Эпигенетика

1.1. Как осуществляется хромосомная наследственность?

Митоз является основным типом клеточного деления, который производит идентичные, диплоидные дочерние клетки и используется соматическими клетками и премейотическими зародышевыми клетками (рис. 14.1а). В митотическом клеточном цикле выделяют четыре фазы, называемые Gj (gap 1, стадия «покоя» после митоза), S (synthesis — репликация ДНК и экспрессия генов), G₂ (gap 2, «покой» после S, подготовка к митозу) и М (mitosis, состоящий из профазы, метафазы, анафазы и телофазы). Во время S-фазы ДНК реплицируется, и дуплицированные сестринские хроматиды удерживаются вместе за счет установления когезии. В начале митоза хромосомы конденсируются, а гистон H3 становится фосфорилированным по Ser-10 (H3S10ph) (глава 10). Кроме того, у большинства организмов единичный сайт (центромера) на каждый сестринской хроматиде формирует структуру, называемую кинетохором, которая опосредует прикрепление микротрубочки веретена и служит в качестве «контрольной точки» (checkpoint) клеточного цикла (рис. 14.1а). В прометафазе пары сестринских хроматид собираются в метафазную пластинку и в анафазе расходятся к полюсам. Эти движения совершаются как за счет активности связанных с кинетохором микротрубочковых моторов (кинезинов и динеинов) и регуляции сборки и разборки микротрубочек, а также требуют разрушения когезии сестринских хроматид при переходе из метафазы к анафазе.

Мейоз происходит только в зародышевых клетках и характеризуется одним раундом репликации, за которым следуют два деления (мейоз 1 и И, рис. 14.16); это дает гаплоидные яйцеклетки в женской зародышевой линии и гаплоидные спермин в мужской зародышевой линии многоклеточных животных, а не диплоидные дочерние клетки. В мейозе I реплицированные гомологи спариваются и расходятся вместе. Сестринские хроматиды каждого гомолога не расходятся друг с другом до мейоза II. Для нормальной сегрегации во время мейоза требуется частая рекомбинация между гомологами, а также специальная когезия в центромерном районе, которая обеспечивает ассоциацию сестринских хроматид во время мейоза I (Watanabe, 2005).

1.2. Какие элементы требуются для хромосомной наследственности?

И митотические, и мейотические клеточные деления нуждаются в активности специфических хромосомных элементов и связывающихся белков для выполнения точной дупликации генома и расхождения хромосом (рис. 14.2).

^{Рис. 14.1. Стадии митоза и мейоза}

^{(а) Микрофотографии клеток Drosophila показывают поведение хромосом (синий цвет, описание см. ниже), микротрубочек (зеленый цвет) и центромер (красный цвет) в интерфазе и митозе, (б) Поведение хромосом показано для профазы мейоза I у кукурузы; это стадия, на которой происходят спаривание гомологов, синапсис и рекомбинация (микрофотографии предоставлены Hank Bass и Shaun Murphy, Университет штата Флорида). Ключевые функции хромосом на каждой стадии показаны внизу (синим шрифтом). Впоследствии, в анафазе мейоза 1, гомологи расходятся к противоположным полюсам, завершая редукционное деление. Сестринские хроматиды разделяются лишь во время мейоза II (рис. 14.9)}

Репликация ДНК начинается в «ориджинах» [точках начала репликации], которые у большинства эукариот не строго зависят от нуклеотидной последовательности (обсуждается в разделе 2 этой главы). В митотически делящихся клетках сцепление сестринских хроматид становится затем видимым по всей длине этих хроматид, хотя в перицентромерном гетерохроматине концентрация когезинов более высокая. Центромеры — это большие участки, состоящие из ДНК и специальных белков хроматина, которые служат в качестве фундамента для формирования кинетохора и играют ключевую роль в прикреплении веретена и нормальной сегерегации мейотических и митотических хромосом (обсуждается в разделе 3 этой главы). У большинства эукариот имеется одна и только одна центромера на хромосому. Утрата центромеры приводит к нарушениям в прикреплении веретена и к утере хромосом, а присутствие более чем одной центромеры ведет к прикреплению одной и той же хроматиды к обоим полюсам, что вызывает образование хромосомных мостов и фрагментацию в анафазе. Изредка организмы (например, круглый червь Caenorhabditis elegans) содержат «полицентрические», или «голоцентрические» хромосомы, в которых кинетохоры присутствуют во многих районах (см., например, рис. 13.5). Такие хромосомы используют специальные механизмы для обеспечения прикрепления и расхождения сестринских хроматид к противоположным полюсам. Теломеры — это специализированные хроматиновые структуры, находящиеся на концах хромосом для защиты их от деградации или рекомбинации и для обеспечения полной дупликации ДНК. Для мейотической сегрегации требуются также центромеры, теломеры, сцепление (когезия) и «ориджины» репликации. Однако для обеспечения спаривания гомологов и их расхождения в мейозе I необходимы некоторые дополнительные элементы и изменение поведения центромер (обсуждется в разделе 4 этой главы).

^{Рис. 14.2. Элементы хромосомной наследственности}

^{Диаграмма показывает элементы хромосомы, существенные для нормальной дупликации («ориджины» репликации) и наследования (центромеры, сцепление, теломеры) в митозе и мейозе. Для нормального расхождения хромосом в мейозе требуются также сайты спаривания гомологов (не показаны) и, в большинстве случаев, рекомбинация}

Сама природа хромосомной наследственности предполагает, что спецификация и локализация элементов наследственности должны быть «зашиты» в нуклеотидной последовательности ДНК. Поэтому вызывает удивление, что многие элементы, в том числе перечисленные в этом разделе, вместо этого регулируются эпигенетически, особенно у многоклеточных эукариот Говоря коротко, элементами, предрасположенными к эпигенетической регуляции для обеспечения надежной хромосомной наследственности, являются «ориджины» репликации ДНК, теломеры, сайты сцепления (когезии) сестринских хроматид и сайты спаривания гомологов.

Первым этапом в обеспечении наследования генетической информации является надежная дупликация всего генома, которая осуществляется процессом, известным как репликация ДНК. К сожалению, в ходе репликации происходят ошибки, вызывая изменения в ДНК (мутации), которые могут быть вредными для жизнеспособности организма. Кроме того, такие агенты внешней среды, как радиация, производят мутации, в том числе изменения оснований в ДНК, делеции, инсерции (вставки) и перестройки. Клетки реагируют на повреждение ДНК активацией механизмов репарации ДНК, выполняющих удивительную работу по поддержанию надежности и стабильности генома. Наконец, дупликация линейных молекул ДНК ставит задачи, которые решаются наличием специализированных последовательностей и структур на концах хромосомы, известных как теломеры. Недавние исследования показали, что на эти базовые процессы, необходимые для точного удвоения и поддержания нуклеотидных последовательностей ДНК, влияют эпигенетические механизмы, регулирующие хроматин.

2.1. Инициация репликации ДНК контролируется эпигенетическими механизмами

Надежное копирование ДНК осуществляется ДНК-полимеразами, действующими от 5’- к З’-концу, и начинается в специфических сайтах, называемых «ориджинами» [точками начала репликации ДНК]. В «ориджинах» образуется «пузырь», состоящий из двухрепликационных «вилок», и репликация идет в двух направлениях, пока не встречаются «вилки», генерируемые следующими «ориджинами». Домены, реплицируемые с одного «ориджина», обычно очень большие, длиной в сотни тысяч пар оснований (Aladjem and Fanning, 2004). «Ориджины» у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (известные также как ARSs — autonomously replicating sequences, автономно реплицирующиеся последовательности) функционируют эктопически, будучи клонированы в плазмиды, и обычно после интеграции в другие хромосомные сайты, показывая тем самым, что инициация репликации регулируется специфическими последовательностями нуклеотидов ДНК. ARSs имеют величину приблизительно 100—150 п.н. и содержат одну или несколько копий важной последовательности длиной приблизительно 11 п.н. и обогащенной АТ плюс другие консервативные элементы (Weireich et al., 2004). Для инициации необходим белковый комплекс, известный как комплекс распознавания «ориджинов» (ORC, origin recognition complex), который отвечает за рекрутирование предрепликационного комплекса (PRC, prereplication complex), включающего белки поддержания минихромосом (МСМ, minichromosome maintenance proteins) (Prasanth et al., 2004). У многоклеточных «ориджины» репликации можно идентифицировать in situ, но обычно после клонирования и реинтродукции они не активны, что позволяет предполагать, что у этих организмов инициация регулируется эпигенетически, а не строгой зависимостью от последовательности ДНК (Aladjem and Fanning, 2004). Хотя у многоклеточных белки ORC и МСМ консервативны, факторы и механизмы, ответственные за регуляцию активности «ориджинов» у этих организмов, остаются загадкой. Кроме того, неясно, влияет ли структура хроматина на работу репликационных «вилок».

Ключ к тому, каким образом «ориджины» многоклеточных могли бы регулироваться эпигенетически, дают детальные исследования на S. cerevisiae. Хотя нуклеотидные последовательности ДНК в «ориджинах» необходимы и, по большей части, достаточны для инициации репликации у этого организма, имеются четкие данные о влиянии структуры хроматина на активность «ориджинов» (Weinreich et al., 2004). Анализ с использованием микрочипов (microarray analysis) показал, что не все из 332 сайтов двунаправленной репликации или из 429 сайтов связывания белков ORC и МСМ активны в каждом клеточном цикле. Хромосомный контекст и структура хроматина влияют на способность предполагаемого «ориджина» быть активным в инициации репликации. Например, ARS, локализованная в «молчащих» локусах типа спаривания, не может инициировать репликацию, если не будет перемещена в другие места хромосомы. Другой пример эпигенетической регуляции «ориджинов» относится к приблизительно 100—200 генам, кодирующим рибосомную РНК (rDNA), которые расположены в виде тандемных повторов (Pasero et al., 2002). Каждая единица rDNA длиной 9.1 т.п.н. содержит ARS, которая инициирует репликацию, будучи вставлена в плазмиду или в другое место генома. Однако в каждой S-фазе активны лишь около 20 % «ориджинов» rDNA.

«Ориджины» могут также регулироваться таким образом, что будут работать [to fire] на разных стадиях S-фазы (Weinreich et al., 2004). Например, «ориджины» возле теломер обычно активны в поздней S-фазе (см. раздел 2.3 далее в этой главе), но вставка тех же самых последовательностей в кольцевые плазмиды приводит к репликации в ранней S-фазе (рис. 14.3) (Ferguson and Fangman, 1992) Поздняя репликация может рекапитулировать в результате линеаризации такой плазмиды и добавления теломер, что помещает ARSs вблизи концов.

^{Рис. 14.3. Эпигенетическая регуляция сроков репликации у дрожжей}

^{Один из лучших примеров эпигенетических влияний на репликации был продемонстрирован у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Вставка поздно реплицирующегося «ориджина» в кольцевую плазмиду приводит к ранней репликации в S-фазе, а поздняя репликация восстанавливается после линеаризации этой плазмиды и добавления теломер (Ferguson and Fangman, 1992; Weinreich et al., 2004)}

Эти результаты показывают, что как активность «ориджинов», так и время начала работы «ориджина» в ходе S-фазы регулируются эпигенетически. Дальнейшие доказательства вытекают из наблюдений, согласно которым «расписание» S-фазы, сайленсинг «ориджинов» в rDNA, теломеры и локусы типа спаривания регулируются многими из модификаций гистонов и белками, отвечающими за эпигенетический сайленсинг генов, в том числе белками SIR (глава 4).

2.2. Репарация ДНК включает эпигенетические изменения в структуре хроматина

Накопление повреждений ДНК из-за ошибок репликации или воздействия внешними агентами может приводить к вредным мутациям, нестабильности генома, раку, старению клеток и смерти. Повреждения ДНК исправляются механизмами исправления ошибок в ходе репликации ДНК, а также независимыми механизмами, действующими в фазе G_r Клетки содержат «контрольные точки» («checkpoints»), выявляющие наличие повреждений ДНК и останавливающие или задерживающие клеточный цикл до тех пор, пока не завершится репарация; эти механизмы индуцируют также гибель клетки (апоптоз), если повреждение не исправляется, что способствует выживаемости организма за счет удаления дефектных клеток. Эти процессы в норме весьма эффективны; например, клетки кожи человека, подвергнутые УФ-облучению солнечного света, содержат удивительно большое количество повреждений ДНК, подавляющее большинство которых должным образом вылечиваются (Friedberg et al., 1995). Индивидуумы, дефектные по репарации в силу мутаций в одном или нескольких компонентах механизмов «контрольной точки» или репарации, страдают от целого ряда заболеваний, в том числе предрасположенностью к раку прямой кишки, груди и кожи и подвержены преждевременному старению.

В ранних исследованиях были успешно идентифицированы молекулы и механизмы, распознающие разные типы повреждений в ДНК, такие как двунитевые разрывы (DSBs) и пиримидиновые димеры, и рекрутирующие специфические комплексы для исправления этих повреждений. Однако упаковка ДНК в хроматин могла бы потенциально блокировать доступ факторов, участвующих в распознавании сайтов повреждения или осуществляющих репарцию, подобно репрессивному влиянию гетерохроматина на экспрессию генов (Hassa and Hottiger, 2005). Однако репарация использует АТФ-зависимые комплексы ремоделинга хроматина, которые, как предполагается, «экспонируют» дефектную ДНК для репарации

Более недавние исследования показали, что специфические изменения в хроматиновой матрице, такие как присутствие вариантов гистонов и посттрансляционные модификации гистонов, играют ключевую роль в распознавании повреждений ДНК и в рекрутировании соответствующих механизмов репарации (Hassa and Hottiger, 2005). Например, присутствие DSBs имеет своим результатом быстрое фосфорилирование варианта гистона Н2А, Н2АХ, по серинам 136 и 139 (обозначается у ШАХ). Фосфорилирование Н2АХ необходимо для накопления белков репарации в больших (мегабазы) районах, окружающих DBSs, и для сборки «фокусов» репарации, а не для первоначального рекрутирования репарационных комплексов к первичным сайтам повреждения ДНК (Bassing et al., 2002; Celeste et al., 2002). Эти наблюдения позволяют предполагать, что «распространение» у ШАХ из DBSs действует для усиления сигнала, исходящего из DBSs, увеличивая рекрутирование и, возможно, сохранение факторов репарации (Fernandez-Capetillo et al., 2004). В дополнение к участию в репарации DBSs фосфорилирование Н2АХ влияет на рекомбинацию V(D)J в лимфоцитах млекопитающих, а также действует как супрессор геномной нестабильности и опухолей у мышей (Fernandez-Capetillo et al., 2004).

Другие типы изменений хроматина, такие как ацетилирование гистонов, SUMOhjiирование, убиквитинирование и метилирование, также играют заметную роль в успешной репарации ДНК. Например, метилирование гистона H3 по лизину 79 (H3K79me) необходимо для рекрутирования к DSBs белка репарационной «контрольной точки» 53ВР1 и опосредуется DOT1-метилтрансферазой лизинов гистонов (НКМТ) (Huyen et al., 2004). Интересно, что индуцированные повреждения ДНК не изменяют уровни метилирования H3K79, позволяя предполагать, что эта модификация не добавляется в ответ на DSBs. Одна из возможностей заключается в том, что рекрутирование 53ВР1 и «ощущение» («sensing») DSBs связано с экспозицией предсуществующего метилирования H3K79 в ответ на ремоделинг хроматина в сайтах повреждений ДНК.

Хотя наше современное понимание влияния этих и других факторов хроматина на репарацию ДНК предполагает участие в сигналинге и рекрутировании соответствующих комплексов к повреждениям ДНК, вполне вероятно, что будущие исследования выявят новые направления, по которым эпигенетические механизмы регулируют пути, поддерживающие стабильность генома. Важно отметить, что роль хроматина в репарации ДНК является динамической и происходит в ответ на повреждение. Хотя модификации гистонов и другие эпигенетические регуляторные белки играют ключевые роли, эти изменения не наследуются при клеточном делении, в отличие от других примеров, обсуждаемых в этой главе.

2.3. Эпигенетический контроль структуры и функции теломер

Концы линейных эукариотических хромосом являются специализированными сайтами, известными как теломеры; они выполняют три существенные функции. Во-первых, теломеры обеспечивают включение самых дистальных концов хромосом в репликацию ДНК, решая тем самым «проблему репликации концов» (Lue, 2004). Во-вторых, теломеры защищают концы хромосом от деградации и подавляют слияния с другими хромосомами. В-третьих, у многих, но не у всех, организмов теломеры облегчают спаривание хромосом в мейозе. У большинства эукариот теломеры состоят из простых, коротких повторов, которые восстанавливаются ферментом теломеразой. Теломерные функции регулируются как механизмами на основе нуклеотидных последовательностей, так и эпигенетическими механизмами.

Проблема репликации концов возникает в связи с тем, что ДНК-полимеразе требуется праймер для инициации синтеза в направлении 5’ к 3’ «отстающей нити»; следствием этой ограниченной активности фермента оказывается тот факт, что репликация не может проходить до самого конца хромосомы (Lue, 2004). Для преодоления этой проблемы используются два механизма. Преобладающий механизм, используемый большинством организмов, в том числе дрожжами, млекопитающими и растениями, включает необычный ферментативный комплекс, известный как теломераза. Теломеры у большинства эукариот состоят из простых повторов длиной 6 п.н., распространяющихся на расстояние от десятков до сотен тысяч пар оснований. Теломеразные комплексы содержат энзиматическую активность, подобную обратной транскриптазе, а также РНК, обладающими гомологией с теломерными повторами. Суть дела состоит в том, что репликация конца выполняется путем «нацеливания» этого комплекса на теломерные повторы с помощью РНК-компонента; за этим следует обратная транскрипция (3’ к 5’), производящая новые повторы. Интересно, что утрата теломеразной активности и укороченные теломеры коррелируют с клеточным дряхлением и старением и, наоборот, раковые клетки обнаруживают повышенную теломеразную активность и удлиненные теломеры (Blasco, 2005).

Существуют также независящие от теломеразы механизмы поддержания хромосомных концов (Louis and Vershinin, 2005). Одна хорошо изученная альтернативная система, по-видимому, ограничена дрозофилой и другими двукрылыми. У этих организмов теломераза не идентифицируется, а концы не содержат простых, коротких повторов, обнаруживаемых у большинства других эукариот. Вместо этого концы хромосом Drosophila состоят из перетасованныхкластеровразличныхретротранспозонов типа non-LTR (LTR — длинный терминальный повтор), размеры которых варьируют от 3 до 5 т.п.н., и других повторов (TAS — telomere-associated repeats) (Biessmann and mason, 2003). Эти транспозоны кодируют ферменты типа обратной транскриптазы (отсюда re/rot ransposon), позволяя предполагать, что здесь имеется эволюционное родство с более стандартными теломеразными механизмами. Основное различие, однако, заключается в том, что хромосомы Drosophila не реплицируются до самого конца; они теряют примерно 70 п.н. на мушиное поколение, т.е. примерно то самое количество, которое ожидается в связи с проблемой репликации концов. Эта утрата не выбывает делеции существенных генов, потому что домены теломерных и субтеломерных повторов имеют длину около 50—100 т.п.н., и потребовалось бы много поколений, чтобы потерялось достаточное количество ДНК и были достигнуты участки с генами. Эта утеря теломерных последовательностей компенсируется, однако, нечастым добавлением ретротранспозонов типа non-LTR (Biessmann and Mason, 2003).

Эпигенетическая регуляция затрагивает функции теломер и экспрессию генов, находящихся в этом районе. «Голая» теломерная ДНК или внутренние DSBs приводят к хромосомным слияниям и анеуплоидии. Барбара МакКлинток (Barbara McClintock) первой описала явление, известное как цикл «разрыв-слияние-мостик». в котором слияния между разорванными хромосомами или слияния концов хромосом производят дицентрические хромосомы и анафазные мосты, которые генерируют дальнейшие разрывы. Доказательства эпигенетической регуляции теломерной защиты концов хромосом вытекает из исследований на Drosophila, показавших, что она не зависит от нуклеотидных последовательностей ДНК. Оторванный конец хромосомы у Drosophila может вести себя как DSB в одном поколении, но действует как полностью функциональная теломера впоследствии, без какого-либо добавления ретротранспозонов или каких-либо изменений последовательности (Ahmad and Golic, 1998). Более того, любой конец, созданный у Drosophila (известно как терминальные делеции), может быть упакован как теломера и защищен от событий слияния (Karpen and Spradling, 1992). Кроме того, у Schizosaccharomyces pombe теломерные функции зависят от белка Tazl (Miller and Cooper, 2003) и теломерного хроматина, и эта зависимость не связана с каноническими теломерными повторами (Sadaie et al., 2003).

Теломерные районы содержат модификации хроматина и обладают свойствами, сходными с перицентромерным гетерохроматином, описанным в разделе 3 далее в этой главе. Характеристика эпигенетических механизмов, регулирующих теломерные и субтеломерные районы, была получена в исследованиях экспрессии генов у дрожжей и Drosophila, но наблюдается также у человека. Сайленсинг эухроматиновых генов, вставленных в теломерные районы, варьирует. Это явление называется теломерным эффектом положения (ТРЕ, telomere position effect); оно похоже на эффект положения мозаичного типа (PEV, position-effect variegation), индуцируемый соседним центромерным гетерохроматином у мух и S. pombe (детали см. в главах 5 и 6, соответственно). У почкующихся дрожжей многие факторы, связанные с хроматином, такие как белки SIR, влияющие на сайленсинг типа спаривания, влияют также на сайленсинг, индуцируемый теломерой (глава 4). Удивительно, что почти ни один из генов, регулирующих PEV у Drosophila (Супрессоры и Энхансеры Мозаицизма, Su(var) s и E(var)s, описанные в главе 5), никак не влияет на теломерный сайленсинг. Это заставляет предположить, что PEV и ТРЕ опосредованы, по крайней мере отчасти, разными механизмами (Cryderman et al., 1999; Donaldson et al., 2002).

Гетерохроматиновый белок 1 (HP1, продукт гена Su(var)) и метилирвание H3K9, которые являются ключевыми компонентами сайленсинга, опосредованного хроматином (глава 8), присутствуют в теломерах Drosophila и необходимы для удлинения теломер (рис. 14.4) (Perrini et al., 2004). Результатом делеции НР1 или его партнера по связыванию НОАР (сокращение для НР1/ ORC-associated protein) оказывается очень высокая частота теломерных слияний (Cenci et al., 2003). НР1 обычно рекрутируется к хроматину благодаря своему сродству к метилированному H3K9 через хромодомен. Интересно, что кэпирование теломеры белком НР1 не зависит от метилирования H3K9; это позволяет предполагать, что защита концов опосредуется альтернативным механизмом, в котором участвует прямое связывание с теломерной ДНК или нетеломерными последовательностями, присутствующими в терминальных делециях (рис. 14.4а) (Perrini et al., 2004). Одна из привлекательных моделей сводится к тому, что НР1 связывается и защищает концы независимо от нуклеотидной последовательности ДНК, затем рекрутирует неизвестную НКМТ H3K9; локальное метилирование H3K9 могло бы затем рекрутировать к этому участку большие количества НР1, что стимулирует распространение теломерного сайленсинга (рис. 14.4). Этот механизм, вероятно, не требует средств RNAi, участвующих в установлении и сайленсинге центромерного гетерохроматина (глава 8), но этот компонент модели нуждается в прямой проверке.

Недавние исследования показали, что у млекопитающих зависимое от теломеразы удлинение теломеры также регулируется эпигенетически (Lai et al., 2005). Например, мыши с делецией обеих копий HKMTs H3K9. Suvar39hl/2, имеют теломеры с редуцированными уровнями H3K9me2 и H3K9me3 и демонстрируют аномально длинные теломеры (рис. 14.46) (Garcia-Cao et al., 2004). Эти результаты позволяют предполагать, что активность НКМТ Suvar39hl/2 превращает модификацию H3K9me в ди- и триметилированные формы, облегчая связывание гомологов НР1, СЬх 3 и 5, которые необходимы для сборки нормальной структуры теломерного хроматина и регуляции длины теломер.

Наконец, эпигенетические модификации, происходящие в теломерах, влияют также и на мейотическую рекомбинацию и передачу хромосом. Например, у почкующихся дрожжей утрата Ndjl, теломерного белка, необходимого как для формирования теломерного букета (т.е. образования кластера), так и для мейотической рекомбинации (Wu and Burgess, 2006), приводит к резкой редукции частоты теломерных делеций (Joseph et al., 2005). Джозеф и сотрудники предполагают что Ndj 1 облегчает теломерную делецию, «стимулируя взаимодействия теломер в ходе мейоза, что приводит к эффективному увеличению содержания факторов, необходимых для делеции». Аналогичным образом, мутанты, дефектные по транскрипционному сайленсингу генов, помещенных поблизости от теломер, демонстрируют серьезные нарушения в мейотическом спаривании и рекомбинации, что приводит к неправильной агрегации во время мейоза (Nimmo et al., 1998). Таким образом, эпигенетические события, которые контролируют как длину теломер, так и транскрипционную компетентность, используются также в процессах, контролирующих поведение хромосом в ходе мейоза.

Для нормального наследования генетического материала требуется, чтобы после того как геном точно дуплицировался и репарировался в S-фазе, хромосомы надежно расходились во время митоза и мейоза. Центромеры были впервые определены в 1880 году Флемингом (Flemming) как цитологически видимая «первичная» перетяжка в хромосоме. В начале 1900-х годов центромеры были определены и генетически как хромосомные сайты, существенные для нормального наследования, и как участки с резко сниженной или даже вовсе отсутствующей мейотической рекомбинацией. В настоящее время мы определяем центромеру (CEN) как ДНК плюс белки хроматина, ответственные за формирование кинетохора. Кинетохор — это белковая структура, облегчающая прикрепление микротрубочек и движение вдоль них, обращенная к пластинке во время прометафазы и к полюсам во время анафазы митоза и мейоза. Кинетохор служит также местом действия ключевой для клеточного цикла «контрольной точки», известной как «контрольная точка сборки веретена» (SAC, spindle assembly checkpoint), или «митотическая контрольная точка» (Cleveland et al., 2003).

^{Рис. 14.4. У мух и млекопитающих функции теломер регулируются эпигенетически}

^{(а) У Drosophila гетерохроматиновый белок 1 (НР1) связывается с теломерной ДНК независимо от ее хромодомена и «кэпирует» теломеры, что обеспечивает нормальное расхождение благодаря блокировке теломерных слияний (Fanti et al. 1998; Perrini et al. 2004). Затем HP1 рекрутирует неизвестную метилтрансферазу гистонов (НКМТ; не Su(var)3-9), которая триметилирует H3K9 на близлежащих нуклеосомах; НР1 связывается с H3K9me3 через хромодомен, что, в свою очередь, рекрутирует большие количества НКМТ, а последовательные раунды связывания НР1 — рекрутирования НКМТ стимулируют распространение «молчащего» хроматина по субтеломерным районам, (б) У мышей нокаут обоих локусов НКМТ Suv39 понижает уровни H3K9me3 и me2 и увеличивает содержание модификаций H3K9me, измененной структуры хроматина и изменений в уровнях белков, связывающихся с ди- и триметилированными H3K9 (1 СЬх 3 и 5), H3K9me (Т Cbx 1) и TERF 1 и 2 (не показано) в теломерах (Garcia-Cao et al. 2004). Эти изменения коррелируют с увеличенной длиной теломер, позволяя предполагать, чтотриметилирование H3K9 с помощью Suv39hs необходимо для нормального функционирования теломеразы и регуляции размера теломер}

Ключевой вопрос для организмов с моноцентрическими хромосомами сводится к тому, каким образом один и только один сайт на хромосому ассоциируется с функцией центромеры (известной как «идентичность центромеры» — «centromere identity»). Здесь мы представим доказательства того, что у большинства эукариот идентичность и воспроизведение центромеры регулируются эпигенетически посредством структуры хроматина, а не специфическими нуклеотидными последовательностями ДНК (Carroll and Straight, 2006). Сводка этих ключевых данных включает следующие положения: (1) центромерные последовательности не являются консервативными даже у близкородственных видов и даже у хромосом одного какого-нибудь вида, (2) центромерная ДНК не является необходимой или достаточной для формирования кинетохора и (3) позиционирование центромеры на хромосоме обнаруживает удивительную пластичность в ходе эволюции.

3.1. Структура и функция центромеры у разных эукариот

Исследования, проведенные на дрожжах S. cerevisiae в 1980-е годы, привели к первому клонированию и анализу эукариотной центромеры. Было показано, что структура размером 125 п.н., присутствующая на всех 16 хромосомах S. cerevisiae, необходима и достаточна для нормального функционирования центромеры (Bloom et al., 1989); даже однонуклеотидные изменения в высококонсервативных элементах I и III приводили к полной утрате функции. Таким образом, идентичность и воспроизведение центромеры у этого одноклеточного эукариотического организма определяются нуклеотидной последовательностью ДНК.

Надежда на то, что аналогичные механизмы, базирующиеся на нуклеотидной последовательности, могли бы регулировать идентичность центромеры у других эукариот, впервые была развеяна исследованиями на другом «простом» эукариотическом организме, S. pombe. Центромерные последовательности у этих дробянковых дрожжей структурно более крупные и более сложные, чем у S. cerevisiae (Clarke et al., 1986; Nakaseko et al., 1987). Негомологичные последовательности «центрального кора» длиной 4—5 т.п.н., являющиеся сайтами формирования кинетохора, фланкированы инвертированными повторами различных классов, общими для трех хромосом. Минимум 25 т.п.н., содержащие неповторяющийся центральный кор, внутренние повторы и часть внешних повторов, абсолютно необходимы для функционирования центромеры и стабильной передачи хромосом (Baum et al., 1994). Достаточная центромерная функция наблюдается для трансфицированных плазмидных конструктов, несущих центральный кор плюс внутренние повторы (т.е. центральный домен) и два фланкирующих внешних повтора. Интересно, что делеция внутренних повторов нарушает расхождение сестринских хроматид в мейозе, демонстрируя тем самым, что центромерные районы играют роль в процессах, отличающихся от сборки кинетохора. Действительно, и кинетохор, и домены когезии тесно сцеплены и важны для правильного расхождения хромосом.

Хотя центромерные районы у многоклеточных эукариот даже больше и более сложные, чем у S. pombe (сотни или тысячи тысяч пар оснований повторяющихся ДНК), общая организация и функционирование центромер дробянковых дрожжей послужили превосходной моделью центромер у млекопитающих, растений и насекомых. Центромеры у этих организмов заключены в крупные гетерохроматиновые блоки, присутствующие на каждой хромосоме, которые преимущественно состоят из сателлитных ДНК (простые, короткие повторы) и транспозонов. Эти центромерные районы составлены из субдоменов, отвечающих за различные функции, прежде всего за формирование кинетохора и сестринскую когезию. Центромерные последовательности, однако, не консервативны у эукариот или даже у разных хромосом отдельного вида. Именно эпигенетический состав функциональных субдоменов центромеры демонстрирует консерватизм, особенно по составу гистоновых вариантов и паттернам модификаций гистонов, которые, по-видимому, регулируются эпигенетически

У нематоды С. elegans и у других видов голоцентрические хромосомы рекрутируют и собирают центромерные белки по всей длине хромосомы (Demburg, 2001). Специфические для червя последовательности не являются, очевидно, необходимыми, поскольку конкатемеры лямбда и ДНК многих других типов стабильно передаются. Белки рекрутируются «пакетами» [«bundles»] в профазе, но к метафазе распределяются ровным слоем на обращенной к полюсу поверхности хромосомных плеч, заставляя предполагать, что многие области генома С. elegans могут поддерживать сборку кинетохора в эпигенетическом режиме. Несмотря на очевидные различия с моноцентрическими хромосомами, возможно, что организационные и структурные атрибуты, такие как ЗБ-спирализация или выпетливание ДНК CEN, являются консервативными (см. раздел 3.3 далее в этой главе).

3.2. Центромерные последовательности не являются необходимыми или достаточными для формирования и функционирования кинетохора

Большая величина и сложность центромерных последовательностей у многоклеточных эукариот сделали затруднительным анализ потребностей в нуклеотидной последовательности ДНК с помощью определенных конструктов, столь успешно использовавшихся в исследованиях на дрожжах. Тем не менее, путем трансфекции клеток культуры ткани набором сателлитных ДНК были созданы с низкой частотой искусственные хромосомы человека (HACs), но они обнаружили высокий уровень митотической нестабильности (Rudd et al., 2003). Мы знаем, однако, что HACs образованы путем конкатемеризации введенных наборов сателлитов, и тем не менее некоторые альф?-сателлитные наборы не могут формировать сентромеры de novo, что заставляет предположить потребность в множественных, неизвестных этапах или факторах. Более недавние исследования показали, что уникальные свойства и компоненты иентромерного хроматина (как объясняется в разделе 3.3 далее в этой главе) имеются в HACs как в сателлитных наборах, так и в нецентромерных последовательностях (например, последовательностях плазмидного вектора и селектируемого маркера) (Lam et al., 2006). Таким образом, остается все еще неясным, насколько специфические последовательности ДНК достаточны для сборки и поддержания функциональных центромер человека.

Первое указание на то, что идентичность и воспроизведение центромер регулируются эпигенетически, было получено в исследованиях «минимальных» центромерных конструктций у S. pombe (Steiner and Clarke, 1994). Небольшая доля трансформантов, полученных с помощью конструктов, обнаруживала переключение с редуцированной центромерной функции к высоко «активному» центромерному функционированию (0,6 % клеток), что впоследствии могло воспроизводиться в линии на протяжении многих поколений. Таким образом, одни и те же нуклеотидные последовательности ДНК могут демонстрировать два функционально различных, наследуемых состояния, аналогично наблюдениям эпигенетических влияний на генную экспрессию при PEV (глава 5) или ТРЕ (глава 4).

Другие наблюдения заставляют предполагать главную роль эпигенетических механизмов в детерминации идентичности центромер и формировании кинетохоров у многоклеточных эукариот. Во-первых, нуклеотидные последовательности ДНК, в норме ассоциированные с центромерами, не достаточны для функционирования. Например, только подгруппа гетерохроматиновых сателлитных последовательностей мыши и человека связана с центромерной функцией (Lam et al., 2006). Кроме того, в функциональных хромосомах с двумя участками центромерных сателлитов (дицентрики), наблюдаемых у мух и у человека, один из этих участков теряет способность формировать кинетохор (Sullivan and Willard, 1998). Во-вторых, центромерные последовательности не являются необходимыми для формирования кинетохора, поскольку нецентромерная ДНК может приобретать и надежно воспроизводить центромерную функцию благодаря процессу, известному как «формирование неоцентромеры» (рис. 14.5а). У человека были идентифицированы многочисленные функциональные неоцентромеры, и анализ нуклеотидной последовательности показал, что эти новые районы формирования кинетохоров не приобрели сателлитных ДНК. Однако участки, фланкирующие новый кинетохор, приобрели эпигенетические свойства, сравнимые с соответствующими районами в эндогенных центромерах (т.е. перицентрическом хроматине), такими как метилирование H3JT9 и связывание НР1 (Lo et al., 2001).

Хотя механизм формирования неоцентромер у человека не известен, в модельной системе неоцентромеры были созданы экспериментально. У Drosophila неопентромеры получаются из минихромосом, когда помещаются рядом нецентромерная ДНК и эндогенная центромера (рис. 14.56) (Maggert and Karpen, 2001). Таким образом, у Drosophila для активации неоцентромеры требуется близость к функциональной центромере, заставляя предполагать, что одним из механизмов приобретения центромеры является распространение центромерных белков в с/^-конфигурации на соседние, нецентромерные участки. Коль скоро это распространение произошло, центромерная функция затем воспроизводится в этом новом сайте эпигенетически. Интересно, что формирование неоцентромеры подавляется, когда между эндогенной центромерой и участком формирования неоцентромеры присутствует гетерохроматин, заставляя предполагать, что в определении величины центромеры играют роль дополнительные эпигенетические механизмы.

Наконец, признаком эволюции являются хромосомные перестройки. Эти изменения сопровождаются приобретением, утратой и перемещениями центромер по отношению к нуклеотидным последовательностям генома (Ferreri et al., 2005). Такую пластичность легче всего объяснить, если идентичность центромеры определяется эпигенетически, как это описано в разделе 3.5.

3.3. Необычный состав центромерного хроматина

Данные об эпигенетическом регулировании центромерной идентичности и воспроизведении указывают на вероятность того, что ключевыми детерминантами являются структура и состав хроматина, а не первичные последовательности ДНК. Здесь мы обсудим различные компоненты и структуры, обнаруживаемые в хроматине CEN, а также удивительное наблюдение, показывающее, что эти свойства консервативны у далеко отстоящих друг от друга эукариот.

^{Рис. 14.5. Формирование неоцентромер у человека и мух (а)}

^{Хромосомы человека, несущие неоцентромеры, которые демонстрируют центромерную функцию и формирование кинтетохора в отсутствие центромерной ДНК, обычно связаны с крупными перестройками (Amor and Choo, 2002). В этом примере происходящая от хромосомы 10 неоцентромера (mar(del)10), структура которой указывает на формирование посредством большой интерстициальной делеции. удалившей эндогенную центромеру (серые пунктирные линии). Mar(del) 10 была открыта у индивидуума, в кариотипе которого была также кольцевая хромосома (ring(del)10, не показана), содержавшая ДНК из делегированного участка Последовательность событий для неоцентромер человека неясна; формирование неоцентромеры могло бы происходить вначале, давая дицентрическую хромосому, которая впоследствии подвергается перестройкам, или же формирование неоцентромеры могло бы происходить после делеции эндогенной центромеры, (б) У мух неоцентромеры могут создаваться экспериментально из минихромосомы, охарактеризованной на молекулярном уровне. Фрагмент эухроматина величиной 320 т.п.н. и теломерный хроматин, не содержащий центромерной ДНК. можно отделить от остальной минихромосомы, используя облучение. Этот фрагмент, который должен бы быть «ацентрическим», может стать функциональной неоцентромерой, которая надежно воспроизводится в митозе и мейозе и содержит белки центромеры и кинетохора, в норме ограниченные эндогенной центромерой (Blower and Karpen, 2001). Однако для формирования неоцентромеры требуется близость к эндогенной неоцентромере (420 т.п.н.), как в инверсионном деривате ?238; более того, формирование неоцентромеры не происходит по обе стороны от центромеры, когда присутствует перицентрический гетерохроматин (Maggert and Karpen, 2001) Эти результаты заставляют предполагать, что формирование неоцентромеры происходит через эпигенетическое распространение центромерного хроматина в соседний эухроматин, за которым следует эпигенетическое воспроизведение центромерной идентичности и функции. Блокирование этого процесса гетерохроматином согласуется с наблюдением, что сверхэкспрессированная CENP-A включается эктопически в эухроматин. но не в гетерохроматин (Heun et al. 2006), и позволяет предполагать, что протяженность центромерного хроматина определяется двумя эпигенетическими процессами: загрузкой и распространением CENP-A и формированием — блокированием гетерохроматина}

У всех эукариот в центромерных нуклеосомах присутствуют специфичные для центромер белки семейства CENP-A, подобные гистону H3 (рис. 14.6а). Они служат и структурной, и функциональной основой для кинетохора и являются превосходными кандидатами на роль эпигенетической метки, устанавливающей и воспроизводящей центромерную идентичность (Cleveland et al., 2003). В отличие от большинства белков кинетохоров, собирающихся во время митоза, CENP-A присутствует в центромерах на протяжении всего клеточного цикла, что является одним из первых указаний на его важность для центромерной идентичности. У дрожжей, червей, мух и млекопитающих хроматин, содержащий CENP-A, обеспечивает также основу, существенную для рекрутирования белков кинетохора, прикрепления веретена и нормального расхождения хромосом (Carroll and Straight, 2006). Эксперименты по реципрокному эпистазу показали, что CENP-A является первым белком на пути сборки кинетохора, что согласуется с его физической локализацией в хроматине в основании кинетохора в митотических хромосомах. Дальнейшие доказательства важности CENP-A для формирования кинетохора вытекают из опытов по сверхэкспрессии у мух, в которых неправильная локализация CENP-A в нецентромерных районах производит функциональные эктопические кинетохоры (Heun et al., 2006). Поэтому, коль скоро этот вариант гистона существен для центромерной функции, мы в настоящее время определяем CEN-хроматин как район ДНК и белков, связанных с CENP-A.

Структура нуклеосом, содержащих CENP-A. необычна по сравнению с каноническими гистоновыми корами, содержащими H3, Н2А, Н2В и Н4. Нуклеосомы CENP-A можно собрать in vitro из очищенного

CENP-A и гистонов Н2А, Н2В и Н4, что согласуется с предыдущими наблюдениями, показывающими, что in vivo они гомотипичны (т.е.содержат две копии CENP-А, а не одну копию H3 и одну копию CENP-A) (Yoda et al., 2000). Детальный биофизический анализ показал, что интерфейс между CENP-A и Н4 отличается от интерфейса H3—Н4, и домен, взаимодействующий с Н4 достаточен для «нацеливания» CENP-A на центромеры в присутствии эндогенного CENP-A (Black et al., 2004).

Замещение гистона H3 белком CENP-A в центромерных нуклеосомах первоначально позволяло думать, что CENP-A составляет весь хроматин, связанный с кинетохором. У S. pombe CENP-A равномерно распределен по центральным коровым участкам величиной 5—7 т.п.н. Эти коры фланкируются крупными гетерохроматиновыми доменами, содержащими метилирование H3K9 и белки гетерохроматина (Pidoux and Allshire, 2004). Однако детальный цитологический анализ и исследования с использованием иммунопреципитации обнаружили, что у многоклеточных эукариот центромерный хроматин имеет более сложный состав и организацию. Центромеры Drosophila, человека и риса содержат перемежающиеся блоки нуклеосом, содержащих H3 и CENP-A (в совокупности называемые CEN-хроматином), фланкированные еще более крупными блоками (от тысяч до миллионов пар нуклеотидов) перицентромерного гетерохроматина (рис. 14.66) (Blower et al., 2002; Yan et al., 2005).

^{Рис. 14.6. Организация центромерного хроматина}

^{(a) CENP-A является высококонсервативным, специфичным для центромер вариантом гистона Рисунок показывает его локализацию исключительно в центромерах в митотических хромосомах Drosophila (б) CEN-хроматин у мух и человека содержит перемежающиеся блоки содержащих Н3 и содержащих CENP-A нуклеосом и фланкирован перицентромерным гетерохроматином (Blower et al. 2002)}

Чередование [interspersion] доменов H3 и CENP-A ставит ключевые вопросы относительно эпигенетической природы CEN-хроматина. В частности, модифицированы ли субдомены H3 в CEN-хроматине многоклеточных эукариот подобно гетерохроматину или эухроматину? Или же они маркированы уникальным образом? Далее, эквивалентна ли каждая перемежающаяся единица CENP-A/H3 в более крупных эукариотических центромерах единичной центромере S. pombe? К этим вопросам обратились, изучая посттрансляционные модификации, характеризующие перемежающиеся блоки нуклеосом H3 и CENP-A и обнаружившие еще большую сложность. Удивительно, что у человека и мух перемежающиеся домены H3 содержат H3K9me2 — метку, обычно ассоциированную с эухроматином — и, более того, не имеют H3K9me2 и H3K9me3, ассоциированных с фланкирующим гетерохроматином (рис. 14.7а) (Sullivan and Karpen, 2004; Lam et al., 2006). Однако, как и в гетерохроматине, в перемежающихся нуклеосомах H3 отсутствовали множественные формы ацетилирования H3 и Н4, как отсутствовал и H3K4me3. Таким образом, нуклеосомы H3 в CEN-хроматине обнаруживают паттерн модификаций, отличающийся от канонических эухроматина или гетерохроматина (рис. 14.76). Эти результаты наводят также на мысль, что центросомы мух и человека не составлены просто из повторяющихся S. pombe-подобных центромер. Важно, однако, отметить, что общая организация центромерных районов консервативна, так что у всех многоклеточных эукариот и у S. pombe весь хроматиновый домен CENP-A фланкируется перицентромерным гетерохроматином, содержащим метилирование H3K9.

Какова возможная функциональная роль модификаций гистонов в CEN и фланкирующем хроматине? Отдельные состояния хроматина в районе CEN, вероятно, вносят вклад в разнообразные свойства центромерных доменов, такие как установление сроков для дифференциальной репликации CEN и фланкирующего гетерохроматина (Sullivan and Karpen, 2001; Blower et al., 2002). Модификации фланкирующего перицентромерного гетерохроматина могут также поддерживать размеры центромер, создавая барьер против расширения CEN-хроматина. У Drosophila CEN-хроматин легко распространяется на соседние последовательности, когда фланкирующий гетерохроматин удаляется, делая возможной активацию неоцентромеры (рис. 14.56) (Maggert and Karpen, 2001), а сверхэкспрессия CENP-A приводит к неправильной локализации в эухроматин, но не гетерохроматин (Heun et al., 2006). Интересно, что результатом сверхэкспрессии CENP-A в клетках человека является распространение CEN -хроматина и изменения в метилировании H3K9 во фланкирующих участках (Lam et al, 2006). Таким образом, размеры центромер, по-видимому, определяются балансом между двумя эпигенетическими состояниями: CEN-хроматином и фланкирующим перицентромерным гетерохроматином.

Концентрация белков, необходимых для сцепления (когезии) сестринских хроматид, которое устанавливается одновременно с репликацией ДНК в фазе S, выше всего в гетерохроматине, фланкирующем центромеру. Это распределение, по-видимому, вносит вклад в соответствующую двойную ориентацию кинетохоров в митозе, а также в поддержание сцепления во время метафазы несмотря на развиваемые веретеном силы, концентрирующиеся в кинетохорах/центромерах (Watanabe, 2005). Эпигенетическое регулирование сцепления включает рекрутирование когезинов белками НР1 (Swi6у S. pombe), которое, в свою очередь, опосредуется высокими концентрациями метилирования H3K9 в перицентромерном гетерохроматине (Nonaka et al., 2002). Таким образом, специфичные для CEN комбинации модификаций гистонов тоже могли бы быть важными для рекрутирования когезионных комплексов к гетерохроматину вблизи сестринских кинетохоров, обеспечивая в то же время пространственное разделение когезионных и кинетохорных доменов (Sullivan and Karpen, 2004; см. также главу 6).

^{Рис. 14.7. Различные паттерны модификаций гистонов в центромерном хроматине}

^{(а) Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител, распознающих специфические модификации гистонов на расправленных хромосомных фибриллах, показал, что перемежающиеся блоки нуклеосом, содержащих H3, обладают паттерном модификаций, отличающимся от канонических эухроматина и гетерохроматина (Sullivan and Karpen, 2004). Например, несмотря на то, что центромеры у большинства эукариот погружены в крупные блоки перицентрического гетерохроматина, перемежающиеся блоки H3 содержат модификацию H3K9me2, в норме ассоциирующуюся с «открытым» эухроматином (наверху) и лишены гетерохроматинового маркера H3K9me2, присутствующей в перицентрических фланкирующих участках (внизу), (б) Сводка «двумерной» организации центромерного хроматина в интерфазе, основывающаяся на исследованиях растянутых фибрилл хроматина у мух и человека. + и — обозначают присутствие и отсутствие указанных модификаций гистонов (соответственно) в эухроматине, перицентромерном гетерохроматине и перемежающихся блоках нуклеосом H3 в центромерном хроматине (Sullivan and Karpen 2004; Lam et al., 2006). (в) Модель трехмерной организации хроматина в центромерном районе митотических хромосом. Предполагается, что ассоциации между сходным образом модифицированными нуклеосомами вносят вклад в формирование отдельных трехмерных структур в центромерном и фланкирующем хроматине. Перемежающиеся CENP-A/ CID и по-разному модифицированные H3 и Н4 могут опосредовать формирование «цилиндрических» трехмерных структур, наблюдаемых в метафазных хромосомах (Blower et al., 2002; Sullivan and Karpen, 2004). Хроматин H3K9me2, рекрутирующий такие белки гетерохроматина, как НР1, и такие белки когезии, как RAD21/SCC1, присутствует во внутреннем кинетохорном пространстве между митотическими сестринскими хроматидами и в участках, фланкирующих центромерный хроматин. Это расположение может быть необходимо для «презентации» CENP-A направленной к полюсу поверхности митотической хромосомы и облегчения рекрутирования внешних кинетохорных белков, а также для стимуляции взаимодействия НР1 с самим собой и правильной конденсации/когезии хромосом. Когезины изображены в виде кольцевидных структур в соответствии с последними моделями}

В митотических хромосомах человека и Drosophila субдомены CENP-A сливаются, образуя трехмерную цилиндрическую структуру, в значительной мере исключающую нуклеосомы H3 (Blower et al., 2002). Блоки нуклеосом CENP-A ориентированы на поверхности хромосом, направленной к полюсам, а блоки нуклеосом H3 локализованы по направлению к внутреннему району хроматид. Внутренние и внешние белки кинетохора обернуты вокруг цилиндра CENP-A; это трехмерное расположение согласуется с CENP-A, играющим центральную роль в рекрутировании других кинетохорных белков (Blower et al., 2002). Для того чтобы согласовать двумерное чередование блоков CENP-Аи H3 (рис. 14.66 и 14.76) с разделением в трехмерных митотических хромосомах, предположили, что CEN-ДНК может закручиваться спиралью или выпетливаться в цилиндрической структуре, приводя к выравниванию нуклеосом с одним и тем же составом по одной линии [alignment] или в стопку (рис. 14.7в). Таким образом, раздельно модифицированные перемежающиеся нуклеосомы H3 и фланкирующий гетерохроматин могли бы отвечать за сборку трехмерной структуры CEN-хроматина в митозе (Sullivan and Karpen, 2004). Такое расположение может быть необходимо, чтобы экспонировать хроматин CENP-A внешней стороне хромосомы, где он может рекрутировать кинетохорные белки таким образом, который устанавливает правильную двойную ориентацию сестринских кинетохоров по отношению к полюсам веретена.

3.4. Модели структуры, функции и воспроизведения центромеры

Ключевым вопросом, исследуемым в настоящее время, является вопрос о том, как CENP-A и другие эпигенетические маркеры специфически локализуются и воспроизводятся в центромерах. Другой подход к этому же вопросу заключается в том, чтобы рассмотреть, каким образом CENP-A собирается только в центрмерном хроматине. Одна из привлекательных моделей предполагает, что включение CENP-A специфически в центромеры регулируется дифференциальными сроками и репликации CEN-ДНК, и экспрессии CENP-A по сравнению с основной массой хроматина (Ahmad and Heniloff, 2001). Однако репликация CEN-ДНК у человека и мух происходит на протяжении всей фазы S, одновременно с репликацией основной ДНК (Shelby et al., 2000; Sullivan and Karpen, 2001), а включение CENP-A происходит в отсутствие репликации ДНК (Shelby et al., 2000; Ahmad and Heniloff, 2001). Эти наблюдения исключают механизм строгой привязки ко времени репликации для воспроизведения CENP-A и центромерной идентичности.

Более привлекательный механизм вытекает из интригующего наблюдения, согласно которому CENP-A активно инкорпорируется в нуклеосомы не зависящим от репликации образом с помощью комплекса обмена гистонов (Shelby et al., 2000; Ahmad and Heniloff, 2001). H3.3 является вариантом H3, сборка которого, не зависящая от репликации (Ahmad and Heniloff, 2002), опосредуется комплексом, известным как регулятор гистонов A (HIRA), а не комплексами фактора сборки хроматина (CAF, chromatin assembly factor), ответственными за зависимое от репликации включение канонических нуклеосом H3 (Nakatani et al., 2004). У S. cerevisiae устранение компонентов HIRA приводит к неправильной локализации CENP-A (Sharp et al., 2002). Однако в настоящее время неясно, влияют ли компоненты HIRA на центромерный хроматин у многоклеточных эукариот или у S. pombe, где центромерная идентичность определяется эпигенетически. Более важно, что эти белки играют роль в сборке и структуре хроматина, например путем откладки H3.3; таким образом, широкая активность идентифицированных компонентов HIRA не объясняет специфичности включения CENP-A в центромеры. Возможно, что некая подгруппа комплексов HIRA содержит факторы, взаимодействующие только с CENP-A и распознающие существующие нуклеосомы CENP-A в реплицированном хроматине CEN; однако никаких таких факторов специфичности идентифицировать не удалось. Один из способов согласовать участие неспецифических факторов сборки — это представить себе, что специфичность обеспечивается CENP-A или нуклеосомами CENP-A. Например, определенные структурные взаимоотношения между CENP-A и Н4 могли бы обеспечить специфичность сборки новой CENP-A в центромерах; на эту мысль наводит способность взаимодействующего домена «нацеливать» CENP-A на центромеры (Black et al., 2004). Неясно, однако, достаточны ли эти домены для «нацеливания» центромер в отсутствие эндогенной CENP-A.

Сейчас очевидно, что требуется по-новому представлять себе эпигенетическую регуляцию центромерной идентичности и воспроизведения. У S. cerevisiae результатом дефектов в протеолизе CENP-A оказывается неправильное включение в нецентромерные в норме районы, что в норме удаляется неизвестным механизмом «очищения» отовсюду, кроме эндогенной центромеры (Collins et al., 2004). Это позволяет предполагать, что центромерная идентичность может регулироваться после сборки нуклеосом. Однако неправильная локализация CENP-A у мух приводит к эктопическому формированию кинетохора (Heun et al., 2006), заставляя предполагать, что удаление неправильно включенного CENP-A может быть специфичным для S. cerevisiae.

Тем не менее, вариации такой модели «негативной специфичности» стоит рассмотреть. Ключевой вопрос для всех моделей центромерной идентичности заключается в следующем: что обеспечивает специфичность? В данном случае, почему такие белки, как CENP-A, должны сохраняться только в одном сайте? Одна новая идея возникает в связи с тем фактом, что стабильная ассоциация с веретеном является тем свойством, которое уникально для функциональных центромер, кинетохоров (Mellone and Allshire, 2003). Таким образом, воспроизведение центромеры и сайт включения CENP-A могут определяться в ходе митоза, с помощью механизма, чувствующего продуктивные прикрепления кинетохора и веретена, или опосредованное веретеном натяжение. Другая идея, которую стоит рассмотреть, заключается в том, что паттерн модификации перемежающихся нуклеосом H3 белками, модифицирующими гистоны (т.е. ацетилтрансферазами, метилтрансферазами и киназами), может помогать воспроизводить центромерную идентичность вместо ассоциированных с CENP-A белков (или в дополнение к ним) (Sullivan and Karpen, 2004). По-разному модифицированные перемежающиеся субдомены H3 (рис. 14.7) могли бы создавать «пермиссивную» структуру хроматина, необходимую для сборки новой CENP-A.

Идентификация факторов, требующихся для помещения CENP-A в центромеры, независимо от конкретной модели, является стратегией, которая, вероятно, обеспечит новое понимание. Биохимические и генетические исследования позволили идентифицировать некоторые из них как влияющие на сигналы CENP-A в центромерах, включая ранее известные факторы, участвующие в не зависящей от хроматина сборке хроматина. Однако ни один из идентифицированных до сих пор факторов не взаимодействует специфическим образом с CENP-A или другими белками центромерного хроматина или модификациями. Тем не менее, удивительно, что факторы все же идентифицируются, и должно скоро последовать выяснение специфических механизмов.

3.5. Эпигенетика и эволюция центромер

При том значении, которое центромеры имеют для клетки и жизнеспособности организма, не может быть и речи о приобретении или утрате центромерной функции. Тогда почему же центромеры используют эпигенетические механизмы регуляции, если существенным преимуществом для отдельной клетки и организма в целом было бы иметь центромеры «зашитыми» в первичную нуклеотидную последовательность ДНК?

Можно возразить, что эпигенетическая регуляция центромерной идентичности необходима для подгонки к изменениям, происходящим в ходе эволюции с хромосомами, нуклеотидными последовательностями и белками. Исследования на млекопитающих (например, приматах и сумчатых), насекомых и организмах других таксонов показали, что приобретение и утрата центромер являются характерными событиями в эволюции хромосом (Ferreri et al., 2005). Родственные виды часто различаются расположением и ассоциацией хромосомных плеч, даже в тех случаях, когда нуклеотидные последовательности ДНК почти идентичны. Эти приобретения и утраты центромер часто сопровождают транслокации и другие перестройки и, вероятно, поддерживаются ими. Например, потребность в одной, и только в одной, центромере делала бы многие из получающихся в результате дицентрических и ацентрических хромосомных перестроек бесполезными, если бы центромеры не могли инактивироваться, а неоцентромеры— активироваться (рис. 14.8а). Таким образом, способность перемещать центромеры из одной нуклеотидной последовательности ДНК в другую путем распространения, перескакивания или активации может ускорять эволюцию хромосом. Кроме того, в ходе эволюции в высокоповторяющихся сателлитных последовательностях очень часто происходят наращивания, сокращения и замены оснований и они могут быть связаны с изменениями в локализации центромер (рис. 14.86). Центромеры растений в особенности демонстрируют в ходе эволюции быстрые и значительные изменения в нуклеотидных последовательностях ДНК и в локализации (Hall et al., 2006). Неясно, однако, вызывают ли изменения ДНК перемещения центромер, или они происходят в ответ на перемещения центромер, или же и те и другие полностью независимы. Тем не менее, должен существовать механизм поддержания функции и воспроизведения центромер, не зависимый от изменений нуклеотидных последовательностей, и такой механизм обеспечивает эпигенетическая регуляция.

Сравнение аминокислотных последовательностей у центромерных белков разных видов привело к предположению, что домены, связанные с CEN-ДНК, «коэволюируют», чтобы приспособиться к изменениям в сателлитных последовательностях (Malik and Henikoff, 2002; см. также главу 13). Интересный компонент этой модели предполагает, что эти изменения стимулируются «мейотическим драйвом» — явлением аллельного отбора (а по умолчанию, отбора целой хромосомы), происходящего во время мейоза. Так, центромера, обладающая самым высоким сродством к белкам CEN-хроматина, достигает наибольшего успеха во включении в функциональные зародышевые клетки (т.е. в ооцит, а не в полярное тельце в случае женского мейоза) (см. другие примеры мейотического драйва в разделе 5). Это, в свою очередь, могло бы принуждать другие центромеры к тому, чтобы приспосабливаться к тем же вариантам нуклеотидных последовательностей и белков, чтобы эффективно расходиться.

Утрата такой эпигенетической метки, как CENP-A, дает другой механизм для инактивации центромеры без делеции центромерной ДНК, как показывают последствия обеднения CENP-A у многочисленных организмов (Cleveland et al., 2003). Идентификация механизмов приобретения центромеры является большим вызовом, поскольку она требует приобретения эпигенетической метки в отсутствие изменений в нуклеотидных последовательностях ДНК. Исследования экспериментально индуцированных центромер у мух позволяют предположить один такой молекулярный механизм для приобретения центромеры — за счет cis-распространения таких ключевых белков центромерного хроматина, как CENP-A (рис. 14.56) (Maggert and Karpen, 2001). Однако эта модель не может объяснить формирование неоцентромер у человека или большинство примеров приобретения центромеры в эволюции, которое может происходить на больших расстояниях от родительской центромеры. Возможно, механизм, более соответствующий этим случаям приобретения центромеры, включает неправильную локализацию CENP-A в ответ на преходящую сверхэкспрессию, приводя к формированию эктопических кинетохоров, как это наблюдали в опытах на мухах (Heun et al., 2006). Сверхэкспрессию CENP-A наблюдали в опухолях прямой кишки и груди, заставляя предполагать потенциальную связь с массивной нестабильностью генома, наблюдаемую при раке. Для прямой проверки этой гипотезы, а также ее роли в эволюции центромер необходимы дальнейшие исследования преобладания неправильной локализации CENP-A в различных типах рака у человека и сроков этой неправильной локализации в ходе инициации и прогрессии рака.

^{Рис. 14.8. Эволюция хромосом и эпигенетическая регуляция центромерной идентичности}

^{Пластичность центромер в отношении ассоциации со специфическими нуклеотидными последовательностями ДНК может быть нужна для приспособления к тем изменениям нуклеотидных последовательностей и хромосомным перестройкам, которые происходят в ходе эволюции, (а) Транслокации, часто наблюдаемые в ходе эволюции, могут создавать ацентрические и дицентрические хромосомы; и те, и другие в норме теряются при митотических или мейотических делениях Эпигенетическая регуляция и пластичность позволяют ацентрическим фрагментам приобрести неоцентромерную функцию, так же как инактивация одной центромеры в дицентрической хромосоме, что приводит к нормальному наследованию обоих продуктов транслокации (В.Р. = точки разрывов при транслокации). (б) У большинства эукариот центромеры погружены в гетерохроматин и повторяющиеся ДНК, особенно в высокоповторяющиеся сателлитные последовательности. В ходе эволюции эти последовательности изменяются с огромной частотой и претерпевают частые замены оснований, а также приращения и сокращения. Строгая зависимость центромерной идентичности от специфических нуклеотидных последовательностей ДНК приводила бы к утрате функций центромеры и кинетохора и к пагубной потере хромосомы. Напротив, эпигенетическая регуляция идентичности и локализации центромеры обеспечивает механизм поддержания центромер несмотря на изменения нуклеотидных последовательностей}

Наконец, первые центромеры могли бы быть представлены голоцентрическими хромосомами; формирование кинетохоров могло бы вначале развиваться со случайной специфичностью в отношении нуклеотидной последовательности, за чем могла следовать эволюция моноцентрических хромосом, возникающих благодаря инвазии транспозонов, экспансии сателлитной ДНК и формированию фланкирующего гетерохроматина.

Однако возможно также, что голоцентрические хромосомы развились из моноцентрических хромосом благодаря утрате гетерохроматиновых граничных элементов и as-распространению центромерного хроматина, примерно так же, как это происходит при возникновении неоцентромер у Drosophila (Maggert and Karpen, 2001).

Меотический процесс у большинства организмов охватывает (1) спаривание, которое выравнивает гомологи относительно друг друга; (2) синапсис, которое соединяет гомологи структурой, известной как синаптонемный комплекс (SC); (3) рекомбинацию, которая физически сцепляет гомологичные хромосомы и осуществляет обмен генетической информацией; (4) расхождение гомологов к противоположным полюсам в мейозе I и (5) разделение сестринских хроматид в мейозе II (рис. 14.9). Такие гетерохроматиновые элементы, как центромеры и теломеры, играют важную роль в контроле положения рекомбинационных событий в эухроматине; и наверняка гетерохроматиновые элементы (в особенности центромера) играют критическую роль в расхождении Более того, многочисленные недавние исследования убедительно свидетельствуют, что модификации гистонов и, возможно, другие эпигенетические компоненты и процессы играют критическую роль в облегчении мейотического процесса. Например, белок HIM-17 у С. elegans, который нужен для метилирования H3K9, необходим для формирования DSBs, инициирующих рекомбинацию (Reddy and Villeneuve, 2004). Аналогичным образом, для инициации DSBs у S. pombe требуется киназа гистонов (Ogino et al., 2006). Метилирование гистонов также необходимо, чтобы сделать мейотические хромосомы компетентными к завершению мейотических делений у Drosophila (Cullen et al., 2005; Ivanovska et al., 2005) и млекопитающих (De La Fuente, 2006).

^{Рис. 14.9. Механистическое представление мейотического процесса}

^{Пара гомологичных хромосом во время первого мейотического деления должна совершить три вещи. Во-первых, гомологи должны спариться по всей своей длине. Практически у всех организмов кульминацией этого спаривания является интимная ассоциация, при которой эти гомологи соединены вдоль всей своей длины синаптонемным комплексом. Это состояние называется синапсисом. Во-вторых, практически у всех организмов гомологичные хромосомы соединяются вместе рекомбинацией, называемой также кроссинговером. События обмена (кроссоверы) формируют структуры, называемые хиазмами, которые физически соединяют хромосомы друг с другом посредством сестринской хроматиды, представленной на каждом гомологе на обеих сторонах кроссоверного события. Как спаривание, так и рекомбинация происходят во время профазы (до разрушения ядерной оболочки). Третье важное событие, расхождение (сегрегация), происходит на MI-веретене, которое создается после разрушения ядерной оболочки. В ходе ранних стадий сборки веретена (прометафаза) хромосомы собираются вместе и образуют метафазную пластинку. У большинства животных самцы содержат центриолярные мейотические веретена, тогда как у самок большинства животных веретено ацентриолярно. В этом случае сами хромосомы образуют массу, на месте которой в конечном счете формируется метафазная пластинка, и организуют вокруг нее биполярное веретено. Коль скоро хромосомы должным образом совместно ориентированы (т.е. уравновешены в метафазной пластинке гомологичными кинетохорами, прикрепленными к противоположным полюсам веретена), ряд механизмов включают начало анафазы. В анафазе соединение (когезия) сестринских хроматид ослабляется вдоль плеч (но не возле центромер). Это растворяет связи, называемые хиазмами и созданные кроссоверами, и таким образом дает гомологам возможность разделиться и отойти к противоположным полюсам в анафазе I. Мейоз II в основе своей является гаплоидным митозом, который происходит и без репликации, и без рекомбинации}

Хотя использование рекомбинации для обеспечения расхождения мейотических хромосом является почти универсальным, существуют также мейотические системы, в которых ассоциации гомологов могут устанавливаться без рекомбинации (т.е. так называемые ахиазматические мейотические системы). В таких системах гетерохроматиновые спаривания и, возможно, другие субстраты для эпигенетических модификаций оказываются играющими критическую роль. Это в особенности верно в отношении самок и самцов Drosophila melanogaster, но может быть верным и по отношению к дрожжам. Наконец, известны многие системы мейотического драйва — например, благоприятствование одной из аллелей в ходе мейотической сегрегации, — в которых модификация специфических гетерохроматиновых элементов вызывает или делает возможной последующую утрату инактивации специфической хромосомы или целого хромосомного набора.

4.1. Обнаружение сайта гетерохроматинового спаривания у самцов Drosophila

Первым доказательством существования гетерохроматинового элемента, опосредующего спаривание и расхождение гомологов, была идентификация структур в перицентромерном гетерохроматине, опосредующих спаривание и расхождение ахиазматических пар половых хромосом в сперматогенезе у самцов Drosophila. Было показано, что эти структуры, известные как коллохоры, соответствую! повторам рДНК; было показано, что интеграция генов рДНК в лишенные коллохоров Х-хромосомы восстанавливает спаривание Х-Y в сайте вставки рДНК (McKee, 1998). Ключевым сегментом повтора рДНК в отношении спаривания является повторяющаяся последовательность длиной 240 п.о. в межгенном спейсере. Когда эта последовательность в 240 п.о. присутствует во многих копиях, она облегчает спаривание и последующее расхождение хромосом X и Y в мейозе у самцов Drosophila. Хотя степень, с которой гетерохроматиновые ассоциации в сперматоцитах Drosophila облегчают эухроматиновое спаривание, остается открытым вопросом, ниже мы обсудим ряд наблюдений, позволяющих предполагать, что неспособность опосредовать или поддерживать спаривание приводит, оказывается, к неправильной активации или инактивации гетерохроматина. Результатом такого события часто оказываются нарушения сперматогенеза (McKee, 1998).

4.2. Спаривание гетерохроматина облегчает расхождение у самок Drosophila

Имеются два главных механизма для обеспечения расхождения (сегрегации) гомологов у самок Drosophila: система хиазм, которая опосредует расхождение гомологов, которые подверглись кроссинговеру, и ахиазматическая система, которая обеспечивает расхождене тех пар гомологов. которые не претерпели кроссинговер. Например, мелкие точечные четвертые хромосомы никогда не претерпевают кроссинговер, и тем не менее они расходятся друг с другом во время мейоза с очень высокой степенью надежности. Цитологические и генетические эксперименты показали, что для ахиазматического спаривания и расхождения необходим гетерохроматин. Спаривание гомологичных гетерохроматиновых участков ахиазматических хромосом поддерживается начиная с ранней профазы и до того момента, когда ахиазматические гомологи начинают отделяться от своих партнеров в прометафазе I (рис. 10) (Dernburg et al., 1996). Более того, опыты с использованием делеций показали, что гомологичная ахиазматическая сегрегация у Drosophila полностью зависит от гетерохроматиновых гомологий (Hawley et al., 1993; Karpen et al., 1996). Все еще неясно, является ли способность опосредовать эти события спаривания и расхождения общим свойством гетерохроматиновых последовательностей или белков хроматина или же результатом ряда специфических участков, диспергированных в гетерохроматине.

4.3. Роль центромеры в облегчении ахиазматической сегрегации у почкующихся дрожжей

Хотя фланкирующие гетерохроматиновые районы, по-видимому, достаточны для того, чтобы опосредовать ахиазматическую сегрегацию у самок Drosophila, кажется вероятным, что у почкующихся дрожжей одни только центромерные последовательности могут быть способны играть эту роль. Дин Даусон (Dean Dawson) и его сотрудники проанализировали мейоз у дрожжей, несущих пару гомеологичных (т.е. частично гомологичных) хромосом, происходящих от разных видов дрожжей (Kemp et al., 2004). Несмотря на тот факт, что эти хромосомы несут сходные наборы генов, они дивергировали в достаточной степени, чтобы между ними не происходил кроссинговер; тем не менее, они надежно расходились. Хотя плечи этих гомеологичных хромосом соединяются друг с другом во время профазы мейоза не чаще, чем плечи гетерологичных хромосом, эти гомеологичные хромосомы, тем не менее, обнаруживают высокую степень центромерного спаривания (Kemp et al., 2004). Более того, это спаривание уменьшается в присутствии третьей безобменной хромосомы, даже если она несет другой центромерный участок; это заставляет предполагать, что центромерное спаривание действительно является независимым от последовательности.

^{Рис. 14.10. У самок Drosophila melanogaster имеются два механизма обеспечения расхождения гомологов}

^{Верхний ряд изображений повторяет канонический процесс, как он показан на рис. 14.9. Нижний ряд описывает мейотический процесс у самок Drosophila, у которых необычная диплотена. При каноническом мейозе диплотена (иногда называемая «диплотена— диакинез») определяется как последняя стадия в профазе, на которой гомологи отталкиваются друг от друга и удерживаются вместе лишь хиазмами. Однако у самок Drosophila в конце профазы отталкиваются (или разделяются) лишь эухроматиновые плечи хромосом; гетерохроматиновые районы остаются тесно спаренными даже позже конца профазы (разрушения ядерной оболочки) и вплоть до прометафазы (Dernburg et al., 1996). Как обсуждается в тексте, это спаривание гетерохроматина и необходимо, и достаточно для обеспечения надежной сегрегации в отсутствие кроссинговера (Hawley et al., 1993; Karpen et al., 1996)}

Если для центромерного спаривания не требуется гомология последовательностей, почему тогда расхождение гомеологичных хромосом у дрожжей является неслучайным? Кемп и сотрудники (Kemp et al., 2004) предполагают, что «Именно обмен и следующий за обменом синапсис помещают гомологичные центромеры рядом и блокируют случайное спаривание центромер». Согласно этой модели, центромеры могли бы первоначально спариваться полностью независимым от последовательности образом. По мере того как плечи гомологичных хромосом претерпевают обмены, их центромеры «выдергиваются» из потенциально негомологичных ассоциаций и принуждаются к гомологичным спариваниям. Центромеры, оставляемые таким зависимым от обменов ресортингом как «синглеты», могут затем свободно реассоциироваться с другими неспаренными центромерами, приводя в конечном счете к сприванию центромер тех хромосом, которые по тем или иным причинам не обменивались. В то время как Кемп и сотрудники приводят в качестве аналогии прогрессивное формирование пар из более привлекательных танцоров на школьной танцевальной вечеринке, что, по умолчанию, заставляет менее привлекательных становиться партнерами по танцам, более формальный взгляд на этот процесс был описан Род ой Грелль (Rhoda Grell) десятилетия тому назад. Она предположила, что коль скоро обменные спаривания произошли, имеющиеся в наличии хромосомы были бы свободны для реассоциации (Grell, 1976). Действительно, недавние исследования показали, что во время мейоза все дрожжевые центромеры негомологично ассоциированы и подвергаются процессу ресортинга, соединяющего в пары гомологичные центромеры после рекомбинации (Tsubouchi and Roeder, 2005).

В совокупности эти исследования свидетельствуют о том, что независимое от последовательности узнавание центромерных районов играет важную роль в создании хромосомных ассоциаций в раннем мейозе. В то время как эти связи могут часто соединять негомологичные хромосомы, негомологичные ассоциации могут корректироваться физическими связями между гомологичными хромосомами, создаваемыми при обменах. Механизм, посредством которого такие обмены, происходящие на больших расстояниях от самих центромер, могут облегчать такую центромерную пересортировку, остается неясным. Однако соблазнительно по крайней мере высказать предположение, что «соединение» хиазм (физического выражения события обмена) с центромерами могло бы быть одной из функций синаптонемного комплекса (SC). В соответствии с такой моделью, SC служил бы для сообщения двум гомологичным центромерам о том, что хиазма действительно сформирована, индуцируя таким образом ее совместную ориентацию задолго до разрушения ядерной оболочки.

4.4. Ассоциированный с гетерохроматином локус Ph1 у кукурузы и его роль в опосредовании гомологичного versus негомологичного спаривания

У пшеницы правильное спаривание гомологичных хромосом и предотвращение гомеологичных спариваний опосредуются локусом Phi (Griffiths et al., 2006). В отсутствие гена Phi спаривание и обмен между гомеологичными хромосомами становятся частыми (Luo et al., 1996) и уменьшается надежность как мейотического, так и митотического спаривания. Значение неправильного спаривания центромер в терминах более беспорядочного спаривания и обменов между плечами гомеологичных хромосом остается спорным (Dvorak and Lukaszewski, 2000). Однако ясно, что эффекты делетирования Phi могут быть супрессированы добавлением к геному гетерохроматиновых сверхчисленных В-хромосом (Bennett et al., 1974). Недавно локус Phi был локализован в интервале величиной 2,5 млн. п.о., в котором содержится субтеломерный гетерохроматин, вставленный в кластер генов, родственных cdc2, что произошло после полиплоидизации, характерной для эволюции современных пшениц (Griffiths et al., 2006). Хотя в совокупности эти исследования локуса Phi позволяют предположить эпигенетическое регулирование выбора партнера в мейозе пшеницы, роль (или роли) гетерохроматина в опосредовании предотвращения гомеологичного спаривания и, таким образом, в стимулировании гомологичных спариваний остается несколько неясной.

Существуют многочисленные случаи, когда гетерохроматиновые районы играют роль в опосредовании процесса, называемого мейотическим драйвом. Термин «мейотический драйв» обозначает способность одного гомолога увеличивать вероятность его передачи за счет своего партнера, так что в гетерозиготе А/а гаметы, несущие А, производятся или используются чаще, чем гаметы, несущие а. Мы сосредоточимся прежде всего на тех случаях, где гетерохроматиновые элементы вызывают утрату или деструкцию их гомологов. Хотя мы детально описываем лишь систему CD у D. melanogaster и утерю хромосом у Sciara и Nasonia, существуют и другие системы связанного с гетерохроматином мейотического драйва, такие как гетерохроматинизация и последующая утеря хромосомы, ограниченной зародышевой линией, у зяблика, и накоплением В-хромосом у кукурузы.

5.1. Нарушитель сегрегации (Segregation Distorter) у самцов Drosophila

Одним из наиболее впечатляющих примеров роли гетерохроматина в опосредовании мейотического драйва является гаплотип у D. melanogaster; изолированный из природной популяции и названный Segregation Distorter [нарушитель сегрегации], или просто SD (Sandler and Hiraizumi, 1959). Вторая хромосома плодовой мушки, несущая гаплотип SD, обладает способностью элиминировать свой гомолог дикого типа (обозначаемый SD⁺) в процессе созревания спермы и делает это, предотвращая правильную конденсацию этого гомолога. Только сперма, несущая - SD, завершает созревание, становится зрелыми сперматидами и, следовательно, передается потомству.

Хромосома с SD несет несколько дискретных генетических элементов, существенных для ее функции. Первым из них является сам эухроматиновый мутант 5Z), вызывающий дисфункцию сперматид, действуя на отдельный гетерохроматиновый элемент-мишень, расположенный на гомологе и называемый Rsp (Ganetzky, 1977). Сам Rsp включает повторяющийся элемент, локализованный в перицентромерном гетерохроматине второй хромосомы (Wu et al., 1988). Чувствительность гомологичной хромосомы SD⁺ к нарушению конденсации зависит от числа копий повтора Rsp. Имеется также ряд других элементов, обычно локализованных в хромосомах, несущих SD и укрепляющих способность SD вызывать нарушение расхождения.

Сама мутация SD является результатом небольшой тандемной дупликации, включающей ген RanGAP. Эта перестройка производит мутантный белок RanGAP, усеченный на 234 аминокислоты на карбоксильном конце и вызывающий дефект в ядерном транспорте (Kusano et al., 2003). Почему такой дефект может приводить к тому, что не происходит конденсация хроматина хромосом, несущих локус Rsp, остается неясным (но см. обсуждение возможных механизмов: Kusano et al., 2003).

5.2. Утеря отцовской хромосомы у Sciara и картирование реагирующего элемента

Мухи-сциариды претерпевают сложные процессы элиминации отцовской хромосомы и в соме, и в зародышевом пути. Все эмбрионы возникают из зигот генотипа А_тА_рХ_тХ_рХ_р, что означает, что они получили один набор аутосом и одну Х-хромосому от своих матерей и один набор аутосом и две копии Х-хромосом от своих отцов. Соматические клетки тех эмбрионов, которые должны стать самками, утрачивают одну из двух полученных от отца Х-хромосом, а соматические клетки эмбрионов, которые должны развиваться как самцы, утрачивают две полученные от отца Х-хромосомы. Критический прорыв в действительный механизм элиминации Х-хромосомы, включающий неполное разделение сестринских хроматид, был сделан Сен Фаллем и Салливаном (Saint Phalle and Sullivan, 1996).

Утрата отцовской Х-хромосомы происходит и в клетках, составляющих зародышевый путь. На более поздних стадиях развития зародышевой линии единственная хромосома Х_р отбрасывается у обоих полов. Вслед за утратой этой отцовской Х-хромосомы весь отцовский хромосомный набор оказывается деконденсированным, как показывает его более светлая окраска. Это различие в конденсации поддерживается у обоих полов до позднего первого личиночного возраста, иначе говоря до начала гениальных митотических делений.

На этом этапе и материнские, и отцовские хромосомы выглядят полностью конденсированными. Хотя наступающий мейоз у самок цитологически нормален, мейоз у самцов необычен в двух отношениях. Во-первых, элиминируется весь отцовский хромосомный набор и, во-вторых, полученная от матери Х-хромосома претерпевает направленное нерасхождение в мейозе И, и формируется спермий с одним набором аутосом и двумя Х-хромосомами.

Интересно, что с этими паттернами элиминации хромосом коррелирует ацетилирование гистонов H3 и Н4 (Goday and Ruiz, 2002). Сначала, в ходе раннего развития зародышевой линии, лишь половина хромосом, а именно отцовский набор, высокоацетилированы по H3 и Н4. Как отмечают Годей и Руиц (Goday and Ruiz, 2002), «продемонстрированная здесь дифференциальная метка хромосом зародышевого пути ацетилированием гистонов согласуется с ранними данными о существовании различий в окрашивании хроматина между обоими родительскими геномами в зародышевых клетках». Исключением из этого правила является отцовская Х-хромосома, которая будет элиминирована в ходе развития зародышевой линии: она не сильно ацетилирована. На более поздних стадиях, перед началом гениальных митотических делений, все хромосомы, и материнские, и отцовские, ацетилированы в высокой степени. Интереснее всего, что в мейозе у самцов, в ходе которого утрачивается весь отцовский набор, этот отцовский набор весь недоацетилирован по H3 и Н4 по сравнению с высокоацетилированным набором хромосом, происходящим от матери. Хотя отношение этих изменений в модификации гистонов к последующим элиминационным событиям в механистических терминах остается неясным, кажется вероятным, что такие различия маркируют хромосомы и для мейотической, и для митотической элиминации.

5.3. Утеря отцовских хромосом у Nasonia

У паразитической осы Nasonia vitripennis из неоплодотворенных (гаплоидных) яиц развиваются самцы, тогда как из оплодотворенных (диплоидных) яиц обычно развиваются самки (обзор см.: Beukeboom and Werren, 1993). Однако имеется сверхчисленная, или В-хромосома, известная как хромосома PSR, которая заставляет оплодотворенные яйца развиваться в самцов. Хромосома PSR выполняет эту работу по реверсии пола, вызывая сверхконденсацию и утерю всех отцовских хромосом (кроме себя самой?) в оплодотворенных яйцах (Werren et al., 1987). Хромосома PSR в основном представлена гетерохроматином и содержит тандемно повторяющиеся последовательности, не представленные в аутосомах. Попытки картировать эту хромосому с помощью делеций позволили получить нефункциональные хромосомы PSR, которые могут передаваться дочерним особям (Beukeboom and Werren, 1993). Однако в этих исследованиях не удалось идентифицировать в этой хромосоме специфический домен или класс повторов, который отвечал бы за ее способность включать деструкцию отцовского генома. Следует, однако, отметить обнаружение одного такого делеционного деривата, который ревертировал из нефункционального состояния в функциональное в пределах одной линии. Авторы (Beukeboom and Werren, 1993) предположили, что некоторый набор повторов на хромосоме PSR может функционировать как «сток» для продукта, в норме необходимого для правильного процессинга отцовских хромосом после оплодотворения. Действительное существование импринтированных «различий состояний» между отцовскими и материнскими наборами, на которые могла бы действовать хромосома PSR, позволяют предполагать исследования роли геномного импринтинга в детерминации пола у Nasonia (Dobson and Tanouye, 1998).

5.4. Вздутие 10 у кукурузы — роль последовательностей, соответствующих гетерохроматиновым «вздутиям», в облегчении расхождения хромосом в мейозе I

Еще один пример гетерохроматиновых элементов, ассоциированных с мейотическим драйвом, наблюдается у растений, содержащих хромосомы с гетерохроматиновыми вставками, известными как «вздутия» (knobs), или «псевдокинетохоры»; они благоприятствуют передаче хромосомы, несущей такое вздутие, в женском мейозе. Молекулярная организация вздутий охватывает два набора тандемных повторов, каждый из которых, по-видимому, представлен в виде длинной непрерывной последовательности (Dawe and Hiatt, 2004). Функционирование гетерохроматиновых вздутий как псевдокинетохоров зависит от варианта хромосомы 10, известного как аномальная хромосома 10 (Ab10). Когда Ab10 присутствует, вздутия формируют псевдокинетохоры, которые движутся к полюсам веретена мейоза I впереди эндогенных центромер, и скорость этого движения пропорциональна величине вздутия. Однако вздутия проявляют псевдокинетохорную активность только тогда, когда они находятся в cis-конфигурации с эндогенной центромерой; они также обнаруживают только латеральные ассоциации с микротрубочками в отличие от ассоциаций «в торец», демонстрируемых полностью функциональными эндогенными кинетохорами Таким образом, несмотря на терминологическую путаницу, вздутия не являются «неоцентромерами» (см. раздел 3.3), поскольку они не способны стимулировать нормальное расхождение сами по себе, не рекрутируют белки и не обнаруживают функций, связанных с эндогенными центромерами и кинетохорами.

В терминах мейотического драйва обмены в мейоцитах, гетерозиготные по данному вздутию, приводят к формированию кроссоверного продукта, несущего это вздутие только на одной из двух его хроматид (Rhoades and Dempsey, 1966). Псевдокинетохорное поведение этого вздутия направляет несущую вздутие хроматиду в один из четырех продуктов мейоза, известный как базальная мегаспора, который является одним из двух «внешних» ядер (из четырех мейотических продуктов) и который только один и имеется для оплодотворения (Rhoades and

Dempsey, 1966; Yu et al., 1997). Таким образом, причина мейотического драйва в этой системе — опосредованное гетерохроматином направленное расхождение в функциональную гамету одной хроматиды за счет ее сестры. Каким образом эпигенетические механизмы регулируют поведение вздутий и псевдокинетохорную активность, в настоящее время неизвестно.

Имеются многочисленные примеры случаев, в которых отсутствие мейотического спаривания приводит к эпигенетическому сайленсингу неспаренной ДНК. В случае Neurospora этот сайленсинг обычно ограничен неспаренными участками.

6.1. Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК в мейозе у Neurospora

Необычный пример сайленсинга генов в ходе мейоза, который называют мейотическим сайленсингом, вызываемым неспаренной ДНК (MSUD, meiotic silencing by unpaired DNA), был описан у Neurospora crassa (обзор см. Hynes and Todd, 2003). Этот процесс позволяет неспаренной копии данного гена сайленсировать и себя, и любые другие спаренные копии этого гена (рис. 14.11). Этот процесс был выявлен с помощью характеристики гетерозиготных делеций в гене ascospore maturation 1 (asm-1). Однако, чтобы инициировать сайленсинг, неспаренная последовательность должна быть достаточного размера и обладать гомологией с продуктом (иРНК) этого гена (Lee et al., 2004). Такие последовательности, однако, не должны содержать соответствующий промоторный элемент для рассматриваемого гена. Сайленсинг ограничен геном, определяемым неспаренной последовательностью, и не распространяется на соседние, спаренные гены (Kutil et al., 2003). Мутации в гене sad-1, который кодирует белок, обладающий существенной гомологией с РНК-зависимыми РНК-полимеразами (RdRP), участвующими в путях RNA1, блокируют процесс MSUD (Shiu and Metzenberg, 2002), что позволяет предположить, что «для MSUD необходимы синтез двунитевой РНК и, вероятно, амплификация РНК» (Hynes and Todd, 2003). Хотя примеры MSUD наблюдались для генов, которые в норме экспрессируются в мейозе, MSUD не был выявлен для генов, экспрессирующихся только в вегетативных клетках, что является дополнительным доводом в пользу участия RNAi (Hynes and Todd, 2003). Дальнейшая поддержка этой идеи вытекает из наблюдений, согласно которым для MSUD необходим белок, подобный Argonaute и Dicer (Leeetal., 2003).

^{Рис. 14.11. Модели, показывающие, каким образом транскрипция неспаренной ДНК приводит к различным уровням сайленсинга в мейозе}

^{В модели а предполагается, что одиночные транскрипционные комплексы в более крупных петлях обладают большей транскрипционной активностью, чем в более мелких, что обозначается числом красных концентрических кругов. Модель б предполагает, что более крупные петли могут содержать большее количество транскрипционных комплексов (красные шарики), чем более мелкие петли, (в) В обеих моделях не­ спаренная ДНК в больших петлях продуцировала бы более высокие концентрации siRNAs (показано величиной стрелок) и, таким образом, больший объем сайленсинга (адаптировано, с любезного разрешения, из Lee et al., 2004 [©Genetics Society of America])}

Предположили, что MSUD является кульминацией процесса, состоящего из двух частей: trans-узнавание [trans-sensing] и MSUD (Pratt et al., 2004). Процесс «trans-узнавания», который оказывается зависимым от метилирования ДНК. позволяет данной нуклеотидной последовательности ДНК «чувствовать» идентичность или гомологию спаренных районов в контексте мейотической профазы. Коль скоро неспаренные районы оказываются идентифицированными таким образом, вступает в действие процесс MSUD, чтобы подавить экспрессию этих последовательностей.

PHК-зависимый механизм мейотического сайленсинга неспаренной ДНК был также хорошо документирован у С. elegans. ДНК, у которой в мейозе нет спаривающегося партнера, становится мишенью метилирования гистонов по H3K9 (Bean et al., 2004). Для этого механизма сайленсинга требуется РНК-зависимая РНК-полимераза (EGO-1); однако ему не нужен Dicer (Maine et al., 2005).

6.2. Сайленсинг асинапсных хромосом у мыши

Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК был продемонстрирован и у обоих полов мыши (Baarends et al., 2005; Turner et al., 2005). А именно, неспаренные хромосомные районы в мейозе самцов или неспаренные Х-хромосомы в мейозе самок являются транскрипционно «молчащими» и маркированы убиквитинированием гистона Н2А — оба эти свойства характерны для тельца XY, в норме присутствующего в мужских мейотических клетках (Baarends et al., 2005). Сообщалось также, что неспаренная ДНК, возникающая в результате гетерозиготности по транслокациям у мышей, была сайленсирована рекрутированием киназы «контрольной точки» ATR со стороны BRCA1 примерно так же, как это наблюдается для сайленсинга X- и Y-хромосом в ходе нормального мужского мейоза (Turner et al., 2005).

6.3. Дисфункция половой хромосомы у Drosophila

Эухроматиновые примеры MSUD не известны ни у того, ни у другого пола D. melanogaster. Более того, масштабное исследование эухроматиновых делеций и, что более важно, дупликаций делает крайне маловероятным, что такие гены существуют. С другой стороны, хорошо документировано, что делеции перицентромерного Х-гетерохроматина взаимодействуют с транслокациями «Y — аутосома», вызывая полную мужскую стерильность (обзор см. McKee, 1998). Эту стерильность нельзя подавить, добавив назад либо полную Y-хромосому, либо полную дупликацию Х-гетерохроматина. МакКи (McKee, 1998) предположил, что стерильность транслокаций типа «Y — аутосома» обусловлена присутствием мейотической «контрольной точки», которая детектирует неспаренные или слабоспаренные половые хромосомы. Основываясь на описанных выше примерах MSUD у разных эукариот, мы предполагаем альтернативное объяснение, заключающееся в том, что присутствие неспаренных последовательностей в X- и Y-хромосоме включает сайленсинг существенных элементов, функция которых необходима для нормальной фертильности.