Эпигенетика

Все многоклеточные организмы начинаются с одной клетки, зиготы, которая в ходе развития дает начало множеству различных клеточных типов со специализированными функциями. Это ставит перед нами проблему: каким образом, будучи однажды детерминированы, клеточные типы могут поддерживаться на протяжении многих клеточных делений, происходящих в различных фазах роста?

1.1. Концепция клеточной памяти

Взрослое животное обладает 200—300 структурно различными клеточными типами, тогда как растение — где-то между 30 и 40. Если принять во внимание сложные паттерны экспрессии генов, можно различить еще большее число разных клеточных популяций. Идентичность и функция данного клеточного типа определяются характерным для него профилем экспрессии генов, где соответствующие группы генов являются либо активными, либо «молчащими». В ходе развития и в состоянии гомеостаза взрослого организма критически важно помнить и надежно воспроизводить это состояние после каждого клеточного деления. Это особенно важно во время репликации генетического материала (фаза S) и расхождения хромосом в митозе (фаза М), которые являются событиями, повторяющимися в каждом клеточном цикле и прерывающими процессы экспрессии генов. Итак, каким же образом дифференциальные паттерны генной экспрессии могут поддерживаться от одного клеточного поколения до следующего?

Мы знаем из экспериментов, проделанных в 1960— 1970-е годы, что ткани растений и животных «помнят» свое детерминированное состояние даже после продолжительных пассажей в культуре (Hadom, 1968; Hackett et al., 1987). Хадорн и сотрудники показали что клетки имагинальных дисков, обнаруживаемых в личинках Drosophila, обладают присущей им клеточной памятью, что позволяет им помнить состояния детерминации, фиксированные в эмбриогенезе. Имагинальные диски — это кластеры эпителиальных клеток, обособливающиеся в развивающемся эмбрионе в качестве предшественников специфичных внешних структур и придатков во время метаморфоза. Например, из двух пар имагинальных дисков во втором торакальном сегменте одна образует среднюю пару ног, а другая — крылья (рис. 12.2). Имагинальные диски можно культивировать путем трансплантации в гемоцель взрослых самок, где они продолжают пролиферировать, но не дифференцируются. Когда такой диск пересаживают обратно в личинку перед началом метаморфоза, он в конечном счете дифференцируется в ожидаемые структуры взрослого организма даже после нескольких трансплантационных пассажей. Позже было показано, что для поддержания этого детерминированного состояния клеток имагинальных дисков необходимы белки PcG и trxG (рис. 11.1). Однако в описанных выше экспериментах с культивированием наблюдали, что в редких случаях имагинальный диск может изменить свою судьбу в результате процесса, названного трансдетерминацией. Этот процесс включает даун-регуляцию репрессии PcG сигнальным каскадом INK в трансдетерминированных клетках (рис. 11.2а, б) (Lee et al., 2005). Мутанты по PcG также имеют повышенную частоту трансдетерминации, что, опять-таки, говорит в пользу роли белков PcG в поддержании судьбы имагинальных дисков (Klebes et al., 2005). Таким образом, белки PcG, по-видимому, играют ключевую роль в репрограммировании клеточных судеб как в ходе нормального развития, так и в процессах регенерации (дополнительные детали см. в разделе 4 3 далее в этой главе).

1.2. Генетическая идентификация группы Polycomb

У всех многоклеточных передне-задняя ось специфицируется посредством определенных паттернов экспрессии генов НОХ (рис. 12.2). У Drosophila во время эмбриогенеза активность произведенных матерью (т.е. унаследованных через ооцит) и произведенных в зиготе транскрипционных факторов генерирует специфическую комбинацию экспрессии НОХ, необходимую для каждого сегмента. Этот сегмент-специфичный профиль активности генов НОХ поддерживается на протяжении всего развития мухи, спустя долгое время после того как исчезли регуляторы ранней транскрипции. Когда функция генов НОХ была охарактеризована генетически, были изолированы многие trans-действующие регуляторы. Среди них Пам и Эд Льюс (Lewis, 1978) идентифицировали и генетически проанализировали Polycomb (Рс). Гетерозиготные мутантные по Рс самцы имели дополнительные половые гребешки на второй и третьей паре ног, тогда как самцы дикого типа несли половые гребешки только на первой паре ног (см. рисунок на титульной странице этой главы). Гомозиготные мутанты были летальны на стадии эмбриона, демонстрируя трансформацию всех кутикулярных сегментов в направлении самого заднего абдоминального сегмента (рис. 11.2в, г). Эти классические фенотипы PcG были интерпретированы как обусловленные эктопической экспрессией генов НОХ. Таким образом, Рс и другие гены со сходными фенотипами были определены как репрессоры активности генов НОХ. Впоследствии детальный анализ позволил обнаружить, что белки PcG требуются лишь для поддержания репрессии НОХ, а не для установления активности НОХ в ходе формирования паттерна, специфичного по отношению к положению Эта последняя задача выполняется транскрипционными факторами, закодированными в рано действующих генах сегментации. На основе их репрессирующего или активирующего влияния на экспрессию генов НОХ эти вновь идентифицированные trans-действующие регуляторы были разделены на два антагонистических класса, PcG HtrxG, соответственно (рис. 11.1) (Kennison, 1995).

^{Рис. 11.1. Концепция клеточной памяти}

^{Схема, иллюстрирующая участие комплексов PcG и trxG в детерминации активного и репрессированного состояний экспрессии генов и, тем самым, клеточной дифференцировки, которая поддерживается на протяжении многих клеточных делений: (ТА) транскрипционный активатор; (TR) транскрипционный репрессор}

^{Рис. 11.2. Гомеотические трансформации у PcG-мутантов разных видов}

^{(а-г) Drosophila melanogaster, (д, е) Mus musculus, (ж, з) Arabidopsis thaliana. (а, б) Ножные имагинальные диски, претерпевающие трансдетерминацию, на что указывает экспрессия крыло-специфического гена vestigial (маркированного GFP). (в. г) Кутикулы эмбриона дикого типа (в) и мутанта Su(z)12 (г). У мутантного эмбриона Su(z)12 все абдоминальные, торакальные и несколько головных сегментов (не все из них видны в этой фокальной плоскости) гомеотически трансформированы в копии восьмого абдоминального сегмента благодаря нарушенной экспрессии гена Abd-B в каждом сегменте, (д, е) Осевой скелет новорожденных мышей дикого типа (д) и RinglA-/- (е) Вид торакальных районов очищенных скелетов, показывающий кости (красный цвет) и хрящ (синий цвет). Мутант обнаруживает переднюю трансформацию восьмых торакальных позвонков, на что указывает наличие восьми (1—8) вертебростернальных ребер вместо семи (1—7), как у дикого типа, (ж, з) Цветок дикого типа (ж) и мутанта clf-2 (з). Цветок дикого типа демонстрирует нормальное расположение чашелистиков, лепестков, тычинок и плодолистиков. У цветка clf-2 лепестки отсутствуют или число их уменьшено. (а.б, с любезно предоставлено N. Lee and R. Раго; в, г, перепечатка, с любезного разрешения, из Birve et al., 2001 [©Company of Biologists Ltd.]; д, e, перепечатка, с любезного разрешения, из del Маг Lorente et al., 2000 [©Company of Biologists Ltd.]; з, любезно предоставлено J. Goodrich)}

Молекулярное выделение генов PcG Drosophila сделало возможным изучение функции ортологов позвоночных у мышей, где они также оказались ключевыми регуляторами экспрессии генов НОХ (van der Lugt et al., 1994; Core et al., 1997). У млекопитающих мутации в генах PcG приводят к гомеотическим трансформациям позвонков (Рис. 11.2д, е). Кроме того, гены PcG играют ключевую роль в контроле клеточной пролиферации, поддержания стволовых клеток и рака (см. разделы 4.2 и 4.3 далее в этой главе). Замечательный консерватизм генов PcG у мух и млекопитающих облегчил биохимический анализ и привел к идентификации некоторых новых членов комплексов PcG, например белка RING 1 (Satijn and Otte, 1999). Направленная [targeted] мутация RING1 у мыши, например, привела к классической гомеотической трансформации фенотипа. Лишь впоследствии было обнаружено, что она соответствует гену Sex combs extra из группы PcG у Drosophila.

У двух других модельных организмов, а именно у червя Caenorhabditis elegans и цветкового растения Arabidopsis thaliana, молекулярная характеристика мутантов, изолированных в ходе разных генетических скринингов, выявила существование других ортологов белков PcG. У С. elegans члены группы PcG были идентифицированы в ходе скрининга на мутантов maternal effect sterile (mes), и было показано, что они участвуют в сайленсинге Х-хромосомы в зародышевой линии гермафродитов (Fong et al., 2002; глава 15).

У Arabidopsis гены PcG были идентифицированы в результате нескольких генетических скринингов при исследовании различных процессов развития (Hsieh et al/, 2003). Первый ген PcG у растений, CURLY LEAF (CLF), был идентифицирован как мутант с гомеотическими трансформациями органов цветка (рис. 11.2ж, з) (Goodrich et al., 1997). Мутации в генах класса FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED (FIS) были обнаружены в ходе скрининга на мутанты, обнаруживающие материнский эффект—недоразвитие семян (Grossniklaus et al., 1998) или допускающие некоторое развитие семян в отсутствие оплодотворения (Luo et al., 1999; Ohad et al., 1999). Наконец, гены PcG были идентифицированы в результате скрининга на мутанты по срокам цветения, например мутанты, зацветающие сразу после прорастания (Yoshida et al., 2001) или с нарушенной реакцией на яровизацию — процесс, делающий растения компетентными к цветению после продолжительного воздействия холодом (Gendall et al., 2001).

Разнообразие процессов, регулируемых белками PcG, иллюстрирует значение поддержания репрессированного состояния ключевых регуляторов развития у различных организмов. С одной стороны, имеет место удивительный консерватизм некоторых биологических функций от растений до млекопитающих, например, регуляции таких ключевых регуляторов развития, как гомеотические гены, или участия в жесткой регуляции клеточной пролиферации. С другой стороны, комплексы PcG оказываются гибкими и динамичными молекулярными модулями, которые используются для контроля большой группы клеточных процессов и процессов развития.

Белки PcG распадаются на два биохимически охарактеризованных класса, образующих репрессивные комплексы Polycomb 1 и 2 (PRC1 и PRC2). Эти два комплекса необходимы для последовательных шагов в репрессии генной экспрессии. Сначала PRC2 обладает модифицирующей гистоны активностью и метилирует H3K27 и (или) H3K9 в генах, являющихся «мишенями» для сайленсинга. Компоненты PRC1 могут затем узнавать такие модификации, связываться с ними и индуцировать соответствующие структурные изменения в хроматине. В то время как белки PRC2 имеются у всех многоклеточных модельных видов, компоненты PRC1 не были идентифицированы у С. elegans и Arabidopsis.

2.1. Компоненты PRC2 и его эволюционный консерватизм

Несколько вариантов PRC2 были выделены из эмбрионов Drosophila, но все эти комплексы содержали четыре коровых белка (Levine et al., 2004): SET-гистонметилтрансфераза Enhancer of Zeste (E(Z)), WD-40-белок ESC, связывающийся с гистонами белок р55 и SupressorofZestel2 (Su(Z)12) (табл. 11.1 ирис. 11.3). Исходя из такого состава, PRC2 первоначально называли комплексом E(Z)-ESC. В этом разделе освещаются молекулярные и биохимические детали того, что известно о разных компонентах PRC2, идентифицированных до сегодняшнего дня у различных модельных организмов.

^{Рис. 11.3. Консервативные коровые комплексы PRC2}

^{Показаны коровые члены PRC2 у D. melanogaster, М. musculus, A. thaliana и С. elegans. Предполагается, что у A. thaliana анцестральный комплекс диверсифицировался на три варианта с дискретными функциями в развитии. У С. elegans коровый комплекс PCR2 содержит только три белка: MES-3 не обладает гомологией ни с каким другим идентифицированным белком PRC2. Различные цвета указывают гомологию, контакты указывают на взаимодействия (из Reyes and Grossniklaus, 2003 и Chanvivattana et al., 2004, с изменениями)}

Ген E(z) кодирует белок из 760 аминокислот, содержащий домен SET, который придает ему активность метилтрансферазы лизинов гистонов (НКТМ). Этому домену SET предшествует домен СХС, или Pre-SET (Tschiersch et al., 1994), содержащий девять консервативных цистеинов, которые связывают три иона цинка и, как полагают, стабилизируют домен SET. В пользу такой структурной роли говорит тот факт, что несколько температурочувствительных аллелей E(z) затрагивают один из этих консервативных цистеинов (Carrington and Jones, 1996). Кроме того, E(z) содержит домены SANT, вовлеченные в связывание с гистонами, и домен С5, необходимый для физического взаимодействия с SU(Z)12.

ESC — это короткий белок из 425 аминокислот, содержащий пять повторов WD40, образующих структуру типа «(3-пропеллер». Это создает платформу для белок-белковых взаимодействий, отводя ESC тем самым центральную роль в PRC2: физически взаимодействовать как с E(z), так и с р55 во всех проанализированных модельных системах.

Белок SU(Z)12 состоит из 900 аминокислот и характеризуется структурой «цинковый палец» С₂Н₂-типа и карбокситерминальным доменом VEFS. Домен VEFS был идентифицирован как консервативный участок между SU(Z)12 и его тремя гомологами у растений: VRN2, EMF2, FIS2 (см. рис. 11.3). Несколько мутантных аллелей Su(z)12 изменяют этот домен, показывая тем самым, что он необходим для взаимодействия с доменом С5 белка E(Z) (Chanvivattana et al., 2004; Yamamoto et al., 2004).

Генетически белок p55 не был идентифицирован как член PcG — возможно потому, что он участвует во множестве других белковых комплексов, ассоциированных с хроматином (Hennig et al., 2005). Однако биохимически белок р55 был идентифицирован как часть PRC2. Он состоит из 430 аминокислот и содержит шесть повторов WD40, которые физически взаимодействуют с ESC или его ортологами у млекопитающих и растений (Tie et al., 2001; КцЫег et al., 2003a).

Кроме коровых белков PRC2 некоторые варианты этого комплекса содержат деацетилазу гистонов (HDAC) RPD3, или Polycomb-подобный белок (PCL). Взаимодействие с RPD3 заслуживает особого внимания, поскольку деацетилирование гистонов коррелирует с репрессированным состоянием экспрессии генов (глава 10). Различный состав PRC2 отражает, вероятно, динамические изменения в ходе развития или же ткане-специфичные варианты.

PRC2 высоко консервативен у беспозвоночных, позвоночных и растений (рис. 11.3). У С. elegans присутствуют только гомологи E(Z) и ESC: MES-2 и MES-6. Вместе с еще одним неконсервативным белком. MES-3, они формируют маленький комплекс с мол. массой около 230 кДа, необходимый для сайленсинга в гермафродитной зародышевой линии (глава 15). У растений и млекопитающих присутствуют все четыре коровых белка PRC2. Как и у Drosophila, комплекс млекопитающих имеет мол. массу около 600 кДа и играет роль не только в регуляции экспрессии гомеотических генов, но и в контроле клеточной пролиферации, инактивации Х-хромосомы и экспрессии импринтированных генов (см. дополнительные детали в разделе 4 этой главы и в главах, имеющих отношение к этому вопросу).

У растений несколько генов, кодирующих компоненты PRC2, претерпели дупликацию, так что теперь они представлены небольшими семействами генов. У Arabidopsis имеется только один гомолог ESC, FERTILIZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE), но три гомолога E(Z), три гомолога SU(Z)12 и пять гомологов р55 (называемые MSI1-5) (табл. 11.1). Различные комбинации этих белков образуют по крайней мере три разных комплекса, контролирующие специфические процессы развития (рис. 11.3 и 11.4) (Reyes and Grossniklaus, 2003; Chanvivattana et al., 2004).

Из этих комплексов лучше всего изучен комплекс, образованный членами класса FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED (FIS), который играет ключевую роль в контроле клеточной пролиферации в семени (Grossniklaus et al., 2001). Этот комплекс FIS, или МЕА-FIE содержит MEDEA, FIE, FIS2 и MSI1. Как оказалось, комплекс FIS регулирует гены, кодирующие PHERES1 (РНЕ1), транскрипционный фактор с доменом MADS [MADS domain transcription factor]; и MEIDOS, гомолог Skpl, который у дрожжей играет ключевую роль в контроле клеточной пролиферации (КцЫег et al., 2003b). Интересно, что отцовская аллель РНЕ1 экспрессируется на более высоких уровнях, чем материнская аллель. Эта регуляция экспрессии гена посредством геномного импринтинга находится под контролем комплекса FIS, который специфически репрессирует материнскую аллель (КцЫег et al., 2005). Таким образом, как описывается ниже, комплекс FIS имеет общие с его аналогом у млекопитающих функции в регулировании клеточной пролиферации, а также экспрессии импринтированных генов.

Комплекс EMF содержит CLF и EMBRYONIC FLOWER2 (EMF2) (Chanvivattana et al., 2004). Мутации по любому из этих компонентов обнаруживают слабые гомеотические трансформации и фенотип раннего цветения. Комплекс EMF необходим для репрессии гомеотических генов, чье комбинированное действие определяет идентичность органов цветка (Goodrich et al., 1997). Таким образом, комплекс EMF обладает функцией в поддержании репрессированного состояния гомеотических генов, сходной с функцией PRC2 у Drosophila и позвоночных (рис. 11.2). Однако гомеотические гены у растений кодируют не гомеодоменные белки, а, скорее, другие транскрипционные факторы, принадлежащие к семействам MADS-домена и специфичного для растений АР2-домена. Сильные [strong] мутанты EMF2, однако, имеют более резко выраженные [severe] фенотипы, когда их сеянцы производят цветки сразу же после прорастания, минуя вегетативную фазу развития (Yoshida et al., 2001). Таким образом, комплекс EMF играет роль как в раннем развитии, где он предотвращает немедленное цветение, так и позже, в ходе органогенеза цветка (Chanvivattana et al., 2004). На обеих стадиях комплекс EMF репрессирует гомеотические гены цветка, такие как AG и APETALA3 (АРЗ) (рис. 11.4). Белки FIE и MSI1, относящиеся к классу FIS, также вовлечены в контроль экспрессии гомеотических генов (рис. 11.3 и 11.4). Поскольку мутации в обоих этих белках вызывают связанную с материнским эффектом эмбриональную летальность, эта функция была обнаружена лишь тогда, когда аллели типа частичной утраты функции можно было изучать на более поздних стадиях развития (Kinoshita et al., 2001; Hennig et al., 2003).

Наконец, комплекс VRN играет ключевую роль в хорошо известном эпигенетическом процессе — яровизации (продолжительное воздействие низкой температуры). Яровизация индуцирует цветение у озимых однолетников, но этот эффект виден только после многих клеточных делений (рис. 11.4). Клетка растения будет помнить, что она была яровизирована, на протяжении многих месяцев или даже лет после холодного периода. Эта клеточная память поддерживается при пассажах в клеточной культуре, но не от одного поколения к следующему (Sung and Amasino, 2004а). Этот ответ на яровизацию опосредуется генами VERNALIZATION (VRN). Обнаружили, что VRN2 кодирует гомолог SU(Z)12 (Gendall et al., 2001), который взаимодействует с гомологами E(Z) растений, CLF и SWINGER (SWN) в двугибридных тестах у дрожжей (Chanvivattana et al., 2004). Переход к цветению контролируется не только яровизацией, но включает восприятие эндогенных (стадия развития и возраст) и экзогенных (длина дня, условия освещения, температура) факторов. Генетический анализ позволил определить четыре пути: (1) автономный путь конститутивно репрессирует цветение, (2) фотопериодический путь ускоряет цветение в условиях длинного дня, (3) яровизационный путь индуцирует цветение в ответ на действие низкой температуры и (4) гиббереллины стимулируют цветение. Ген сроков цветения FLC, содержащий MADS-бокс, является ключевым интегратором реакции цветения: он репрессирует цветение. Экспрессия FLC редуцируется как яровизанионным, так и автономным путями. В то время как первоначальная репрессия FLC не зависит от комплекса VRN, поддержание репрессии требует VRN2, который изменяет организацию хроматина в локусе FLC (Gendall et al., 2001). Важно отметить, что один из компонентов автономного пути — это гомолог р55, FVE (или MS 14), который влияет на реакцию по срокам цветения, но не действует в яровизационном пути (Ausin et al., 2004; Kim et al., 2004). Поскольку ни о каких биохимических исследованиях комплекса VRN не сообщалось, его точный состав в настоящее время неизвестен (рис. 11.3 и 11.4).

2.2. Модифицирующая хроматин активность PRC2

Каким образом PRC2 опосредует свое репрессирующее действие? Несколько белков PcG и trxG имеют домены SET, в том числе компонент PRC2, E(Z). Обнаружение того факта, что белки с доменом SET обладают активностью HKMT (Rea et al., 2000), позволило предположить, что в функцию PcG входит метилирование гистонов. Действительно, было показано, что комплексы PRC2 у млекопитающих и Drosophila метилируют гистон H3 по лизину 27 (H3K27) и, в меньшей степени, по H3K9 как in vivo, так и in vitro (Cao et al., 2002; Czermin et al., 2002; Kuzmichev et al., 2002; Mbller et al., 2002). Эти гистоновые метки обычно ассоциируются с транскрипционно «молчащим» состоянием. Более того, метилирование H3K9 и H3K27 было связано с репрессированными гомеотическими генами комплекса bithorax (Mbller et al., 2002). Однако лишь метилирование H3K27 утрачивалось у мутантов по E(z), подчеркивая тем самым значение метилирования H3K27 в PcG-сайленсинге. В отличие от белка SU(VAR)3-9, который сам метилирует H3K9, белки E(Z) сами по себе не обладают активностью HKMT H3K27. Наименьший комплекс, действующий как HKMT, также требует ESC и SU(Z) 12, которые могут иметь модулирующие функции. Недавно было показано, что комплексы PRC2 могут также метилировать Н1К26 (Kuzmichev et al., 2004). Разные изоформы гомолога ESC у млекопитающих, Eed, определяют специфичность PRC2 млекопитающих по отношению к метилированию Н1К26 versus H3K27 (Kuzmichev et al., 2004). Однако функциональное отношение метилирования Н1К26 к PcG-сайленсингу остается неясным.

^{Рис. 11.4. Участие различных PRC2 на разных стадиях развития растений}

^{В жизненном цикле растения разные варианты PRC2 (см. рис. 11.3) контролируют процесс развития. (А) Просветленная [cleared] семяпочка дикого типа с женским гаметофитом в центре. Комплекс FIS репрессирует гены-мишени, контролирующие пролиферацию центральной клетки; как и у всех мутантов классаfls, эта клетка пролиферирует в отсутствие оплодотворения. Приблизительно во время оплодотворения требуется также МЕА для поддержания низкого уровня экспрессии MEAT, но эта активность не зависит от других компонентов комплекса FIS. (Б) Срез семени дикого типа, содержащего зародыш и эндосперм, окруженный семенной оболочкой [seed coat]. После оплодотворения комплекс FIS участвует в контроле клеточной пролиферации в зародыше и эндосперме. Он поддерживает низкий уровень экспрессии РНЕ1 и необходим для удержания отцовской аллели МЕАР в «молчащем» состоянии. (В) Проростки дикого типа (справа) и мутанта ет/2 (слева), 21-й день после прорастания. Проросток ет/2 произвел цветок с гомеотическими трансформациями, но не дал листьев. Комплекс EMF предотвращает цветение и репрессирует гомеотические гены цветка, такие как AG, АРЗ и другие. (/) Яровизированное (справа) и неяровизированное (слева) растения; второе из них характеризуется продолжительной вегетативной фазой и образованием многочисленных листьев. Во время вегетативной фазы развития экзогенные и эндогенные сигналы индуцируют цветение. Яровизация ведет к репрессии цветкового репрессора FLC и таким образом стимулирует цветение. Поддержание этой репрессии зависит от комплекса VRN. (Д) Цветок Arabidopsis дикого типа. Во время органогенеза цветка комплекс EMF регулирует цветковые гомеотические гены, определяющие идентичность органов цветка. (А — любезно предоставлено J.M. Мооге и U. Grossniklaus; Б — любезно предоставлено J.-P. Vielle-Calzada и U. Grossniklaus; В — перепечатано, с любезного разрешения, из Moon et al., 2003 [©ASPB]; Г— перепечатано, с любезного разрешения, из Page and Grossniklaus, 2002 [©Macmillan].)}

У растений HKMT-активность комплексов PRC2 еще не была продемонстрирована in vitro. Однако исследования регулирования FLC показали, что яровизация индуцирует утрату ацетилирования и увеличение метилирования H3K9 и H3K27, главным образом в первом интроне этого гена (Bastow et al., 2004; Sung and Amasino, 2004b). У мутантов vm2 обе метки метилирования утрачены, что предполагает участие комплекса VRN в установлении этих репрессивных меток метилирования гистонов. У двух других мутантов, vrnl и vernalization in-sensitive3 (vin3), исчезает лишь метка H3K9me2. VRN 1 и VIN3 кодируют транскрипционные факторы семейств ВЗ-домена и гомеодомена, соответственно, но точный молекулярный механизм их участия в модификации хроматина в настоящее время неизвестен

Исходя из многочисленных исследований, выполненных к сегодняшнему дню, основной функцией PRC2 представляется обладание активностью HKMT, но у некоторых вариантов PCR2 имеются и другие активности, модифицирующие хроматин. Ген Rpd3 кодирует HDAC, которая, как полагают, участвует в PcG-сайленеинге (Tie et al., 2001). Однако, хотя мутации rpd3 усиливают фенотипы PcG, сами они не обнаруживают типичных гомеотических трансформаций. Тот факт, что RPD3 не присутствует во всех препаратах PRC2, может, таким образом, отражать либо слабое общее взаимодействие, либо ткане- и стадиеспецифичное взаимодействие с коровыми компонентами PRC2. Взаимодействие RPD3 с PRC2 представляет собой интересное партнерство, поскольку активности и HKMT, и HDAC ассоциируются с «молчащим» хроматином и в сочетании могут еще больше укреплять транскрипционно «молчащие» состояния.

2.3. Динамическая функция PRC2 в развитии

Как указывалось выше, коровые комплексы PRC1 и PRC2 ассоциируются с разными факторами, которые могут играть роль в рекрутировании комплексов PcG к тканеспецифичным локусам-мишеням или в модулировании их активности (Otte and Kwaks, 2003). Разные этапы PcG-репрессии, показанные на рис. 11.5, иллюстрируют стадиеспецифичные композиции комплексов PcG в эмбриогенезе Drosophila. До сих пор было трудно охарактеризовать различия в отношении разных тканей или клеточных типов у мух, поскольку для биохимической очистки обычно используются экстракты из целых эмбрионов. Однако исследования, выполненные на млекопитающих и растениях, ясно показывают, что комплексы PcG представлены по разному в различных конкретных тканях и что их состав изменяется в ходе клеточной дифференцировки (Chanvivattana et al.. 2004; Kuzmichev et al.. 2005; Baroux et al., 2006). У млекопитающих уровни экспрессии генов PcG различаются в огромной степени от одной клеточной линии к другой. Комплексы PcG могут различаться даже между генами-мишенями в одной и той же клетке, что заставляет предположить высоко динамичное поведение на разных стадиях развития.

^{Рис. 11.5. Последовательность событий, ведущих к зависимому от PcG репрессированному состоянию экспрессии генов у эмбрионов Drosophila}

^{Исходное состояние экспрессии регулируемого PRE гена определяется активностью регуляторов транскрипции — либо репрессоров (TR), либо активаторов (ТА) транскрипции. Транскрипция через PRE предотвращает установление состояния «OFF» («ВЫКЛ.») и приводит к зависимому от trxG состоянию «ON» («ВКЛ.») (детали см. рис. 12.8). (а—б) Нетранскрибируемый PRE связывается со специфическими белками, связывающимися с ДНК (например, РНО, PHOL, DSP1 или GAF), которые участвуют в рекрутировании раннего комплекса PcG, содержащего белки и PRC1, и PRC2. (в) Этот ранний комплекс PcG маркирует хроматин путем зависимого от E(Z) метилирования гистонов. (г) Поддержание «молчащего» состояния происходит через взаимодействия двух разных комплексов, PRC 1 и PRC2, в отсутствие исходного транскрипционного репрессора. Поддержание PRC1 стабилизируется посредством связывания через хромодомен ЗС. (d) PRC1 может компактизировать хроматин, устанавливая далее плотно конденсированный, «молчащий» хроматин}

У Drosophila белки PcG поддерживают репрессированные состояния гомеотических генов, установившиеся в раннем эмбриогенезе, фиксируя тем самым «решения» по развитию. Коль скоро «молчащее» состояние мишени PcG зафиксировано, она будет оставаться в этом состоянии весь остаток жизни особи. У растений аналогичная ситуация может возникать с комплексом VRN: будучи однажды яровизирован, ген-мишень (гены-мишени) будет перманентно инактивированным и будет «переустановлен» только в следующем поколении. Однако другие растительные комплексы PRC2, по-видимому, более быстро реагируют на стимулы, связанные с развитием или исходящие из окружающей среды. Например, одной из функций комплекса FIS является репрессия клеточной пролиферации в отсутствие оплодотворения. После оплодотворения, однако, клеточная пролиферация быстро индуцируется, предположительно через дерепрессию генов-мишеней PcG. Это показывает, что PcG-репрессия является состоянием «по умолчанию», которое должно быть преодолено неким неизвестным механизмом, чтобы стал возможным нормальный ход развития. Инактивация комплексов PcG как часть нормального жизненного цикла растения может объяснить отсутствие белков PRC1 у растений (рис. 11.4). PRC1 играет важную роль в перманентной, стабильной и длительной инактивации генов-мишеней. Такая перманентная инактивация была бы вредной для развития растения, где нередко PcG-репрессия снимается после соответствующих стимулов.

3.1. Компоненты PRC1

Молекулярный анализ продуктов генов PcG выявил структурно разнообразную группу ассоциированных с хроматином белков. PRC1 содержит четыре белка PcG: Polycomb (PC), Polyhomeotic (PH), Posterior Sex Combs (PSC) и Ring 1 (dRingl/SCE) (см. табл. 11.1) (Francis et al., 2001). Они встречаются в стоихометрических количествах, и были идентифицированы дополнительные белки-партнеры в зависимости от материала, используемого для очистки. Из млекопитающих был выделен и очищен родственный комплекс, что заставляет предполагать, что эти четыре субъединицы образуют кор PRC1 (Levine et al., 2002). Иммуноокрашивание политенных хромосом Drosophila с использованием антител против белков PRC1 продемонстрировало перекрывающуюся локализацию, которая показывала, что эти белки взаимодействуют на определенном и общем [defined and common] наборе генов-мишеней (рис. 11.6а). Кроме того, приблизительно 100 бэндов, наблюдаемых на хромосомах, дали доказательство того, что гены НОХ являются лишь частью более крупной регуляторной сети, включающей другие генные мишени, подверженные PcG-сайленсингу.

^{Рис. 11.6. «Нацеливание» PRC1 на PREs на политенных хромосомах}

^{(а) Иммуноокрашивание политенных хромосом Drosophila для визуализации распределения белка РС. (б) Выравнивание хромосомных плечей, показывающее перекрывание между предсказанными сайтами PRE в геноме Drosophila и цитологически картированными сайтами связывания РС на политенных хромосомах. Два кластера генов НОХ (ANT-C и ВХ-С) являются особо заметными сайтами для PRCls}

Ген РС кодирует белок из 390 аминокислот, содержащий хромодомен на своем аминотерминальном конце. Этот консервативный мотив обладает гомологией с НР1, белком Drosophila, необходимым для формирования гетерохроматина (Раю and Hogness, 1991; глава 5). Впоследствии было найдено, что хромодомен связывается с метальными компонентами в H3K27 и H3K9 (Bannister et al., 2001; Fischle et al., 2003). Еще один консервативный домен присутствует на карбокситерминальном конце. Консерватизм, как и наличие нескольких аберраций в мутантных аллелях, заставляет предполагать наличие важной, но все еще неизвестной регуляторной функции в этой части данного белка. Карбоксильный конец РС необязателен для «нацеливания» этого белка на «молчащие» гены (выполняемого хромодоменом), но, как оказалось, взаимодействует in vitro с нуклеосомами (Breiling et al., 1999). Предстоит выяснить, указывает ли это на еще не открытый узнающий мотив для еще одной модификации гистона. Для Рс2 человека была продемонстрирована SUMO ЕЗ-лигазная активность, что указывает на SUMO-модификации как на важные метки в процессе PcG-сайленсинга (Kagey et al., 2003).

Аминотерминальная часть белка PSC консервативна в протоонкогене bmi-1 позвоночных и гене-супрессоре опухолей mel-18. Этот район содержит мотив С₃НС₄ (RING finger), который может опосредовать белок-белковые взаимодействия. Этот мотив RING finger оказался связанным с субъядерной локализацией Bmi-1/ Mel-18, которая коррелирует с клеточной трансформацией.

У Drosophila локус polyhomeotic (ph) дуплицирован и состоит из проксимального (ph-p) и дистального (ph-d) генов, сохранивших обширную гомологию. У мышей были идентифицированы гомологичные белки PH. У всех у них имеются общий консервативный «цинковый палец» и домен SAM (известный также как SEP или SPM). Этот домен обнаруживается в еще одном белке PcG, SCM (Sex Combs on the Midleg). Домены SAM участвуют в белок-белковых взаимодействиях, поскольку было продемонстрировано, что они участвуют в гомо- или гетеротипических взаимодействиях с другими белками. Эти данные говорят в пользу предположения о возможной функции в генерировании крупных ядерных комплексов, необходимых для сайленсинга Действительно, белки PcG были локализованы в субнуклеарных фокусах, названных PcG-тельцами, которые могут функционировать как компартменты сайленсинга (Saurin et al., 1998).

Как упоминалось выше, dRINGl первоначально не был распознан как член PcG. Лишь биохимическая очистка обнаружила присутствие этого фактора с мотивом RING finger в PRC1, в котором, как полагают, он играет структурную роль (Francis et al., 2001; Lavigne et al., 2004). Было обнаружено, что белки Ring 1А и RING 1В из PRC1 млекопитающих ассоциированы с убиквитилированным Н2А на неактивной Х-хромосоме, и поддержание этой гистоновой метки зависит от белков Ringl (de Napoles et al., 2004; Fang et al., 2004; Cao et al., 2005; дополнительные детали см. в разделе 4.1 этой главы и в главе 17).

Эти четыре белка составляют коровую структуру PRC1. Однако другие белки PcG, подобные SCM или белку Zeste, оказались связанными с этим комплексом (Otte and Kwaks, 2003). Их молекулярная функция в PRC1 остается неясной, поскольку они, по-видимому, играют дополнительные роли в ядре; в качестве примера можно привести функцию активатора транскрипции, которую играет Zeste. Были идентифицированы еще и другие гены PcG по их роли как регуляторов транскрипции генов кора PcG (Ali and Bender, 2004). А именно, три гена PcG являются находящимися «вверх по течению» регуляторами генов, кодирующих компоненты PRC1. Петли отрицательной обратной связи между компонентами PRC1, а также положительная регуляция компонентов PRC1 со стороны PRC2 еще более заставляют предполагать сложную, кросс-регуляторную сеть между генами PcG для обеспечения тонкой настройки белковых уровней в этих комплексах (рис. 7а). Аналогичным образом, сложные регуляторные взаимодействия были описаны для генов комплекса FIS у Arabidopsis (Baroux et al., 2006).

3.2. «Нацеливание» PRC1 на сайленсированные гены

Трансгенный анализ кластеров гомеотических генов у Drosophila обнаружил регуляторные элементы, необходимые для поддержания сегмент-специфичной экспрессии генов НОХ. Эти ДНК-элементы — названные Polycomb Response Elements, или PREs — поддерживают сегмент-специфичную экспрессию генов НОХ за рамками фазы эмбриональной инициации. PREs привлекают белки PRC1, будучи интегрированы в эктопические сайты в политенных хромосомах; это позволяет предполагать что они определяют специфичность последовательности для узнавания комплексом PRC1 генов-мишеней и заякоривания на них. Однако тема «нацеливания» PcG оказывается довольно сложной. Размеры функционально охарактеризованных PREs варьируют от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований, они содержат консенсусные сайты связывания для многих разных белков, связывающихся с ДНК, и обычно в данном локусе-мишени обнаруживаются два или более PREs. Все охарактеризованные до сих пор PREs происходят от Drosophila и ни один PRE пока еще не был определен у млекопитающих или растений. Несмотря на сложность PREs, удалось идентифицировать четыре консенсусные последовательности-мотива и показать, что они играют роль в функции PRE у Drosophila. Один из этих мотивов (GCCAT) связывается как с Плейогомеотическими (РНО, Pleiohomeotic), так и с Плейогомеотикоподобными (PHOL) белками, которые обладают отчасти избыточными функциями. РНО и PHOL функционируют в «нацеливании» PcG, поскольку они найдены в комплексах PcG, выделенных из экстрактов ранних эмбрионов, обнаруживают совместную иммунопреципитацию с членами как PRC 1, так и PRC2 и связываются с PREs in vitro (рис. 11.5а) (Poux et al., 2001). Недавно значение в рекрутировании PcG было продемонстрировано и для DSP1, который связывается с мотивом GAAA, обнаруженным во многих PREs (Dejardin et al., 2005). Наконец, белки trxG, Zeste и GAF (кодируемый геном Trithorax-like) могут помогать рекрутировать белки PcG к их мишеням.

Вновь разработанный алгоритм, основывающийся на том, что собранные в кластер пары сайтов GAF, Zeste и PHO/PHOL характеризуют PRE, с высокой вероятностью предсказывает известные PREs и, таким образом, может идентифицировать потенциальные гены-мишени PcG в геноме Drosophila (рис. 11.66) (Ringrose et al., 2003). Семейство генов, контролируемых PRE, включает элементы от генов хорошо известных и важных для развития транскрипционных факторов, необходимых для формирования паттерна, до генов, кодирующих факторы, участвующие в регулировании клеточного цикла и старения.

^{Рис. 11.7. Регуляция и функция PRC 1 входе клеточного деления}

^{(а) Кросс-регуляторные взаимодействия между генами PcG, предполагаемые на основе генетических данных. Е(Рс), Pci и Asx — позитивные регуляторы членов кора PRC1, действующих «вверх по течению», Члены PRC2 Esc и E(z) действуют как позитивные регуляторы транскрипции Рс. Видна отрицательная обратная связь от членов кора PRC1 на Psc и dRing 1, а также на Su(z)2. Тонкая настройка уровня генного продукта, вероятно, необходима для хорошо сбалансированных процессов, базирующихся на химическом равновесии, (б) Факторы транскрипции, специфичные для нуклеотидной последовательности (TF) привязывают компоненты PRC1 к PRE. Стабильный сайленсирующий комплекс требует заякоривания PRC1 через хромодомен РС на соседних метилированных «хвостах» гистонов. (в) Возможная модель того, как могут наследоваться состояния дифференциальной экспрессии генов. Процесс межгенной транскрипции помещает позитивные эпигенетические метки (например, ацетилированные хвосты гистонов, варианты гистонов) в PREs, которые контролируют активные гены (PRE 2). Все другие PREs сайленсируются «по умолчанию» (PRE 1). Во время репликации ДНК и митоза только позитивный эпигенетический сигнал нужно передать дочерним клеткам, что гарантирует, что в следующей интерфазе межгенная транскрипция возобновляется в PRE 2, прежде чем сайленсинг «по умолчанию» вновь устанавливается во всех других PREs (а — из Ali and Bender, 2004, переработано)}

PRC1, будучи однажды связанным, взаимодействует с соседними гистонами и генерирует стабильные сайленсирующие комплексы в PREs (Рис. 11.76). Метки H3K27шеЗ, созданные PRC2, действуют как дополнительные места связывания для хромодомена РС (рис. 11.7в). В их отсутствие, как показывает конкуренция с растворимым пептидом метилированного «хвоста» гистона, PRCls диссоциируют со своих генов-мишеней (Czermin et al., 2002; Ringrose et al., 2004; Wang et al., 2004) Открытие у PRC2 активности HKMT и ассоциированных гистоновых меток, типичных для «молчащего» хроматина, позволило предположить новый механизм для установления репрессии PcG. Вслед за катализируемой PRC2 модификацией H3K27me3 PRC1 связывается через хромодомен белка РС и стабилизирует сайленсинг. Это подкрепляется данными о том, что (1) метки H3K27me3 и РС колокализуются на политенных хромосомах и (2) связывание РС утрачивается у мутантов E(z), у которых нет активности HKMT модифицирующей H3 метками H3K27me3 в PREs, помогая рекрутировать РС к его мишеням (рис. L 1.5). Хотя такая модель несомненно привлекательна, ситуация в PRE», по-видимому, более сложная, поскольку PRC2s и PRC1 действуют не последовательно, а, скорее, присутствуют вместе на PREs в раннем эмбриогенезе (рис. 11.56, в). Таким образом, представляется вероятным, что метилирование H3K27 является событием «вниз по течению» после рекрутирования PcG, но играет ключевую роль в установлении «молчащего» состояния.

Эта описанная выше модель демонстрирует параллели с формированием гетерохроматина, где Гетерохроматиновый Белок 1 (НР1) рекрутируется через свой хромодомен к меткам H3K9me, созданным SU(VAR)3-9 (глава 5). Таким образом, продуктивный сайленсирующий комплекс «нацеливается» транскрипционными факторами на определенные элементы нуклеотидных последовательностей ДНК, но, помимо этого, требует поблизости слой соответствующим образом модифицированных гистонов для генерации структуры репрессированного хроматина более высокого порядка (рис. 11.5).

В ходе эволюции PREs оказались на удивление мало консервативными по последовательности. Даже в пределах близкородственных видов Drosophila число, положение и состав PREs существенно варьируют (L. Ringrose and R. Раю, неопубликовано). Это заставляет предполагать, что требования в отношении последовательности, а также положения PREs являются нежесткими и могут быть адаптированными к видоспецифичным требованиям. Тем не менее, компоненты PRC1 высоко консервативны и предположительно используют тот же самый базовый молекулярный механизм (механизмы) для индукции изменений более высокого порядка в хроматине «молчащих» генов-мишеней.

3.3. Установление репрессивных функций с помощью PRC1

Способ, которым связанные с PRE PRCls взаимодействуют с промотором и предотвращают транскрипцию, все еще неизвестен. Заякоривание временно останавливающихся [paused] комплексов PHК-полимеразы в промоторах, предотвращающее инициацию, было приписано взаимодействиям PRE-PRC1, описанным для ре портерных конструктов (Dellino et al., 2004). Кроме того, было показано, что PRC1 противодействует ремоделингу нуклеосом in vitro и индуцирует компактную структуру хроматина. Таким образом, PRC1 потенциально блокирует доступ к ДНК транскрипционных факторов и других комплексов, необходимых для транскрипции (Francis et al., 2004). С помощью алгоритма, описанного выше, предсказывается существование PRE-подобных последовательностей в почти всех промоторах контролируемых PcG генов-мишеней Drosophila. Это позволяет предполагать, что размещение PRC1 и в промоторах, и в регуляторных сайтах могло бы благоприятствовать взаимодействиям между PREs и промоторами и устанавливать стабильно репрессированные хроматиновые структуры, неблагоприятные для транскрипции (Ringrose et al., 2003).

Стабильность сайленсирующих комплексов, как показывает заякоривание через метилированные «хвосты» гистонов, оказывается признаком долговременной репрессивной функции белков PcG. Однако при анализе in vivo на клеточном уровне наблюдается замечательно динамичное поведение. Белки PcG кластеризуются в PcG-тельца, которые варьируют между клетками по величине и составу, заставляя предполагать взаимодействие сайленсирующих комплексов в ядре, которое регулируется в развитии. Более того, анализ динамики маркированных GFP белков РС и PH in vivo обнаружил очень высокую скорость обмена несвязанных белков с их комплексами в сайленсированных мишенях (Ficz et al., 2005). Эти результаты позволяют предполагать, что долговременная репрессия в основном базируется на химическом равновесии между связанными и не связанными белками, а не на высокоаффинной защите сайтов, связывающихся с ДНК.

3.4. Предотвращение наследуемой репрессии антисайленсингом

Связывание PRCls с PREs, по-видимому, индуцируется «по умолчанию», поскольку многие из заякориваюшихся компонентов PcG и белков, связывающихся с ДНК, экспрессируются во всех клетках, и PREs глобально сайленсируют репортерные гены в трансгенных конструктах. Противодействующие белки группы trxG в действительности функционируют не как активаторы, но, скорее, как антирепрессоры (Klymenko and Mbller, 2004; глава 12). Таким образом, для поддержания активной транскрипции гена контролируемого PRE, сайленсинг в этом PRE должен быть предотвращен ткане- и стадиеспецифическим образом. У Drosophila, например, активация генов НОХ контролируется ранним каскадом транскрипционных факторов, кодируемых генами сегментации. Интересно, что эти факторы индуцируют транскрипцию не только генов НОХ, но и межгенных, некодирующих РНК, которые транскрибируются через ассоциированные PREs, часто обнаруживаемые «вверх по течению» или «вниз по течению» (рис. 11.5). Было показано, что транскрипция через PREs необходима для предотвращения сайленсинга и поддержания активного состояния репортерного гена с использованием трансгенных конструктов (Schmitt et al., 2005). Процесс транскрипции, вероятнее всего, ремоделирует хроматин PRE и генерирует активное состояние, характеризующиеся, например, отсутствием репрессивного метилирования гистонов и присутствием ацетилирования гистонов. Таким образом, даже несмотря на то, что белки, связывающиеся с ДНК, и привлекают PRC1 к этому конкретному активированному PRE, гистоновое окружение не разрешает заякоривание РС через H3K27шеЗ и никакой стабильный сайленсинг не будет установлен. Поскольку в системе PcG сайленсинг индуцируется «по умолчанию», эпигенетическое наследование паттерна дифференциальной экспрессии генов требует только передачи активного состояния PRE в ходе репликации ДНК и митоза (рис 11.7в). Каким образом это достигается на молекулярном уровне и какая эпигенетическая метка (метки) отвечает за поддержание активного состояния PRE — все эти вопросы пока еще остаются открытыми. Интересно, что недавно было показано, что в PRE гомеотического гена Ubx у Drosophila некодирующие РНК, продуцируемые на PREs, остаются ассоциированными с хроматином и рекрутируют регулятор trxG, Absent Small или Homeotic discs 1 (ASH1). Разрушение этих РНК с помощью RNAi ослабляет рекрутирование ASH 1 к PRE, заставляя предполагать, что это взаимодействие играет важную роль в эпигенетической активации гомеотических генов путем преодоления сайленсинга, индуцированного PcG «по умолчанию» (Sanchez-Eisner et al., 2006).

4.1. От репрессии гена к репрессии хромосомы

Мутации в компонентах мышиного PRC1 демонстрируют гомеотические трансформации аксиального скелета. Это может вызывать появление дополнительных позвонков как следствие дерепрессии генов НОХ (рис. 11.2д, е) (Core et al., 1997). Кроме того, мутантные мыши обнаруживают тяжелый комбинированный иммунодефицит, вызываемый отсутствием пролиферативных ответов гематопоэтических клеток (Raaphorst, 2005). Роль белков PcG была особенно хорошо изучена на клетках крови, в свете того факта, что большинство линий клеток крови характеризуются их хорошо описанными, специфичными для клеточного типа программами транскрипции. Однако коммитирование и рестрикция линии каким-то образом нуждаются в надежном поддержании при клеточном делении. Оказывается, что у нокаутных по PcG мышей популяции предшественников В- и Т-клеток продуцируются нормально, показывая, что контроль PcG не играет роли в установлении специфичных для линии паттернов генной экспрессии. Однако белки PcG вносят вклад в необратимость выбора линии, а не участвуют в решении следовать по определенному пути развития.

Кроме контроля генов НОХ, паттерны экспрессии которых характеризуют разные линии клеток крови, белки PcG играют главную роль в контроле пролиферации. Ген bmi1, ортолог гена Psc Drosophila, был первоначально идентифицирован как онкоген, который, в кооперации с туе, индуцирует лимфомагенез у мышей (van Lohuizen et al., 1991). Белок Bmi1 контролирует регуляторы клеточного цикла р16^INK4а из 19^АRF (Jacobs et al., 1999). И Bmi1, и родственный белок Mel-18 являются негативными регуляторами локуса 1NK4C-ARF, необходимого для контроля нормальной лимфоидной пролиферации. Мисрегуляция этой важной контрольной точки [checkpoint] клеточного цикла влияет на апоптоз и старение у мышей (Akasaka et al., 2001).

Белки PcG млекопитающих ассоциированы также с классическим эпигенетическим феноменом инактивации Х-хромосомы (глава 17). Инактивация одной Х-хромосомы в ХХ-клетках самок сопровождается серией модификаций хроматина, в которых участвуют белки PcG (Heard, 2004). В частности, компоненты PRC2, подобно гомологу ESC, Eed (Embryonic ectoderm expression), или гомологу E(Z), Enx1 (табл. 11.1), играют главную роль в установлении меток гистонов, ассоциированных с транскрипционным сайленсингом. Временная [transient] ассоциация этого PRC2 с Х-хромосомой, покрытой РНК Xist, сопровождается метилированием H3K27. Напротив, мутантные по eed эмбрионы мыши не обнаруживают рекрутирования HKMT Fnx1, и у них не наблюдается никакого метилирования H3K27. Однако отсутствие этих компонентов PRC2 не ведет к полной дерепрессии всей неактивной Х-хромосомы; скорее, в некоторых клетках наблюдаются спорадическая реэкспрессия сцепленных с X генов и увеличение эпигенетических меток, ассоциированных с активным состоянием (H3K9ас и H3K4me3). Это происходит, вероятно, потому, что другие частично избыточные эпигенетические механизмы взамен обеспечивают поддержание одной активной Х-хромосомы.

Рекрутирование PRC2 к неактивной Х-хромосоме, по-видимому, зависит от РНК Xist. Поскольку связь PRC2 с неактивной X лишь временная, оказывается, что этот комплекс необходим лишь для установления эпигенетических меток (т.е. H3K27me3), чтобы поддерживать сайленсинг. В настоящее время неизвестно, узнает ли PRC1 эти метки непосредственно и требуется ли он для перманентного сайленсинга неактивной Х-хромосомы, но компоненты PRC1 оказываются связанными с неактивной Х-хромосомой. Однако известно, что метилирование ДНК сопровождает фазу поддержания и необходимо для перманентной инактивации X.

PRC2 специфически участвует в регуляции моноаллельной экспрессии Х-хромосомы как у эмбриона, где инактивация Х-хромосомы является случайной, так и в экстраэмбриональных тканях, где всегда инактивирована Х-хромосома, унаследованная от отца (инактивация импринтированной Х-хромосомы). Кроме того, недавно было обнаружено, что PRC2 участвует в регуляции некоторых аутосомных импринтированных генов. Например, анализ 14 импринтированных локусов из шести несцепленных импринтированных кластеров показал, что четыре из них биаллельно экспрессировались у мутантных по eed мышей (Mager et al., 2003; дополнительные детали см в главе, 19). Интересно, что все локусы, утратившие импринтированную экспрессию, были нормально репрессированы, когда наследовались от отца, тогда как ни один из локусов, репрессированных по материнской линии, не был затронут Поскольку недавно было показано, что Ezh2 непосредственно взаимодействует с метилтрансферазами ДНК млекопитающих и требуется для их активности (Vim et al., 2006), не исключено, что PRC2 играет роль в регуляции этих импринтированных генов посредством метилирования ДНК (глава 18).

Об участии PRC2 в регуляции экспрессии импринтированных генов сообщалось и для Arabidopsis, где локус РНЕ1 экспрессируется на гораздо более высоких уровнях с отцовской аллели (КцЫег et al., 2005). У мутантов по МЕА, гомологу E(z), материнская аллель РНЕ1 специфически дерепрессирована. Аналогичным образом МЕЛ регулирует также свою собственную импринтированную экспрессию: на ранних стадиях репродуктивного развития материнская аллель МЕЛ сильно дерепрессирована у мутантов теа. Этот эффект, однако, не зависит от других компонентов комплекса FIS (Baroux et al., 2006). Напротив, на более поздних стадиях развития комплекс FIS обеспечивает стабильную репрессию отцовской аллели МЕЛ (Ваших et al., 2006; Gehring et al., 2006; Jullien et al., 2006). В этом последнем случае комплекс FIS участвует в сайленсинге репрессированных у отца импринтированных генов аналогично ситуации у млекопитающих. Кроме того, МЕЛ играет также роль в поддержании экспрессии материнских аллелей РНЕ1 и МЕА на низком уровне, как описано выше (рис. 11.4).

Поскольку компоненты PRC2 имеются у растений, беспозвоночных и млекопитающих, PRC2 представляет собой древний молекулярный модуль, годящийся для репрессии генов, который имелся уже у одноклеточного предка растений и животных, до развития многоклеточности. Таким образом, эти примеры позволяют предполагать, что PRC2 был мобилизован независимо для регуляции экспрессии импринтированных генов у растений и животных, в двух линиях, где возник геномный импринтинг (Grossniklaus, 2005).

4.2. Последствия аберрантной активации транскрипции

Обнаружение того, что миерегуляция Bmi1 вызывает злокачественные лимфомы у мышей, ставит вопрос о том, вносит ли BMI1 человека (являющийся компонентом PRC1) сам по себе вклад в развитие рака аналогичным образом. Накапливаются данные о том, что измененная экспрессия гена PcG широко распространена в злокачественных лимфомах человека (Raaphorst, 2005). Например, уровень сверхэкспрессии BMI1 в В-клеточных лимфомах коррелирует со степенью злокачественности, заставляя предполагать, что компоненты PRC1 играют-таки роль в развитии рака у человека. Однако гены-мишени BMI1 в клетках человека, по-видимому, отличаются от генов-мишеней в мышиных лимфоцитах, поскольку никакую очевидную даун-регуляцию pl6^INK4a нельзя скоррелировать со сверхэкспрессией онкогенов.

Сверхэкспрессия гена PcG наблюдается не только при гематологических злокачественных новообразованиях, но обнаруживается и в солидных опухолях, в том числе в медуллобластомах и опухолях, происходящих из печени, прямой кишки, груди, легкого, пениса и простаты (рис. 11.8). Высокий уровень экспрессии Ezh2, маркера PRC2, часто обнаруживается на ранних стадиях высокопролиферативных легочных карцином. Это позволяет предположить, что хорошо известный каскад инициации PRC2 и поддержания PRC1 (рис. 11.5) мог бы также сопровождать развитие линии опухолевых клеток.

^{Рис. 11.8. PRC2 регулирует клеточную пролиферацию у млекопитающих и растений}

^{(а, б) Зародыши растения, происходящие из яйцеклеток дикого типа и мутанта теа. МЕА кодирует белок комплекса FIS и регулирует клеточную пролиферацию. Гигантский зародыш mea гораздо крупнее соответствующего зародыша дикого типа на той же стадии развития (поздняя стадия «сердечка» — late heart stage). Мутантные зародыши развиваются меделеннее и имеют примерно вдвое большее число клеточных слоев. (в, г) Нормальный и раковый эпителий простаты. В раковом эпителии экспрессия Ezh2 сильно увеличена (метка антителом против Ezh2). Таким образом, как утрата Е(2)-функции у растений, так и сверхэкспрессия функции E(Z) у человека может приводить к дефектам в клеточной пролиферации. (д. е) Контрольные крысиные фибробласты 1а и фибробласты со сверхэкспрессией RING1. Сверэкспрессия RING1 приводит к независимому от заякоривания росту в мягком агаре, типичному для неопластически трансформированных клеток, (а,б, любезно предоставлено J.-P. Vielle-Calzada and U. Grossniklaus; в, г, перепечатано, с любезного разрешения, из Kuzmichev et al., 2005 [©National Academy of Sciences]; д, e, перепечатано, с любезного разрешения, из Satijn and Otte, 1999 [©American Society for Microbiology].)}

Интересно, что компоненты PRC2 играют также ключевую роль в контроле клеточной пролиферации у Arabidopsis. Хотя у растений аберрантный рост не приводит к раку и гибели, жесткий контроль клеточной пролиферации является существенным для нормального развития. У мутантов классаfis два продукта оплодотворения у цветковых растений, зародыш и эндосперм, пролиферируют избыточно, и получающиеся в результате семена абортируют (рис. 11.8) (Grossniklaus et al., 2001; Hsieh et al., 2003; Guitton and Berger, 2005). Влияние на клеточную пролиферацию наблюдается и у двойных мутантов elf и swn, двух гомологов E(z) у растений. Такие растения демонстрируют нормальное развитие семян после прорастания, но образуют массу пролиферирующей, недифференцированной ткани (каллус), а не листья (Chanvivattana et al., 2004).

Хотя и неизвестно, каким образом PRC2 контролирует клеточную пролиферацию у растений, вполне вероятно, что он должен взаимодействовать с RBR1, растительным гомологом ретинобластомного белка Rb (Ebel et al.. 2004; Mosquna et al., 2004). Мутанты в FIS-классе генов не только обнаруживают дефекты пролиферации в ходе развития семян после оплодотворения, но и необходимы для предотвращения пролиферации эндосперма в отсутствие оплодотворения. Этот последний аспект фенотипа является общим с мутантами rbr1 обеспечивая связующее звено с Rb-путем. Замечательно, что сообщалось также о связи между Rb-путем и PRC2 у млекопитающих (Bracken et al, 2003), что иллюстрирует консерватизм регуляторных сетей между растениями и млекопитающими.

4.3. Поддержание судьбы стволовой клетки

Стволовые клетки играют все возрастающую роль в медицине. Их возможность обеспечивать прогениторные клетки для заживления поврежденной ткани включает их в высокоценимый инструментарий регенеративной медицины. Неудивительно, что больше всего об идентичности и локализации стволовых клеток мы знаем на примере лучше всего охарактеризованной линии клеток крови.

Гематопоэтические стволовые клетки (HSCs) поддерживают пул клеток крови путем самообновления, а также производства дочерних клеток, которые дифференцируются в лимфоидные, миелоидные и эритроидные линии. Ниша стволовых клеток в костном мозге взрослого организма обеспечивает эти клетки специфическими внешними сигналами для поддержания их судьбы. С другой стороны, внутриклеточные сигналы для поддержания состояния «стволовости», базируются, по-видимому, на системе PcG.

Мутанты мышей с мутациями генов PRC 1 (например, bmi1/mel-18, mph1/rae28 и тЗЗ: см. табл. 11.1) страдают различными дефектами в гематопоэтической системе, такими как гиперплазия (т.е. увеличенная клеточная пролиферация) в селезенке и тимусе, уменьшение числа В- и Т-клеток и нарушенный пролиферативный ответ лимфоидных предшественников на цитокины. Потребность в Bmi1 и Mel-18 в процессе самообновления стволовых клеток на различных стадиях развития позволяет предполагать меняющийся пул генов-мишеней для эмбриональных и взрослых стволовых клеток.

Для нейральных стволовых клеток (NSCs) также необходима система PcG, как показывают дефекты нейронов, наблюдаемые у мутантов bmi1 мышей (Bruggeman et al., 2005; Zencak et al., 2005). В частности, в постнатальном периоде мыши лишены церебральных NSCs, показывая тем самым потребность в Bmi1 in vivo в процессе обновления NSCs. Как было обнаружено для гематопоэтической системы, поддержание эмбриональных NSCs находится, как оказывается, под контролем другой сети PcG, чем самообновление взрослых NSCs.

Внешние сигналы, подобные сигнальному каскаду sonic Hedgehog, модулируют ответ Bmi1 в NSCs и обеспечивают способность к пролиферации/самообновлению (Leung et al., 2004). Идентификация этих внешних сигналов, контролирующих репрессию PcG была достигнута посредством анализа развития прогениторов гранулярных нейронов мозжечка (CGNPs — cerebellar ganule neuron progenitors). Постнатальная волна пролиферации индуцируется сигнальным фактором Sonic hedgehog (Shh), секретируемым клетками Пуркинье. Сигнал Shh разветвляется и контролирует уровни N-Myc и Bmi1 (рис. 11.9). Таким образом, CGNPs с нехваткой Bmi1, демонстрируют дефектный пролиферативный ответ на стимуляцию Shh. Сигнал Shh способен в конечном счете контролировать пролиферацию этих стволовых клеток, модулируя и путь Rb «вниз по течению» (через N-myc и Bmi1/pl6^INK4a), и путь р53 (через Bmi1/pl9^ARF). Этот механизм объясняет, почему гиперактивация Shh-сигналинга ведет к развитию медуллобластом (Leung et al., 2004). HSCs регулируются сходным путем, контролируемым Indian hedgehog. У NSCs экспрессия локусов Hoxd8, Hoxd9 и Нохс9 находится под контролем Bmi1. Соответствующий профиль экспрессии НОХ сообщает стволовым клеткам необходимую судьбу.

Действительно, поскольку стволовые клетки представляют определенную и коммитированную клеточную судьбу, неудивительно, что система PcG поддерживает эту конкретную судьбу наследуемым в митозе образом. В будущем будет интересно идентифицировать пул мишеней системы PcG в различных популяциях стволовых клеток и выяснить, каким образом можно влиять на систему поддержания, чтобы сделать возможным контролируемое репрограммирование судьбы стволовых клеток. В данный момент неясно, играет ли PcG какую-либо роль в поддержании стволовых клеток у растений. Возможно, однако, что репрограммирование растительных клеток, которые являются тотипотентными и обладают потенциальной способностью образовывать, в соответствующих условиях, полный новый организм, могло бы включать регуляцию PcG. Действительно, растения, лишенные гомологов E(z), CLF и SWN, продуцируют, после прорастания, массу недифференцированных клеток; это позволяет предположить, что для поддержания дифференцированного состояния необходимы гены PcG (Chanvivattana et al., 2004).

^{Рис. 11.9. Сигналит Sonic Hedgehog поддерживает пролиферацию/ самообновление прогениторных клеток мозжечка}

^{Сигнальный каскад Shh регулирует и путь Rb, и путь р53 через Bmi1-контроль контрольную точку пролиферации Р16/р19. Подавление Smoothened (Smoh) Shh-рецептором Patched (Ptch) приводит к сигналингу «вниз по течению» в ядре Одна часть этого сигнала индуцирует N-Myc, Cyclin D1 и D2, тогда как другая часть активирует Bmi1 через эффекторы Gli (адаптировано из Valk-Lmgbeek et al., 2004)}