Эпигенетика

2.1. Внеклеточные сигналы

Гемопоэтическое развитие инициируется в костном мозге взрослой мыши путем решения гемопоэтических стволовых клеток (HSCs) дифференцироваться в общие миелоидные прогениторы (CMP) (Akashi et al., 2000) или в лимфоид-праймированные мультипотентные прогениторы (LMPP) (Adolfsson et al., 2005). Клетки эритроидных типов возникают только из СМР, в то время как миелоидные клетки могут происходить как из СМР, так и из LMPP. Активация лимфоидных генов RAG1 или RAG2 в клетках LMPP характеризует появление самых ранних прогениторов лимфоцитов (ELP), которые дифференцируются в обычные лимфоидные прогениторы (CLP) с характерным для них В-, Т-, и NK-клеточным потенциалом развития (рис. 21.3) (Busslinger, 2004).

Как внеклеточные сигналы, так и транскрипционные факторы существенны для дифференцировки HSCs в CLPs и в ранние прогениторы В-клеток (про-В-клетки) в костном мозге. Выработка лимфоидных прогениторов и В-лимфоцитов зависит от сигнала с рецепторов c-Kit, Flt3, и IL-7 (Waskow et al., 2002; Vosshenrich et al., 2003). В частности, мышь с двойным дефицитом по Flt3 и IL совершенно не может вырабатывать про-В клетки (Vosshenrich et al., 2003). Сигналы от Flt3 и IL-7R активируют близко родственные транскрипционные факторы Stat5a и Stat5b, которые, в свою очередь, облегчают дифференцировку лимфоидных прогениторов до стадии про-В-клеток (рис. 21.4) (Zhang et al, 2000; Kovanen и Leonard, 2004).

Развитие В-клеток чем дальше, тем больше зависит от факторов транскрипции с доменами типа «цинковые пальцы», Ikaros, и Ets-домена белка PU.1, так как CLP с характерной для них экспрессией IL-7R отсутствуют в костном мозге мутантных мышей Ikaros и PU.I (рис. 21.4) (Ariman et al., 2003; Dakic et al., 2005).

2.2. Транскрипционные факторы

Вступление лимфоидных прогениторов на путь В-клеток зависит от транскрипционного фактора Е2А (Tcfe2a) типа «спираль-петля-спираль», раннего фактора В-клеток EBF1 и от белка Рах5 (BSAP), имеющего парный (спаренный) домен (paired domain protein) (рис. 21.4). Е2Аи EBF1 координированно активируют экспрессию генов, специфичных для В-клеток, которые важны для выработки ранних про-В-клеток (Busslinger, 2004). Тем не менее, активация транскрипционной программы, специфичной для В-клеток, недостаточна для коммутирования ранних прогениторов к В-лимфоидной линии в отсутствие Рах5. В костном мозге гомозиготная мутация Рах5 останавливает развитие В-клеток на стадии ранней про-В-клетки (Nutt et al., 1997). Pax5^-/ про-В-клетки сохраняют мощный потенциал самообновления и развития, характерный для некоммитированных лимфоидных прогениторов (Nutt et al., 1999). Интересно, что эктопическая экспрессия миелоидных факторов транскрипции эффективно индуцирует переключение линии с лимфоиднои на миелоидную дифференциацию в прогениторах Рах5^-/-, показывая, что про-В-клетки Рах5^-/- in vitro являются клонируемыми лимфоидными прогениторами с латентным потенциалом миелоидной дифференцировки (Busslinger, 2004). Важно, что восстановление экспрессии Рах5 подавляет этот мультилинейный потенциал про-В-клеток Рах5^-/- одновременно стимулируя их развитие в зрелые В-клетки (Nutt et al., 1999). Эти эксперименты позволяют определить Рах5 как критичный фактор коммутирования В-линии, который ограничивает возможности развития лимфоидных прогениторов только путем развития В-клеток.

^{Рис. 21.3. Схема развития В-клеток}

^{Гематопоэтические стволовые клетки (HSC) дифференцируются через обозначенные стадии развития в секретирующие иммуноглобулин плазматические клетки: LMPP — лимфоид-праймированные мультипотентные прогениторы; СМР — общий миелоидный прогенитор; ELP — самые ранние прогениторы лимфоцитов: CLP — общий лимфоидный прогенитор. Части 1-111, указанные внизу рисунка, обозначают стадии лимфопоэтического развития, эпигенетические механизмы которых были исследованы и которые обсуждаются в этой главе}

^{Рис. 21.4. Транскрипционный контроль раннего лимфопоэза}

^{Прогениторы естественных киллеров (NK), линий В- и Т-клеток развиваются из гемопоэтических стволовых клеток (HSC) под контролем обозначенных факторов транскрипции. Детальное описание см. Bussinger (2004)}

Некоммитированные гематопоэтические прогениторы беспорядочно экспрессируют гены с различными программами посредством процесса, который известен как «праймирование линии» (Miyamoto et al., 2002). В соответствии с этим открытием, про-В-клетки Рах5^-/- экспрессируют не только гены, характерные для про-В-клеток, но и гены программ, специфичных для других линий (Nutt et al., 1999). При линейном коммитировани Рах5 выполняет двойную роль, активируя специфичные для В-клеток гены и одновременно подавляя гены, не подходящие для линии (рис. 21.5) (Nutt et al., 1999). Рах5 активирует несколько генов-мишеней, кодирующих существенные компоненты сигнального пути, связанного с рецептором пре-В-клеток (BCR), такие, как трансдуцирующая сигнал цепь Ig? (mb-1, Cd79a), стимулирующие корецепторы CD, 19 и CD1, а также центральный адаптерный белок BLNK (рис. 21.5) (Busslinger). Таким образом, функция трансактивации Рах5 облегчает передачу сигнала от pre-BCR и BCR, образуя важные контрольные точки в развитии В-клеток. С другой стороны, гены, репрессированные Рах5, кодируют избыток выделенных белков, молекулы клеточной адгезии, передатчики сигналов и белков ядра, которые экспрессируются в эритроидных, миелоидных и (или) Т-лимфоидных клетках (рис. 21.5) (Delogu et al., 2006). Среди них — гены Csflr (М-CSFR) и Notchl. что является хорошим примером того, как их Рах5-зависимая даун-регуляция делает коммутированные В-клетки больше не реагирующими на миелоидный цитокин M-CSF (Nutt et al., 1999) или на Notch лиганды, индуцирующие Т-клетки (Busslinger, 2004). Следовательно, репрессивная функция Рах5 содействует коммитированию В-клеток, прекращая работу ненужных сигнальных систем. Взаимодействуя с ко-репрессорами белкового семейсва Groucho, Pax5 может рекрутировать деацетилазы гистонов (HDACs) к регуляторным элементам, результатом чего является репрессия генов (Linderson et al., 2004).

^{Рис. 21.5. Двойная роль Рах5 в развитии В-клеток}

^{Рах5 активирует гены, специфичные для В-клеток, участвующие в (пре)ВСВ-сигналинге и подавляет неприемлемые для линии гены, необходимые для трансдукции сигнала в миелоидных (FcRy, Csfr) или Т-лимфоидных (Notchl, CD28, Grap2)}

Е2А, EBF1 и их гены-мишени обычно экспрессируются в Pax^-/- про-В-клетках, указывая, что Рах5 в развитии В-клеток функционирует «вниз по течению» от Е2А и EBFT1 (Nutt et al., 1997; Busslinger, 2004). Согласно этим наблюдениям, транскрипты Рах5 отсутствуют и в прогениторах E2A^-/- или EBFI^-- (Ikawa et al., 2004; Medina et al., 2004). Прогениторы E2A^-/- экспрессируют EBF1 на низком уровне, в то время как Е2А нормально транскрибируются в прогениторах EBF1^- (Medina et. al., 2004). Более того, ретровирусное восстановление экспрессии EBF1 в прогениторах Е2А^-- активирует транскрипцию Рах5 и таким образом инициирует дифференцировку про-В-клеток (Seet et al., 2004). Отсюда следует, что эти три транскрипционных фактора стимулируют раннее развитие В-клеток в генетической иерархии E2A-EBF1-Pax5. Тем не менее, в пределах В-лимфоидной линии экспрессия EBFI поддерживается благодаря регуляции белком Рах5, основанной на обратной связи (рис. 21.4) (Horher et al., 2001; Fuxa et al., 2004).

2.3. Эпигенетический контроль экспрессии генов

В любой клетке многоклеточного эукариотного организма большая часть генов транскрипционно подавлена и избирательно активируется только в специфичных путях развития. Репрессия генов опосредуется многочисленными слоями эпигенетических механизмов, включая метилирование ДНК, модификации гистонов, позиционирование нуклеосом и структуру хроматина более высокого порядка (Smale, 2003). Первое проникновение в то, как снимается репрессия генов в начале развития В-клеток, было обеспечено анализом специфичного для В-клеток гена Cd79а (mb-1, Igw, Maier et al., 2004) Промотор гена Cd79a содержит функциональные узнающие последовательности для трех транскрипционных факторов Е2А, EBF1 и Рах5, в дополнение к Ets и Runx-связывающим сайтам (рис. 21.6) (Maier etal., 2004). Этот участок транскрипционного контроля метилирован по динуклеотидам CpG в HSCs, частично деметилирован в CLPs и полностью деметилирован в коммитированых про-В-клетках (Maier et al., 2004). Промотор Cd79a также полностью метилирован в прогениторах Е2А^-/- или EBF1, но может быть деметилирован синергическим действием EBF1 и Runxl, что вместе с Рах5 ведет к транскрипционной активации гена mb-1 в коммитированныхпро-В-клетках (рис. 21.6) (Maieretal., 2004). Таким образом, в раннем развитии В-клеток EBF1 и, возможно. Е2А функционируют как «пионерские» факторы, инициируя эпигенетические изменения, необходимые для активации генов в процессе дифференцировки ранних прогениторов в коммитированные про-В-клетки. Несмотря на то, что изменения в модификации гистонов и структуре хроматина еще не были исследованы, вполне вероятно, что Е2А и Рах5 вносят вклад в локальное образование открытого ацетилированного хроматина путем их взаимодействия с комплексами ацетилтрансфераз гистонов (HAT) SAGA и p300/CBR (Massari et al., 1999; Bariev et al., 2003).

^{Puc. 21.6. Эпигенетическая активация гена Cd79a в раннем лимфопоэзе}

^{На схеме промотор Cd79a(mb-1, Iga) показан вместе с паттерном метилирования (me) CpG и последующим связыванием с различными факторами транскрипции в процессе перехода HSCs в коммитированные про-В-клетки (Maier et al., 2003)}

3.1. Регуляция перестроек генов рецепторов антигенов в процессе развития

Ведущий принцип в системе приобретенного иммунитета заключается в том, что каждый вновь образованный лимфоцит узнает уникальный антиген и что общее разнообразие лимфоцитов достаточно велико, чтобы нейтрализовать любой возможный антиген С этой целью, В- и Т-клетки экспрессируют специфичные для данной клеточной линии рецепторы антигенов, опосредующие зависимый от антител гуморальный или клеточный иммунитет. BCR состоит из тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) и легкой цепи (IgL) типа Ig? или Ig?. Т-клетки линии ??, составляющие у мыши и у человека большинство Т лимфоцитов, экспрессируют рецептор Т-клеток (TCR, T-cell receptor) — ?-полипептид, связанный с TCRa, тогда как функционально отличающиеся Т-клетки уб содержат на своей поверхности TCRy, спаренный с TCR5. Эти белки-рецепторы антигенов кодируются большими генными локусами, содержащими дискретные генные сегменты: V (variable), D (diversity) и J (joining), которые в процессе развития лимфоцита собираются посредством V(D)J-рекомбинации в функциональный ген. Многообразие генных сегментов D, J и особенно V, в сочетании с случайным характером их рекомбинации, отвечает за практически неограниченное разнообразие иммунного репертуара (Bassing et al., 2002).

Механика V(D)J-рекомбинации на уровне ДНК довольно проста. Все V, D и J генные сегменты фланкированы рекомбинационными сигнальными последовательностями (RSSs), которые состоят из относительно консервативных гептамерных и нонамерных элементов, разделенных спэйсерами либо из 12, либо из 23 пар нуклеотидов. Лимфоид-спепифичные белки-рекомбиназы RAG1 и RAG2 при помощи белков группы высокой мобильности собирают 12 и 23 нуклеотидные RSSs в синаптический комплекс и затем производят двухцепочечные разрывы ДНК между RSSs и кодирующими сегментами. Эти разрывы ДНК впоследствии обрабатываются и вновь связываются вездесущими факторами репарации, относящимися к механизму негомологичного соединения концов с образованием кодирующих и сигнальных соединений (Bassing et al., 2002). Простота процесса V(D)J-рекомбинации на уровне матрицы ДНК выдвигает логистические проблемы в отношении сборки различных рецепторов антигенов, потому что белки RAG экспрессируются во всех незрелых В- и Т-лимфоцитах. Следовательно, должна иметь место строгая регуляция, чтобы ограничить доступ белков RAG только к специфичным подгруппам всех субстратов рекомбинации (Yancopoulos and Alt, 1985; Stan-hope-Bakeret al., 1996).

V(D)J-рекомбинация строго контролируется специфичным для клеточной линии и стадии развития образом. В пределах В-лимфоидной линии локус IgH в про-В-клетках реорганизуется до рекомбинации генов Ig? and Ig? в пре-В-клетках, тогда как гены TCR? и TCR? перестраиваются, соответственно, в про-Т-и пре-Т-клетках. Более того, V(D)J-рекомбинация гена IgH осуществляется в определенном временном порядке с перестройками D_H-J_H, предшествующими У_н-01_н-рекомбинации Перестройки локуса TCRp в ходе развития про-Т-клетки происходят в таком же порядке (D_?-J_? перед V_?-DJ_?). Таким образом, должны существовать контрольные механизмы, чтобы защитить все гены от опосредованного RAG-расщепления в ходе D-J-рекомбинации и облегчить перестройку лишь одного из сотни генов У во время y-DJ-рекомбинации Следовательно, процесс производства рецептора антигена полностью зависит от точной регуляции доступности RSSs для действия рекомбиназы RAG S.

Успешная V-DJ-peкомбинация гена IgH или TCR? ведет к экспрессии белка Ig? или TCR? как части пре-BCR- или пре-TCR-комплекса, который работает как важная контрольная точка, чтобы ингибировать V-DJ-рекомбинацию второй DJ-реорганизованной аллели и стимулировать развитие пре-В или пре-Т-клеток, инициирующее перестройки в генах IgL или TCR?, соответственно. Наконец, экспрессия BCR или TCR, компетентных к сигналингу, полностью блокирует V(D)J-рекомбинацию с помощью транскрипционной репрессии генов RAG S в незрелых В- или Т-клетках (Jankovic et al., 2004). Сигналинг ауто реактивного BCR может, однако, возобновить перестройку гена легкой цепи иммуноглобулина, что приводит к производству BCR с новой антигенной специфичностью (редактирование рецептора; Jankovic et al., 2004). Более того, сигналинг цитокина IL-7 необходим для стимулирования рекомбинации гена TCR? в про-Т-клетках (Schlissel et al., 2000). Следовательно, V(D)J-рекомбинация контролируется не только изнутри (ядерными механизмами, специфичными к типу клеточной линии и стадии развития), но также и извне (сигналами, образуемыми на поверхности клетки). Ограничения V(D)J-рекомбинации, специфичные для данных стадии развития и локуса, в шачительной степени накладываются на эпигенетическом уровне (Krangel, 2003). В нелимфоидных клетках гены Ig и TCR присутствуют в недоступном хроматине, так как в клетках почек белки RAG, экспрессирующиеся экзогенно, без труда расщепляют субстраты рекомбинации, привнесенные с трансфецированной эписомой, но не эндогенные гены рецепторов антигена (Romanow et al., 2000). Более того, рекомбинантные белки RAG, добавленные к изолированным ядрам лимфоцитов, могут расщеплять только ген Ig или TCR, который активно подвергается V(D)J-рекомбинации на стадии развития, используемой для подготовки ядра (Stanhope-Baker et al., 1996).

Следовательно, линейная специфичность и временное упорядочение перегруппировки генов вызывается последовательным открыванием локального хроматина, что делает специфичные RSSs доступными для V(D) J-рекомбиназы. Способность хроматина как защищать RSSs, так и управлять их расщеплением, предполагает существование «хроматинового кода», который маркирует сайты рекомбинации и (или) облегчает опосредованное RAG расщепление.

Ацетилирование гистонов на лизиновых остатках является не только характерной чертой открытого хроматина, но также играет важную роль в определении доступности хроматина локусов Ig и TCR, так как оно разделяет домены рекомбинационно-компетентных сегментов генов (McMurry and Krangel, 2000; Chowdhury and Sen, 2001). Анализ состояния ацетилирования гистонов выявил ступенчатую активацию дискретных доменов хроматина в локусе IgH (Chowdhury and Sen, 2001). Перед рекомбинацией V(D)J первым гиперацетилируется геномный участок длиной 120 тыс. пар нуклеотидов, окружающий генные сегменты D_H, J_H и С. Вслед за этим перестройки D_H-J_H индуцируют ацетилирование гистонов и перестройки генов V_H, проксимальных по отношению к D_H (Chowdhury and Sen, 2001). Наконец, дистальный домен длиной 2 млн. пар нуклеотидов, содержащий большинство генов V_H, оказывается активированным сигналом IL-7 (Chowdhury and Sen, 2001). Детальный анализ локуса TCRa/b в развивающихся Т-клетках также выявил полное перекрывание участков, характеризующихся гиперацетилированием гистона H3 и доступностью для рекомбиназы V(D)J (McMurry and Krangel, 2000). Следовательно, ацетилирование гистонов оказывается существенной частью паттерна модификации хроматина, который контролирует инициацию и (или) развитие рекомбинации (Krangel, 2003).

Однако самого по себе ацетилирования недостаточно для того, чтобы облегчить рекомбинацию, поскольку ингибиторы деацетилаз гистонов имеют слабое влияние на рекомбинацию V(D)J in vivo (McBlane and Boyes, 2000). Более того, в про-В-клетках наблюдалось поражающее несоответствие между высоким уровнем ацетилирования гистона H3 и слабой рекомбинацией H3 (Hesslein et al., 2003; Suetal., 2003). Нормальные уровни ацетилирования гистонов в кластере генов V_H, дистальных по отношению к D_H, не поддерживают дистальную рекомбинацию V_M-DJ_H в про-В-клетках без метилтрансферазы гистоновых лизинов (НКМТ) Ezh2, которая триметилирует гистон H3 по лизину 27 (H3K27me3) (Su et al., 2003). Тот факт, что более высокие уровни H3K27me3 ассоциируются с дистальными, а не проксимальными генами V_H, предполагает домен-специфическую роль метилирования H3K27 в рекомбинации генов V_H (Su et al., 2003). Избирательность регуляции, осуществляемой Ezh2 для локуса IgH, подчеркивается равной эффективностью рекомбинации гена TCRp у дикого типа и у дефицитных по Ezh2 про-Т-клеток (Su et al., 2005). Следовательно, дополнительные модификации хроматина, вероятно, участвуют в контроле V(D)J-рекомбинации проксимальных генов V_hb про-В-клетках и TCRp-перестроек в про-Т-клетках. Диметилирование гистона H3 по лизину 4 (H3K4me2) — это активная гистоновая метка, которая также коррелирует с доступным состоянием сегментов генов IgH и TCRft (Morshead et al., 2003). Напротив, диметилирование H3 по лизину 9 (H3K9me2) — это репрессивная хроматиновая метка, которая обнаруживает отрицательную корреляцию с V(D)J — рекомбинацией сегментов генов IgH и TCRp (Morshead et al., 2003). Важная роль H3K9me2 в подавлении рекомбинации была недавно продемонстрирована путем таргетинга H3K9 НКМТ G9a на PDp 1 — промотор зародышевой линии (минилокус TCRp), что предотвратило перестройки V(D)J посредством перевода локального хроматина в недоступное состояние (Osipovich et al., 2004).

Паттерн модификации гистонов, облегчающий доступ V(D)J-рекомбиназе, должен быть установлен с помощью процессов, которые происходят в пределах локусов рецептора антигена до перестройки. Прежде чем картирование модификаций гистонов стало экспериментально осуществимым, уже было известно, что в зародышевой линии транскрипция короткой смысловой РНК с сегмента неперестроенного гена предшествует рекомбинации V(D)J (Yancopoulos and Alt, 1985). Возможная роль транскрипции в контролировании доступности локуса была в дальнейшем подтверждена рядом открытий, демонстрирующим, что энхансеры и промоторы, расположенные в пределах локусов рецептора антигена, необходимы для того, чтобы осуществилась рекомбинация V(D)J. Делеция эндогенных энхансеров и промоторов уменьшает или аннулирует рекомбинацию V(D) J локусов рецептора антигена, тогда как вставка дополнительных энхансеров, специфичных для линии, ведет к новому паттерну рекомбинации V(D)J (Bassing et al., 2002; Krangel, 2003). Многочисленные промоторы, ассоциированные с сегментами V, D и J, контролируют перестройки последовательностей, проксимальных по отношению к промотору, в пределах относительно коротких расстояний, тогда как энхансеры приводят в действие контроль над рекомбинацией V(D)J на больших расстояниях (Bassing et al., 2002; Krangel, 2003). Сборка на промоторе комплекса пре-инициации может локально разрушить нуклеосомы и таким образом облегчить доступ ферментам рекомбинации, даже в отсутствие изменений в модификации гистонов. Более вероятно, однако, что промоторы активно принимают участие в установлении хроматиновой структуры, разрешающей рекомбинацию, так как элонгирующий комплекс РНК-полимеразы 11 несет свою собственную гистоновую ацетилтрансферазу, которая может способствовать распространению ацетилирования гистонов вдоль транскрибируемых участков (Orphanides and Reinberg, 2000). Транскрипция генов также приводит к локальному обмену зависимого от репликации гистона H3 на замещающий его вариант H3.З, который предположительно поддерживает доступное состояние хроматина транскрибируемых участков (Chow et al., 2005; Mito et al., 2005).

Как было упомянуто выше, каждый локус рецептора антигена содержит сотни RSSs, хотя лишь немногие из них будут расщеплены в индивидуальном лимфоците на определенной стадии развития. Таким образом, потенциально возможно, что вариации в последовательности нуклеотидов ДНК индивидуальных сайтов RSS также могут вносить свой вклад в эффективность их расшепления. Анализ искусственных субстратов V(D)J-рекомбинации в самом деле продемонстрировал, что встречающиеся в естественных условиях различия в элементах гептамера и нонамера RSS, так же как и в менее консервативном спэйсере и во фланкирующих кодирующих последовательностях, влияют на частоту рекомбинации и таким образом вносят свой вклад в дифференциальное использование конкретных — V, D и J-сегментов гена в первичном ассортименте рецептора антигена (Lee et al., 2003). В рамках модели «гистонового кода» избирательность расщепления должна определяться процессом, который транслировал бы уникальные свойства индивидуальных RSS или соседних последовательностей в специфический паттерн модификации гистонов, маркирующий сайт для растепления, осуществляемого RAG. Этот код может быть установлен с помощью антисмысловых транскриптов. Конечно, антисмысловая межгенная транскрипция по всему кластеру гена V_H предваряет рекомбинацию V_H-DJ_H локуса IgH в про-В-клетках (Bolland et al., 2004). Эти длинные антисмысловые транскрипты могут направлять ремоделинг хроматина таким образом, чтобы открыть большой домен гена V_H перед рекомбинацией. В качестве альтернативы эти антисмысловые транскрипты могли бы сформировать двухцепочечные гибриды РНК с короткими смысловыми транскриптами V_H зародышевой линии и затем быть подвергнутыми процессингу с помощью механизма РНК-интерференции, чтобы произвести микроРНК, которые рекрутируют HKMTs к сайтам рекомбинации (Bolland et al., 2004, см. о деталях аппарата RNAi в главе 8). В развитие этой гипотезы мы допускаем, что специфическая смысловая транскрипция определенного сайта RSS зародышевой линии может генерировать двухцепочечную РНК. которая могла бы «нацеливать» ферменты, модифицирующие гистоны, на эту, но не на все другие последовательности RSS. Если это будет подтверждено экспериментально, данный гипотетический механизм мог бы объяснить точность и избирательность расщепления индивидуальных сайтов RSS, осуществляемое RAG. Интересно, что недавно было показано, что белок RAG2 непосредственно взаимодействует с гистонами и может, таким образом, играть важную роль в считывании специфического паттерна модификации гистонов на индивидуальных последовательностях нуклеотидов RSS (West et al., 2005).

3.2. Субъядерное перемещение генов иммуноглобулинов

Периферическое пространство ядра и перицентромерный гетерохроматин — это два главных репрессивных компартмента в ядре, которые важны для воспроизведения и для неактивного состояния генов в гематопоэтических клетках (Brown et al., 1997; Baxter et al., 2002). В зависимости от степени своей активности, гены перемещаются между этими репрессивными компартментами и центральными позициями в ядре, что облегчает транскрипцию генов. Интересно, что локусы IgHw Ig? «по умолчанию» расположены на периферии ядра во всех не-В клетках, включая некоммитированные лимфоидные прогениторы (Kosak et al., 2002). Таким образом, локус IgH заякорен через дистальные гены V_H на периферии ядра и сориентирован проксимальным доменом IgH по направлению к центру ядра, что облегчает перестройки D_H-J_H в лимфоидных прогениторах (Fuxa et al., 2004). Начальный этап активации локуса IgH состоит из перемещения локусов IgH и Ig? с периферии ядра в более центральную позицию внутри ядра в начале развития В-клеток (Kosak et al., 2002). Эта субъядерная передислокация, по-видимому, облегчает открывание хроматина и транскрипцию, характерную для зародышевой линии, ведущих к проксимальным перестройкам V_H-DJ_H. Косвенные доказательства предполагают, что EBF1 и Рах5 играют определенную роль в центральном перемешении локусов IgH и Ig?, соответственно (Fuxa et al., 2004; Sato et al., 2004).

Хотя в про-В-клетках обе аллели локусов IgH и Ig? перемещаются в центральные позиции ядра (Kosak et al., 2002; Fuxa et al., 2004) совместно, эти две аллели ведут себя по-разному после успешной рекомбинации V(D)J в зрелых В-клетках (Skok et al., 2001). Вслед за активацией В-клеток продуктивно реорганизованные аллели Ig остаются расположенными вдали от центромерных кластеров, усиливая, таким образом, их экспрессию (Skok et al., 2001). В то же время нефункциональные аллели IgH и Ig? после активации В-клеток перемещены в центромерный хроматин и таким образом засайленсированы там. Интересно, что центромерное рекрутирование нефункциональных локусов IgH и Ig? происходит через дистальный участок их гена V, что предполагает, что те же самые последовательности ДНК участвуют в рекрутировании «молчащих» локусов Ig либо на периферию ядра, либо в центромерный гетерохроматин (Roldan et al., 2005).

3.3. Сокращение локуса генов иммуноглобулина

Приблизительно 200 генов V_H локуса IgH распространены по участку длиной более 2,4 миллионов пар нуклеотидов и могут быть разделены на 15 дистальных, центральных или проксимальных семейств генов V_H в соответствии со сходством их последовательности и позицией относительно проксимальных сегментов D_H. В не-В-лимфоидных клетках и лимфоидных прогениторах две аллели IgH присутствуют в удлиненной конформации на периферии ядра (Kosak et al., 2002). Напротив, в коммитированных про-В-клетках локус IgH подвергается сокращению, что сближает дистальные гены V_H с перестроенным проксимальным доменом DJ_H, облегчая таким образом перестройки V_H-DJ_H (рис. 21.7) (Kosak et al., 2002; Fuxa et al., 2004).

Локус Ig? с его примерно 140 генами V_K также растягивается по участку длиной более 3 млн. о. и, таким образом, является таким же большим, как локус IgH. Так же, как и ген IgH в про-В-клетках, локус Ig? подвергается сокращению в малых пре-В- и незрелых В-клетках, демонстрируя, что оба локуса Ig в перестраивающихся клетках находятся в состоянии сокращения (Roldan et al., 2005). Более того, анализ с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с зондами к дистальным, центральным и проксимальным генам показал, что выпетливание отдельных субдоменов Ig отвечает за протяженное сокращение локусов IgH и Ig? (рис. 21.7) (Roldan et al., 2005).

Дистальные перестройки V_H-DJ_H не имеют места в про-В-клетках Рах5^! (Nutt et al., 1997), несмотря на тот факт, что в гиперацетилированном состоянии хроматина гены V_H доступны на всем протяжении кластера генов V_H, включая наиболее дистальное семейство V_HJ558 (Hessleinetal., 2003). Отсутствие перестроек дистального V_H — D J коррелирует с отсутствием сокращения локуса IgH (рис. 21.7), которое, однако, может быть восстановлено посредством экспрессии ретровирусного Рах5 в про-В-клетках Рах5^-/- (Fuxa et al., 2004). Следовательно, Рах5 — это ключевой регулятор сокращения локуса IgH в про-В-клетках. Метилтрансфераза гистонов Ezh2 предположительно также участвует в сокращении локуса IgH, так как условная активация Ezh2 в HSCs приводит к редукции дистальных перестроек V_H- DJ_H, несмотря на полную доступность хроматина дистальных генов V_H в про-В-клетках, дефектных по Ezh2 (Su et al., 2003). Интересно, что между Рах5 and Ezh2 не имеется генетической связи, несмотря на сходный фенотип IgH-перестройки соответствующих мутантных про-В-клеток (Fuxa et al., 2004). Поэтому, возможно, что Рах5 функционирует как сиквенс-специфичный фактор «нацеливания», чтобы рекрутировать Ezh2-содержащий репрессивный комплекс Polycomb 2 (PRC2) к избранным участкам на локусе IgH. Возникающее метилирование локального хроматина в гистоне H3 на лизине 27 (H3K27me3) может привлекать комплекс PRC1, чтобы индуцировать сжатие хроматина целевых участков (Francis et al., 2004; обсуждается в главе 11), приводя, таким образом, к выпетливанию и к сокращению локуса IgH. В качестве альтернативы сокращение локуса может не зависеть от модификации гистонов в ядре, но предпочтительнее требует метилирования лизина сигнальных белков цитоплазматическим Ezh2-содержащим метилтрансферазным комплексом, про который известно, что он регулирует полимеризацию актина путем присоединения к фактору обмена GTP/GDP, Vavl, (Su et al., 2005).

3.4. Контроль аллельного исключения в локусах IgH и Ig?

Аллельное исключение обеспечивает продуктивную перестройку только одной из двух аллелей Ig, что приводит в В-клетках к экспрессии одиночной молекулы антитела с уникальной антигенной специфичностью.

Процесс аллельного исключения может быть разделен на два отдельных этапа. В течение фазы инициации одна из двух аллелей Ig выбирается посредством дифференциального эпигенетического маркирования, чтобы быть реорганизованной в первую очередь, что препятствует одновременной рекомбинации в двух аллелях. Экспрессия продуктивно реорганизованной аллели впоследствии предотвращает рекомбинацию во второй аллели посредством ингибирования по типу обратной связи, таким образом поддерживая аллельное исключение. Процесс аллельного исключения уже инициирован на ранних стадиях развития во время имплантации, когда две аллели гена рецептора антигена начинают асинхронно реплицироваться в каждой клетке. Отцовский или материнский ген Ig, который стохастически выбирается для ранней репликации посредством пока не известной хромосомной метки, почти всегда представляет собой ту первую аллель, которая претерпевает перестройки в незрелых В-лимфоцитах (Mostoslavsky et al., 2001). Вторая V_н-DJ_н-реорганизация локуса IgH является, таким образом, регулируемым этапом, так как D_H-J_H-рекомбинация осуществляется в обеих аллелях IgH в процессе развития про-В-клеток (Bassing et al., 2002). Однако пока так ничего и неизвестно про то, как эта аллель-специфичная эпигенетическая метка, установленная на ранних стадиях развития зародыша, транслируется в последовательную активацию V_н-DJ_н-рекомбинации на двух аллелях IgH.

Успешная перестройка одной аллели IgH ведет к экспрессии на поверхности клеток белка Ig? как части рецептора пре-В-клетки. Этот рецептор функционирует как важная контрольная точка, чтобы просигналить относительно пролиферативной экспансии больших пре-В-клеток, индуцировать последующую дифференцировку в малые пре-В-клетки и поддержать аллельное исключение в аллели IgH, реорганизованной по типу DJ_H (Kitamura and Rajewsky, 1992; Bassing et al., 2002). Экспрессия белка RAG быстро утрачивается под воздействием сигнала пре-BCR (рис. 21.8), который останавливает всю дальнейшую рекомбинацию V(D)J и подготавливает почву для установки аллельного исключения в больших пре-В-клетках (Grawunder et al., 1995). Сигнал пре-BCR также ведет к деацетилированию гистонов и, таким образом, к пониженной доступности генов V_H в малых пре-В-клетках, что может быть механизмом обратной связи, лежащим в основе аллельного исключения (Chowdhury and Sen, 2003). Однако более правдоподобный механизм осуществляется быстрой реверсией сокращения локуса IgH в ответ на сигнал пре-BCR, что физйчески отделяет гены V_H от проксимального домена IgH (рис. 21.8), предотвращая, таким образом, перестройку типа V_H-DJ_H на второй аллели IgH, реорганизованной по типу DT_H (Roldan et al., 2005).

^{Рис. 21.7. Сокращение локуса тяжелой цепи иммуноглобулина в про-В-клетках}

^{Локус IgH состоит из проксимального домена, содержащего следующие генные сегменты: разнообразия (diversity, D), соединительные (joining, J) и константные (constant, С), а также большой кластер вариабельных (variable, V) генов с ~200 генами V, расположенными на участке длиной более 2,4 млн. о. Локус IgH находится в растянутой конфигурации в про-В-клетках Pax5-/- или Ezh2-/-, что позволяет V(0)1-рекомбинации осуществиться только в проксимальном домене. В про-В-клетках дикого типа все гены VН участвуют в перестройках VН-DH благодаря сокращению локуса IgH путем выпетливания}

Более того, пре-BCR сигнал ведет к быстрому перемещению нефункционирующей аллели IgH к репрессивным центромерным доменам (Roldan et al., 2005). Следовательно, утрата сокращения локуса и центромерное рекрутирование изменяют реорганизованную по типу DJ_H аллель IgH во время образования свободного от RAG окна пре-В-сигнала таким образом, что она не может более подвергаться перестройкам типа V_H-DJ_H после последующей реэкспрессии белков RAG в малых пре-В-клетках (рис. 21.8).

^{Рис. 21.8. Аллельное исключение путем устранения сокращения локуса IgH в пре-В-клетках}

^{В ранних про-В-клетках реорганизации типа DH-JH происходят одновременно в обеих аллелях IgH, тогда как в поздних про-В-клетках только одна аллель в это время подвергается рекомбинации по типу VH-DJH. Ядра рассортированных про-В- и пре-В-клеток были проанализированы трехмерным DNA-FISH с флуоресцентными зондами из дистального (красный) и проксимального (зеленый) участков локуса IgH. Две аллели IgH одной и той же клетки показаны на двух репрезентативных конфокальных срезах. Пре-BCR сигнал приводит не только к быстрой потере белка RAG, но и к устранению сокращения локуса IgH. Хотя обе аллели не находятся в состоянии сокращения, локус IgH полностью растянут только в случае не окончательно DJH-перестроенной аллели. Эти два сигнала функционально перестроенной аллели (VDJ+) разделены более коротким расстоянием благодаря делеиии внедренной последовательности ДНК. Данные по FISH взяты из Roldan et al. (2005)}

Инициация аллельного исключения в локусе Ig? изучалась, в значительной степени, посредством исследования паттерна метилирования ДНК с помощью рестрикционных ферментов, чувствительных к метилу (Mostoslavsky et al., 1998; Goldmit et al., 2002;, 2005), и, наряду с этим, посредством анализа гетерозиготных по репортеру ?°-GFP мышей, содержащих вставку гена GFP в элементе J_?1 эндогенного локуса Ig? (Liang et al., 2004). Локус Ig? сильно метилирован в динуклеотидах CpG во всех не-В и про-В-клетках, но становится специфически деметилирован только на одной аллели в пре-В-клетках (рис. 21.9) (Mostoslavsky et al., 1998; Liang et al., 2004). Это моноаллельное деметилирование предваряет перестройку и зависит от активности как интронных, так и 3’ к — энхансеров (Mostoslavsky et al., 1998). Эта деметилированная аллель находится в доступном хроматине, так как он чувствителен к ДНКазе I, гиперацетилирован по гистонам H3 и Н4 и расположен в пре-В-клетках вдали от центромерного хроматина (рис. 21.9) (Goldmit et al., 2002, 2005). Как следствие, только неметилированная аллель Ig? инициирует транскрипцию зародышевой линии и перестройки типа V_?-J_? (Goldmit et al., 2002; Liang et al., 2004), тогда как в малых пре-В-клетках обе аллели подвергаются сокращению локуса (рис. 21.9) (Roldan et al., 2005). На удивление, в пре-В-клетках вторая аллель Ig? перемещается в центромерный гетерохроматин (Goldmit et al., 2005), аналогично локусу IgH (Roldan et al., 2005).

Это моноаллельное центромерное рекрутирование (рис. 21.9) может объяснить, почему для аллели с метилированной ДНК характерно пониженное ацетилирование гистонов и почему она связана с белками НР1у и Ikaros, которыми наряду с комлексами деацетилазы гистонов обогащен центромерный хроматин (Goldmit et al., 2005). Интересно, что именно поздно реплицирующаяся аллель Ig? перемещается в центромерные кластеры (Goldmit et al., 2005) в соответствии с тем, что паттерн асинхронной репликации, уже установленный на ранних стадиях развития эмбриона, коррелирует с моноаллельной инициацией перестроек Ig? в пре-В-клетках (Mostoslavsky et al., 2001). Удивительно, что только очень малая доля (5 %) всех пре-В-клеток подвергается активации локуса Ig? у мышей ?°-GFP (Liang et al., 2004).

^{Рис. 21.9. Механизмы, контролирующие аллельное исключение в локусе Ig?}

^{В пре-В-клетках субъядерное перемещение, деметилирование ДНК и ацетилирование гистонов вносят свой вклад в выбор одной аллели Ig? для VK-JK-рекомбинации. Для детального объяснения см. текст. Обозначены: дистальный участок VK (красный) и проксимальный домен JK-CK (зеленый) локуса IgK, и их расположение относительно репрессивного компартментов на периферии ядра (серый) и центромерным хроматином (синий). У этих двух аллелей состояния сокращения локуса, метилирования ДНК (me) и ацетилирования гистонов (ас) схематично показаны для разных стадий развития, включая активированные зрелые В-клетки}

На основании этого результата была выдвинута гипотеза, что в пре-В-клетках определенные транскрипционные факторы, присоединяющиеся к cis-регуляторным элементам локуса Ig?, присутствуют в лимитирующих количествах и что совместное присоединение таких факторов к энхансерам Ig? является редким событием, происходящим стохастически только в одной аллели. Следовательно, стохастическая активация энхансера посредством аллельной конкуренции за лимитирующие транскрипционные факторы может внести свой вклад в аллельное исключение в локусе Ig? (Liang et al., 2004). Успешная перестройка одной аллели Ig? ведет к экспрессии BCR на поверхности клетки, которая впоследствии поддерживает аллельное исключение во второй аллели Ig? посредством подавления экспрессии рекомбиназы RAG 1/2 (Jankovic et al.. 2004).

4.1. Дифференцировка плазматических клеток

Завершение рекомбинации V(D) J и экспрессия рецептора иммуноглобулина (Ig) на поверхности В-клетки маркируют конец антиген-независимой фазы В-лимфопоэза. Начиная с этой точки отсчета, судьба В-клеток начинает зависеть от сигнала рецептора, индуцированного антигеном (Rajewsky, 1996). В отсутствие антигена периферические В-клетки поддерживаются в покоящемся состоянии, где их выживание обеспечивается тонизирующими сигналами с BCR клеточной поверхности (Kraus et al., 2004). Сравнение организации хроматина в покоящихся и активированных В-клетках показывает, что покой В-клеток характеризуется низкими уровнями общего метилирования гистонов (Baxter et al., 2004). Относительно высокие уровни ацетилирования гистонов в покоящихся В-клетках остаются стабильными в процессе активации клеток (Baxter et al., 2004). Общее снижение метилирования лизинов гистонов, включая возможное отсутствие метилирования гистона H3K9, коррелирует с отсутствием других признаков конститутивного хроматина, таких как ассоциация Ikaros и связывание НР1 в покоящихся В-клетках (Baxter et al., 2004). Активация В-клеток восстанавливает метилирование гистонов, которое приводит к увеличению активной метки H3K4me3 на генах, требующихся для функционирования В-клетки (Рах5), и к одновременному повышению репрессивной модификации H3K9me2 на «молчащих» генах (Dntt) (Baxter et al., 2004). Реорганизация хроматина, индуцированная активацией, может поддерживать идентичность В-клетки в течение иммунного ответа. Однако геном В-клетки должен оставаться подверженным перепрограммированию, вызванному антигеном, так как активированные В-клетки после первой встречи с антигеном способны дифференцироваться прямо в плазматические клетки, продуцирующие антитела (Calame et al., 2003).

Как альтернатива, антигенная стимуляция может инициировать реакцию зародышевого центра. В процессе этой реакции зрелые IgM^low IgD^hlgh В-клетки включают свои иммуноглобулиновые изотипы и производят мутации в своих генах Ig с помощью цитидиндеаминазы, индуцированной активированием (AID; Honjo et al., 2004). Белки Ig, возникшие в результате этих процессов, идеально подходят для дифференцировки и поддержки В-клеток памяти, или для развития плазматических клеток, которые продуцируют антитела с высоким сродством к определенному антигену (Honjo et al., 2004). Время реакций зародышевого центра и превращение В-клеток в плазматические клетки регулируются двумя взаимоисключающими репрессорами транскрипции — Вс16 и Blimp 1 (рис. 21.10) (Turner et al., 1994; Ye et al., 1997). Bcl6 экспрессируется на низком уровне в зрелых наивных В-клетках, но быстро ап-регулируется в некоторых В-клетках после антигенной стимуляции (Fukuda et al., 1997). Клетки, которые не ап-регулируют Вс16, после встречи с антигеном дифференцируются в плазматические клетки, которые служат начальным источником антител с низкой аффинностью (Fukuda et aL, 1997).

Наоборот, В-клетки, которые ап-регулируют Вс16, входят в реакцию зародышевого центра (Fukuda et al., 1997) и поддерживаются как В-клетки за счет Вс16-опосредованной репрессии генов, которые контролируют дифференцировку плазматических клеток (Shaffer et al., 2000). Одной из ключевых мишеней Вс16 является ген Prdm1, кодирующий транскрипционный фактор Blimp1 (рис. 21.10). Интересно, что, оказывается, Рах5 помогает Вс16 в репрессии гена Blimp1 (Prdm1) (рис. 21.10) (Delogu et al., 2006). Однако, начав однажды экспрессироваться, Blimp 1 аннулирует транскрипционную программу В-клеток, включая экспрессию Вс16 и Рах5, и одновременно вызывает транскрипцию генов, специфичных для плазматических клеток (Shaffer et al., 2002; Calame et al., 2003). Bcl6 и Blimp 1 используют широкий арсенал репрессивных механизмов для инактивации транскрипции генов. Один характерный аспект Вс16 — это использование ацетилирования лизина за рамками модификации гистонов, чтобы контролировать репрессию генов (Bereshchenko et al., 2002). Вс16 взаимодействует с МТАЗ, субъединицей корепрессорного комплекса Mi-2/NuRD, который в высокой степени экспрессируется в В-клетках зародышевого центра (Fujita et al., 2004). Ассоциация Вс16 с комплексом Mi-2/ NuRD, содержащим МТАЗ, необходима для репрессии гена, так как истощение МТАЗ, опосредованное RNAi, ведет к реактивации репрессированных Вс16 генов-мишеней в В-клетках (Fujita et al., 2004). Функция репрессии комплекса Вс16/МТАЗ/ Mi-2/NuRD зависит от статуса ацетилирования остатков лизина как в Вс16, так и в гистонах, связанных с локусом репрессированного гена. Для осуществления взаимодействия центрального домена Вс16 с МТАЗ он должен быть деацетилирован, тогда как репрессия гена посредством комплекса МТАЗ/ Mi-2/NuRD зависит от деацетилаз гистонов HDAC1 и HDAC2 класса I (Fujita et al., 2004).

^{Рис. 21.10. Транскрипционная репрессия определяет судьбу В-клеток зародышевого центра и плазматических клеток}

^{Рах5 и Вс16 (вместе с МТАЗ) регулируют программу экспрессии генов В-клеток и поддерживают судьбу В-клеток зародышевого центра (GC) посредством транскрипционной репрессии Blimp 1 — регулятора плазматических клеток. Сильный сигнал BCR в конце развития В-клеток GC ведет к деградации белка Вс16 и сопровождающей ее экспрессии Blimp 1, которая впоследствии репрессирует Вс16 и Рах5 и вместе с ХВР1 индуцирует программу транскрипции, характерную для плазматических клеток. Наиболее вероятно, что Blimp1 активирует экспрессию ХВР1 косвенно как часть реакции на развернутый белок, посредством индукции экспрессии секретируемых иммуноглобулинов. Детальное описание см. в тексте}

Вс16 далее связывается через свой амино-концевой домен POZ с тремя корепрессорами SMRT, NCoR и BCoR взаимоисключающим образом (Huynh and Bardwell, 1998; Huynh et al., 2000). Эти три корепрессора, которые дополнительно взаимодействуют с ферментом класса II — HDAC3 (Huynh et al., 2000), могут усиливать репрессию, опосредованную МТАЗ, тех же генов, служащих мишенями для Вс16, или сайленсировать другой набор генов в В-клетках зародышевого центра. Антигенная стимуляция высокоаффинных рецепторов Ig на В-клетках зародышевого центра сопровождается редукцией уровня белка Вс16. Активация рецептора, таким образом, ведет к фосфорилированию Вс16, индуцированному МАР-киназой, которое включает быструю деградацию белка Вс16 по убиквитин-протеосомному пути (Niu et al., 1998).

Падение уровня Вс16 смягчает репрессию гена Prdm1l, что приводит к увеличению экспрессии белка Blimp 1 и последующему развитию в плазматические клетки (рис. 21.10) (Shaffer et al., 2000; Calame et al., 2003). Blimp 1 контролирует множество аспектов дифференцировки плазматических клеток. Во-первых, Blimp 1 нацеливает глубинную транскрипционную программу дифференцировки В-клеток с помощью репрессирующего Рах5 (рис. 10) (Shaffer et al., 2002), который необходим для поддержания функции и идентичности В-клеток (Horcher et al., 2001; Mikkola et al., 2002). Во-вторых, с помощью даун-регуляции экспрессии других транскрипционных факторов (таких как Spi-B, EBF1, СИТА, Id3, Oct2, и OBF1) Blimp 1 косвенно заканчивает транскрипцию генов, которые кодируют белки, необходимые для сигналинга с рецептора антигена и для презентации антигена (Shaffer et al., 2002). В-третьих, чтобы обеспечить покоящееся состояние плазматических клеток, Blimp 1 напрямую репрессирует транскрипцию с-тус (Shaffer et al., 2002). В-четвертых, гены, несоответствующие линии, зарепрессированные в В-клетках при помоши Рах5, реактивируются после того, как в плазматических клетках произошла опосредованная Blimp 1 даун-регуляция экспрессии Рах5 (Delogu et al.,2006). Следовательно, подавляя остальные репрессоры, Blimp 1 может косвенно активировать экспрессию дополнительных генов с важными для плазматических клеток функциями. В-пятых, Blimp1 необходим для экспрессии секретируемых иммуноглобулинов (Calame et al., 2003), которые накапливаются в эндоплазматическом ретикулуме, активируя тем самым экспрессию ХВР1, как часть реакции на развернутый белок. Транскрипционный фактор ХВР1 регулирует секрецию антител, и, таким образом, он важен для дифференцировки плазматических клеток (Reimold et al., 2001; Shaffer et al., 2004).

Интересно, что Blimp 1 также является ключевым детерминантом спецификации примордиальных зародышевых клеток на ранних стадиях эмбриогенеза, как это обсуждается в главе 20. Механизм Blimp 1-опосредованной репрессии в развивающихся примордиальных зародышевых и плазматических клетках в основном неясен. Похоже, однако, что Blimp 1 использует в плазматических клетках те же принципы репрессии, что и в фибробластах, где PRDI-BF1, человеческий ортолог мышиного Blimp 1, участвует в постиндукционной репрессии гена p-интерферона (IFNB1) во время вирусной инфекции (Keller and Maniatis, 1991). Несколько механизмов отвечают за репрессию гена IFNB1, опосредованную PRDI-BF1. Присоединение PRDI-BF1 способно переместить активаторы транскрипции с промотора IFNB1(Keller and Maniatis, 1991). Кроме того, PRDI-BF1 взаимодействует с корепрессорами белкового семейства Groucho, которое использует деацетилазы гистонов как часть своего репрессионного механизма (Ren et al., 1999). Дальнейший сайленсинг достигается через ассоциацию PRDI-BF1 с белком G9a (Gyory et al., 2004), который принадлежит подсемейству метилтрансфераз гистонов со специфичностью к лизину 9 гистона H3 (Tachibana et al., 2002). В отличие от Suv39hl, который использует H3K9me3 для построения транскипционно репрессивной среды в центромерном гетерохроматине (Peters et al., 2001), G9a вносит свой вклад в H3K9me2 и генный сайленсинг в эухроматиновых участках (Tachibana et al., 2002). Каталитическая активность G9a требуется для подавления функции PRDI-BF1, так как каталитически неактивный белок G9a аннулирует ингибирующее влияние PRDI-BF1 на транскрипцию IFNB1 (Gyory et al., 2004). Далее делеция домена, взаимодействующего с G9a, предотвращает метилирование H3K9 и транскрипционный сайленсинг посредством PRDI-BF1 (Gyory et al., 2004). В свете этих данных вероятно, что метилирование гистонов, опосредованное G9a, является необходимым механизмом, с помощью которого Blimp 1 генерирует стабильный паттерн экспрессии генов в плазматических клетках. Интересно, что белок Blimp 1 также содержит домен SET подсемейства PR (RIZ). Предположили, что домен SET родственного белка RIZ1 (Prdm2) участвует в супрессии опухоли и метилировании гистона H3 по лизину 9 (Kim et al., 2003). Следовательно, остается проверить, вносит ли также домен SET белка Blimp 1 свой вклад в репрессию гена в процессе дифференцировки плазматических клеток.

4.2. Пластичность зрелых В-клеток в процессе развития

Возникновение плазматических клеток обычно считается конечной стадией развития В-клетки, так как экспрессия генов иммуноглобулина — это необходимая функция как В-клеток, так и плазматических клеток. Интересно, что в клетках обоих типов гены иммуноглобулина экспрессируются под комбинированным контролем убиквитных, а не В-лимфоидных транскрипционных факторов. Однако, помимо генов иммуноглобулина, В-клетки и плазматические клетки радикально различаются по своим паттернам генной экспрессии (Shaffer et al., 2002, 2004). Что касается функции Рах5, плазматические клетки даже как бы дают «задний ход», так как специфический для плазматических клеток сайленсинг экспрессии Рах5 ведет к реактивации генов, нехарактерных для В-линии, которые в норме репрессированы при помощи Рах5 в начале развития В-клеток (Delogu et al., 2006). Эти данные по генной экспрессии поддерживают, таким образом, альтернативный взгляд, что дифференцировка В-клеток, простимулированных антигеном, в плазматические клетки — это действительно «линейный» переключатель. Эта гипотеза предсказывает, что потенциал развития зрелой В-клетки не должен быть ограничен судьбой В-лимфоцита, но должен быть более пластичным, что подтверждается следующими данными.

Эктопическая экспрессия транскрипционного фактора Вс16 В-клетки и его корепрессора МТАЗ в установившихся линиях плазматических клеток ведет к репрессии генов, специфических для плазматических клеток, в том числе регуляторных генов Blimp1 и ХВР1 (Fujita et al., 2004). В то же время реактивируются множественные гены, специфичные для В-клеток, включая гены-мишени для Рах5 (СИТА and BLNK). и сам ген Рах5(Fujita et al., 2004). Следовательно, белка Вс16 и его партнера — белка МТАЗ достаточно, чтобы перепрограммировать плазматические клетки в клетки с судьбой В-клеток, по меньшей мере в проанализированных условиях культивирования in vitro (рис. 21.11).

Транскрипционный фактор С/Е В Ра, который необходим для развития гранулоцитов, экспрессируется исключительно в миелоидных прогениторах и их дифференцированных потомках (Akashi et al., 2000). Принудительная экспрессия С/ЕВРа в В-лимфоцитах из костного мозга или селезенки ведет к эффективной трансдифференцировке инфицированных В-клеток в функциональные макрофаги в течение 5 дней (Xie et al., 2004). Таким образом, С/ЕВРа активирует миелоидную генную программу и параллельно репрессирует гены, специфичные для В-клеток, интерферируя с транскрипционной активностью Рах5 (Xie et al., 2004). Следовательно, потеря функции Рах5, по-видимому, облегчает превращение В-клеток, присущее миелоидной клеточной линии в ответ на эктопическую экспрессию С/ЕВРа (рис. 21.11).

Условная инактивация гена однозначно указывает на решающую роль Рах5 в контроле идентичности В-клеток в процессе В-лимфопоэза. Cre-опосредованная генная делеция в коммитированных про-В-клетках показывает, что Рах5 необходим не только для того, чтобы инициировать свою В-лимфоидную программу транскрипции, но и для поддержания ее на ранних этапах развития В-клетки (Mikkola et al., 2002). Как следствие инактивации Рах5, ранее коммитированые про-В-клетки восстанавливают способность дифференцироваться в макрофаги in vitro и возрождать развитие Т-клеток in vivo (рис. 21.11) (Mikkola et al., 2002). Условная) делеция Рах5 в зрелых В-клетках также ведет к утрате Рах5-зависимой программы экспрессии гена (Horcher et al., 2001; Delogu et al., 2006). Однако более удивительно то, что зрелые В-клетки с делецией Рах5 все время ретродифференцируются in vivo в мутантные по Рах5 прогениторы после того, как их инъецируют в мышей, дефектных по RAG2. Эти мутантные по Рах5 прогениторы возвращаются в костный мозг, из которого они заселяют тимус и полностью восстанавливают развитие Т-клеток в RAG2-дефицитном хозяине (рис. 21.11)

^{Рис. 21.11. Пластичность В-лимфоцитов на разных этапах развития}

^{Эктопическая экспрессия Вс16 и МТАЗ в установившихся линиях клеток плазмы сайленсирует транскрипцию генов, специфических для плазматических клеток, и одновременно реактивирует программу экспрессии В-клеток (оранжевая стрелка) (Fujita et al., 2004). CD19+ В лимфоциты, которые не были далее охарактеризованы относительно их стадии развития, подвергаются стремительной трансдифференцировке в макрофаги in vitro в ответ на принудительную экспрессию С/ЕВРа (красная стрелка) (Xie et al., 2004). Условная делеция Рах5 позволяет коммитированным про-В-клеткам и даже зрелым В-клеткам ретродифференцироваться in vivo в некоммитированные прогениторы, которые затем развиваются в остальные типы гематопоэтических клеток в костном мозге или в Т-клетки в тимусе (черные стрелки) (Mikkola et al., 2002; С. Cobaleda и М. Busslinger, неопубликованные данные). Синий цвет означает экспрессию Рах5 во время развития В-клетки}

Тот факт, что соответствующие дважды-позитивные тимоциты CD4⁺CD8⁺ несут IgH и Ig? и перестройки TCRa and TCRfi, однозначно демонстрирует, что зрелые В-клетки после потери Рах5 могут быть превращены в Т-клетки через ретродифференцировку в стадию некоммитированной клетки-прогенитора (С. Cobaleda and М. Busslinger, неопубл.). Следовательно, экспрессия Рах5 постоянно требуется для поддержания идентичности В-лимфоцитов от стадии про-В-клетки до стадии зрелой В-клетки. На основании анализа других систем развития у мух и позвоночных животных, предполагается, что транскрипционные факторы инициируют «решение» о той или иной судьбе клетки посредством изменения паттернов экспрессии генов, тогда как транскрипционное состояние коммитированных клеток впоследствии поддерживается эпигенетическими факторами, кодируемыми группами генов Polycomb и Trithorax (Ringrose and Раю, 2004; обсуждается подробнее в главах 11 и 12). Постоянная потребность в транскрипционном факторе Рах5 могла бы свидетельствовать против важной роли этих систем эпигенетической памяти в развитии В-клеток. Однако более вероятно, что Рах5 может поддерживать идентичность В-клеток, выступая ключевым фактором рекрутирования, чтобы нацелить белковые комплексы Polycomb или Trithorax на регуляторные элементы генов.