Эпигенетика

Многочисленные «решения» о ходе развития [developmental decisions] — включая детерминацию судьбы клеток — принимаются в ответ на временную позиционную информацию в раннем эмбрионе. Эти решения зависят от изменений в экспрессии генов. Это дает возможность клеткам с идентичными генетическими «синьками» приобретать уникальные идентичности и следовать разными путями дифферениировки. Эти изменения в экспрессии генов, лежащие в основе детерминации клеточных судеб, являются наследуемыми; судьба клетки редко изменяется, коль скоро она была детерминирована, даже после многочисленных клеточных делений и длительных периодов времени развития. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе детерминированного состояния, с давних пор было целью биологов развития и молекулярных биологов.

Многие из регуляторных белков, участвующих в поддержании наследуемых состояний экспрессии генов были идентифицированы в исследованиях гомеотических (НОХ) генов у Drosophila. Гены НОХ кодируют гомеодоменные транскрипционные факторы, которые регулируют транскрипцию батарей генов-мишеней, расположенных «вниз по течению» и, в свою очередь, специфицирующих идентичности сегментов тела (Gellon and McGinnis, 1998). У Drosophila гены НОХ обнаруживаются в двух комплексах генов: комплексе Antennapedia (Ant-C), который содержит НОХ-гены labial (lab), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr) и Antennapedia (Antp); и комплекс bithorax (BX-C), содержащий НОХ-гены Ultrabithorax (Ubx), abdominalA (abdA) и abdominalB (abdB) (Duncan, 1987; Kaufman et al., 1990). Каждый ген НОХ специфицирует идентичность конкретного сегмента или группы сегментов вдоль передне-задней оси развивающейся мухи. Например, Antp специфицирует идентичность второго торакального сегмента, включая вторую пару ног, тогда как Ubx специфицирует идентичность третьего торакального сегмента, включая жужжальца, расположенные позади крыльев. Таким образом, транскрипционные факторы, кодируемые генами НОХ. функционируют как главные регуляторные переключатели, определяющие выбор между альтернативными путями развития.

Транскрипция генов НОХ должна регулироваться очень точно, потому что в результате их несоответствующей экспрессии могут возникать резкие изменения в клеточных судьбах (Simon, 1995; Simon and Tamkun, 2002). Например, дерепрессия Antp в головных сегментах превращает антенны в ноги, а инактивация Ubx в торакальных сегментах превращает жужжальца в крылья. У Drosophila начальные паттерны транскрипции НОХ устанавливаются на ранних стадиях эмбриогенеза транскрипционными факторами, кодируемыми генами сегментации. Белки, кодируемые генами сегментации, — включая гены группы gap, группы pair-rule и группы segment-polarity — подразделяют ранний зародыш на 14 идентичных сегментов. Эти белки устанавливают также начальные паттерны транскрипции НОХ, что является первым шагом на пути к развитию сегментов с разными идентичностями и мофологией. Будучи установлены, эти ограниченные сегментами паттерны транскрипции НОХ должны поддерживаться на протяжении последующих эмбриональной, личиночной стадий и стадии куколки для того, чтобы поддерживать идентичность индивидуальных сегментов тела. Поскольку большинство генов сегментации временно экспрессируются в раннем развитии, эта функция выполняется двумя другими группами регуляторных белков: репрессорами группы Polycomb (PcG) и транскрипционными регуляторами группы trithorax (trxG) (рис. 12.1). Регуляция транскрипции НОХ состоит, следовательно, из по крайней мере двух различных фаз: установления (генами сегментации) и поддержания (генами PcG и trxG) (рис. 12.2).

^{Рис. 12.1. Концепция клеточной памяти}

^{Схематическая иллюстрция, освещающая роль комплексов trxG в поддержании наследуемых состояний активной экспрессии генов в противоположность наследуемому сайленсингу, обусловленному комплексами PcG, как это первоначально было определено для кластера НОХ-генов у Drosophila}

1.1. Идентификация генов, участвующих в поддержании детерминированного состояния

Благодаря своей роли в поддержании клеточных судеб гены PcG и trxG на целые десятилетия стали объектом интенсивных исследований. Как обсуждается в предыдущей главе, большинство генов PcG были идентифицированы по мутациям, вызывающим гомеотические трансформации в силу неспособности поддерживать репрессированные состояния транскрипции НОХ. Классическим примером фенотипа, ассоциированного с мутациями PcG, является трансформация второй и третьей пары ног в ноги первой пары. Эта гомеотическая трансформация является результатом дерепрессии гена группы ANT-C, Scr, и проявляется как появление на второй и третьей парах ног щетинок, характерных для первой пары ног и известных как зубцы половых гребешков. Этот фенотип «Polycomb», или «избыточные половые гребешки» — вместе с другими гомеотическими трансформациями, являющимися результатом неспособности поддерживать репрессию генов НОХ, — привел к идентификации более чем дюжины генов PcG у Drosophila. Большинство генов PcG кодируют субъединицы двух комплексов, участвующих в репрессии транскрипции: Polycomb Repressive Complex (PRC) 1 и PRC2 (Levine et al., 2001). PRC1 и PRC2 «нацеливаются» на участки вблизи промоторов НОХ (и других) посредством cis-регуляторных элементов, известных как элементы ответа Polycomb (PREs — Polycomb-response elements). Большое число данных позволяет предполагать, что комплексы PcG репрессируют транскрипцию, модулируя структуру хроматина (Francis and Kingston, 2001; Ringrose and Paro, 2004).

Члены группы trxG, в том числе trithorax (trx); absent, small или homeotic 1 (ash 1), absent, small или homeotic 2 (ash2) и female-sterile homeotic (fsh) изначально были идентифицированы по мутациям, имитирующим мутации НОХ типа «потери функции» у Drosophila (рис. 12.3) (Kennison, 1995). Например, мутации в trx — члене-основателе группы trxG — вызывают частичную трансформацию гальтеров в крылья (благодаря уменьшенной транскрипции Ubx); первой пары ног во вторую пару (благодаря сниженной транскрипции Sc г); и задних абдоминальных сегментов в более передние образования (благодаря сниженной транскрипции abdA и AbdB). Многочисленные другие члены trxG были идентифицированы в ходе скрининга на экстрагенные супрессоры мутаций Рс(Su(Pc)) (Kennison and Tamkun, 1988). Идея этих генетических скринингов заключалась в том, что снижение уровня белка, поддерживающего активное состояние, должно компенсировать снижение уровня репрессора PcG (рис. 12.4). Локус brahma (brm) и многочисленные другие локусы Su(Pc) были идентифицированы с помощью этого подхода, что довело общее число членов trxG до более чем 16 (табл. 12.1). Многие другие белки были классифицированы как члены trxG на основе других, менее строгих критериев, в том числе гомологии по последовательности с известными белками trxG, физической ассоциации с белками trxG, биохимической активности или влияния на транскрипцию НОХ in vitro или in vivo.

^{Рис. 12.2. Регуляция транскрипции НОХ}

^{Границы транскрипции abd-A и других генов НОХ устанавливаются белками сегментации. В число этих белков входят продукты генов gap и pair-rule, подразделяющие эмбрион на 14 идентичных сегментов. В ходе последующего развития состояния «ВЫКЛЮЧЕНО» и «ВКЛЮЧЕНО» транскрипции НОХ поддерживаются повсеместно экспрессированными членами группы активаторов trxG и репрессоров PcG посредством механизмов, которые остаются мало понятными}

Функциональные взаимоотношения между членами trxG и механистическая связь между функцией trxG и поддержанием клеточной судьбы являются сложными. Имеются многочисленные механизмы, посредством которых белок мог бы поддерживать соответствующий высокий уровень экспрессии гомеотического гена (генетическое определение белка trxG), не будучи специально предназначенным [devoted] активатором транскрипции, или белком, предназначенным для эпигенетического контроля. Формальные возможности для функции trxG (в дополнение к способности непосредственно активировать транскрипцию) включают способность усиливать функцию прямых активаторов, способность блокировать функцию репрессоров PcG и способность создавать «пермиссивное» состояние хроматина, облегчающее функционирование других многочисленных регуляторных комплексов. Более того, как обсуждается ниже, некоторые белки trxG играют сложную механистическую роль, которая на одних генах вносит вклад в активацию, а на других генах может вносить вклад в репрессию.

Два коротких примера иллюстрируют сложность потенциальных ролей в отношении белков trxG. Было высказано предположение, что комплексы АТФ-зависимого ремоделинга, такие как комплекс, содержащий белки trxG BRM и MOR, увеличивают способность любого сиквенс-специфичного, связывающегося с ДНК белка связываться с хроматином. Нерешенной проблемой является вопрос о том, может ли этот АТФ-зависимый комплекс ремоделинга использовать эту способность стимулировать и активацию генов посредством увеличенного связывания активаторов, и репрессию посредством увеличенного связывания репрессоров. Другие исследования привели к гипотезе о том, что некоторые комплексы белков trxG могли бы функционировать главным образом путем блокирования способности PcG-репрессорного комплекса функционировать, и что репрессия белками PcG является состоянием «по умолчанию». Таким образом, в этом последнем случае роль в поддержании активного состояния некоторыми белками trxG могла бы отражать косвенные, в противоположность прямым, действия. Эволюционный консерватизм этого семейства и консервативные функции этого семейства наводят на мысль: механизмы какого типа нужны для поддержания соответствующего уровня активации главных регуляторных генов, определяющих клеточную судьбу.

1.2. Белки trxG у других организмов

Функциональные аналоги по существу всех белков trxG Drosophila имеются у млекопитающих, в том числе у человека (табл. 12.1). Генетические и биохимические исследования показали, что белки мух и млекопитающих играют весьма консервативную роль и в экспрессии генов, и в развитии. Хорошим примером функционального консерватизма белков trxG является MLL, ортолог trx Drosophila у млекопитающих. Мутации в MLL вызывают гомеотические трансформации аксиального скелета мышей благодаря неспособности поддерживать активную транскрипцию генов НОХ (Yu et al., 1995,1998). Функционирование как MLL, так и trx в качестве метилтрансфераз лизинов в гистонах (HKMTs) и прямое доказательство функциональной гомологии между этими двумя белками было получено при использовании MLL человека для частичного «спасения» дефектов развития, возникающих в результате утраты функции trx у мух (Muyrers-Chen et al., 2004). Таким образом, механизмы, лежащие в основе поддержания детерминированного состояния, были высококонсервативными в ходе эволюции.

^{Рис. 12.3. Примеры трансформаций клеточной судьбы в развитии, связанных с мутациями в генах trxG y Drosophila}

^{(А) Нога первой пары, дикий тип. Половой гребешок, уникальный для первой пары ног, помечен стрелкой. (Б) Участок мутантной по kis ткани (маркирован стрелкой) частично трансформирован от ног первой пары в ноги второй пары благодаря сниженной транскрипции Scr, хотя и недостаточной, на что указывает уменьшение числа зубцов полового гребешка. (В) Участок мутантной по тог ткани (маркирован стрелкой) обнаруживает частичную трансформацию из жужжальца в крыло благодаря сниженной экспрессии Ubx. (Г) Участок мутантной по kis ткани (маркирован стрелкой) в пятом абдоминальном сегменте частично трансформирован к более передней идентичности благодаря сниженной экспрессии Abd В, на что указывает утрата темной пигментации, характерной для этого сегмента. (А, Б, Г — перепечатано, с любезного разрешения, из Daubesse et al., 1999)}

^{Рис. 12.4. Мутации trxG блокируют дерепрессию генов Нох у мутантов PcG}

^{(а) Ножные имагинальные диски, окрашенные антителами против белка, кодируемого геном Нох, Scr, который специфицирует идентичность лабиального и первого торакального сегментов, в том числе первой пары ног. (б) Базитарзальные сегменты ног взрослых особей дикого типа и мутантных. Обратите внимание на присутствие зубцов полового гребешка на ноге первой, но не второй и третей пары у взрослых особей дикого типа. Ген Scr частично дерепрессирован во вторых и третьих ножных дисках, где в норме он «молчит», у особей, гетерозиготных по мутациям в генах PcG, что приводит к появлению эктопических зубцов полового гребешка на ногах второй и третьей пары. Эти фенотипы супрессируются мутациями в brm и многих других генах trxG (а — перепечатано, с любезного разрешения, из Tamkun et al., 1992 [©Elsevier]; б — часть с изменениями, с любезного разрешения, из Kennison, 2003 [©Elsevier].)}

Рак и другие заболевания человека могут быть результатом неспособности поддерживать наследуемое состояние экспрессии генов. Неудивительно, что многие гены PcG и trxG у человека функционируют как протоонкогены или гены-супрессоры опухолей. Например, ген MLL из группы trxG у человека первоначально был идентифицирован по хромосомным транслокациям 1 lq23, ассоциированным с острой лимфобластозной (ALL) или миелоидной (AML) лейкемией. Мутации в других генах trxG млекопитающих также ассоциируются с различными раковыми заболеваниями (дополнительные детали см. в главе 23). Например, BRG1, аналог гена brm Drosophila у человека, физически взаимодействует с белком-супрессором опухоли ретинобластомы; нарушение этого взаимодействия приводит к ускоренному клеточному делению и злокачественной трансформации в некоторых линиях опухолевых клеток человека (Dunaief et al, 1994; Strober et al., 1996). В согласии с ролью BRG1 в супрессии опухоли мыши, гетерозиготные по мутациям в этом гене, склонны к образованию разнообразных опухолей (Bultman et al., 2000). Мутации в INI 1, человеческом аналоге гена группы trxG SNF5-related gene 1 (SNR1) у Drosophila, также делают их носителей предрасположенными к раку и были идентифицированы в большом проценте злокачественных рабдоидных опухолей (агрессивный рак у детей) (Versteege et al., 1998). Эти и другие связи с заболеваниями у человека дали исследователям дополнительную мотивацию к пониманию механизма действия белков trxG.

1.3. Белки trxG играют разные роли в эукариотической транскрипции

Группа активаторов trxG — это большая и функционально разнообразная группа регуляторных белков. Это может отражать сложность эукариотической транскрипции, включающей высокорегулируемые взаимодействия между геноспецифичными активаторами транскрипции, многочисленными компонентами общей транскрипционной машины и транскрибируемой матрицей ДНК Активация транскрипции включает связывание сиквенс-специфичных активирующих белков, рекрутирование этими белками общей транскрипционной машины, формирование преинициационного комплекса, в котором РНК-полимераза II связывается с промотором, раскрытие спирали ДНК возле этого промотора, эффективный уход РНК-полимеразы от промотора и эффективную элонгацию РНК-полимеразы через данный ген.

Способность поддерживать состояние активной транскрипции могло бы включать любой из многочисленных этапов, необходимых для активации, поскольку на любом данном гене разные этапы могли бы играть роль, определяющую скорость процесса для транскрипционной активности. Упаковка эукариотической ДНК в хроматин представляет еще один уровень, на котором белки trxG могут регулировать транскрипцию Нуклеосомы и другие компоненты хроматина обнаруживают тенденцию к подавлению связывания общих и ген-специфичных транскрипционных факторов с ДНК, а также к подавлению элонгации РНК-полимеразы. Изменения в структуре хроматина — в том числе изменения в структуре и позиционировании нуклеосом — могут влиять практически на каждый этап в процессе транскрипции.

Любой белок, необходимый для транскрипции, требуется для поддержания активного состояния. Действительно, некоторые белки trxG могут играть сравнительно общие роли в транскрипции, а не быть предназначенными исключительно для поддержания детерминированного состояния. Однако другие белки trxG могут играть специализированные роли в этом процессе, либо непосредственно противодействуя репрессии, осуществляемой PcG, либо поддерживая наследуемые состояния активности генов в ходе репликации ДНК и митоза. Этот последний класс белков trxG представляет особый интерес для биологии развития.

Генетические исследования, показывающие, что гены trxG играют ключевые роли в транскрипции и развитии, стимулировали значительные усилия, направленные на понимание биохимической функции их продуктов. Многие из этих экспериментов использовали в качестве своей концептуальной базы гипотезу, согласно которой хроматин является биологически релевантным субстратом для белков trxG. Все гены упакованы в хроматин, и эта упаковка может создать компактное и недоступное состояние или же может находиться в открытом и пермиссивном состоянии. И пермиссивное, и недоступное состояния, по-видимому, могут быть наследуемыми. Эти соображения привели к простой гипотезе, согласно которой белки trxG могли бы модулировать структуру хроматина и влиять на регуляцию. Более того, поскольку гены trxG были клонированы и секвенированы, стало очевидным, что некоторые из их продуктов родственны белкам, участвующим в АТФ-зависимом ремоделинге хроматина или ковалентной модификации нуклеосомных гистонов у других организмов, в том числе у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Таким образом, хотя у дрожжей отсутствуют гены НОХ или репрессоры PcG, этот организм дал ценные сведения о потенциальной роли белков trxG в эукариотической транскрипции.

Одна из первых связей между trxG и хроматином вытекала из открытия, показавшего, что trxG-ген brm у Drosophila является близкородственным SWI2/SNF2 дрожжей (Tamkun et al., 1992). SWI2/SNF2 был идентифицирован в ходе скрининга на гены, участвующие в переключении типа спаривания (гены switch [xw/]) и сбраживании сахарозы (гены sucrose-nonfermenting [snf]). Впоследствии было показано, что SWI2/SNF2 необходим для активации многочисленных индуцибельных генов дрожжей (Holstegeetal., 1998; Sudarsanametal., 2000). Дефекты транскрипции, наблюдаемые у мутантов swi2/ snf2, супрессируются мутациями в нуклеосомных гистонах; это раннее наблюдение впервые позволило предположить, что SWI2/SNF2 активирует транскрипцию путем противодействия репрессии хроматина (Kruger et al., 1995). Биохимические исследования, проведенные в начале 1990-х годов, подтвердили эту гипотезу; SWI2/ SNF2 и многие другие белки, идентифицированные в ходе скрининга на swi2/snf2, функционируют как субъединицы большого белкового комплекса (SWI/SNF), использующего энергию гидролиза АТФ для увеличения способности белков связываться с нуклеосомной ДНК (Cote et al., 1994; Imbalzano et al., 1994; Kwon et al., 1994). SWI2/SNF2 функционирует как субъединица АТФазы, или «двигатель», этой машины ремоделинга хроматина; другие субъединицы комплекса SWI/SNF опосредуют взаимодействия с регуляторными белками или с его хроматиновым субстратом (Phelan et al., 1999).

На еще одну связь между trxG и хроматином указывало наличие доменов SET в белках Trithorax (TRX) и Absent (малый, или гомеотический — ASH1) группы trxG. Домен SET был первоначально определен по отрезку аминокислотной последовательности, обнаруживающему гомологию между Su(var)3-9, Enhancer of zeste (E(z)) и TRX; последние два белка являются членами PcG и trxG, соответственно. В конце 1990-х годов было показано, что белки семейства SET обладают активностью НКМТ. Su(var)3-9 метилирует H3K9, тогда как (E(z)) метилирует H3K27 (Rea et al., 2000; Levine et al., 2004; Ringrose and paro, 2004) Как обсуждается в других главах, метилирование H3K9 стимулирует сборку гетерохроматина, тогда как метилирование H3K27 оказывается необходимым для PcG-репрессии (более детальное обсуждение см. в главах 5 и 11, соответственно). Присутствие доменов SET в белках trxG позволило предположить, что метилирование «хвостов» гистонов могло бы иметь важное значение для поддержания активных транскрипционных состояний.

Эти открытия, вместе с растущим пониманием, что ферменты ремоделинга и модификации хроматина играют ключевую роль в активации транскрипции, побудили биохимиков идентифицировать белковые комплексы, содержащие белки trxG, и изучить влияние этих комплексов на структуру хроматина in vitro. Другие эксперименты имели своей целью проверку гипотезы о том, что белки trxG могли бы взаимодействовать непосредственно с транскрипционной машиной (еще один хорошо установленный способ влиять на регуляцию) Как описано ниже, эти исследования показали, что некоторые белки trxG влияют на регуляцию посредством модификации структуры хроматина, тогда как другие функционируют путем прямых взаимодействий с компонентами транскрипционной машины.

2.1. Белки trxG, участвующие в АТФ-зависимом ремоделировании хроматина

Участие комплексов ремоделинга хроматина предполагалось в самых разных биологических процессах, в том числе в репрессии и активации транскрипции, сборке хроматина, регуляции структуры хроматина более высокого порядка и в клеточной дифференцировке. Наиболее всесторонне изученными белками trxG, участвующими в ремоделинге хроматина, являются BRM и его аналоги у человека, BRG1 и HBRM. Как и предсказывалось, эти белки функционируют как АТФазные субъединицы комплексов, очень близко родственных SWI/SNF дрожжей (Kwon et al., 1994; Wang et al., 1996). Комплексы SWI/SNF сотержат от 8 до 15 субъединиц и были очень консервативны в ходе эволюции (рис. 12.5). АТФаза каждого из этих комплексов способна функционировать как отдельная субъединица. Хотя на это семейство белков исторически ссылались как на содержащее «геликазный» мотив (в силу сходства их АТФазного домена с доменом истинных геликаз), никогда не было показано, что эти белки, родственные BRM, обладают геликазной активностью; скорее, для влияния на изменения в структуре хроматина они используют другие механизмы, такие как транслокацию вдоль ДНК (Whitehouse et al., 2003; Saha et al., 2005). Второй trxG-ген, идентифицированный при этом скрининге, moira (тог), кодирует еще один ключевой член этого АТФ-зависимого ремоделирующего комплекса у Drosophila, а гомологи BRM и MOR взаимодействуют непосредственно и формируют функциональный кор SWI/ SNF у человека (Phelan et al., 1999).

SWI/SNF и другие комплексы ремоделинга хроматина используют энергию гидролиза АТФ для изменения структуры или позиционирования нуклеосом. Катализируя АТФ-зависимые изменения в структуре хроматина, комплексы ремоделинга хроматина помогают транскрипционным факторам и другим регуляторным белкам получить доступ к нуклеотидным последовательностям ДНК, которые в норме были бы закрыты гистоновыми белками (Polach and Widom, 1995; Logie and Peterson, 1997). Среди моделей создания доступа к специфическим сайтам — «скольжение» гистонов по ДНК для перемещения сайта в линкерный участок, выпетливание ДНК из гистонового октамера или же (самый крайний вариант!) выселение всего гистонового октамера в другое место в ядре (рис. 12.6). АТФ-зависимый ремоделинг может также приводить к изменениям в положении нуклеосом вдоль нуклеотидной последовательности ДНК, к изменениям в спейсинге нуклеосом и к перемещениям гистонов в гистоновый октамер (являющийся кором нуклеосомы) и из него. Другие ремоделирующие комплексы обнаруживают разную склонность к выполнению каждой из этих функций.

^{Puc. 12.5. Семейство ремоделирующих комплексов SWI/SNF}

^{Каждый комплекс содержит член SNF2/SWI2-семейства АТФаз и по крайней мере восемь других субъединиц, (а) Схематическое изображение белка BRM, показывающее расположение АТФазного домена и карбокситерминального бромодомена (обнаруживающего сродство к ацетилированным остаткам лизина в гистоновых «хвостах»), которые консервативны у всех членов семейства SNF2/SWI2. Показаны цветом комплексы SWI/SNF у дрожжей (б), Drosophila (в) и человека (г). Дальнейшую информацию об этих комплексах и их субъединицах можно найти в Mohrmann and Verrijzer. 2005}

б Обмен гистонов

^{Рис. 12.6. Механизмы АТФ-зависимого ремоделинга}

^{Модели ремоделирования хроматина иллюстрируются показом изменения в положении или составе нуклеосом относительно ДНК, обернутой вокруг них. Центральная часть рисунка показывает стартовый район хроматина, где линкерная ДНК изображена желтым цветом, а нуклеосомная ДНК — красным, (а) Движение нуклеосомы трансляционно вдоль ДНК (скольжение) для открытия участка (отмеченного красным цветом), который ранее был закрыт; (б) обмен стандартного гистона на вариантный гистон для создания вариантной нуклеосомы; (в) вытеснение нуклеосом для открытия большого района ДНК. Этот механизм мог бы зависеть от других белков, таких как гистоновые шапероны или факторы, связывающиеся с ДНК, в дополнение к белкам ремоделлинга; (г) создание петли на поверхности нуклеосомы. Гипотетически предполагается, что ремоделеры семейства SWI/ SNF используют альтернативные механизмы, такие как создание стабильных петель ДНК на поверхности нуклеосомы, чтобы сделать доступными сайты, являющиеся центральными для этой нуклеосомы}

У высших эукариот комплексы SWI/SNF весьма многочисленны; например, каждое ядро млекопитающих содержит около 25 ООО копий комплексов семейства SWI/SNF. Биохимические анализы показывают, что комплексы SWI/SNF способны открывать доступ к необычно широкому спектру сайтов в нуклеосоме по сравнению с другими АТФ-зависимыми комплексами ремоделинга хроматина (Fan et al., 2003). Например, комплексы SWI/SNF способны эффективно обеспечивать доступ к сайтам в центре мононуклеосомы, что в энергетическом отношении затруднительно, поскольку сайты в центре нуклеосомы имеют приблизительно 70 пар оснований ограниченной [constrained] нуклеосомной ДНК с каждой стороны. Вызывается ли это необычно мощной способностью использовать энергию гидролиза АТФ по сравнению с другими ремоделерами или же, вместо этого, представляет другой механизм ремоделинга, является темой текущих исследований (Kassabov et al., 2003). Комплексы SWI/SNF не обнаруживают сколько-нибудь измеримой способности равномерно распределять [to space] нуклеосомы, что является отличительным признаком других комплексов ремоделинга хроматина. Они также не обнаруживают такой же степени эффективности в «свопинге» [swapping — обмен одних элементов на другие] димеров Н2А/ Н2В, как некоторые другие комплексы ремоделинга хроматина, хотя при тестировании in vitro они способны осуществлять это и перемещать октамеры (Lorch et al., 1999). Какая из этих способностей имеет отношение к функции этих комплексов в поддержании активного состояния, еще не ясно.

У каждого исследованного вида предполагалось участие комплексов SWI/SNF в транскрипционной активации. Это семейство комплексов может быть «нацелено» на гены взаимодействиями с транскрипционными активаторами, может ремоделировать нуклеосомы, помогая в первоначальном связывании общих транскрипционных факторов и РНК-полимеразы II, и может становиться «нацеленным» на более поздних стадиях процесса активации, способствуя транскрипционной элонгации. Таким образом, комплексы SW1/SNF, по-видимому, функционируют на каждом этапе процесса транскрипционной активации, хотя, по-видимому, имеет место акцент на функцию, осуществляемую на ранних этапах, ведущих к загрузке РНК-полимеразы II. Анализ с использованием микрочипов (microarray analysis) у дрожжей показывает, что помимо этих влияний, стимулирующих активацию, комплексы SWI/SNF могут также облегчать репрессию некоторых генов (Sudarsanam et al., 2000).

Одна простая гипотеза, объясняющая эти широкие функции in vivo, заключается в том, что эти ремоделирующие комплексы изменяют структуру нуклеосом таким образом, что облегчается связывание и функционирование широкого спектра разных регуляторных факторов и комплексов. Таким образом, эффективные [potent] характеристики ремоделинга, наблюдаемые in vitro, могли бы отражать способность существенно расширять доступ к регуляторным факторам in vivo. Возможно, что комплексы SWI/SNF обладают уникальной способностью создавать широкий доступ, которая может объяснять их важное значение в поддержании активного состояния.

Каждый изученный вид обладает по крайней мере двумя разными комплексами SWI/SNF, которые оба содержат BRM или близкородственную АТФазу ремоделинга хроматина. Еще один белок trxG, OSA, обеспечивает различие между этими комплексами в том отношении, что один класс комплексов содержит OS А, а еще один эволюционно консервативный комплекс содержит белок с полибромодоменом (рис. 12.6) (Mohrmann and Verrijzer, 2005). Биохимическая функция OSA не ясна. Одна привлекательная возможность заключается в том, что он мог бы «нацеливать» комплекс SWI/SNF, в котором он находится, на специфическую группу генов.

SWI/SNF — не единственный фактор ремоделинга хроматина, имеющийся в эукариотических клетках. Идентифицированы десятки различных комплексов реиоделинга хроматина, в том числе NURF, NURD, ACF и CHRAC (Vignali et al., 2000). Эти комплексы можно подразделить на несколько основных групп на основе идентичностей их АТФазных субъединиц. Комплексы SWI/SNF содержат АТФазы, родственные SWI2/SNF2; комплексы ISWI (например, NURF, CHRAC и ACF) содержат АТФазы, родственные Imitation-SWI (ISWI); наконец, комплексы CHD (например, NURD) содержат АТФазы, родственные CHD1 и Mi2.

Недавние исследования позволили предположить участие имеющегося у Drosophila kismet (kis) — члена семейства CHD факторов ремоделинга хроматина — в поддержании активного состояния. Подобно brm, mor и osa, kis был идентифицирован в ходе скрининга на экстрагенные супрессоры Рс; это позволяло предполагать, что он действует антагонистически по отношению к белкам PcG и поддерживает активные состояния НОХ-транскрипции (Kennison and Tamkun, 1988). Генетические исследования показали, что kis необходим как для сегментации, так и для поддержания HOX-транскрипции в ходе развития Drosophila (Daubresse et al., 1999; Therrien et al., 2000). Консервативные домены вне АТФазного домена (в том числе бромодомены и хромодомены) вносят свой вклад в функциональную специфичность ремоделирующих хроматин факторов, опосредуя взаимодействия с нуклеосомами или другими белками. BRM и другие АТФазные субъединицы комплексов SW1/SNF содержат единственный бромодомен (белковый мотив, ассоциированный со связыванием определенных ацетилированных гистонов), тогда как KIS-L содержит два хромодомена (белковых мотива, связывающихся с определенными метилированными гистонами) и является, следовательно, более похожим на Mi2 и другие ремоделирующие хроматин факторы, члены семейства CDH. Хотя большие размеры KIS-L (~575 кДа) затруднили биохимический анализ этого белка, его последовательность убедительно свидетельствует о том, что он активирует транскрипцию, ремоделируя хроматин

KIS-L не ассоциирован физически с BRM и хроматографически ведет себя так, как будто бы он находится в другом белковом комплексе (Srinivasan et al., 2005). Однако эти два белка существенно перекрываются друг с другом и с РНК-полимеразой II на политенных хромосомах, что позволяет предполагать, что оба они играют относительно глобальные роли в транскрипции (рис. 12.7) (Armstrong et al., 2002; Srinivasan et al., 2005). Утрата функции BRM блокирует относительно ранний этап в транскрипции (Armstrong et al., 2002), тогда как утрата функции KIS-L ведет к снижению уровня элонгации, но не инициации форм РНК-полимеразы II (Srinivasan et al., 2005). Эти открытия заставляют предполагать, что BRM и KIS-L облегчают различные этапы в транскрипции с помощью РНК-полимеразы II, катализируя АТФ-зависимые изменения в структуре или спейсинге нуклеосом.

^{Рис. 12.7. Распределение белков trxG в хромосомах}

^{Распределение белков trxG по всему геному изучали с помощью окрашивания политенных хромосом слюнных желез Drosophila антителами против BRM (а) или TRX (б). В соответствии с относительно глобальной ролью BRM в активации транскрипции он связан с сотнями сайтов паттерн которых существенно перекрывается с RNA pol II. Напротив, сильные сигналы TRX выявляются в значительно меньшем числе сайтов политенных хромосом}

Важный вопрос для будущих исследований касается роли, которую АТФ-зависимый ремоделинг играет в поддержании активированного состояния. Весьма интригует тот факт, что четыре члена trxG известны (BRM, KIS и OSA) или подозреваются (KIS) как члены больших АТФ-зависимых ремоделирующих хроматин комплексов, но ни один из других многочисленных АТФ-зависимых ремоделирующих комплексов не был идентифицирован в ходе генетических скринингов на trxG-белки Drosophila. Две преобладающих гипотезы (не являющиеся взаимоисключающими), предложенные для объяснения этого, заключаются в том, что ремоделирующие хроматин комплексы BRM и KIS «нацелены» на гены, важные для прогрессии развития, или что они обладают специальными характеристиками ремоделинга, которые являются уникально необходимыми для поддержания. Таким образом, возможно, что родовой [generic] АТФ-зависимый ремоделинг требуется для всех активных состояний и что для поддержания активного состояния важных для развития генов оказываются необходимыми эти члены trxG, поскольку они «нацелены» на эти гены. Возможно также, что поддержание требует специальных АТФ-зависимых функций, которые могут быть выполнены комплексами, содержащими члены trxG.

Заманчиво также думать о механизмах, которые могут использоваться ремоделерами для того, чтобы внести вклад в эпигенетическую регуляцию активного состояния. Можно представить себе три класса механизмов, к которым это могло бы относиться. Во-первых, функция ремоделинга могла бы потребоваться в каком-то косвенном режиме для облегчения связывания (или повторного связывания после репликации) генспецифичных активирующих белков, которые нужны для поддержания активной транскрипции. В этом случае ремоделеры не были бы «мозгами» эпигенетического механизма, но, вместо этого, действовали бы как инструмент, необходимый для эффективного функционирования требуемых белков. Во-вторых, ремоделеры могли бы работать одни или с гистоновыми шаперонами для вытеснения нуклеосом из данного района, и эта незанятость нуклеосомами гипотетически заставляла бы этот район оставаться ненуклеосомным после репликации. Как упоминалось выше, способность машины репликации/смещения нуклеосом точно рекапитулировать модификации или локализацию нуклеосом является важным вопросом эпигенетики, на который пока нет ответа. Наконец, механизмы ремоделинга могли бы повторно позиционировать нуклеосомы и создавать структуру, поддающуюся активации. Этот последний механизм получил экспериментальную поддержку в исследованиях гена альбумина (Chaya et al., 2001; Cirillo et al., 2002). Несколько связывающихся с ДНК факторов необходимы для поддержания активности этого ключевого гена в печени. Один из этих факторов, FoxA, связывается с сайтом на нуклеосоме, и эта специфическая конструкция «нуклеосома-FoxA» является ключевой для поддержания активного состояния гена альбумина. Хотя неясно, имеется ли необходимая роль для АТФ-зависимого ремоделинга, чтобы позиционировать эту специфическую нуклеосому в печени, этот пример показывает, что специфическое позиционирование нуклеосом обладает достаточным потенциалом, чтобы играть ключевую эпигенетическую роль [whether there is a required role for ATP-dependent remodeling to position this specific nucleosome in the liver, this example demonstrates the potential for specific nucleosome positioning to play a key epigenetic role].

2.2. Белки trxG, ковалентно модифицирующие нуклеосомные гистоны

Второй распространенный способ регулирования экспрессии генов включает ковалентную модификацию аминотерминальных «хвостов» коровых гистонов, составляющих белковый компонент нуклеосомы. Эти «хвосты», выступающие с поверхности нуклеосомы, могут опосредовать взаимодействия с другими нуклеосомами, а также с весьма разнообразными структурными и регуляторными белками. Ковалентная модификация гистоновых «хвостов» с помощью ацетилирования, метилирования или фосфорилирования может помогать «нацеливать» регуляторные комплексы на хроматин и может также непосредственно изменять способность нуклеосом компактизироваться в репрессивные структуры путем изменения заряда на этих «хвостах». Ковалентная модификация могла бы также обеспечивать метку, чтобы способствовать поддержанию специфического регулируемого состояния (поскольку ковалентно модифицированные гистоны обладают возможностью разделяться на две дочерние нити и тем самым воспроизводят информацию, содержащуюся в ковалентной метке) и передавать ее как материнской, так и дочерним клеткам после репликации. Остаются ли гистоны связанными с одной или с обеими дочерними нитями после репликации — это ключевой вопрос для потенциальных механизмов эпигенетического регулирования; вопрос этот остается спорным, по большей части в связи с поиском методов, которые позволили бы точно прослеживать индивидуальные гистоны в живых клетках.

Несколько белков trxG способны ковалентно модифицировать «хвосты» гистонов, и эти белки часто обнаруживаются в комплексах, способных осуществлять более чем один тип реакций модификации. Например, TRX Drosophila и его аналоги у других организмов метилируют гистон H3 по лизину 4 (H3K4): эта ковалентная метка прочно ассоциирована с активными генами у самых разных организмов, в том числе у дрожжей, мух и человека. Второй белок trxG, ASH1 (см. ниже), также обладает H3K4-метилтрансферазной активностью (Beisel et al., 2002; Byrd and Sheam, 2003). Подразумевалось, что H3K4-метилирование связано с поддержанием активной экспрессии генов у дрожжей, исходя из времени его появления и исчезновения на активных генах (Santos-Rosa et al., 2002; Pokholok et al., 2005). Тот факт, что члены trxG обладают этой модификационной (в отношении гистонов) активностью, еще больше связывает метку H3K4 с поддержанием активного состояния.

У дрожжей и у человека аналоги TRX обнаруживаются в комплексе, который содержит также третий белок группы trxG, Ash2, по последовательности не родственный Ash1 Дрожжевой гомолог trithorax, Setl, обнаруживается в комплексе (COMPASS или Set 1C), который имеет величину приблизительно 400 кДа и содержит пять других белков кроме Setl и Ash2 (Miller et al., 2001; Roguev et al., 2001). Единственной известной биохимической активностью этого комплекса является метилирование H3K4; пока еще не ясно, какова могла бы быть функция каждого из других белков, хотя один компонент мог бы способствовать воспроизведению метальной метки (см. ниже).

У человека имеются три гомолога TRX, называемые MLL1, MLL2 и hSETl. Белок MLL1 привлек наибольшее внимание в биохимических анализах и обнаруживается в большом комплексе (>10 членов), который содержит также человеческий гомолог ASH2 (Hughes et al., 2004; Yokoyama et al., 2004). Этот комплекс и дрожжевой комплекс оба содержат повторяющийся белок [repeat protein] WD40, который у человека называется WDR5 (Dou et al., 2005; Wysocka et al., 2005). Недавно было показано, что белок WDR5 может связываться с гистоном H3, который был метилирован по лизину 4 (Wysocka et al., 2005). Таким образом, связывание этого белка с меткой, созданной комплексом MLL1, в котором он находится, могло бы дать механизм для облегчения распространения этой метки. Это сходно с предположениями, сделанными относительно репрессивных комплексов, метилирующих H3K9, которые содержат НР1, белок, специфически связывающийся с метилированным К9 (дополнительные детали см. в главах 5 и 6).

Имеются данные, полученные как на Drosophila, так и на человеке, о том, что комплекс, содержащий TRX/ MLL, участвует также в ацетилировании. У человека MLL ассоциирован с ацетилтрансферазой MOF, которая ацетилирует лизин 16 гистона Н4, что является еще одной модификацией, связанной в норме с активацией (Dou et al., 2005). У мух TRX ассоциирован с dCBR — ацетилтрансферазой с широкой специфичностью, которая участвует в активации (Petruk et al., 2001). Ацетилирование могло бы работать совместно [synergistically] с метилированием H3K9, направляя активное состояние после функционирования этих комплексов trxG. Известно также, что ацетилирование предотвращает метилирование таких остатков, как H3K9 и H3K27, которые направляют репрессию матрицы.

Белок ASH1, еще один член trxG, тоже является метилтрансферазой гистонов, которая метилирует H3K4 (Beisel et al., 2002; Byrd and Sheam, 2003). Состав ни у одного комплекса, содержащего ASH1, не был установлен; непонятно также, как координируются активности ASH1 и комплексов, содержащих TRX/MLL1/SET1. Однако наблюдали также, что ASH1 колокализуется и ассоциируется с семейством ацетилтрансфераз СВР (Bantignies et al., 2000), что опять-таки предполагает, что метилирование и апетилирование идут рука об руку.

Существуют захватывающие, но все еще остающиеся без ответа вопросы относительно того, каким образом ковалентная модификация гистонов могла бы вносить вклад в функцию trxG. Какую функциональную роль играют метки? Ковалентная модификация может вносить свой вклад в эпигенетическое регулирование с помощью широкого спектра механизмов. Метки метилирования и ацетилирования могли служить для непосредственного изменения компактизации хроматина (иногда это обозначается как cis-эффекты, как на рис. 3.8). На способность хроматина входить в компактизированное состояние, которое, как обычно принимается, является репрессивным для транскрипции, влияет распределение зарядов на гистоновых «хвостах». Модификации, происходящие на лизине (например, ацетилирование), могут устранять положительный заряд, в норме обнаруживаемый с этим остатком, и, следовательно, могут прямо снижать способность нуклеосом формировать компактные структуры, повышая таким образом способность матрицы к транскрипции.

Предположили, что ковалентные метки создают сайты прочного связывания для комплексов, управляющих [direct] транскрипционной активацией. Эти ковалентные модификации способны создавать специфические «выросты» [«knobs»] на поверхности нуклеосом, которые соответсвуют «карманам» на комплексах, стимулирующих активацию, увеличивая таким образом энергию связывания и функцию этих комплексов. Например, ацетилирование гистоновых «хвостов» увеличивает связывание гомологами белка BRM, стимулируя таким образом АТФ-зависимый ремоделинг ацетилированных матриц (Hassan et al., 2001). Механизм этого типа, часто обозначаемый как «гистоновый код» или trans-эффекты ковалентных модификаций гистонов, потенциально может быть центральной эпигенетической функцией. Нужны дальнейшие исследования, чтобы определить, какие именно метки, созданные белками trxG, усиливают связывание каких именно комплексов, определить степень, с какой энергия связывания с одним модифицированным остатком может влиять на функцию и «нацеливание», и определить временной порядок добавления этих меток и возможность их поддержания при митозе.

Оборотная сторона этого механизма заключается в том, что эти метки могли бы подавлять связывание репрессивными комплексами. Ковалентная метка на ключевом остатке, необходимом для оптимального связывания каким-то репрессивным комплексом, могла бы сильно ингибировать связывание этим репрессивным комплексом. Например, известно, что связывание репрессивными комплексами увеличивается метилированием гистона H3 по К9 и К27 (Khorasanizadeh, 2004). Ацетилирование этих остатков и блокировало бы метилирование, и создавало бы «вырост» неправильной формы на гистоне, ослабляющий связывание этим репрессивным комплексом. Таким образом, способность модификаций влиять на функцию других комплексов может работать в обоих направлениях [cut in both directions], увеличивая действенность этого потенциального способа эпигенетической регуляции.

Эти механизмы не только не являются взаимоисключающими, но вероятно работают совместно, помогая поддерживать активное состояние. Метки, которые химически увеличивают возможность формировать компактное состояние (cis-эффект), могли бы также увеличивать способность комплексов связываться (trans-эффект) и еще более [further] стимулировать компактное состояние. Наоборот, метки которые химически уменьшают компактизацию, могли бы увеличивать связывание комплексов, которые также декомпактизируют нуклеосомы. Это механистически экономное использование ковалентных меток для изменения нескольких характеристик структуры хроматина и способности регуляторных комплексов связываться могло бы создавать мощные средства поддержания активного состояния.