофите (см. раздел 2.1, подраздел «Активное деметилирование CpG и Д Н К гликозилазы»), в то время как отцовская копия неактивна (Autran et al., 2005). Удивительно то, что хотя у животных и растений импринтинг эволюционировал независимо, тем не менее, у тех и у других организмов для импринтинга необходимы метилирование ДНК и PcG белки (Kohler et al., 2005).

Switch2/caxapoзy неферментируюшие факторы 2 (SWI2/ SNF2) из консервативного семейства АТФ-зависимых ремоделирующих хроматин факторов способны сдвигать нуклеосомы или уменьшать прочность контактов между гистонами и ДНК. При генетическом скрининге получены данные примерно о 40 SWI2/SNF2 гомологах, закодированных в геноме Arabidopsis ((Plant Chromatin Database). Два из них — фактор 1 уменьшения метилирования ДНК (DDM1, Jeddeloh et al., 1999) и фактор 1 дефекта управлямого РНК метилирования ДНК (DRD1, Kanno et al., 2004) участвуют в регуляции метилирования ДНК. Дефектные по DDM1 мутанты с глобальным уменьшением степени метилирования геномной ДНК и транскрипционной реактивацией определенных молчащих транспозонов и повторяющихся последовательностей обнаруживают ряд серьезных нарушений в морфологии и развитии растений. Это выявляется после нескольких поколений инбридинга гомозиготных ddml растений вследствие накопления эпимутаиий и инсерционного мутагенеза реактивированными у мутанта транспозонами. DDM1 ортолог имеется у млекопиающих (Lymphoid-Specific Helicase (L5H), он важен для глобального CpG метилирования и эмбриогенеза. DRD1 уникален для мира растений и, по-видимому, играет специфическую роль в направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 3.4).

Мутации в молекуле Морфея (MOM, Amedeo et al., 2000), специфического для растений гена с неполным мотивом АТФ-завимой хеликазы, активируют некоторые повторяющиеся последовательности и не вызывают другие фенотипические изменения. МОМ функционирует синергично, но независимо от DDM1 метилирования ДНК. Это указывает на множественность путей регуляции транскрипции у растений (Tariq and Paszkowski, 2004).

Участие в специфических модификациях хроматина трех других белков с предполагаемой функцией ремоделирования хроматина — Splayed (SPD), фактор фотопериодически независимого раннего цветения (PIE) и Pickle (PKL), идентифицированых по их влиянию на развитие соответствующих дефектных мутантов, пока еще не установлено (Wagner, 2003).

В то время как SWI2/SNF2 белки, возможно, действуют на собранном хроматине, другие белковые факторы необходимы для восстановления структуры хроматина после репликации и репаративного синтеза ДНК. Комплекс факторов сборки хроматина (CAF), состоящий из трех субъединиц, помогает разместить полусобранные нуклеосомы у репликативной вилки. У Arabidopsis мутации (fasl,fas2) в генах двух больших CAF субъединиц вызывают характерные морфологические аномалии (фасциация, рис. 9.2е), дефекты в репарации ДНК и дерепрессируют повторяющиеся последовательности (Takeda et al., 2004). Это указывает на то, что правильное расположение нуклеосом в хроматине существенно для нормального развития растения и эпигенетического контроля. В то время как утрата CAF субъединиц не нарушает поддерживающее метилирование ДНК, она может приводить к стиранию других эпигенетических сигналов, таких как модификации гистонов. Снижение уровня содержания третьей CAF субъединицы MSI1 не вызывает фасцинирование, но приводит к нарушению формирования семян и различным фенотпическим изменениям (Hennig et al., 2005). Мутация в BRUгене, который не относится ни к одному из генов, кодирующих белки сборки хроматина, приводит к возникновению фенотипа, очень сходного с фенотипом fas мутантов. Возможно, что в сохранении эпигенетической информации и генетической целостности при пострепликативной сборке хроматина участвуют и другие дополнительные факторы (Takeda et al., 2004). Наконец, утрата RPA2, субъединицы белка А репликативного комплекса, вызывает увеличение чувствительности ДНК к повреждениям, транскрипционной дерепрессии и изменение модификации гистонов, но не влияет на характер метилирования ДНК (Elmayan et al., 2005; Kapoor et al., 2005b).

HP1 (гетерохроматиновый белок 1) у Drosophila и млекопитающих и его гомологи у грибов являются компонентами молчащего гетерохроматина. Присоединение НР1 его хромодоменом к метилированному по 9-му лизиновому остатку гистона H3 (H3K9me) способствует распространению состояния замалчивания генов и формированию гетерохроматиновых доменов В геноме Arabidopsis закодирован один-едиственный белок, гомологичный белку НР1 Drosophila. Мутации в этом гене, называемом LHP1 (Gaudin et al., 2001), или Terminal flower 2 (TFL2) (Kotake et al., 2003) приводят к изменению строения растения, развития листа и раннему зацветанию. Хотя фенотип этого мутанта указывает на важную роль в регуляции экспрессии гена, все же мало вероятно, что LHP1 действует на образование репрессированных комплексов хроматина подобно действию НР1 у других организмов. LHP1 у Arabidopsis регулирует функционирование локусов в хроматине, которые не являются мишенями для метилирования ДНК (Kotake et al., 2003; Tariq and Paszkowski, 2004). Таким образом, в результате эволюции LHP1 у растений и НР1 у других организмов выработались разные пути действия этих белков.

Современные эпигенетические исследования традиционно сфокусированы на изучении метилирования ДНК и модифицирования гистонов За последние несколько лет стало очевидно, что эти изменения в специфических областях генома могут происходить в результате интеференции РНК. Действительно сегодня уже невозможно рассматривать эпигенетическую регуляцию у многих организмов без участия компонентов аппарата интеферирующих РНК (PHKi) (Matzke and Birchler, 2005). Особенно это касается растений, у которых вклад работы этой машинерии в замалчивание генов гораздо выше, чем у всех других организмов.

3.1. Выработка PHKi-зависимого сайленсинга у растений

PHKi и сходные типы замалчивания (сайленсинга) генов представляют собой ответ клеток на двутяжевые РНК (dsPHK). dsPHK гидролизуется РНКаза 111-подобной эндонуклеазой (Dicer) с образованием маленьких РНК, которые и обеспечивают специфичность сайленсинга, комплементарно связываясь с соответствующей последовательностью-мишенью нуклеиновых кислот. Маленькие РНК включаются в мульти-белковые эффекторные комплексы, осуществляющие непосредственно деградацию информационных РНК и подавляют трансляцию (PTGS) или индуцируют модификации хроматина (TGS) в области определенных нуклеотидных последовательностей ДНК. Ключевой компонент этого эффекторного комплекса сайленсинга — белок по названию аргонавт, который связывает маленькие РНК с помощью своего PAZ домена. Индивидуальные белки из семейства белков аргонавтов, которое представляет собой самую большую группу белков, важных для PHKi-направляемого сайленсинга, сообщают функциональную специфичность разным эффекторным (исполнительным) комплексам (Carmel] et al., 2002). РНК-направляемое замалчивание генов участвует в защите от вирусов, контролирует транспозоны и играет существенную роль в развитии растений и животных.

Выработка PHKi-направляемого сайленсинга у растений отчасти отражает их коэволюцию с патогенами (РНК-содержащие вирусы, вироиды), которые образуют двутяжевые РНК (dsPHK) при репликации. На самом деле они наряду с транс генами (другой тип «чужеродных» нуклеиновых кислот) оказались бесценными для выявления и изучения разных форм PHKi-направляемого замалчивания генов у растений.

Разные пути PHKi-направляемого замалчивания генов продемонстрированы в результате

1. широкого выявления и функциональной диверсификации семейств генов, кодирующих основные компоненты для продуцирования PHKi: в геноме Arabidopsis закодированы четыре DICER-подобные (DCL) белка и десять белков аргонавтов (AGO);

2. обнаружения разных по длине и функционированию маленьких РНК, включая короткие, состоящие из 21 нуклеотидного остатка, интерферирующие РНК (siPHK), образующиеся из вирусов и трансгенов, и несколько типов эндогенных маленьких РНК (21-24 нуклеотидные микроРНК; 21-нуклеотидные трансдействующие siPHK и 24—26-членные гетерохроматиновые siPHK;

3. выявления разных типов генного сайленсинга, осуществляемого разными маленькими РНК: 1) PTGS (посттранскрипционный сайленсинг) по механизму деградации информационных РНК или путем подавления трансляции; 2) TGS (транскрипционный сайленсинг) связан с такими модификациями, как цитозиновое метилирование ДНК и метилирование гистонов;

4. обнаружения важной роли PTGS в защите от вирусов, это связано с разными вирусными белками, подавляющими разными способами замалчивание генов;

5. обнаружения таких процессов, как не клеточноавтономный сайленсинг и транзитивность (раздел 3.2, подраздел «Не клеточно-автономный сайленсинг и транзитивность»), которые обусловлены РНК-зависимыми РНК-полимеразами, шесть из которых закодированы в геноме Arabidopsis.

Все это обсуждается при рассмотрении трех основных путей РНК-направляемого замалчивания генов у растений (рис. 9.3а-в). Следует иметь в виду, что эти пути взаимно перекрещиваются друг с другом. Их функционально различные компоненты приведены в табл. 9.2.

3.2. Путь 1: связанное с трансгенами посттранскрипционное и индуцированное вирусами замалчивание генов (PTGS/VICS)

Направляемое PHKi замалчивание генов, индуцированное трансгенами и вирусами, изначально функционировало как защитная система хозяина от чужих и инвазивных нуклеиновых кислот в виде соответствующих вирусных компонентов, транспозонов и трансгенов.

^{Рис. 9.3. Пути РНК-обусловленного сайленсинга у растений}

^{Несмотря на то, что отдельные элементы и пути сайленсинга могут перекрываться или быть общими, все же различают три основных пути сайленсинга, они отличаются по источникам двутяжевых РНК, классу маленьких РНК, природе мишеней-последовательностей и характеру сайленсинга. На рисунке эффекторные комплексы сайленсинга, содержащие белки аргонавты, показаны в виде светлосерых шариков. Желтыми прямоугольниками помечены процессы, протекающие в ядре. Детали и названия регуляторных элементов описаны в тексте и табл. 9.2. Специфические растительные белки отмечены зеленым. PTGS — посттранскрипционное замалчивание генов, VIGS — индуцированное вирусом замалчивание генов, TGS — транскрипционное замалчивание генов, RdDM — направляемое РНК метилирование ДНК, IR — инвертированные повторы, AS — антисенс, антисмысловая последовательность, vRdRP — вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза, аРНК — аберрантная РНК, siPHK — короткая интерферирующая РНК, RISC — РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (взято с изменениями из работы Meins et al., 2005)}

Трансгенные конструкции можно ввести в растительный геном в смысловой или антисмысловой ориентации или в виде инвертированных повторяющихся последовательностей ДНК. Вирусы могут иметь геномы, представленные одно- или двутяжевыми ДНК или РНК. Поэтому dsPHK могут возникать разными путями. В принципе антисмысловые транскрипты могут комплементарно спариваться с информационными РНК-мишенями с образованием двутяжевых РНК. Транскрипция инвертированных повторов ДНК может приводить к образованию шпилечных РНК. Вирусные РНК, кодирующие собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу (vRdRP) и реплицирующиеся с образованием двутяжевых интермедиатов РНК, включаются в игру прямо на уровне двутяжевых РНК. Наоборот, смысловые трансгены и ДНК-содержащие вирусы как, например, джеминивирусы, для образования двутяжевых РНК нуждаются в клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразе RDR6 и других генетически идентифицированных факторах (SDE3, SGS3 и WEX; табл. 9.2). При образовании субстратов для RDR6 транскрипты или смысловые трансгены и вирусные ДНК должны быть в известном смысле аберрантными, например, без 5’ cap или полиаденилатного хвоста (Meins et al., 2005).

Активность DCL, необходимая для процессирования dsPHK с образованием siPHK при PTGS, еще не идентифицирована (DCLX). Анализ dell мутантов с частично утраченными функциями показал, что DCL1, по-видимому, не вовлечен в эту стадию процессинга. Специфический растительный белок HEN 1 метилирует 3’-нуклеотид у маленьких РНК, защищая их от уридилирования и последующей деградации (Li et al., 2005). DCL2 участвует в образовании siPHK из некоторых, но не всех, вирусных РНК (Xie et al., 2004).

PTGS и VIGS приводят к образованию двух разных по величине и функциональному значению классов siPHK, состоящих из 21-22 нуклеотидов и 24-26 нуклеотидов, соответственно (Baulcombe, 2004). В целом, считается, что 21-членные siPHKs участвуют в растеплении иРНК, а 24-26-членные, называемые гетерохроматиновыми siPHK, вызывают эпигенетические модификации в гомологичных последовательностях ДНК (TGS; см. раздел 3.4).

Вслед за осуществленным DCL процессингом дуплекс siPHK раскручивается и антисмысловая цепочка взаимодействует с одним из белков из семейства аргонавтов с образованием комплекса индуцированного РНК сайлесинга (RISC). RISC, запрограммированный siPHK, может затем эндонуклеолитически гидролизовать мРНК-мишени в одном единственном месте примерно в середине комплементарного комплекса siPHK-мРНК. У животных это расщепление катализируется Ago2 «slicer» (см. главу 8). У Arabidopsis эту функцию в трансгенном PTGS выполняет белок AGOl (Baumberger and Baulcombe, 2005). Вслед за нуклеолитическим расщеплением отдельный 3’-фрагмент мРНК деградируется в направлении от 5’ к 3’ концу экзонуклеазой AtXRN4 (Souret et al., 2004), а 5’-фрагмент, по-видимому, гидролизуется экзосомой в направлении от 3’- к 5’-концу.

PTGS у растений обладает двумя особенностями, которые обусловлены активностью РНК-зависимой РНК-полимеразы RDR6: не клеточно-автономным сайленсингом и транзитивностью (рис. 9.3а). В первом случае индуцирующие PTGS сигнальные РНК перемещаются из клеток, в которых они возникли, в соседние через плазмодесмы или, как это изначально было показано в опытах с прививками, по сосудистой системе и вызывают специфичное к нуклеотидной последовательности замалчивание генов в довольно отдаленных местах (Voinnet, 2005). Небольшие мобильные РНК, являющиеся системными сигналами замалчивания генов, могли бы выполнять двойственную функцию в развитии растения: осуществлять коммуникацию между клетками и координировать их активность в разных, в том числе и отдаленных частях растения. Это предположение подкреплено открытием микроРНК (miPHK; важны для развития, раздел 3.3) и небольшого связывающего Маленькие РНК белка в соке флоэмы, который служит основным транспортером метаболитов по сосудистой системе растения (Yoo et al., 2004).

Транзитивность представляет собой образование вторичных siPHK, соответствующих определенным нуклеотидным последовательностям, локализованным вне первичных мишеней. В этом случае РНК-зависимая РНК-полимераза катализирует синтез вторичных двутяжевых РНК на трансгенных или вирусных матричных РНК с использованием в качестве праймеров первичных siPHK. В результате действия дайсера образуются вторичные siPHK, которые преумножают реакцию сайленсинга и, когда речь идет о вирусных РНК, увеличивают устойчивость растений к вирусной инфекции (\binnet, 2005).

Другим единственным организмом, у которого выявлены не клеточно-автономное замалчивание генов и транзитивность. является нематода С. elegans (глава 8), имеющая предполагаемую РНК-зависимую РНК-полимеразу, которой нет у млекопитающих и Drosophila

Растительные вирусы — не только индукторы и мишени замалчивания генов, у них есть белки, которые могут подавлять сайленсинг (Voinnet, 2005). Это укрепляет идею о том, что PTGS служит природной защитой от вирусов, эти супрессорные белки стоят на вооружении контрзащитной «стратегии» патогена. В геноме большинства вирусов закодирован, по-крайней мере, один белок, подавляющий замалчивание генов, который работает на определенном этапе PTGS после процессинга двутяжевых РНК. Подавление PTGS вирусом четко наблюдается у крапчатой сои, у которой темная окраска есть результат обратимости естественного PTGS, т.е. реактивации гена, отвечающего за образование пигмента (рис. 9.2д) (Senda et al., 2004). Вирусные супрессоры PHKi недавно найдены также у вирусов насекомых и животных ретровирусов (Lecellier et al., 2005; Voinnet, 2005).

3.3 Путь 2: регуляция развития растений miPHK и транс-действующими siPHK

Открытие эндогенных популяций miPHK у растении и животных знаменовало новую эру в исследовании биологии развития и обусловленного PHKi замалчивания генов (Bartel, 2004). miPHK замалчивают экспрессию генов путем комплементарного спаривания с информационными РНК-мишенями и индукции расщепления мРНК или ингибирования трансляции. На важную роль miPHK в развитии растений указывает и тот факт, что многие необходимые для биогенеза miPHK и сайленсинга гены (в том числе DCL1, AGOl, HEN1, HYL1 и HST) были обнаружены при скринировании мутантов с дефектами развития, у них и было выявлено накопление miPHK. Фенотипы мутантов, дефектных по этим белкам, указывали на разнообразную роль miPHK в функционировании меристемы, полярности органов, развитии сосудистой системы, структуре цветка и ответах растения на стресс и гормональное воздействие (Kidner and Martienssen, 2005). Недавно установлено, что miPHK участвуют в биогенезе новых типов маленьких РНК и транс-действующих siPHK.

МикроРНК изначально были получены при клонировании разделенных по размеру маленьких РНК, содержащих 18-28 нуклеотидных остатков. Их высокая степень комплементарности к мРНК-мишеням у растений заметно облегчила идентификацию дополнительных микроРНК при компьютерном анализе. Таким путем у арабидопсиса найдены 92 локуса. в которых закодировано 27 определенных микроРНК, примерно столько же выявлено и у риса. Экспрессия многих микроРНК регулируется средой и программой развития растения. Примерно 50% их мишеней у арабидопсиса — факторы транскрипции, многие из которых являются модуляторами образования меристемы и идентичности. Это было установлено еще до их идентификации в качестве мишеней микроРНК. В отличие от этого, у животных микроРНК не всегда адресованы мишеням, кодирующим факторы транскрипции, а регулируют разные гены в клетке. Два важных белка микроРНКового пути у арабидопсиса, DCL1 и AGOl, саморегурегулируются с помощью микроРНК с участием негативной модуляции по принципу обратной связи (Kidnerand Martienssen, 2005).

У эукариот многие микроРНК эволюционно консервативны (Axtell and Bartel, 2005). Примечательно, что у цветковых, голосеменных и более примитивных растений мРНК группы факторов транскрипции, регулирующих образование меристемы и асимметрию латеральных органов, сохранили совершенную комплементарность к узнающим их микроРНК. Эта особенность сохранена по-крайней мере в течение 400 миллионов лет (Floyd and Bowman, 2004).

МикроРНК закодированы в таких зонах генома, которые расположены между генами, кодирующими белки, или в интронах. Они возникают из несовершенных шпилечных предшественников РНК размером от 70 до 300 и более пар оснований, которые транскрибируются ДНК-зависимой РНК-полимеразой II. Процессинг предшественников растительных микроРНК в ядре происходит в несколько этапов. Сначала концы пре-микроРНК удаляются ядерной DCL1. Для этого необходим связывающийся с двутяжевыми РНК белок HYL1, который был выделен при анализе фенотипических мутантов с дефектным гормональным ответом (Han et al., 2004; Vasquez et al., 2004a). Затем микроРНК дуплекс (miR/miR*, рис. 9.36) высвобождается под действием DCL1 и его 3’-конец метилируется с помощью HEN 1 (раздел 3.2, подраздел «Происхождение и процессинг двутяжевых РНК»). Для транспорта дуплекса miR/miR* из ядра в цитоплазму нужен HASTY (HST), гомолог животного экспортина 5 (Park et al., 2005). Зрелые микроРНК найдены также и в ядерной фракции, может быть в ядре некоторые из них могут осуществлять эпигенетические модификации. МикроРНК к сплайсированным растущим цепям транскриптов транскрипционных факторов индуцируют неким неизвестным путем цитозиновое метилирование ДНК в последовательностях, расположенных ниже гена-мишени (Schubert et al., 2005).

Биогенез микроРНК у животных происходит иначе, у них есть только один дайсер, который локализован в цитоплазме, и вторая РНК-аза III-типа, Drosha, в ядре. Drosha вместе со связывающим двутяжевые РНК белком Pasha (у растений их гомологов нет) отщепляет концы от пре-микроРНК. Затем такие пре-микроРНК перемещаются в цитоплазму экспортином 5 и процессируются окончательно дайсером с образованием зрелых микроРНК (Du and Zamore, 2005, Ют, 2005).

В целом, животные микроРНК неполностью комплементарны к мРНК-мишеням, и они подавляют трансляцию, связываясь с многими сайтами в 3’-нетранслируемых областях (UTR). В отличие от этого почти совершенная комплементарность растительных микроРНК к кодирующим участкам мРНК-мишеней способствует расщеплению мРНК, по-видимому, подобно siPHK. Однако существуют исключения из этих «правил». Так, например, растительная miR172 способна блокировать трансляцию, а некоторые животные микроРНК могут участвовать в расщеплении мРНК-мишеней (Du and Zamore, 2005).

AGO I — главный белок из семейства белков аргонавтов и нарезающий (слайсер) мРНК компонент в программированном микроРНК RISC у арабидопсиса (Baumberger and Baulcombe, 2005). AGOl был найден еще до открытия микроРНК при скрининге мутантов Arabidopsis с дефектным развитием листьев (Carmell et al., 2002). Название аргонавты было инспирировано фенотипом agol мутантов, которые были похожи на небольших кальмаров из-за их узких нитевидных листьев. У agol мутантов в апикальной меристеме побегов обнаруживаются такие же дефекты, как у дефектных мутантов PNH/ZLL/AGO10 (табл. 9.2), они сходны с AGOl, но еще неизвестно, нужны ли они для PTGS (Vaucheret et al., 2004). В меристемах растений белки AGO играют существенную роль в поддержании «стволовости» клеток (Carmell et al., 2002: Kidner and Martienssen, 2005).

Эндогенные транс-действующие siPHK (ta-siPHK) — новый тип маленьких РНК, которые недавно были открыты у Arabidopsis. ta-siPHK, гидролизующие свои мРНК-мишени, обладают свойствами как siPHK, так и микроРНК. Подобно siPHK синтез двутяжевых РНК-предшественников ta-siPHKs зависит от RDR6 и SGS3. Как и микроРН К, ta-siPHК образуются в таких участках генома, которые мало сходны с их мРНК-мишенями. Для образования правильных ta-siPHK, комплементарных мРНК-мишеням, микроРНК настраивает фазовое расщепление предшественников двутяжевых РНК с помощью DCL4 (рис. 9.36) (Allen et al., 2005; Gasciolli et al., 2005).

ta-siPHK приписывают регуляторную роль в определении времени развития растения. Побег цветкового растения во время развития проходит две фазы перемен: вегетативную фазу с переходом от молодого в зрелое состояние побега и репродуктивную фазу, которая сопровождается ростом цветочных ветвей вместо вегетативных (рис. 9.1). В то время как индукция цветения изучена генетически довольно хорошо, вегетативная фаза перемен в побеге исследована гораздо хуже. Один из белков аргонавтов, ZIPPY/AG07, играет специализированную роль в таком фазовом переходе. При скрининге мутантов с преждевременными изменениями в вегетативной фазе развития побега, аналогичных zip, ago7 мутантам, были выявлены два гена (RDR6и SGS3), которые важны для PTGS (рис. 9.36) (Peregrine et al., 2004). Последующий анализ показал, что некоторые гены с контролируемой увеличенной экспрессией у rdrb и sgs3 мутантов замалчиваются посттранскрипционно с помощью ta-siPHK (Vazquez et al., 2004b). Эти данные свидетельствуют о том, что компоненты PTGS важны не только для защиты растения от вирусов и замалчивания трансгенов, но также и для контроля за временем включения пусковых механизмов развития растения. Пока еще не известно, есть ли у животных такие ta-siPHK.

3.4. Путь 3: связанный с трансгенами транскрипционный сайленсинг, направляемое РНК метилирование ДНК и образование гетерохроматина

Современные концепции обусловленного PHKi транскрипционного замалчивания генов выросли из более ранних исследований гомологичного замалчивания генов, запускаемого множественными копиями промоторных областей генома, и из результатов изучения направляемого РНК метилирования ДНК (Matzke and Matzke, 2004). Последующее изучение PHKi-зависимого образования гетерохроматина у делящихся дрожжей (главы 6 и 8) и индуцированных siPHK TGS в клетках млекопитающих заметно расширили представления о филогенетических масштабах этих процессов и подтвердили их перекрывание с PHKi.

Впервые RdDM наблюдали у растений табака, зараженных вироидами (Wassenegger et al., 1994). Вироиды — небольшие патогены растений, содержащие только некодирующие белки циклические РНК, состоящие из нескольких сотен нуклеотидных остатков. В изначальных экспериментах было обнаружено, что реплицирующиеся вироиды запускают de novo метилирование вироидных кДНК, интегрированных в геном табака в качестве трансгенов. При изучении таких трансгенных систем было установлено, что для RdDM необходимы двутяжевые РНК, которые процессируются с возникновением маленьких РНК (признак PHKi). Реплицирующиеся исключительно в цитоплазме РНК-содержащие вирусы индуцируют метилирование гомологичных участков в ядерной ДНК. Это указывало на то, что маленькие РНК, возникающие при PTGS, способны проникать в ядро и индуцировать в нем эпигенетические изменения. Содержащие промоторные последовательности двутяжевые РНК могут направлять метилирование ДНК и вызывать транскрипционное замалчивание узнаваемых ими промоторов-мишеней (Mathieu and Bender, 2004: Matzke et al., 2005).

У растений РНК индуцируют специфическое de novo метилирование цитозиновых остатков в разных нуклеотидных последовательностях ДНК преимущественно в областях комплементарного взаимодействия. Считается, что в результате этого специфического спаривания РНК с ДНК возникает субстрат для de novo метилирования ДНК, однако это еще требует экспериментальных доказательств. В то время как асимметричное CpNpN метилирование не поддерживается после удаления триггерной РНК, симметричные CpG и CpNpG метилирования сохраняются без РНК в области разных промоторов. Различия в эффективности поддерживающих метилирований ДНК могут быть связаны с разным составом нуклеотидных последовательностей или разным характером модификаций гистонов.

Молекулярные компоненты, необходимые для RdDM и TGS, выявлены в результате скрининга соответствующих трансгенов и эндогенных генетических систем. Трансгенные системы транскрибируемых инвертированных повторов или вирусов поставляют двутяжевые РНК, гомологичные соответствующим локусам ДНК-мишеней. В этом отношении информативными эндогенными генами при генетическом скрининге оказались ген фосфорибозилантранилат изомеразы (PAI) (Mathieu and Bender, 2004) и SUPERMAN ген (Chan et al., 2005). Эти гены выполняют роль мишеней или индукторов RdDM и TGS. Например, в семействе из четырех PAI генов два представляют собой инвертированные повторы. Транскрипция инвертированных повторов в области непосредственно вышестоящего промотора приводит к появлению двутяжевых РНК, которые могут специфично связываться с синглетными копиями PAI генов для метилирования ДНК и сайленсинга.

Почти всегда консервативные ДНК-метилтрансферазы и гистон-модифицирующие ферменты необходимы для RdDM (разделы 2.1 и 2.2). De novo метилирование цитозиновых остатков в различных нуклеотидных контекстах катализируется ДНК-метилтрансферазой из класса консервативных DRM ферментов. Консервативная МЕТ1 и специфичная для растений ДНК-метилтрансфераза СМТЗ осуществляют прежде всего поддерживающее метилирование соответственно CpG и CpNpG сайтов, хотя они в небольшой степени могут быть вовлечены и в de novo метилирование. Консервативная гистоновая деацетилаза HDA6 и SWI2/SNF2 белок DDM1 помогают поддерживать CpG метилирование в некоторых локусах. Гистоновая метилтрансфераза KYP/SUVH4 вовлечена в поддержание локус-специфичного CpNpG метилирования, индуцированного РНК (Chan et al., 2005).

К удивлению, недавно было найдено, что для RdDM необходима специфичная для растений РНК-полимераза, называемая pol IV. У всех изученных до сих пор эукариот имеются три ДНК-зависимых РНК-полимеразы (pol 1, pol II и pol III), которые содержат несколько субъединиц, закодированных в определенных генах. Первое свидетельство о существовании pol IV появилось в результате анализа нуклеотидной последовательности ДНК генома, когда были выявлены гены, кодирующие две самые большие субъединицы растительной уникальной, атипичной РНК-полимеразы. Существуют два функционально различных комплекса pol IV с самыми крупными специфичными уникальными субъединицами, каждая из которых взаимодействует с общей для них второй крупной субъединицей, pol IVa необходима для образования siPHK, по-видимому, изначально в результате транскрипции генов-мишеней (Herr et al., 2005; Onodera et al., 2005). RDR2 использует исходный транскрипт в качестве матрицы для синтеза двутяжевои РНК. которая процессируется DCL3 — ядерной активностью, которая специализирована на образовании 24-членных гетерохроматиновых siPHK с транспозонов и повторяющихся последовательностей генома (Xie et al., 2004). После образования siPHK фермент pol IVb вместе со специфичным для растений SWI2/SNF2-noflo6HbiM белком DRD1 формируют сигнал для метилирования ДНК (Kanno et al., 2005), возможно это делается в кооперации с AG04 (рис. 9.3в) (Chan et al., 2005). Пока не известно, действительно ли pol IVb транскрибирует РНК, ее главная роль состоит в формировании структуры хроматина, которая разрешает ДНК-метилтрансферазам катализировать de novo цитозиновое метилирование в определяемых siPHK сайтах. Хотя у других эукариот нет субъединиц pol IV, у делящихся дрожжей две субъединицы pol II, транскрибирующие предшественники мРНК, важны для направленного РНК образования гетерохроматина (главы 6 и 8).

Несмотря на то, что направленные на промотор siPHK могут индуцировать TGS в человеческих клетках, пока еще точно не ясно, сопровождается ли это заметным метилированием ДНК (Kawasaki et al., 2005; Ting et al., 2005). Многие белки, необходимые для RdDM у растений, найдены только у представителей растительного мира (рис. 9.3в). Таким образом, если RdDM и происходит регулярно у млекопитающих, его механизмы и белковые участники должны быть иными, чем у растений.

Многие транспозоны и повторяющиеся последовательности ДНК, включая наборы 5S рДНК и богатые транспозонами области гетерохроматина в хромосоме 4 Arabidopsis замалчиваются транскрипционно и метилируются по PHKi-направляемому механизму (Lippman and Martienssen, 2004; Chan et al., 2005). Эндогенные ДНК-мишени отражают естественную роль РНК-направляемого TGS в подавлении транспозиции и упаковке нуклеотидных повторов в гетерохроматине. Однако содержащие вставки транспозонов растительные гены могут сами по себе становиться мишенями направляемых PHKi сайленсинга и метилирования ДНК. Например, возникшие из транспозонов повторы в промоторе FWA гена цветка Arabidopsis служат мишенями для соответствующих siPHK (Lippman and Martienssen, 2004) и осуществляют замалчивание этого гена в вегетативных тканях, где его работа вовсе не нужна. У некоторых растений Arabidopsis элемент Ми в интроне FLC гена (репрессор цветения) делает этот ген доступным для репрессивных модуляций хроматина, направляемых siPHK, возникшими из диспергированных копий Ми (Liu et al., 2004). В результате сниженная экспрессия гена FLC может ускорять цветение, что может иметь адаптивное значение при определенных условиях среды. Поскольку многие растительные гены имеют транспозонные вставки в области или поблизости от промоторов или в интронах, такая регуляция генной активности может быть довольно распространенной в мире растений. Чем больше мы узнаем об эпигенетической регуляции, тем все более подтверждается идея Барбары МакКлинток о том, что транспозоны действуют как контрольные элементы хозяйских генов и развития (McClintock, 1956).