Глава 12. Регуляция транскрипции белками группы TRITHORAX

Robert Е. Kingston1 и John W. Tamkun2

1 Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts 02114 department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz, California 95064

Общее резюме

Все клетки в организме должны обладать способностью «помнить», клетками какого типа они должны быть. Для этого процесса, называемого «клеточная память», или «транскрипционная память», необходимы механизмы двух основных классов. Первый класс, обсуждавшийся в предыдущей главе, функционирует таким образом, чтобы поддерживать состояние «ВЫКЛЮЧЕНО» у тех генов, которые, будучи включены, определяли бы неправильныи клеточный тип. Белки группы Polycomb (PcG — Polycomb-Group) играют, в качестве своей основной функции, эту репрессивную роль в клеточной памяти. Ко второму классу относятся те механизмы, которые требуются для поддержания ключевых генов в состоянии «ВКЛЮЧЕНО». Любой клеточный тип требует экспрессии главных регуляторных белков, которые управляют специфическими функциями, необходимыми для данного клеточного типа. Гены, кодирующие эти главные регуляторные белки, должны поддерживаться в состоянии «ВКЛЮЧЕНО» на протяжении всей жизни организма, чтобы поддерживать соответствующие клеточные типы в этом организме.

Удивительная многокрылая мушка, изображенная в левой части рисунка в начале этой главы, иллюстрирует эффектные фенотипы, которые могут получиться в результате неспособности поддерживать состояние «ВКЛЮЧЕНО» у главного регуляторного гена. Белки, участвующие в поддержании состояния «ВКЛЮЧЕНО», называются белками группы trithorax (trxG — trithorax-Group) в честь гена trithorax, члена-основателя этой группы регуляторных белков. Большая группа белков с различными функциями составляет группу trxG. Роли, которые эти белки играют в эпигенетических механизмах, поддерживающих состояние «ВКЛЮЧЕНО», оказываются на данный момент более сложными, чем роли белков PcG в репрессии. Первая сложность состоит в том, что очень большое число белков и механизмов нужно для того, чтобы активно транскрибировать РНК с любого гена. Таким образом, в противоположность репрессии, которая может быть выполнена сравнительно простыми механизмами, блокирующими доступ всех белков, активация гена требует многочисленных шагов, любой из которых может играть роль в поддержании состояния «ВКЛЮЧЕНО». Таким образом, имеются многочисленные возможные стадии, на которых мог бы работать белок trxG.

Вторая сложность в представлениях о белках trxG заключается в том, что белки, функционирующие в активации, могут также, в других контекстах, функционировать в репрессии. Это могло бы показаться противоречащим интуиции, но, в зависимости от точной архитектуры гена, один и тот же белок, выполняющий свою функцию, мог бы в одном случае помогать гену становиться активированным, а в другом — помогать другому гену становиться репрессированным. В настоящее время представляется, что белки trxG не предназначены исключительно для поддержания экспрессии гена, но что эти белки могут также играть в клетке множество ролей. Эти сложности порождают несколько интересных вопросов, остающихся пока без ответа Почему лишь некоторые из этих белков, нужных для активации транскрипции, являются также критичными для поддержания транскрипции? Обладают ли эти белки функциями, уникально приспособленными для поддержания активного состояния? Или же некоторые из этих белков нужны для поддержания исключительно благодаря эволюционной случайности, сделавшей их ключевыми регуляторами гена (генов), имеющего особенно важное значение для развития?

Как показано ниже, некоторые из белков trxG участвуют в регулировании структуры хроматина в противоположность механизмам, используемым белками PcG. Белки trxG могут размещать ковалентные модификации на хроматине или могут изменять хроматин, изменяя структуру и положение нуклеосом. являющихся строительными блоками хроматина. Другие белки trxG функционируют как часть транскрипционной машины. Таким образом, эти белки обнаруживаются в более широком ряду комплексов, чем белки PcG, и, вероятно, играют более сложные роли в эпигенетическом механизме.

1. Введение

Многочисленные «решения» о ходе развития [developmental decisions] — включая детерминацию судьбы клеток — принимаются в ответ на временную позиционную информацию в раннем эмбрионе. Эти решения зависят от изменений в экспрессии генов. Это дает возможность клеткам с идентичными генетическими «синьками» приобретать уникальные идентичности и следовать разными путями дифферениировки. Эти изменения в экспрессии генов, лежащие в основе детерминации клеточных судеб, являются наследуемыми; судьба клетки редко изменяется, коль скоро она была детерминирована, даже после многочисленных клеточных делений и длительных периодов времени развития. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе детерминированного состояния, с давних пор было целью биологов развития и молекулярных биологов.

Многие из регуляторных белков, участвующих в поддержании наследуемых состояний экспрессии генов были идентифицированы в исследованиях гомеотических (НОХ) генов у Drosophila. Гены НОХ кодируют гомеодоменные транскрипционные факторы, которые регулируют транскрипцию батарей генов-мишеней, расположенных «вниз по течению» и, в свою очередь, специфицирующих идентичности сегментов тела (Gellon and McGinnis, 1998). У Drosophila гены НОХ обнаруживаются в двух комплексах генов: комплексе Antennapedia (Ant-C), который содержит НОХ-гены labial (lab), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr) и Antennapedia (Antp); и комплекс bithorax (BX-C), содержащий НОХ-гены Ultrabithorax (Ubx), abdominalA (abdA) и abdominalB (abdB) (Duncan, 1987; Kaufman et al., 1990). Каждый ген НОХ специфицирует идентичность конкретного сегмента или группы сегментов вдоль передне-задней оси развивающейся мухи. Например, Antp специфицирует идентичность второго торакального сегмента, включая вторую пару ног, тогда как Ubx специфицирует идентичность третьего торакального сегмента, включая жужжальца, расположенные позади крыльев. Таким образом, транскрипционные факторы, кодируемые генами НОХ. функционируют как главные регуляторные переключатели, определяющие выбор между альтернативными путями развития.

Транскрипция генов НОХ должна регулироваться очень точно, потому что в результате их несоответствующей экспрессии могут возникать резкие изменения в клеточных судьбах (Simon, 1995; Simon and Tamkun, 2002). Например, дерепрессия Antp в головных сегментах превращает антенны в ноги, а инактивация Ubx в торакальных сегментах превращает жужжальца в крылья. У Drosophila начальные паттерны транскрипции НОХ устанавливаются на ранних стадиях эмбриогенеза транскрипционными факторами, кодируемыми генами сегментации. Белки, кодируемые генами сегментации, — включая гены группы gap, группы pair-rule и группы segment-polarity — подразделяют ранний зародыш на 14 идентичных сегментов. Эти белки устанавливают также начальные паттерны транскрипции НОХ, что является первым шагом на пути к развитию сегментов с разными идентичностями и мофологией. Будучи установлены, эти ограниченные сегментами паттерны транскрипции НОХ должны поддерживаться на протяжении последующих эмбриональной, личиночной стадий и стадии куколки для того, чтобы поддерживать идентичность индивидуальных сегментов тела. Поскольку большинство генов сегментации временно экспрессируются в раннем развитии, эта функция выполняется двумя другими группами регуляторных белков: репрессорами группы Polycomb (PcG) и транскрипционными регуляторами группы trithorax (trxG) (рис. 12.1). Регуляция транскрипции НОХ состоит, следовательно, из по крайней мере двух различных фаз: установления (генами сегментации) и поддержания (генами PcG и trxG) (рис. 12.2).

Рис. 12.1. Концепция клеточной памяти

Схематическая иллюстрция, освещающая роль комплексов trxG в поддержании наследуемых состояний активной экспрессии генов в противоположность наследуемому сайленсингу, обусловленному комплексами PcG, как это первоначально было определено для кластера НОХ-генов у Drosophila

1.1. Идентификация генов, участвующих в поддержании детерминированного состояния

Благодаря своей роли в поддержании клеточных судеб гены PcG и trxG на целые десятилетия стали объектом интенсивных исследований. Как обсуждается в предыдущей главе, большинство генов PcG были идентифицированы по мутациям, вызывающим гомеотические трансформации в силу неспособности поддерживать репрессированные состояния транскрипции НОХ. Классическим примером фенотипа, ассоциированного с мутациями PcG, является трансформация второй и третьей пары ног в ноги первой пары. Эта гомеотическая трансформация является результатом дерепрессии гена группы ANT-C, Scr, и проявляется как появление на второй и третьей парах ног щетинок, характерных для первой пары ног и известных как зубцы половых гребешков. Этот фенотип «Polycomb», или «избыточные половые гребешки» — вместе с другими гомеотическими трансформациями, являющимися результатом неспособности поддерживать репрессию генов НОХ, — привел к идентификации более чем дюжины генов PcG у Drosophila. Большинство генов PcG кодируют субъединицы двух комплексов, участвующих в репрессии транскрипции: Polycomb Repressive Complex (PRC) 1 и PRC2 (Levine et al., 2001). PRC1 и PRC2 «нацеливаются» на участки вблизи промоторов НОХ (и других) посредством cis-регуляторных элементов, известных как элементы ответа Polycomb (PREs — Polycomb-response elements). Большое число данных позволяет предполагать, что комплексы PcG репрессируют транскрипцию, модулируя структуру хроматина (Francis and Kingston, 2001; Ringrose and Paro, 2004).

Члены группы trxG, в том числе trithorax (trx); absent, small или homeotic 1 (ash 1), absent, small или homeotic 2 (ash2) и female-sterile homeotic (fsh) изначально были идентифицированы по мутациям, имитирующим мутации НОХ типа «потери функции» у Drosophila (рис. 12.3) (Kennison, 1995). Например, мутации в trx — члене-основателе группы trxG — вызывают частичную трансформацию гальтеров в крылья (благодаря уменьшенной транскрипции Ubx); первой пары ног во вторую пару (благодаря сниженной транскрипции Sc г); и задних абдоминальных сегментов в более передние образования (благодаря сниженной транскрипции abdA и AbdB). Многочисленные другие члены trxG были идентифицированы в ходе скрининга на экстрагенные супрессоры мутаций Рс(Su(Pc)) (Kennison and Tamkun, 1988). Идея этих генетических скринингов заключалась в том, что снижение уровня белка, поддерживающего активное состояние, должно компенсировать снижение уровня репрессора PcG (рис. 12.4). Локус brahma (brm) и многочисленные другие локусы Su(Pc) были идентифицированы с помощью этого подхода, что довело общее число членов trxG до более чем 16 (табл. 12.1). Многие другие белки были классифицированы как члены trxG на основе других, менее строгих критериев, в том числе гомологии по последовательности с известными белками trxG, физической ассоциации с белками trxG, биохимической активности или влияния на транскрипцию НОХ in vitro или in vivo.

Рис. 12.2. Регуляция транскрипции НОХ

Границы транскрипции abd-A и других генов НОХ устанавливаются белками сегментации. В число этих белков входят продукты генов gap и pair-rule, подразделяющие эмбрион на 14 идентичных сегментов. В ходе последующего развития состояния «ВЫКЛЮЧЕНО» и «ВКЛЮЧЕНО» транскрипции НОХ поддерживаются повсеместно экспрессированными членами группы активаторов trxG и репрессоров PcG посредством механизмов, которые остаются мало понятными


Функциональные взаимоотношения между членами trxG и механистическая связь между функцией trxG и поддержанием клеточной судьбы являются сложными. Имеются многочисленные механизмы, посредством которых белок мог бы поддерживать соответствующий высокий уровень экспрессии гомеотического гена (генетическое определение белка trxG), не будучи специально предназначенным [devoted] активатором транскрипции, или белком, предназначенным для эпигенетического контроля. Формальные возможности для функции trxG (в дополнение к способности непосредственно активировать транскрипцию) включают способность усиливать функцию прямых активаторов, способность блокировать функцию репрессоров PcG и способность создавать «пермиссивное» состояние хроматина, облегчающее функционирование других многочисленных регуляторных комплексов. Более того, как обсуждается ниже, некоторые белки trxG играют сложную механистическую роль, которая на одних генах вносит вклад в активацию, а на других генах может вносить вклад в репрессию.

Два коротких примера иллюстрируют сложность потенциальных ролей в отношении белков trxG. Было высказано предположение, что комплексы АТФ-зависимого ремоделинга, такие как комплекс, содержащий белки trxG BRM и MOR, увеличивают способность любого сиквенс-специфичного, связывающегося с ДНК белка связываться с хроматином. Нерешенной проблемой является вопрос о том, может ли этот АТФ-зависимый комплекс ремоделинга использовать эту способность стимулировать и активацию генов посредством увеличенного связывания активаторов, и репрессию посредством увеличенного связывания репрессоров. Другие исследования привели к гипотезе о том, что некоторые комплексы белков trxG могли бы функционировать главным образом путем блокирования способности PcG-репрессорного комплекса функционировать, и что репрессия белками PcG является состоянием «по умолчанию». Таким образом, в этом последнем случае роль в поддержании активного состояния некоторыми белками trxG могла бы отражать косвенные, в противоположность прямым, действия. Эволюционный консерватизм этого семейства и консервативные функции этого семейства наводят на мысль: механизмы какого типа нужны для поддержания соответствующего уровня активации главных регуляторных генов, определяющих клеточную судьбу.

1.2. Белки trxG у других организмов

Функциональные аналоги по существу всех белков trxG Drosophila имеются у млекопитающих, в том числе у человека (табл. 12.1). Генетические и биохимические исследования показали, что белки мух и млекопитающих играют весьма консервативную роль и в экспрессии генов, и в развитии. Хорошим примером функционального консерватизма белков trxG является MLL, ортолог trx Drosophila у млекопитающих. Мутации в MLL вызывают гомеотические трансформации аксиального скелета мышей благодаря неспособности поддерживать активную транскрипцию генов НОХ (Yu et al., 1995,1998). Функционирование как MLL, так и trx в качестве метилтрансфераз лизинов в гистонах (HKMTs) и прямое доказательство функциональной гомологии между этими двумя белками было получено при использовании MLL человека для частичного «спасения» дефектов развития, возникающих в результате утраты функции trx у мух (Muyrers-Chen et al., 2004). Таким образом, механизмы, лежащие в основе поддержания детерминированного состояния, были высококонсервативными в ходе эволюции.

Рис. 12.3. Примеры трансформаций клеточной судьбы в развитии, связанных с мутациями в генах trxG y Drosophila

(А) Нога первой пары, дикий тип. Половой гребешок, уникальный для первой пары ног, помечен стрелкой. (Б) Участок мутантной по kis ткани (маркирован стрелкой) частично трансформирован от ног первой пары в ноги второй пары благодаря сниженной транскрипции Scr, хотя и недостаточной, на что указывает уменьшение числа зубцов полового гребешка. (В) Участок мутантной по тог ткани (маркирован стрелкой) обнаруживает частичную трансформацию из жужжальца в крыло благодаря сниженной экспрессии Ubx. (Г) Участок мутантной по kis ткани (маркирован стрелкой) в пятом абдоминальном сегменте частично трансформирован к более передней идентичности благодаря сниженной экспрессии Abd В, на что указывает утрата темной пигментации, характерной для этого сегмента. (А, Б, Г — перепечатано, с любезного разрешения, из Daubesse et al., 1999)

Рис. 12.4. Мутации trxG блокируют дерепрессию генов Нох у мутантов PcG

(а) Ножные имагинальные диски, окрашенные антителами против белка, кодируемого геном Нох, Scr, который специфицирует идентичность лабиального и первого торакального сегментов, в том числе первой пары ног. (б) Базитарзальные сегменты ног взрослых особей дикого типа и мутантных. Обратите внимание на присутствие зубцов полового гребешка на ноге первой, но не второй и третей пары у взрослых особей дикого типа. Ген Scr частично дерепрессирован во вторых и третьих ножных дисках, где в норме он «молчит», у особей, гетерозиготных по мутациям в генах PcG, что приводит к появлению эктопических зубцов полового гребешка на ногах второй и третьей пары. Эти фенотипы супрессируются мутациями в brm и многих других генах trxG (а — перепечатано, с любезного разрешения, из Tamkun et al., 1992 [©Elsevier]; б — часть с изменениями, с любезного разрешения, из Kennison, 2003 [©Elsevier].)

Таблица 12.1. Биохимические функции белков trxG

Рак и другие заболевания человека могут быть результатом неспособности поддерживать наследуемое состояние экспрессии генов. Неудивительно, что многие гены PcG и trxG у человека функционируют как протоонкогены или гены-супрессоры опухолей. Например, ген MLL из группы trxG у человека первоначально был идентифицирован по хромосомным транслокациям 1 lq23, ассоциированным с острой лимфобластозной (ALL) или миелоидной (AML) лейкемией. Мутации в других генах trxG млекопитающих также ассоциируются с различными раковыми заболеваниями (дополнительные детали см. в главе 23). Например, BRG1, аналог гена brm Drosophila у человека, физически взаимодействует с белком-супрессором опухоли ретинобластомы; нарушение этого взаимодействия приводит к ускоренному клеточному делению и злокачественной трансформации в некоторых линиях опухолевых клеток человека (Dunaief et al, 1994; Strober et al., 1996). В согласии с ролью BRG1 в супрессии опухоли мыши, гетерозиготные по мутациям в этом гене, склонны к образованию разнообразных опухолей (Bultman et al., 2000). Мутации в INI 1, человеческом аналоге гена группы trxG SNF5-related gene 1 (SNR1) у Drosophila, также делают их носителей предрасположенными к раку и были идентифицированы в большом проценте злокачественных рабдоидных опухолей (агрессивный рак у детей) (Versteege et al., 1998). Эти и другие связи с заболеваниями у человека дали исследователям дополнительную мотивацию к пониманию механизма действия белков trxG.

1.3. Белки trxG играют разные роли в эукариотической транскрипции

Группа активаторов trxG — это большая и функционально разнообразная группа регуляторных белков. Это может отражать сложность эукариотической транскрипции, включающей высокорегулируемые взаимодействия между геноспецифичными активаторами транскрипции, многочисленными компонентами общей транскрипционной машины и транскрибируемой матрицей ДНК Активация транскрипции включает связывание сиквенс-специфичных активирующих белков, рекрутирование этими белками общей транскрипционной машины, формирование преинициационного комплекса, в котором РНК-полимераза II связывается с промотором, раскрытие спирали ДНК возле этого промотора, эффективный уход РНК-полимеразы от промотора и эффективную элонгацию РНК-полимеразы через данный ген.

Способность поддерживать состояние активной транскрипции могло бы включать любой из многочисленных этапов, необходимых для активации, поскольку на любом данном гене разные этапы могли бы играть роль, определяющую скорость процесса для транскрипционной активности. Упаковка эукариотической ДНК в хроматин представляет еще один уровень, на котором белки trxG могут регулировать транскрипцию Нуклеосомы и другие компоненты хроматина обнаруживают тенденцию к подавлению связывания общих и ген-специфичных транскрипционных факторов с ДНК, а также к подавлению элонгации РНК-полимеразы. Изменения в структуре хроматина — в том числе изменения в структуре и позиционировании нуклеосом — могут влиять практически на каждый этап в процессе транскрипции.

Любой белок, необходимый для транскрипции, требуется для поддержания активного состояния. Действительно, некоторые белки trxG могут играть сравнительно общие роли в транскрипции, а не быть предназначенными исключительно для поддержания детерминированного состояния. Однако другие белки trxG могут играть специализированные роли в этом процессе, либо непосредственно противодействуя репрессии, осуществляемой PcG, либо поддерживая наследуемые состояния активности генов в ходе репликации ДНК и митоза. Этот последний класс белков trxG представляет особый интерес для биологии развития.

2. Связи между белками trxG и хроматином

Генетические исследования, показывающие, что гены trxG играют ключевые роли в транскрипции и развитии, стимулировали значительные усилия, направленные на понимание биохимической функции их продуктов. Многие из этих экспериментов использовали в качестве своей концептуальной базы гипотезу, согласно которой хроматин является биологически релевантным субстратом для белков trxG. Все гены упакованы в хроматин, и эта упаковка может создать компактное и недоступное состояние или же может находиться в открытом и пермиссивном состоянии. И пермиссивное, и недоступное состояния, по-видимому, могут быть наследуемыми. Эти соображения привели к простой гипотезе, согласно которой белки trxG могли бы модулировать структуру хроматина и влиять на регуляцию. Более того, поскольку гены trxG были клонированы и секвенированы, стало очевидным, что некоторые из их продуктов родственны белкам, участвующим в АТФ-зависимом ремоделинге хроматина или ковалентной модификации нуклеосомных гистонов у других организмов, в том числе у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Таким образом, хотя у дрожжей отсутствуют гены НОХ или репрессоры PcG, этот организм дал ценные сведения о потенциальной роли белков trxG в эукариотической транскрипции.

Одна из первых связей между trxG и хроматином вытекала из открытия, показавшего, что trxG-ген brm у Drosophila является близкородственным SWI2/SNF2 дрожжей (Tamkun et al., 1992). SWI2/SNF2 был идентифицирован в ходе скрининга на гены, участвующие в переключении типа спаривания (гены switch [xw/]) и сбраживании сахарозы (гены sucrose-nonfermenting [snf]). Впоследствии было показано, что SWI2/SNF2 необходим для активации многочисленных индуцибельных генов дрожжей (Holstegeetal., 1998; Sudarsanametal., 2000). Дефекты транскрипции, наблюдаемые у мутантов swi2/ snf2, супрессируются мутациями в нуклеосомных гистонах; это раннее наблюдение впервые позволило предположить, что SWI2/SNF2 активирует транскрипцию путем противодействия репрессии хроматина (Kruger et al., 1995). Биохимические исследования, проведенные в начале 1990-х годов, подтвердили эту гипотезу; SWI2/ SNF2 и многие другие белки, идентифицированные в ходе скрининга на swi2/snf2, функционируют как субъединицы большого белкового комплекса (SWI/SNF), использующего энергию гидролиза АТФ для увеличения способности белков связываться с нуклеосомной ДНК (Cote et al., 1994; Imbalzano et al., 1994; Kwon et al., 1994). SWI2/SNF2 функционирует как субъединица АТФазы, или «двигатель», этой машины ремоделинга хроматина; другие субъединицы комплекса SWI/SNF опосредуют взаимодействия с регуляторными белками или с его хроматиновым субстратом (Phelan et al., 1999).

На еще одну связь между trxG и хроматином указывало наличие доменов SET в белках Trithorax (TRX) и Absent (малый, или гомеотический — ASH1) группы trxG. Домен SET был первоначально определен по отрезку аминокислотной последовательности, обнаруживающему гомологию между Su(var)3-9, Enhancer of zeste (E(z)) и TRX; последние два белка являются членами PcG и trxG, соответственно. В конце 1990-х годов было показано, что белки семейства SET обладают активностью НКМТ. Su(var)3-9 метилирует H3K9, тогда как (E(z)) метилирует H3K27 (Rea et al., 2000; Levine et al., 2004; Ringrose and paro, 2004) Как обсуждается в других главах, метилирование H3K9 стимулирует сборку гетерохроматина, тогда как метилирование H3K27 оказывается необходимым для PcG-репрессии (более детальное обсуждение см. в главах 5 и 11, соответственно). Присутствие доменов SET в белках trxG позволило предположить, что метилирование «хвостов» гистонов могло бы иметь важное значение для поддержания активных транскрипционных состояний.

Эти открытия, вместе с растущим пониманием, что ферменты ремоделинга и модификации хроматина играют ключевую роль в активации транскрипции, побудили биохимиков идентифицировать белковые комплексы, содержащие белки trxG, и изучить влияние этих комплексов на структуру хроматина in vitro. Другие эксперименты имели своей целью проверку гипотезы о том, что белки trxG могли бы взаимодействовать непосредственно с транскрипционной машиной (еще один хорошо установленный способ влиять на регуляцию) Как описано ниже, эти исследования показали, что некоторые белки trxG влияют на регуляцию посредством модификации структуры хроматина, тогда как другие функционируют путем прямых взаимодействий с компонентами транскрипционной машины.

2.1. Белки trxG, участвующие в АТФ-зависимом ремоделировании хроматина

Участие комплексов ремоделинга хроматина предполагалось в самых разных биологических процессах, в том числе в репрессии и активации транскрипции, сборке хроматина, регуляции структуры хроматина более высокого порядка и в клеточной дифференцировке. Наиболее всесторонне изученными белками trxG, участвующими в ремоделинге хроматина, являются BRM и его аналоги у человека, BRG1 и HBRM. Как и предсказывалось, эти белки функционируют как АТФазные субъединицы комплексов, очень близко родственных SWI/SNF дрожжей (Kwon et al., 1994; Wang et al., 1996). Комплексы SWI/SNF сотержат от 8 до 15 субъединиц и были очень консервативны в ходе эволюции (рис. 12.5). АТФаза каждого из этих комплексов способна функционировать как отдельная субъединица. Хотя на это семейство белков исторически ссылались как на содержащее «геликазный» мотив (в силу сходства их АТФазного домена с доменом истинных геликаз), никогда не было показано, что эти белки, родственные BRM, обладают геликазной активностью; скорее, для влияния на изменения в структуре хроматина они используют другие механизмы, такие как транслокацию вдоль ДНК (Whitehouse et al., 2003; Saha et al., 2005). Второй trxG-ген, идентифицированный при этом скрининге, moira (тог), кодирует еще один ключевой член этого АТФ-зависимого ремоделирующего комплекса у Drosophila, а гомологи BRM и MOR взаимодействуют непосредственно и формируют функциональный кор SWI/ SNF у человека (Phelan et al., 1999).

SWI/SNF и другие комплексы ремоделинга хроматина используют энергию гидролиза АТФ для изменения структуры или позиционирования нуклеосом. Катализируя АТФ-зависимые изменения в структуре хроматина, комплексы ремоделинга хроматина помогают транскрипционным факторам и другим регуляторным белкам получить доступ к нуклеотидным последовательностям ДНК, которые в норме были бы закрыты гистоновыми белками (Polach and Widom, 1995; Logie and Peterson, 1997). Среди моделей создания доступа к специфическим сайтам — «скольжение» гистонов по ДНК для перемещения сайта в линкерный участок, выпетливание ДНК из гистонового октамера или же (самый крайний вариант!) выселение всего гистонового октамера в другое место в ядре (рис. 12.6). АТФ-зависимый ремоделинг может также приводить к изменениям в положении нуклеосом вдоль нуклеотидной последовательности ДНК, к изменениям в спейсинге нуклеосом и к перемещениям гистонов в гистоновый октамер (являющийся кором нуклеосомы) и из него. Другие ремоделирующие комплексы обнаруживают разную склонность к выполнению каждой из этих функций.

Puc. 12.5. Семейство ремоделирующих комплексов SWI/SNF

Каждый комплекс содержит член SNF2/SWI2-семейства АТФаз и по крайней мере восемь других субъединиц, (а) Схематическое изображение белка BRM, показывающее расположение АТФазного домена и карбокситерминального бромодомена (обнаруживающего сродство к ацетилированным остаткам лизина в гистоновых «хвостах»), которые консервативны у всех членов семейства SNF2/SWI2. Показаны цветом комплексы SWI/SNF у дрожжей (б), Drosophila (в) и человека (г). Дальнейшую информацию об этих комплексах и их субъединицах можно найти в Mohrmann and Verrijzer. 2005

б Обмен гистонов


Рис. 12.6. Механизмы АТФ-зависимого ремоделинга

Модели ремоделирования хроматина иллюстрируются показом изменения в положении или составе нуклеосом относительно ДНК, обернутой вокруг них. Центральная часть рисунка показывает стартовый район хроматина, где линкерная ДНК изображена желтым цветом, а нуклеосомная ДНК — красным, (а) Движение нуклеосомы трансляционно вдоль ДНК (скольжение) для открытия участка (отмеченного красным цветом), который ранее был закрыт; (б) обмен стандартного гистона на вариантный гистон для создания вариантной нуклеосомы; (в) вытеснение нуклеосом для открытия большого района ДНК. Этот механизм мог бы зависеть от других белков, таких как гистоновые шапероны или факторы, связывающиеся с ДНК, в дополнение к белкам ремоделлинга; (г) создание петли на поверхности нуклеосомы. Гипотетически предполагается, что ремоделеры семейства SWI/ SNF используют альтернативные механизмы, такие как создание стабильных петель ДНК на поверхности нуклеосомы, чтобы сделать доступными сайты, являющиеся центральными для этой нуклеосомы


У высших эукариот комплексы SWI/SNF весьма многочисленны; например, каждое ядро млекопитающих содержит около 25 ООО копий комплексов семейства SWI/SNF. Биохимические анализы показывают, что комплексы SWI/SNF способны открывать доступ к необычно широкому спектру сайтов в нуклеосоме по сравнению с другими АТФ-зависимыми комплексами ремоделинга хроматина (Fan et al., 2003). Например, комплексы SWI/SNF способны эффективно обеспечивать доступ к сайтам в центре мононуклеосомы, что в энергетическом отношении затруднительно, поскольку сайты в центре нуклеосомы имеют приблизительно 70 пар оснований ограниченной [constrained] нуклеосомной ДНК с каждой стороны. Вызывается ли это необычно мощной способностью использовать энергию гидролиза АТФ по сравнению с другими ремоделерами или же, вместо этого, представляет другой механизм ремоделинга, является темой текущих исследований (Kassabov et al., 2003). Комплексы SWI/SNF не обнаруживают сколько-нибудь измеримой способности равномерно распределять [to space] нуклеосомы, что является отличительным признаком других комплексов ремоделинга хроматина. Они также не обнаруживают такой же степени эффективности в «свопинге» [swapping — обмен одних элементов на другие] димеров Н2А/ Н2В, как некоторые другие комплексы ремоделинга хроматина, хотя при тестировании in vitro они способны осуществлять это и перемещать октамеры (Lorch et al., 1999). Какая из этих способностей имеет отношение к функции этих комплексов в поддержании активного состояния, еще не ясно.

У каждого исследованного вида предполагалось участие комплексов SWI/SNF в транскрипционной активации. Это семейство комплексов может быть «нацелено» на гены взаимодействиями с транскрипционными активаторами, может ремоделировать нуклеосомы, помогая в первоначальном связывании общих транскрипционных факторов и РНК-полимеразы II, и может становиться «нацеленным» на более поздних стадиях процесса активации, способствуя транскрипционной элонгации. Таким образом, комплексы SW1/SNF, по-видимому, функционируют на каждом этапе процесса транскрипционной активации, хотя, по-видимому, имеет место акцент на функцию, осуществляемую на ранних этапах, ведущих к загрузке РНК-полимеразы II. Анализ с использованием микрочипов (microarray analysis) у дрожжей показывает, что помимо этих влияний, стимулирующих активацию, комплексы SWI/SNF могут также облегчать репрессию некоторых генов (Sudarsanam et al., 2000).

Одна простая гипотеза, объясняющая эти широкие функции in vivo, заключается в том, что эти ремоделирующие комплексы изменяют структуру нуклеосом таким образом, что облегчается связывание и функционирование широкого спектра разных регуляторных факторов и комплексов. Таким образом, эффективные [potent] характеристики ремоделинга, наблюдаемые in vitro, могли бы отражать способность существенно расширять доступ к регуляторным факторам in vivo. Возможно, что комплексы SWI/SNF обладают уникальной способностью создавать широкий доступ, которая может объяснять их важное значение в поддержании активного состояния.

Каждый изученный вид обладает по крайней мере двумя разными комплексами SWI/SNF, которые оба содержат BRM или близкородственную АТФазу ремоделинга хроматина. Еще один белок trxG, OSA, обеспечивает различие между этими комплексами в том отношении, что один класс комплексов содержит OS А, а еще один эволюционно консервативный комплекс содержит белок с полибромодоменом (рис. 12.6) (Mohrmann and Verrijzer, 2005). Биохимическая функция OSA не ясна. Одна привлекательная возможность заключается в том, что он мог бы «нацеливать» комплекс SWI/SNF, в котором он находится, на специфическую группу генов.

SWI/SNF — не единственный фактор ремоделинга хроматина, имеющийся в эукариотических клетках. Идентифицированы десятки различных комплексов реиоделинга хроматина, в том числе NURF, NURD, ACF и CHRAC (Vignali et al., 2000). Эти комплексы можно подразделить на несколько основных групп на основе идентичностей их АТФазных субъединиц. Комплексы SWI/SNF содержат АТФазы, родственные SWI2/SNF2; комплексы ISWI (например, NURF, CHRAC и ACF) содержат АТФазы, родственные Imitation-SWI (ISWI); наконец, комплексы CHD (например, NURD) содержат АТФазы, родственные CHD1 и Mi2.

Недавние исследования позволили предположить участие имеющегося у Drosophila kismet (kis) — члена семейства CHD факторов ремоделинга хроматина — в поддержании активного состояния. Подобно brm, mor и osa, kis был идентифицирован в ходе скрининга на экстрагенные супрессоры Рс; это позволяло предполагать, что он действует антагонистически по отношению к белкам PcG и поддерживает активные состояния НОХ-транскрипции (Kennison and Tamkun, 1988). Генетические исследования показали, что kis необходим как для сегментации, так и для поддержания HOX-транскрипции в ходе развития Drosophila (Daubresse et al., 1999; Therrien et al., 2000). Консервативные домены вне АТФазного домена (в том числе бромодомены и хромодомены) вносят свой вклад в функциональную специфичность ремоделирующих хроматин факторов, опосредуя взаимодействия с нуклеосомами или другими белками. BRM и другие АТФазные субъединицы комплексов SW1/SNF содержат единственный бромодомен (белковый мотив, ассоциированный со связыванием определенных ацетилированных гистонов), тогда как KIS-L содержит два хромодомена (белковых мотива, связывающихся с определенными метилированными гистонами) и является, следовательно, более похожим на Mi2 и другие ремоделирующие хроматин факторы, члены семейства CDH. Хотя большие размеры KIS-L (~575 кДа) затруднили биохимический анализ этого белка, его последовательность убедительно свидетельствует о том, что он активирует транскрипцию, ремоделируя хроматин

KIS-L не ассоциирован физически с BRM и хроматографически ведет себя так, как будто бы он находится в другом белковом комплексе (Srinivasan et al., 2005). Однако эти два белка существенно перекрываются друг с другом и с РНК-полимеразой II на политенных хромосомах, что позволяет предполагать, что оба они играют относительно глобальные роли в транскрипции (рис. 12.7) (Armstrong et al., 2002; Srinivasan et al., 2005). Утрата функции BRM блокирует относительно ранний этап в транскрипции (Armstrong et al., 2002), тогда как утрата функции KIS-L ведет к снижению уровня элонгации, но не инициации форм РНК-полимеразы II (Srinivasan et al., 2005). Эти открытия заставляют предполагать, что BRM и KIS-L облегчают различные этапы в транскрипции с помощью РНК-полимеразы II, катализируя АТФ-зависимые изменения в структуре или спейсинге нуклеосом.

Рис. 12.7. Распределение белков trxG в хромосомах

Распределение белков trxG по всему геному изучали с помощью окрашивания политенных хромосом слюнных желез Drosophila антителами против BRM (а) или TRX (б). В соответствии с относительно глобальной ролью BRM в активации транскрипции он связан с сотнями сайтов паттерн которых существенно перекрывается с RNA pol II. Напротив, сильные сигналы TRX выявляются в значительно меньшем числе сайтов политенных хромосом


Важный вопрос для будущих исследований касается роли, которую АТФ-зависимый ремоделинг играет в поддержании активированного состояния. Весьма интригует тот факт, что четыре члена trxG известны (BRM, KIS и OSA) или подозреваются (KIS) как члены больших АТФ-зависимых ремоделирующих хроматин комплексов, но ни один из других многочисленных АТФ-зависимых ремоделирующих комплексов не был идентифицирован в ходе генетических скринингов на trxG-белки Drosophila. Две преобладающих гипотезы (не являющиеся взаимоисключающими), предложенные для объяснения этого, заключаются в том, что ремоделирующие хроматин комплексы BRM и KIS «нацелены» на гены, важные для прогрессии развития, или что они обладают специальными характеристиками ремоделинга, которые являются уникально необходимыми для поддержания. Таким образом, возможно, что родовой [generic] АТФ-зависимый ремоделинг требуется для всех активных состояний и что для поддержания активного состояния важных для развития генов оказываются необходимыми эти члены trxG, поскольку они «нацелены» на эти гены. Возможно также, что поддержание требует специальных АТФ-зависимых функций, которые могут быть выполнены комплексами, содержащими члены trxG.

Заманчиво также думать о механизмах, которые могут использоваться ремоделерами для того, чтобы внести вклад в эпигенетическую регуляцию активного состояния. Можно представить себе три класса механизмов, к которым это могло бы относиться. Во-первых, функция ремоделинга могла бы потребоваться в каком-то косвенном режиме для облегчения связывания (или повторного связывания после репликации) генспецифичных активирующих белков, которые нужны для поддержания активной транскрипции. В этом случае ремоделеры не были бы «мозгами» эпигенетического механизма, но, вместо этого, действовали бы как инструмент, необходимый для эффективного функционирования требуемых белков. Во-вторых, ремоделеры могли бы работать одни или с гистоновыми шаперонами для вытеснения нуклеосом из данного района, и эта незанятость нуклеосомами гипотетически заставляла бы этот район оставаться ненуклеосомным после репликации. Как упоминалось выше, способность машины репликации/смещения нуклеосом точно рекапитулировать модификации или локализацию нуклеосом является важным вопросом эпигенетики, на который пока нет ответа. Наконец, механизмы ремоделинга могли бы повторно позиционировать нуклеосомы и создавать структуру, поддающуюся активации. Этот последний механизм получил экспериментальную поддержку в исследованиях гена альбумина (Chaya et al., 2001; Cirillo et al., 2002). Несколько связывающихся с ДНК факторов необходимы для поддержания активности этого ключевого гена в печени. Один из этих факторов, FoxA, связывается с сайтом на нуклеосоме, и эта специфическая конструкция «нуклеосома-FoxA» является ключевой для поддержания активного состояния гена альбумина. Хотя неясно, имеется ли необходимая роль для АТФ-зависимого ремоделинга, чтобы позиционировать эту специфическую нуклеосому в печени, этот пример показывает, что специфическое позиционирование нуклеосом обладает достаточным потенциалом, чтобы играть ключевую эпигенетическую роль [whether there is a required role for ATP-dependent remodeling to position this specific nucleosome in the liver, this example demonstrates the potential for specific nucleosome positioning to play a key epigenetic role].

2.2. Белки trxG, ковалентно модифицирующие нуклеосомные гистоны

Второй распространенный способ регулирования экспрессии генов включает ковалентную модификацию аминотерминальных «хвостов» коровых гистонов, составляющих белковый компонент нуклеосомы. Эти «хвосты», выступающие с поверхности нуклеосомы, могут опосредовать взаимодействия с другими нуклеосомами, а также с весьма разнообразными структурными и регуляторными белками. Ковалентная модификация гистоновых «хвостов» с помощью ацетилирования, метилирования или фосфорилирования может помогать «нацеливать» регуляторные комплексы на хроматин и может также непосредственно изменять способность нуклеосом компактизироваться в репрессивные структуры путем изменения заряда на этих «хвостах». Ковалентная модификация могла бы также обеспечивать метку, чтобы способствовать поддержанию специфического регулируемого состояния (поскольку ковалентно модифицированные гистоны обладают возможностью разделяться на две дочерние нити и тем самым воспроизводят информацию, содержащуюся в ковалентной метке) и передавать ее как материнской, так и дочерним клеткам после репликации. Остаются ли гистоны связанными с одной или с обеими дочерними нитями после репликации — это ключевой вопрос для потенциальных механизмов эпигенетического регулирования; вопрос этот остается спорным, по большей части в связи с поиском методов, которые позволили бы точно прослеживать индивидуальные гистоны в живых клетках.

Несколько белков trxG способны ковалентно модифицировать «хвосты» гистонов, и эти белки часто обнаруживаются в комплексах, способных осуществлять более чем один тип реакций модификации. Например, TRX Drosophila и его аналоги у других организмов метилируют гистон H3 по лизину 4 (H3K4): эта ковалентная метка прочно ассоциирована с активными генами у самых разных организмов, в том числе у дрожжей, мух и человека. Второй белок trxG, ASH1 (см. ниже), также обладает H3K4-метилтрансферазной активностью (Beisel et al., 2002; Byrd and Sheam, 2003). Подразумевалось, что H3K4-метилирование связано с поддержанием активной экспрессии генов у дрожжей, исходя из времени его появления и исчезновения на активных генах (Santos-Rosa et al., 2002; Pokholok et al., 2005). Тот факт, что члены trxG обладают этой модификационной (в отношении гистонов) активностью, еще больше связывает метку H3K4 с поддержанием активного состояния.

У дрожжей и у человека аналоги TRX обнаруживаются в комплексе, который содержит также третий белок группы trxG, Ash2, по последовательности не родственный Ash1 Дрожжевой гомолог trithorax, Setl, обнаруживается в комплексе (COMPASS или Set 1C), который имеет величину приблизительно 400 кДа и содержит пять других белков кроме Setl и Ash2 (Miller et al., 2001; Roguev et al., 2001). Единственной известной биохимической активностью этого комплекса является метилирование H3K4; пока еще не ясно, какова могла бы быть функция каждого из других белков, хотя один компонент мог бы способствовать воспроизведению метальной метки (см. ниже).

У человека имеются три гомолога TRX, называемые MLL1, MLL2 и hSETl. Белок MLL1 привлек наибольшее внимание в биохимических анализах и обнаруживается в большом комплексе (>10 членов), который содержит также человеческий гомолог ASH2 (Hughes et al., 2004; Yokoyama et al., 2004). Этот комплекс и дрожжевой комплекс оба содержат повторяющийся белок [repeat protein] WD40, который у человека называется WDR5 (Dou et al., 2005; Wysocka et al., 2005). Недавно было показано, что белок WDR5 может связываться с гистоном H3, который был метилирован по лизину 4 (Wysocka et al., 2005). Таким образом, связывание этого белка с меткой, созданной комплексом MLL1, в котором он находится, могло бы дать механизм для облегчения распространения этой метки. Это сходно с предположениями, сделанными относительно репрессивных комплексов, метилирующих H3K9, которые содержат НР1, белок, специфически связывающийся с метилированным К9 (дополнительные детали см. в главах 5 и 6).

Имеются данные, полученные как на Drosophila, так и на человеке, о том, что комплекс, содержащий TRX/ MLL, участвует также в ацетилировании. У человека MLL ассоциирован с ацетилтрансферазой MOF, которая ацетилирует лизин 16 гистона Н4, что является еще одной модификацией, связанной в норме с активацией (Dou et al., 2005). У мух TRX ассоциирован с dCBR — ацетилтрансферазой с широкой специфичностью, которая участвует в активации (Petruk et al., 2001). Ацетилирование могло бы работать совместно [synergistically] с метилированием H3K9, направляя активное состояние после функционирования этих комплексов trxG. Известно также, что ацетилирование предотвращает метилирование таких остатков, как H3K9 и H3K27, которые направляют репрессию матрицы.

Белок ASH1, еще один член trxG, тоже является метилтрансферазой гистонов, которая метилирует H3K4 (Beisel et al., 2002; Byrd and Sheam, 2003). Состав ни у одного комплекса, содержащего ASH1, не был установлен; непонятно также, как координируются активности ASH1 и комплексов, содержащих TRX/MLL1/SET1. Однако наблюдали также, что ASH1 колокализуется и ассоциируется с семейством ацетилтрансфераз СВР (Bantignies et al., 2000), что опять-таки предполагает, что метилирование и апетилирование идут рука об руку.

Существуют захватывающие, но все еще остающиеся без ответа вопросы относительно того, каким образом ковалентная модификация гистонов могла бы вносить вклад в функцию trxG. Какую функциональную роль играют метки? Ковалентная модификация может вносить свой вклад в эпигенетическое регулирование с помощью широкого спектра механизмов. Метки метилирования и ацетилирования могли служить для непосредственного изменения компактизации хроматина (иногда это обозначается как cis-эффекты, как на рис. 3.8). На способность хроматина входить в компактизированное состояние, которое, как обычно принимается, является репрессивным для транскрипции, влияет распределение зарядов на гистоновых «хвостах». Модификации, происходящие на лизине (например, ацетилирование), могут устранять положительный заряд, в норме обнаруживаемый с этим остатком, и, следовательно, могут прямо снижать способность нуклеосом формировать компактные структуры, повышая таким образом способность матрицы к транскрипции.

Предположили, что ковалентные метки создают сайты прочного связывания для комплексов, управляющих [direct] транскрипционной активацией. Эти ковалентные модификации способны создавать специфические «выросты» [«knobs»] на поверхности нуклеосом, которые соответсвуют «карманам» на комплексах, стимулирующих активацию, увеличивая таким образом энергию связывания и функцию этих комплексов. Например, ацетилирование гистоновых «хвостов» увеличивает связывание гомологами белка BRM, стимулируя таким образом АТФ-зависимый ремоделинг ацетилированных матриц (Hassan et al., 2001). Механизм этого типа, часто обозначаемый как «гистоновый код» или trans-эффекты ковалентных модификаций гистонов, потенциально может быть центральной эпигенетической функцией. Нужны дальнейшие исследования, чтобы определить, какие именно метки, созданные белками trxG, усиливают связывание каких именно комплексов, определить степень, с какой энергия связывания с одним модифицированным остатком может влиять на функцию и «нацеливание», и определить временной порядок добавления этих меток и возможность их поддержания при митозе.

Оборотная сторона этого механизма заключается в том, что эти метки могли бы подавлять связывание репрессивными комплексами. Ковалентная метка на ключевом остатке, необходимом для оптимального связывания каким-то репрессивным комплексом, могла бы сильно ингибировать связывание этим репрессивным комплексом. Например, известно, что связывание репрессивными комплексами увеличивается метилированием гистона H3 по К9 и К27 (Khorasanizadeh, 2004). Ацетилирование этих остатков и блокировало бы метилирование, и создавало бы «вырост» неправильной формы на гистоне, ослабляющий связывание этим репрессивным комплексом. Таким образом, способность модификаций влиять на функцию других комплексов может работать в обоих направлениях [cut in both directions], увеличивая действенность этого потенциального способа эпигенетической регуляции.

Эти механизмы не только не являются взаимоисключающими, но вероятно работают совместно, помогая поддерживать активное состояние. Метки, которые химически увеличивают возможность формировать компактное состояние (cis-эффект), могли бы также увеличивать способность комплексов связываться (trans-эффект) и еще более [further] стимулировать компактное состояние. Наоборот, метки которые химически уменьшают компактизацию, могли бы увеличивать связывание комплексов, которые также декомпактизируют нуклеосомы. Это механистически экономное использование ковалентных меток для изменения нескольких характеристик структуры хроматина и способности регуляторных комплексов связываться могло бы создавать мощные средства поддержания активного состояния.

3. Связи между белками trxG и общей транскрипционной машинерией

Тема частого обнаружения белков trxG в одном и том же комплексе продолжается белками skuld (skd) и kohtalo (kto). Эти два белка являются гомологами белков, биохимически идентифицированных как TRAP240 (Skuld) и TRAP230 (Kohtalo), которые оба являются членами комплекса «Mediator» (Janody et al., 2003). Этот медиаторный комплекс является крупным комплексом, функционирующим на поверхности раздела между ген-специфичными активаторными белками и образованием преинициационного комплекса, содержащего PH К-полимеразу II (Lewis and Reinberg, 2003). Таким образом, эти белки участвуют в общих активационных процессах, во многом таким же образом, каким в общей активации участвуют ремоделеры семейства SWI/SNF. SKD и КТО могли бы иметь некоторую специальную функцию, связанную с поддержанием, поскольку другие компоненты этого медиаторного комплекса не были идентифицированы при скрининге на гены trxG. Наблюдение, согласно которому SKD и КТО взаимодействуют друг с другом и согласно которому двойные мутанты skd kto имеют такой же фенотип, что и одиночные мутанты, привело к гипотезе о том, что эти два белка вместе образуют функциональный модуль, который каким-то образом изменяет действие медиатора (Janody et al., 2003).

4. Биохимические функции других белков trxG

Биохимические активности большинства других белков trxG остаются довольно таинственными. Ring3, человеческий аналог гена female-sterile homeotic (fsh) из группы trxG у Drosophila, кодирует ядерную протеинкиназу с двумя бромодоменами, для которой предполагается участие в продвижении по клеточному циклу и в лейкемогенезе, но субстраты которой в настоящее время неизвестны (Denis and Green, 1996). Ген Tonalli (Тпа) из группы trxG кодирует белок, родственный белкам SPRING finger, участвующим в сумоилировании, что позволяет предполагать, что он может также регулировать транскрипцию через ковалентную модификацию других, все еще неидентифицированных, белков (Gutierrez et al., 2003). Ген sallimus (sis) из группы trxG был идентифицирован при скрининге на экстрагенные супрессоры Рс (Kennison and Tamkun, 1988) и впоследствии оказался кодирующим Titin у Drosophila (Machado and Andrew, 2000). Подобно своему аналогу у позвоночных, Titin у Drosophila помогает поддерживать целостность и эластичность саркомера. Кроме того, Titin является хромосомным белком, необходимым для конденсации и расхождения хромосом (Machado and Andrew, 2000). Эти интригующие открытия позволяют предположить потенциальную роль белков trxG в регулировании структуры хроматина более высокого порядка.

5. Функциональные взаимодействия между белками trxG

Теперь, когда идентифицированы основные биохимические активности многих членов trxG и PcG, внимание переключилось на способ, каким эти активности скоординированы для регулирования транскрипции и поддержания активного состояния. Несмотря на отсутствие систем in vitro для изучения поддержания детеминированного состояния, в этом направлении был достигнут значительный прогресс. Одна популярная гипотеза заключается в том, что члены trxG и Peg облегчают последовательность зависимых событий, необходимых для поддержания активного или репрессированного состояния. Поддержка этой идеи пришла из недавних исследований PcG-комплексов PRC1 и PRC2; субъединица метилазы гистонов E(z) из комплекса PRC2, метилируя H3K27, создает ковалентную метку, которая непосредственно распознается хромодоменом субъединицы Рс комплекса PRC1 (Jacobs and Khorasanizadeh, 2002; Min et al., 2003). Таким образом, оказывается, что один комплекс PcG прямо стимулирует связывание другого комплекса PcG с хроматином

По аналогии возможно, что ковалентная модификация нуклеосом членами trxG, обладающими активностями метилтрансферазы или ацетилтрансферазы гистонов (например, TRX или ASH1), непосредственно регулирует «нацеливание» или активности членов trxG, участвующих в АТФ-зависимом ремоделинге хроматина (например, BRM [SWI/SNF], или KIS) (рис. 12.8). С этой возможностью согласуется тот факт, что BRM и другие субъединицы комплексов SWI/SNF содержат бромодомены, которые могут непосредственно взаимодействовать с ацетилированными «хвостами» гистонов, a KIS содержит два хромодомена, которые могут прямо взаимодействовать с метилированными «хвостами» гистонов. Эта модель, в пользу которой свидетельствуют недавние исследования факторов ремоделинга хроматина как у дрожжей, так и у млекопитающих (Agalioti et al., 2000; Hassan et al., 2001), является особенно привлекательной, потому что она обеспечивает механизм, посредством которого наследуемая модификация гистонов могла бы воспроизводить конститутивно «открытую» конфигурацию хроматина, пермиссивную для активной транскрипции.

6. Белки trxG: активаторы или антирепрессоры?

Еще одна важная проблема касается функциональных отношений между репрессорами PcG и активаторами trxG. Играют ли эти регуляторные белки независимые роли в активации и репрессии или же они функционируют в прямом противодействии, чтобы поддерживать наследуемое состояние? Недавние генетические исследования показывают, что удаление комплексов PcG обычно реактивирует гены даже в отсутствие TRX и ASH1 (Klymenko and Muller, 2004), что позволяет предположить, что белки trxG с активностью метилтрансферазы гистонов могут функционировать как антирепрессоры PcG в противоположность активаторам (рис. 12.8).

И биохимические, и генетические анализы доказывают, что могут существовать прямые связи между функцией trxG и функцией PcG. Одно интересное свойство белков PcG заключается в том, что они способны репрессировать транскрипцию, когда оказываются вблизи практически любого гена, транскрибируемого PH К-полимеразой И. Члены trxG, играющие глобальную роль в транскрипции, — в том числе BRM, KIS и другие члены trxG, участвующие в ремоделинге хроматина, — оказываются таким образом превосходными кандидатами на роль прямых мишеней репрессоров PcG (рис. 12.8). Один из главных комплексов PcG, комплекс PRC1, блокирует функцию комплексов ремоделинга из семейства SWI/SNF, очевидно путем блокирования доступа этого комплекса к матрице (Francis et al., 2001). Это согласуется с представлением о том, что один механизм репрессии PcG мог бы заключаться в том, чтобы предотвращать АТФ-зависимый ремоделинг членами trxG. Комплекс Brahma и PRC1 связывает, сверх того, тот факт, что оба они непосредственно взаимодействуют с белком Zeste — белком, играющим сложную роль в регулировании экспрессии генов у Drosophila, который мог бы способствовать прямым «переговорам» между этими двумя комплексами.

Вторым белком, связывающим белки PcG и белки trxG, является фактор GAGA, который кодируется геном Trithorax-like и который, таким образом, является членом trxG (Farkas et al., 1994). Этот белок может функционировать в некоторых промоторах как сиквенс-специфичный активаторный белок, но и является также заметным членом группы белков, которые связываются с репрессивным элементом Polycomb (PRE — Polycomb Repressive Element; глава 8). Нуклеотидные последовательности PRE управляют функцией PcG, и по крайней мере один PRE может действовать как модуль памяти, будучи присоединен к репортерному конструкту, что подчеркивает важность этих последовательностей. Нуклеотидные последовательности, связывающиеся с фактором GAGA, играют важную роль в функционировании PRE, и предполагается, что привязка белка GAGA к ДНК усиливает связывание и функционирование PRC1 (Mahmoudi and Verrijzer, 2001). Таким образом, фактор GAGA мог бы играть ключевые роли в поддержании активации (через его активирующие транскрипцию свойства) и в поддержании репрессии (через взаимодействия с белками PcG). Важная проблема для будущих исследований — понять, почему такие белки, как GAGA и Zeste оказываются взаимодействующими как с активирующей, так и с репрессирующей машинами, обеспечивающими поддержание состояния.

7. Выводы и перспективы

Две из основных проблем, касающихся функции белков trxG, остаются в значительной мере в области догадок. Во-первых, почему относительно небольшая подгруппа белков, необходимых для транскрипционной активации, генетически оцениваются как важные для поддержания активного состояния? Не происходит ли это потому, что эти белки играют глобальную роль в транскрипции, но экспрессируются в лимитирующих количествах, или случайно, благодаря счастливой способности эволюции к открытиям, стали особенно важными для генов, играющих важную роль в развитии? Во-вторых, каким образом активное состояние может поддерживаться при репликации и митозе? Репликация создает две дочерние нити, которые обе должны регулироваться идентично, а митоз требует конденсации и, тем самым, подавления транскрипции большинства генов в клетке. Какие механизмы создают эпигенетическую метку (метки), обеспечивающую реактивацию гена на обеих дочерних нитях после митоза?

Большинство белков trxG являются частью комплексов, широко используемых в экспрессии генов, и большинство этих комплексов содержат также многие другие белки, не входящие в trxG (табл. 12.1). Это ставит важный вопрос о том, существуют ли специальные функции, используемые для поддержания активной экспрессии генов. Возможно, что ремоделеры SWI/ SNF способны выполнять специальную функцию ремоделинга. что метилирование H3K4 «нацеливает» специальные комплексы и (или) конформации хроматина и что Skuld/Kohtalo изменяют функционирование Mediator каким-то специфическим образом, важным для поддержания. Как альтернатива, возможно, что каждый из этих белков осуществляет реакцию, в норме используемую для активации генов всех типов, и что эти комплексы находятся среди тех, которые возникли как существенные для поддержания по относительно неинтересной причине (например, потому, что даже сравнительно слабые изменения в экспрессии генов НОХ у Drosophila вызывают гомеотические трансформации) Для решения этих проблем нужно значительно больше сведений о точных механизмах, используемых каждым из этих белков в активации. Например, используют ли комплексы SWI/SNF энергию гидролиза АТФ таким же образом, как другие АТФ-зависимые комплексы, или же они отличаются каким-то важным образом в том, как эта энергия используется для изменения структуры нуклеосом? Структурные методы, включающие кристаллографию, биофизические методы, такие как анализ одиночных молекул [single-molecule analysis] и метод FRET (fluorescence resonance energy transfer) и получение детальных изображений in vivo, могли бы помочь пролить свет на то, существуют ли механизмы, специально предназначенные для эпигенетического поддержания активации. Начальные функциональные исследования, проведенные с комплексами trxG на простых модельных матрицах, являются всего лишь началом процесса поисков ответов на эти важные вопросы.

Рис. 12.8. Функции и взаимодействия группы Trithorax и группы Polycomb

И семейство trxG, и семейство PcG включает белки, ковалентно модифицирующие гистоны, и белки, нековалентно модифицирующие хроматин. Ковалентные модификации на гистонах могут увеличивать связывание с такими нековалентно модифицирующими комплексами, как SWI/SNF, KIS или PRC1. Связывание с этими последними комплексами обладает возможностью приводить к дальнейшей ковалентной модификации, приводя таким образом к повторяющимся циклам ковалентной модификации и распознавания этих ковалентных меток


Эпигенетические механизмы, которые могли бы поддерживать активное состояние, выяснены в еще меньшей степени. Распределены ли ковалентные метки таким образом, чтобы помочь создать активную метку? Поддерживаются ли позиции нуклеосом после репликации, чтобы создавать «открытые» отрезки хроматина или специально позиционированных нуклеосом, которые увеличивают связывание активаторов? Заставляет ли функционирование trxG активные гены компартментализироваться в ядре в районы, благоприятные для активной транскрипции? Это все жизнеспособные гипотезы; существует еще больше гипотез, а иные еще даже не сформулированы. Неимоверная сложность машинерии, транскрибирующей ДНК, обусловливает многочисленные возможности регулирования и развития механизмов, которые делают возможным эпигенетическое поддержание активной транскрипции Это пересечение двух богатых интеллектуальной историей областей, а именно активации транскрипции и эпигенетического механизма будет благодатной почвой для экспериментаторов на протяжении многих лет

Литература

Agalioti Т., Lomvardas S., Parekh В., Yie J., Maniatis Т., and Thanos D., 2000. Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-p promoter. Cell 103: 667-678.

Armstrong J.A., Papoulas O., Daubresse G., Sperling A.S., Lis J.T., Scott M.P., and Tamkun J.W., 2002. The Drosophila BRM complex facilitates global transcription by RNA polymerase II. EMBO J. 21: 5245-5254.

Bantignies R., Goodman R.H., and Smolik S.М., 2000. Functional interaction between the coactivator Drosophila CREB-binding protein and ASH 1, a member of the trithorax group of chromatin modifiers. Mol. Cell. Biol., 20: 9317-9330.

Beisel C., Imhof A., Greene J.. Kremmer E., and Sauer F., 2002. Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ash 1. Nature 419: 857-862.

Bultman S., Gebuhr Т., Yee D., La Mantia C., Nicholson J., Gilliam A., Randazzo F., Metzger D., Chambon P., Crabtree G., and Magnuson Т., 2000. A Brgl null mutation in the mouse reveals functional differences among mammalian SWI/SNF complexes. Mol. Cell 6: 1287-1295.

Byrd K.N. and Sheam A., 2003. ASH1, a Drosophila trithorax group protein, is required for methylation of lysine 4 residues on histone H3. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 11535-11540.

Chaya D., Hayamizu Т., Bustin М., and Zaret K.S., 2001. Transcription factor FoxA (HNF3) on a nucleosome at an enhancer complex in liver chromatin. J. Biol. Chem. 276: 44385-44389.

Cirillo L.A., Lin F.R., Cuesta I., Friedman D., Jamik М., and Zaret K.S., 2002. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Mol. Cell 9: 279-289.

Cote J., Quinn J., Workman J.L., and Peterson C.L., 1994. Stimulation of GAL4 derivative binding to nucleosomal DNA by the yeast SWI/SNF complex. Science 265: 53-60.

Daubresse G., Deuring R., Moore L., Papoulas O., Zakrajsek 1., Waldrip W.R., Scott M.P., Kennison J.A., and Tamkun J.W., 1999. The Drosophila kismet gene is related to chromatin-remodeling factors and is required for both segmentation and segment identity. Development 126: 1175-1187.

Denis G.V. and Green M.R., 1996. A novel, mitogen-activated nuclear kinase is related to a Drosophila developmental regulator. Genes Dev. 10: 261 -271.

Dou Y., Milne T.A., Tackett A.J., Smith E.R., Fukuda A., Wysocka J., Allis C.D., Chait B.T., Hess J.L., and Roeder R.G., 2005. Physical association and coordinate function of the H3 K4 methyltransferase MLL1 and the H4 K16 acetyltransferase MOF. Cell 121: 873-885.

Dunaief J.L., Strober B.E., Guha S., KhavariP.A., Alin K., Luban J., Begemann М., Crabtree G.R., and Goff S.P., 1994. The retinoblastoma protein and BRG1 form a complex and cooperate to induce cell cycle arrest. Cell 79: 119-130.

Duncan I., 1987. The bithorax complex. Annu. Rev. Genet. 21: 285-319.

Fan H.Y., He X., Kingston R.E., and Narlikar G.J., 2003. Distinct strategies to make nucleosomal DNA accessible. Mol. Cell 11: 1311-1322.

Farkas G., Gausz J., Galloni М., Reuter G., Gyurkovics H., and Karch F., 1994. The Trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor. Nature 371: 806-808.

Francis N.J. and Kingston R.E., 2001. Mechanisms of transcriptional memory. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2: 409-421.

Francis N.J., Saurin A.J., Shao Z., and Kingston R.E., 2001. Reconstitution of a functional core polycomb repressive complex. Mol. Cell 8: 545-556.

Gellon G. and McGinnis W., 1998. Shaping animal body plans in development and evolution by modulation of Hox expression patterns. Bioessays, 20: 116-125.

Gutierrez L., Zurita М., Kennison J.A., and Vazquez М., 2003. The Drosophila trithorax group gene tonalli (tna) interacts genetically with the Brahma remodeling complex and encodes an SP-R1NG finger protein. Development 130: 343-354.

Hassan A.H., Neely K.E., and Workman J.L., 2001. Histone acetyltransferase complexes stabilize swi/snf binding to promoter nucleosomes. Cell 104: 817-827.

Holstege E.C., Jennings E.G., Wyrick J.J., Lee T.I., Hengartner C.J., Green M.R., Golub T.R., Lander E.S., and Young R.A., 1998. Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome. Cell 95: 717-728.

Hughes C.M., Rozenblatt-Rosen O., Milne T.A., Copeland T.D., Levine S.S., Lee J.C., Hayes D.N., Shanmugam K.S., Bhattachaqee A., Biondi C.A., et al., 2004. Memn associates with a trithorax family histone methyltransferase complex and with the hoxc8 locus. Mol. Cell 13: 587-597.

Imbalzano A.N., Kwon H., Green M.R., and Kingston R.E., 1994. Facilitated binding of TATA-binding protein to nucleosomal DNA. Nature 370: 481-485.

Jacobs S.A. and Khorasanizadeh S., 2002. Structure of HP1 chromodomain bound to a lysine 9-methylated histone H3 tail. Science 295: 2080-2083.

Janody E., Martirosyan Z., Benlali A., and Treisman J.E., 2003. Two subunits of the Drosophila mediator complex act together to control cell affinity. Development 130: 3691-3701.

Kassabov S.R., Zhang B., Persinger J., and Bartholomew B., 2003. SWI/SNF unwraps, slides, and rewraps the nucleosome. Mol. Cell 11: 391-403.

Kaufman T.C., Seeger M.A., and Olsen G., 1990. Molecular and genetic organization of the antennapedia gene complex of Drosophila melanogaster. Adv. Genet. 27: 309-362.

Kennison J.A., 1995. The Polycomb and trithorax group proteins of Drosophila: Trans-regulators of homeotic gene function. Annu. Rev. Genet. 29: 289-303.

Kennison J. A., 2003. Introduction to Trx-G and Pc-G genes. Methods Enzymol. 377: 61-70.

Kennison J.A. and Tamkun J.W., 1988. Dosage-dependent modifiers of Polycomb and Antennapedia mutations in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8136-8140.

Khorasanizadeh S., 2004. The nucleosome: From genomic organization to genomic regulation. Cell 116: 259-272.

Klymenko T. and Muller J., 2004. The histone methyltransferases Trithorax and Ash1 prevent transcriptional silencing by Polycomb group proteins. EM BO Rep. 5: 373-377.

Kruger W., Peterson C.L., Sil A., Cobum C, Arents G., Moudrianakis E.N., and Herskowitz I., 1995. Amino acid substitutions in the structured domains of histories H3 and H4 partially relieve the requirement of the yeast SWI/SNF complex for transcription. Genes Dev. 9: 2770-2779.

Kwon H., Imbalzano A.N., Khavari P.A., Kingston R.E., and Green M.R., 1994. Nucleosome disruption and enhancement of activator binding by a human SWI/SNF complex. Nature 370: 477-481.

Levine S.S., King I.F., and Kingston R.E., 2004. Division of labor in Polycomb group repression. Trends Biochem. Sci. 29: 478-485.

Lewis B.A. and Reinberg D., 2003. The mediator reactivator complex: Functional and physical roles in transcriptional regulation. J. Cell Sci. 116: 3667-3675.

Logie C. and Peterson C.L., 1997. Catalytic activity of the yeast SWI/SNF complex on reconstituted nucleosome arrays. EMBO J. 16: 6772-6782.

Lorch Y., Zhang М., and Romberg R.D., 1999. Histone octamer transfer by a chromatin-remodeling complex. Cell 96: 389-392.

Machado C. and Andrew D.J., 2000. D-Titin: A giant protein with dual roles in chromosomes and muscles. J. Cell Biol. 151: 639-652.

Mahmoudi T. and Verrijzer C.P., 2001. Chromatin silencing and activation by Polycomb and trithorax group proteins. Oncogene, 20: 3055-3066.

Miller Т., Krogan N.J., Dover J., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Johnston М., Greenblatt J.F., and Shilatifard A., 2001, COMPASS: A complex of proteins associated with a trithorax-related SET domain protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 12902-12907.

Min J., Zhang Y., and Xu R.M., 2003. Structural basis for specific binding of Polycomb chromodomain to histone H3 methylated at Lys 27. Genes Dev. 17: 1823-1828.

Mohrmann L. and Verrijzer C.P., 2005. Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling complexes. Biochim. Biophys. Acta 1681: 59-73.

Muyrers-Chen I., Rozovskaia Т., Lee N., Kersey J.H., Nakamura Т., Canaani E., and Paro R., 2004. Expression of leukemic MLL fusion proteins in Drosophila affects cell cycle control and chromosome morphology. Oncogene 23: 8639-8648.

Petruk S., Sedkov Y., Smith S., Tillib S., Kraevski V, Nakamura Т., Canaani E„ Croce C.M., and Mazo A., 2001. Trithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene. Science 294: 1331-1334.

Phelan M.L., Sif S., Narlikar G.J., and Kingston R.E., 1999. Reconstitution of a core chromatin remodeling complex from SWI/ SNF subunits. Mol. Celiy. 247-253.

Pokholok D.K., Harbison C.T., Levine S., Cole М., Hannett N.M., Lee T.I., Bell G.W., Walker K., Rolfe P.A., Herbolsheimer E., et al., 2005. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell 122: 517-527.

Polach K.J. and Widom J., 1995. Mechanism of protein access to specific DNA sequences in chromatin: A dynamic equilibrium model for gene regulation. J. Mol. Biol. 254: 130-149.

Rea S., Eisenhaber E, O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W., Schmid М., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., AllisC.D., and Jenuwein Т., 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599.

Ringrose L. and Paro R., 2004. Epigenetic regulation of cellular memory by the polycomb and trithorax group proteins. Annu. Rev. Genet. 38: 413-443.

Roguev A.,. Schaft D., Shevchenko A., Pijnappel W.W., Wilm М., Aasland R., and Stewart A.F., 2001. The Saccharomyces cerevisiae Setl complex includes an Ash2 homologue and methylates histone 3 lysine 4. EMBO J., 20: 7137-7148.

Saha A., Wittmeyer J., and Cairns B.R., 2005. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nat. Struct. Mol. Biol. 12: 747-755.

Santos-Rosa H., Schneider R., Bannister A. J., Sherriff J., Bernstein B.E., Emre N.C., Schreiber S.L., Mellor J., and Kouzandes Т., 2002. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature 419: 407-411.

Simon J., 1995. Locking in stable states of gene expression: Transcriptional control during Drosophila development. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 376-385.

Simon J.A. and Tamkun J.W., 2002. Programming off and on states in chromatin: Mechanisms of Polycomb and trithorax group complexes. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 210—218.

Srinivasan S., Armstrong J.A., Deuring R., Dahlsveen I.K., McNeill H., and Tamkun J.W., 2005. The Drosophila trithorax group protein Kismet facilitates an early step in transcriptional elongation by RNA Polymerase II. Development 132: 1623-1635.

Strober B.E., Dunaief J.L., Guha S., and Goff S.P., 1996. Functional interactions between the hBRM/hBRGl transcriptional activators and the pRB family of proteins. Mol. Cell. Biol 16: 1576-1583.

Sudarsanam P., Iyer V.R., Brown P.O., and Winston F., 2000. Whole-genome expression analysis of snf/swi mutants of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3364-3369.

Tamkun J.W., Deuring R., Scott M.P., Kissinger М., Pattatucci A.M., Kaufman T.C., and Kennison J.A., 1992. brahma: A regulator of Drosophila homeotic genes structurally related to the yeast transcriptional activator SNF2/SWI2. Cell 68: 561-572.

Therrien М., Morrison D.K., Wong A.М., and Rubin G.M., 2000. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetics 156: 1231-1242.

Versteege I., Sevenet N., Lange J.. Rousseau-Merck M.F., Ambros P., Handgretinger R., Aurias A., and Delattre O., 1998. Truncating mutations of hSNF5/INIl in aggressive paediatric cancer. Nature 394: 203-206.

Vignali М., Hassan A.H., Neely K.E., and Workman J.L., 2000. ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol Cell Biol., 20: 1899-1910.

Wang W., Cote J., Xue Y., Zhou S., Khavari P.A., Biggar S.R., Muchardt C., Kalpana G.V., Goff S.P., Yaniv М., et al., 1996. Purification and biochemical heterogeneity of the mammalian SWI-SNF complex. EMBO J. 15: 5370-5382.

White house I., Stockdale G., Flaus A., Szczelkun M.D., and Owen-Hughes Т., 2003. Evidence for DNA translocation by the ISWI chromatin-remodeling enzyme. Mol. Cell. Biol. 23: 1935-1945.

Wysocka J., Swigut Т., Milne T.A., Dou Y., Zhang X., Burlingame A.L., RoederR.G., Brivanlou A.H., and Allis C.D., 2005. WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for H3 K4 methylation and vertebrate development. Cell 121: 859-872.

Yokoyama A., Wang Z., Wysocka J., Sanyal М., Aufiero D.J., Kitabayashi I., Herr W., and Cleary M.L., 2004. Leukemia protooncoprotein MLL forms a SET 1-like histone methyltransferase complex with menin to regulate Hox gene expression. Mol. Cell Biol. 24: 5639-5649.

Yu B.D., Hanson R.D., Hess J.L., Homing S.E., and Korsmeyer S.J., 1998. MLL, a mammalian trithorax-group gene, functions as a transcriptional maintenance factor in morphogenesis. Proc. Natl Acad. Sci. 95: 10632-10636.

Yu B.D., Hess J.L., Horning S.E., Brown G.A., and Korsmeyer S.J., 1995. Altered Hox expression and segmental identity in Mil-mutant mice. Nature 378: 505-508.

Загрузка...