Эпигенетика

3.1. Импринтированные гены контролируют эмбриональный и неонатальный рост

Какова же функция геномного импринтинга у млекопитающих? Одним из способов ответить на этот вопрос было бы определение функции известных импринтированных генов in vivo. Современные технологии позволяют сейчас определять функционирование генов у мышей путем индукции мутаций в нуклеотидной последовательности гена, чтобы нарушить его функцию. С помощью этой техники «гомологичной рекомбинации» были определены функции 26 из 78 известных импринтированных генов (оригинальные ссылки см. по адресу http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/research/imprinting/function.html). В табл. 19.1 эти гены перечисляются соответственно их функции в развитии мышей и их экспрессии с материнской или отцовской аллели. Самая большая категория на сегодня охватывает импринтированные гены, которые влияют на рост эмбриона, или плаценту, или на новорожденного, полностью зависящего от материнского молока. В этой категории приблизительно половина — это отцовски-экспрессируемые импринтированные гены, которые функционируют как ростовые промоторы (как показывает задержка роста у эмбрионов, дефектных по этому гену). Другая половина — это матерински — экспрессируемые импринтированные гены, которые функционируют как ростовые репрессоры (что демонстрируется усилением роста у эмбрионов, дефектных по этому гену). Следующая по величине категория включает гены, не вызывающие никаких очевидных дефектов в эмбриональном развитии; за нею следует категория с поведенческими или нейрологическими дефектами. Остающиеся три испытанных гена обладают разнообразными, внешне не связанными дефектами. Эти результаты являются, на одном уровне, разочаровывающими, поскольку они не не позволили идентифицировать одну какую-нибудь функцию для всех импринтированных генов. Однако все же может быть свет в конце туннеля, потому что эти результаты говорят нам, что более чем 50 % импринтированных генов функционируют как регуляторы эмбрионального или неонатального роста. Более интересно, что способность регулировать рост оказывается четко разделенной: матерински-экспрессируемые регулирующие рост гены действуют как репрессоры роста потомства, тогда как отцовски-экспрессируемые гены в этой категории действуют, усиливая рост, 20 % протестированных импринтированных генов являются активными в нейрологических процессах, некоторые из них влияют на скорость неонатального роста, меняя материнское поведение. Наиболее загадочной категорией, принимая во внимание попытки идентифицировать селективную силу, направляющую приобретение экспрессии импринтированных генов у всех ныне живущих млекопитающих, является категория импринтированных генов, не имеющих никаких очевидных биологических функций в эмбриональном развитии, и эта категория содержит 25 % протестированных импринтированных генов.

3.2. Функция геномного импринтинга у млекопитающих

Могут ли анализы функции гена помочь нам понять, почему гены импринтированы у млекопитающих? Взгляд на геномный импринтинг у разных типов млекопитающих проливает некоторый свет на эту проблему. Плацентарные млекопитающие, такие как мыши и человек, и сумчатые, такие как опоссум и валлаби, демонстрируют геномный импринтинг. Яйцекладущие млекопитающие, такие как утконос и ехидна, по-видимому, не имеют импринтированных генов, хотя экстенсивные исследования все еще не были проведены. Плацентарные млекопитающие и сумчатые различаются в отношении их репродуктивной стратегии, которая позволяет зародышу непосредственно влиять ца объем материнских ресурсов, используемых для его собственного роста. Напротив, эмбрионы, развивающиеся в яйце, не способны прямо влиять на материнские ресурсы. Большинство беспозвоночных и позвоночных используют репродуктивную стратегию, связанную с откладкой яиц. Важно отметить, что они могут также претерпевать партеногенез — форму репродукции, при которой женская гамета развивается в новую диплоидную особь без оплодотворения мужской гаметой (обратите внимание на то, что партеногенетические эмбрионы возникают в результате дупликации одного и того же материнского генома, тогда как гиногенетические эмбрионы, изображенные на рис. 19.3, возникают из двух разных материнских геномов). Эта способность проходить партеногенез, вероятнее всего, указывает на полное отсутствие геномного импринтинга, поскольку она показывает, что без отцовского генома можно обойтись. У млекопитающих, однако, прямым следствием экспрессии импринтированного гена, контролирующего рост плода, является невозможность партеногенеза. Для того чтобы произвести жизнеспособное потомство, необходимы и мать, и отец, что делает млекопитающих в этом деле полностью зависимыми от полового воспроизведения (рис. 19.4). У млекопитающих партеногенез пока еще не наблюдался, несмотря на противоположные заявления, хотя редкие мыши с диплоидным материнским геномом недавно были созданы путем манипулирования с экспрессией импринтированного кластера Igf2 (Kono et al., 2004).

^{Рис. 19.4. Импринтированные гены играют роль в репродукции млекопитающих}

^{Млекопитающие диплоидны, и репродукция требует оплодотворения гаплоидной женской яйцеклетки гаплоидным мужским сперматозоидом для того, чтобы воссоздать диплоидный эмбри­он. Только самки анатомически приспособлены для воспроизведения, но они не могут использовать для этого партеногенез, поскольку существенные импринтированные гены, необходимые для роста плода, импринтированы и сайленсированы на материнских хромосомах. Эти гены экспрессируются только с отцовских хромосом; таким образом, у млекопитающих для репродукции необходимы обе родительские хромосомы. Партеногенез — это образование диплоидного потомства из двух копий одного и того же материнского генома}

Почему геномный импринтинг развился лишь у некоторых млекопитающих, но не у позвоночных в целом? Три особенности геномного импринтинга — функция регуляции роста у многих импринтированных генов, ограничение импринтированных генов плацентарными и сумчатыми млекопитающими и, наконец, необходимость отцовского генома для развития плода — могут соответствовать двум в равной мере привлекательным гипотезам.

Первая гипотеза предполагает, что геномный импринтинг развился в ответ на ситуацию «родительского конфликта» (Moore and Haig, 1991). Эта ситуация возникает в силу противоположных интересов материнского и отцовского геномов: эмбриональный рост зависит от одного родителя, но на него влияет эмбрион, чей геном происходит от двух родителей. Предполагается, что отцовски-экспрессируемые гены стимулируют эмбриональный рост, тем самым максимизируя конкуретноспособность индивидуального потомка, несущего конкретный отцовский геном. Матерински-экспрессируемые импринтированные гены, как предполагается, подавляют рост плода. Это могло бы сделать возможным более равномерное распределение материнских ресурсов между всеми потомками и увеличивало бы шансы на передачу материнского генома более многочисленным потомкам, которые могут иметь разные отцовские геномы.

Вторая гипотеза называется «трофобластная защита» (Varmuza and Mann, 1994). Она предполагает, что материнский геном находится в условиях повышенного риска вследствие того, что мать анатомически приспособлена к внутриутробному воспроизведению; этот риск возникает, если спонтанная активация ооцита приводит к полному эмбриональному развитию. Поскольку у самцов отсутствуют необходимые анатомические предпосылки для внутриутробного воспроизведения, они не рискуют в той же мере, если происходит спонтанная активация сперматозоидов. Таким образом, предполагается, что импринтинг либо сайленсирует гены на материнской хромосоме, стимулирующие развитие плаценты, либо активирует гены, лимитирующие этот процесс. Те гены, которые необходимы для формирования плаценты, экспрессировались бы, следовательно, только с отцовского генома, после того как произошло оплодотворение.

Если хотя бы одна из этих гипотез является правильным объяснением эволюции геномного импринтинга у млекопитающих, го какая из них? Обе гипотезы указывают на роль импринтированных генов в регулировании развития и функции плаценты; однако ни модель родительского конфликта, ни модель трофобластной защиты не могут полностью объяснить все имеющиеся данные (Wilkins and Haig, 2003). Интересно отметить, что импринтированные гены были также идентифицированы в эндосперме растений — ткани, которую сравнивали с плацентой эмбрионов у млекопитающих, поскольку она переносит пищевые ресурсы от родительского растения к зародышу (более подробно о геномном импринтинге у растений см. в главе 11). Это открытие делает более сильными доводы в пользу того, что геномный импринтинг развился как средство регулирования переноса питательных веществ между родителем и потомством, но не объясняет, почему. Более полные или альтернативные объяснения функции геномного импринтинга у млекопитающих могли бы быть получены из двух источников. Первым таким источником могло бы быть исследование функции «импринтинга» по всему генному кластеру per se — в противоположность изучению фенотипа мышей, лишенных продукта какого-то одного импринтированного гена. Это потребовало бы умения ревертировать импринт и генерировать двуродительскую экспрессию генов по всему импринтированному кластеру. Второй подход заключается в том, чтобы узнать в деталях, как гены импринтируются. Возможно, что не все гены в кластере являются предумышленной мишенью для механизма импринтинга и что некоторые из них могут быть просто «безучастными свидетелями» процесса, так что их функция мало что говорила бы о роли геномного импринтинга. Существование генов — «безучастных наблюдателей», затрагиваемых механизмом импринтинга, может удовлетворительно объяснить странное обилие импринтированных генов без какой-либо очевидной биологической функции в развитии (табл. 19.1).

^{(Материнский) — матерински-экспрессированный импринтированный ген, (отцовский) — отцовски-экспрессированные импринтированные гены. (+) — стимулирующее рост влияние, (-) — подавляющее рост влияние, (-/+) — дефект в дифференцировке, но регуляторный статус роста неясен, (*) дополнительный дефект дифференцировки (ссылки на первичные данные можно найти по адресу http://www.mgu.harтгс. ас.uk/research/imprinting/function.html}

3.3. Импринтированные гены собраны в кластеры и контролируются импринтными контрольными элементами

На сегодня около 80 импринтированных генов картированы в десяти хромосомах мыши, и оказалось, что большинство из них собраны в кластеры (Verona et al., 2003). Одиннадцать кластеров импринтированных генов были приписаны к восьми хромосомам (номера 2,6,7,9, 11,12,15 и 17), тогда как одиночные импринтированные гены были идентифицированы лишь на трех хромосомах (номера 2, 14 и 18). Существование кластеров импринтированных генов — сильный аргумент в пользу того, что некий общий ДНК-элемент может регулировать импринтированную экспрессию множественных генов в cis-конфигурации. На сегодняшний день хорошо охарактеризованы только шесть импринтированных кластеров и они перечислены в табл. 19.2 по имени основного импринтированного гена иРНК в кластере (т. е. кластеры импринтированных генов Igf2r; Igf2, Kcnq1. Gnas. Dlk1) или по ассоциации с тем или иным заболеванием (кластер Pws — синдром Прадера — Вилли, более детально обсуждаемый в главе 23). Эти шесть кластеров содержат от трех до десяти импринтированных генов и простираются на более чем 100—3000 т. п.н. ДНК.

На рис. 19.5 изображен специфичный в отношении родителя паттерн экспрессии в типичном кластере импринтированных генов. Общей чертой этих шести кластеров является присутствие нуклеотидной последовательности ДНК, несущей гаметический импринт метилирования, который известен как гаметический DMR (Differentially DNA-Metylated Region). Гаметический импринт метилирования определяется как импринт метилирования, устанавливаемый в одной гамете и поддерживаемый в диплоидных клетках эмбриона только на одной родительской хромосоме. В четырех кластерах (Igf2r; Kcnq1, Gnas и Pws) гаметический DMR имеет материнский импринт метилирования, приобретенный в оогенезе, тогда как в двух кластерах (Igf2 и Dlk1) он имеет отцовский импринт метилирования, приобретенный во время сперматогенеза. Во всех шести примерах было показано, что гаметический DMR контролирует импринтированную экспрессию всего кластера или его части и поэтому обозначается как элемент контроля импринта (ICE, imprint control element) для этого кластера (Spahn and Barlow, 2003).

Табл. 19.2 показывает, что каждый кластер импринтированных генов содержит множественные иРНК и по меньшей мере одну ncRNA. Четыре кластера (Igf2r, Kcnq1, lgf2 и Dlk1) демонстрируют простой паттерн, в котором хромосома, несущая метилированный гаметический DMR, экспрессирует множественные иРНК, но не экспрессирует ncRNA (как показано на рис. 19.5 для материнского гаметического DMR). Хромосома, несущая неметилированный гаметический DMR, обнаруживает реципрокный паттерн экспрессии: репрессию множественных и PHК и экспрессию ncRNA. Остальные два кластера (Gnas и Pws) обладают сложным паттерном, где импринтированные иРНК экспрессируются с обеих хромосом, тогда как импринтированная ncRNA экспрессируется только с хромосомы, несущей неметилированный гаметический DMR. Табл. 19.2 показывает, что в трех кластерах (Igrf2r, Kcnq1 и Gnas) промотор ncRNA расположен в интроне одной из импринтированных иРНК, в то время как в остальных кластерах промотор ncRNA отделен от импринтированных генов и PHК, хотя и лежит близко к ним. Это тесное перемешивание активных и «молчащих» генов в импринтированном кластере показывает, что механизмы сайленсинга и активации, влияющие на импринтированные гены, не распространяют свое действие и могут быть ограничены затрагиваемым геном. В частности, тот факт, что промотор «молчащей» ncRNA может находиться в интроне активно транскрибируемого гена, показывает, что механизмы сайленсинга, могут даже не распространять свое действие на всю длину гена, но могут быть ограничены лишь регуляторными элементами.

Какова же роль гаметического DMR? Несмотря на тот факт, что гаметические DMR могут матерински или отцовски метилироваться, эксперименты по удалению этих элементов дали в целом сходные результаты, хотя и за несколькими исключениями (рис. 19.6). Что касается трех кластеров (Igf2r, Kcnq1, Dlk1), экспериментальная делеция метилированного гаметического DMR не дала никакого эффекта. Однако делеция неметилированного гаметического DMR полностью ревертировала картину специфичной в отношении родителя экспрессии, так что экспрессия ncRNA была утрачена, а биаллельная экспрессия и PHК была приобретена (Lin et al., 1995; Zwart et al., 2001; Fitzpatnck et al., 2002). Два кластера (Gnas и Pws), оказывается, содержат более одного гаметического DMR и демонстрируют более ложное поведение, которое все еще обнаруживает некоторое сходство с этим паттерном (Williamson et al., 2006). Кластер Igf2, однако, ведет себя иначе: делеция и метилированного, и неметилированного гаметического DMR вызывает изменения в экспрессии иРНК и ncRNA в cis-конфигурации (Thorvaldsen et al., 1998).

3.4. Кластеры импринтированных генов содержат по меньшей мере одну ncRNAb

Из 12 известных кластеров импринтированных генов восемь ассоциированы с ncRNA (O’Neill, 2005). Раньше считалось, что ncRNAs, за исключением тех, которые участвуют в процессинге и трансляции РНК, т. е. таких как РНК сплайсинга, траспортные и рибосомные, являются раритетом в геноме млекопитающих. Теперь, благодаря доступности нуклеотидных последовательностей геномов мыши и человека, может быть выполнен анализ транскриптома, дающий перечень всех РНК-транскриптов в данной клеточной популяции. Уже показано, что большая часть транскриптома млекопитающих (не считая ncRNAs, связанные с процессингом и трансляцией) в основном, как это ни удивительно, состоит из ncRNAs, а не и PHК, кодирующих белки. Большой объем транскрипции ncRNAs в геноме млекопитающих и тот факт, что большое число ncRNAs перекрываются с известным кодирующим белок геном, показывают, что это не может рассматриваться как «транскрипционный шум», но представляет, вероятно, новую, до сих пор неизвестную систему регуляции генов (Mattick, 2005). Был создан Web-сайт, названный NON CODE, чтобы собирать данные о функциональных ncRNAs по всем организмам (http://noncode.bioinfo.org.cn/). Имеются несколько типов ncRNAs млекопитающих, которые, как было показано, обладают регуляторными функциями по отношению к генам, в том числе «короткие» ncRNAs от 21 до 30 п.о., участвующие в путях РНК-интерференции (глава 8), «межгенные» непроцессируемые транскрипты, регулирующие локальную активность хроматина (Haussecker and Proudfoot, 2005), и «длинные» процессируемые ncRNAs, такие как Xist, которая участвует в инактивации Х-хромосомы (глава 17).

^{Рис. 19.6. Импринтированная экспрессия регулируется гаметическими DMR}

^{На левой части рисунка показан эффект делегирования гаметического DMR из импринтированной хромосомы (зеленый цвет). Правая часть демонстрирует эффект делегирования гаметического DMR из неимпринтированной хромосомы (желтый цвет). Во многих импринтированных кластерах (например, lgf2r, Kcnq1 и Dlk1) экспериментальная делеция G-DMR влияет лишь на хромосому, несущую неимпринтированныйОМЯ. Результатом этого является утрата репрессии импринтированных генов иРНК, кодирующих белки (IG) и приобретение репрессии импринтированного гена ncRNA (IG-NC). Следует обратить внимание на то, что в некоторых импринтированных кластерах (Igf2 и Pws). которые здесь не изображены, метилированный G-DMR оказывается также необходимым для экспрессии некоторых из импринтированных иРНК в cis-конфигурации: (del) — делегированная ДНК, (G-DMR) — гаметический диффернциально ДНК-метилированный район, (NG) — неимпринтированный ген. (стрелка) — экспрессируемая аллель (черный запрещающий знак) — репрессированная аллель, (IMPRINT) — эпигенетическая модификация, ведущая к изменению экспрессии гена в cis-конфигурации}

Какие типы ncRNAs связаны с кластерами импринтированных генов? Анализ ncRNAs, ассоциирующихся с шестью хорошо охарактеризованными импринтированными кластерами, перечисленными в табл. 19.2, все еще неполон, выявляя некоторые черты сходства, но и некоторые различия. Три импринтированные ncRNAs являются необычно длинными зрелыми РНК: Air имеет длину 108 т. о. (Lyle et al., 2000), Kcnq1ot1 — по крайней мере 60 т. о., но окончательный размер еще не определен (Mitsuya et al., 1999), a Ube3aas может превышать 1000 т. о. (Landers et al., 2004). Напротив, ncRNA Н19 имеет длину всего 2.3 т. о. (Brannan et al., 1990). ncRNA Gtl2 содержит множественные альтернативно сплайсированные транскрипты; однако была отмечена также межгенная транскрипция «вниз по течению», позволяя предполагать, что вероятны и более длинные транскрипционные единицы (Tierling et al., 2005). ncRNa Nespas крупнее, чем можно определить на РНК-блотах, и ее полный размер неизвестен (Wroe et al., 2000). Все эти импринтированные ncRNAs бедны интронами, имеют низкое отношение «интрон — экзон» или не сплайсированы как зрелые транскрипты. Ранее предполагалось, что все импринтированные гены бедны интронами; однако это может быть верно лишь для импринтированных ncRNAs (Hurst et al., 1996). Еще одной особенностью является то, что две импринтированные ncRNAs (Ube3aas и Gtl2-mpancKpunmbi «вниз по течению») действуют как хозяйские транскрипты для snoRNAs (малых ядрышковых РНК, которые направляют модификации к рРНК, snRNAs и, возможно, иРНК, действуя тем самым как посттранскрипционные регуляторы). snoRNAs не направляются к импринтированным генам иРНК в кластере, и вполне вероятно, что они не играют никакой роли в самом механизме импринтинга (Seitz et al., 2004). Аналогичным образом, miRNAs в кластере Dlk1 участвуют в посттранскрипционной репрессии одного из генов и РНК в кластере, но их роль в регулировании импринтированной экспрессии кластера еще не проверена (Davis et al., 2005).

Две особенности импринтированных ncRNAs показывают, что они могут играть роль в сайленсинге импринтированных генов иРНК (т. е. генов, кодирующих белки) в кластере. Первая заключается в том. что ncRNA обычно обнаруживает реципрокную специфичную в отношении родителя экспрессию по сравнению с импринтированными генами иРНК (табл. 19.2). Во-вторых, DMR, несущий гаметический импринт метилирования, который контролирует импринтированную экспрессию целого кластера, перекрывается с промотором ncRNA в трех случаях (Air, Kcnq1otl, Gnas Exon la). Это могло бы служить указанием на то, что эти импринты возникли для регуляции ncRNA в каждом импринтированном кластере В пользу такой интерпретации свидетельствуют эксперименты, в которых делетировали неметилированную последовательность, несущую гаметический DMR, вызывая тем самым утрату экспрессии ncRNA одновременно с приобретением экспрессии импринтированных генов иРНК (рис. 19.6), как было проверено в кластерах Igf2r, Kcnq1, Gnas, Pws и Dlk1 (Wutz et al., 1997; Bielinska et al., 2000; Fitzpatrick et al., 2002; Lin et al., 2003; Williamson et al., 2006). Кластер Igf2 представляет собой исключение, потому что оказывается, что неметилированный гаметический DMR не является непосредственным регулятором ncRNA Н19 (Thorvaldsen et al., 1998).

Эксперименты, в которых прямо тестируется роль самой ncRNA, были проведены сейчас для двух ncRNAs из кластеров импринтированных генов типа I (Air и Kcnq1otl) и одной ncRNA (Н19) из кластера типа II. Укорочение ncRNA>4/r длиной 108 т. о. до 3 т. о. показало, что сама ncRNA необходима для сайленсирования всех трех генов иРНК в кластере Igf2r, указывая тем самым на четкую регуляторную роль этой ncRNA (Sleutels et al., 2002). Кроме того, укорочение ncRNA Kcnq1otl, имеющей длину 60 т. о., до 1.5 т. о. также показало, что эта ncRNA прямо нужна для сайленсирования всех десяти генов иРНК в более крупном кластере Kcnq1 (Mancini-DiNardo, 2006). Напротив, точная делеция ncRNA Н19 и промотора не оказала никакого влияния на импринтинг в кластере lgf2 в тканях эндосперма, хотя в мезодермальной ткани наблюдалась некоторая потеря импринтинга (Schmidt et al., 1999). Таким образом, два из матерински-импринтированных кластеров типа I имеют общий механизм сайленсинга, зависящий от ncRNA, тогда как единственный отцовски-импринтированный кластер типа II, изученный до настоящего времени, использует другую модель, зависящую от инсулятора. Мы с нетерпением ждем результаты по другим импринтированным кластерам, чтобы посмотреть, указывает ли все это на существование только двух типов базовых механизмов импринтинга у млекопитающих — один для отцовски-импринтированных кластеров, а другой для матерински-импринтированных кластеров.

3.5. Роль метилирования ДНК в геномном импринтинге

Идентификация первых трех эндогенных импринтированных генов в 1991 году позволила исследователям изучить, каким образом эпигенетическая машинерия клетки маркирует импринтированный ген в отношении его родительской идентичности. Первым и наиболее легко тестируемым кандидатом было метилирование ДНК — модификация у млекопитающих, ковалентно добавляющая метильную группу к остатку цитозина в любом динуклеотиде CpG. Метилирование ДНК достигается благодаря действию de novo метилтрансфераз и сохраняется in situ каждый раз, когда клетка делится, действием поддерживающих метилтрансфераз (описано в главе 18). Следовательно, эта модификация удовлетворяет критериям, очерченным на рис. 19.3 для метки родительской идентичности, или «импринта», поскольку (1) она может быть установлена либо в спермии, либо в ооците de novo метилтрансферазами, которые действуют лишь в одной гамете, (2) она может стабильно воспроизводиться при каждом делении эмбриональной клетки с помощью поддерживающей метилтрансферазы и (3) она может быть стерта в зародышевой линии для перезагрузки импринта в следующем поколении либо путем пассивного деметилирования, либо, возможно, действием деметилазы.

Метилирование ДНК потенциально могло бы выполнять две функции в геномном импринтинге. Оно могло бы действовать как импринтирующая метка, будучи приобретаемой de novo только хромосомами одной гаметы. Оно могло бы также служить для сайленсинга одной из родительских аллелей, поскольку метилирование ДНК связано с репрессией гена. Чтобы определить, какой же функцией оно обладает, необходимо сначала показать, что метилирование ДНК присутствует только на одной родительской хромосоме (т. е., что оно является DMR). Во-вторых, необходимо идентифицировать, какой импринтированный ген в кластере и какая часть регуляторного аппарата этого гена маркированы метилированием ДНК. Локализация меток метилирования на промоторе или на удаленных позитивных или негативных регуляторных элементах будет иметь разные последствия для экспрессии гена. Наконец, необходимо идентифицировать, когда в ходе развития формируется DMR. Если он формируется во время гаметогенеза и стабильно поддерживается в соматических клетках (что известно как гаметический DMR), он может служить маркером импринтинга. Если, однако, он помещается на ген после того как эмбрион стал диплоидным, когда обе родительские хромосомы находятся в одной и той же клетке (известно как соматический DMR), он вряд ли служит в качестве метки идентичности, но может служить для поддержания специфичного в отношении родителя сайленсинга.

Родительское аллель-специфичное метилирование ДНК обнаружено в большинстве импринтированных изученных кластеров. Например, кластер Igf2 имеет гаметический DMR, расположенный в 2 т. о. «вверх по течению» от промотора ncRNA Н19, который метилирован только в родительской гамете и поддерживается после этого во всех соматических тканях (Bartolomei et al., 1993; Ferguson-Smith et al., 1993). Был идентифицирован похожий гаметический DMR, который покрывал промотор ncRNA Air, присутствовал только на «молчащей» материнской копии гена и был приобретен в женской гамете (Stoger et al., 1993). Удивительно, что гаметические DMRs не были идентифицированы в промоторах главных импринтированных кодирующих белок генов в этих кластерах (соответственно, lgf2 и lgf2r). Вместо этого сайленсированный промотор Igf2 оказался свободным от метилирования ДНК, тогда как сайленсированный промотор Igf2r лежит внутри соматического DMR (Sasaki et al., 1992; Stoger et al., 1993). Подобные находки гаметических DMRs, метилированных на хромосоме, несущей «молчащую» копию импринтированной ncRNA, были сделаны для четырех других хорошо изученных кластеров импринтированных генов, Pws, Kcnq1, Gnas и Dlk1 (Shemer et al., 1997; Liu et al., 2000; Takada et al., 2002; Yatsuki et al., 2002).

Соматические DMRs возникают реже и были описаны лишь на нескольких импринтированных кодирующих белки генах в каждом кластере, что указывает на то, что метилирование ДНК может играть лишь ограниченную роль в поддержании экспрессии импринтированного гена (Stoger et al., 1993; Moore et al., 1997; Yatsuki et al., 2002). Делеции гаметических DMRs у мышей приводят к полной утрате импринтинга для множественных генов, доказывая тем самым, что этот класс DMRs служит также как основной ICE для всего кластера (рис. 19.6) (Wutz et al., 1997; Thorvaldsen et al., 1998; Bielinska et al., 2000; Fitzpatrick et al., 2002; Lin et al., 2003; Williamson et al., 2006). Напротив, делеция соматических DMRs влияет на экспрессию связанного импринтированного гена, кодирующего белок, но импринтированная экспрессия поддерживается другими генами в кластере (Constancia et al.; Sleutels et al., 2003).

Нехватка метилирования ДНК по всему геному, вызываемая мутациями в генах семейства Dnmt, подчеркивает его существенную роль в регулировании экспрессии импринтированного гена. Мутации в de novo метилазе Dmnt3a, в факторе Dmnt3L, стимулирующем метилазу, или в поддерживающей метилазе Dmnt1 дают дефектных по метилированию ДНК эмбрионов, все из которых обнаруживают изменения в экспрессии импринтированных генов (глава 18). Нарушения того типа, который был показан для четырех импринтированных кластеров (Igf2, Igf2r, Kcnq1 и Dlk1), показывает, что метилирование ДНК обычно действует, супрессируя действие гаметического DMR на той же родительской хромосоме, которая экспрессирует собранные в кластер гены и РНК. Таким образом, в отсутствие метилирования ДНК гаметический DMR не может функционировать должным образом. Вследствие этого несколько импринтированных генов, кодирующих белки, в том числе Igf2, Igf2r, Kcnq1 и Dlk1, становятся репрессированными на обеих родительских хромосомах. Это показывает, что эти гены и РНК в геноме млекопитающих сайленсированы «по умолчанию» и требуют активации для своей экспрессии. Примечательно, что ncRNA Н19, которая в норме экспрессируется лишь на хромосоме, несущей неметилированный гаметический DMR, становится экспрессируемой на обеих родительских хромосомах (глава 18) Некоторые исключения из этого общего правила сообщались для генов, демонстрирующих импринтированную экспрессию только в плаценте (Lewis tu al., 2004).

Используются ли другие типы эпигенетических модификаций в качестве гаметических импринтов? При явном изобилии эпигенетических механизмов, действие которых модифицирует генетическую информацию в геноме млекопитающих (описаны в главе 3), маловероятно, чтобы метилирование ДНК было единственным импринтирующим механизмом. Модификации гистонов, влияющие на состояния активности хроматина, также являются вероятными кандидатами на роль родительских импринтов, поскольку они могли бы выполнять многие условия, показанные на рис. 3. На сегодняшний день, однако, показано, что лишь белок — компонент группы Polycomb, известный как Eed (который облегчает метилирование лизина 27 гистона H3), влияет на несколько отцовски-репрессированных генов. Однако влияние Eed на геномный импринтинг довольно незначительно по сравнению с метилированием ДНК, и это может служить лишь функцией поддержания (Mager et al., 2003).

Каким образом DMRs выбираются механизмом гаметического метилирования? Сравнение известных гаметических DMRs по нуклеотидным последовательностям не выявляет сколько-нибудь явного консерватизма последовательностей, хотя сообщалось, что некоторые из них содержат ряд прямых повторов, которые могут приобретать вторичную структуру, привлекающую метилирование ДНК (Neumann et al., 1995). Нуклеотидная последовательность DMRs заметно богаче CpG, чем остальной геном, и напоминает последовательность островков CpG, связанную с промоторами более чем половины генов в геноме млекопитающих (глава 18). Поразительно, что ключевой особенностью промоторов с островками CpG является то, что в норме в них отсутствует метилирование ДНК и что в ранних эмбриональных клетках существуют механизмы для поддержания островков CpG промотора свободными от метилирования (Antequera, 2003). Однако в опухолях и при старении островки CpG могут становиться метилированными.

Два наблюдения пролили свет на то, каким образом метилирование ДНК могло бы «нацеливать» последовательности DMR. Первое наблюдение заключается в том, что отцовская специфичность метилирования в гаметическом DMR Н19 зависит от предотвращения метилирования «по умолчанию» в этом районе в материнской гамете с помощью белка CTFC (Fedoriw et al., 2004; смотри также раздел 3.6). Это может указывать на отсутствие сиквенс-специфичности системы метилирования ДНК. Второе наблюдение заключается в том, что вспомогательный белок метилирования, Dnmt3L, играет разные роли в мужских и женских гаметах. В мужских гаметах Dnmt3L играет главную роль в метилировании и сайленсинге ретротранспозонов и незначительную роль в метилировании DMR. Напротив, в ооцитах Dnmt3L играет основную роль в метилировании DMR и не играет никакой роли в метилировании ретротранспозонов (Bourc’his and Bestor, 2006). Ретро-транспозоны являются мобильными генетическими элементами, присутствующими в очень большом числе в геноме млекопитающих и могут копироваться посредством промежуточных РНК и вставляться в новые геномные сайты (Kazazian, 2004). Обнаружение того факта, что тот же самый белок, который направляет метилирование, чтобы сайленсировать ретротранспозоны, может также направлять метилирование DMR, показывает, что механизмы, нужные для защиты генома от чужеродных ДНК, были использованы, чтобы делать импринты в материнской зародышевой линии (Barlow, 1993).

3.6. Два типа cis-действующего сайленсинга, идентифицированного в кластерах импринтированных генов

В настоящее время предполагается, что импринтингом в разных кластерах управляют два класса cis-действующих механизмов сайленсинга: это модель инсулятора, приложимая к кластеру Igf2, и модель опосредованного ncRNA сайленсинга, приложимая к кластерам Igf2r и Kcnq1. Хотя это еще не полностью определено, большинство кластеров, перечисленных в табл. 19.2, демонстрируют те или иные аспекты одной из двух моделей. Прорывом, приведшим к определению модели инсулятора в локусе Igf2, была делеция гаметического DMR, который локализован на расстоянии 2 т. о. «вверх по течению» от старта транскрипции Н19 и на расстоянии 80 т. о. «вниз по течению» от Igf2 (рис. 19.7) (Thorvaldsen et al., 1998). Будучи делетированы, Н19 и lgf2 обнаруживали утрату импринтинга безотносительно к тому, наследовалась ли эта делеция от матери или от отца, что позволяло идентифицировать этот DMR как ICE. Впоследствии было показано, что этот ICE связывается с CTCF — белком, который, как было показано, опосредует активность инсулятора в локусе beta-globin, и что сам ICE фунционирует как инсулятор (Bell and Felsenfeld, 2000; Hark et al., 2000). В этом контексте инсулятор определяется как элемент, который блокирует взаимодействия промотора и энхансера, будучи помешен между ними Таким образом, модель экспрессии импринтированного гена в этом локусе следующая: на материнской аллели CTCF связывается с ICE и блокирует доступ lgf2 и Ins2 к энхансерам, общим с ncRNA Н19, которые расположены «вниз по течению» от этих трех генов. Тем самым это предоставляет Н19 исключительный доступ к энхансерам (рис. 19.7). На отцовской аллели ICE приобретает метилирование ДНК в мужской зародышевой линии, предотвращая связывание CTCF с ним. Таким образом, на отцовской хромосоме Igf2 и Ins2 взаимодействуют с энхансерами и экспрессируются с этой хромосомы. Присутствие метилирования ДНК на отцовском ICE ведет ко вторичному метилированию промотора Н19 с помощью неизвестного механизма, и он становится сайленсированным на отцовской хромосоме. Участие CTCF в модели инсулятора привело к идентификации сайтов связывания CTCF в других импринтированных генах, таких как Rasgrfl, GrblOw Kcnq1otl, показывая тем самым, что модель инсулятора может работать в других импринтированных кластерах.

^{Рис. 7. Два cis-действующих механизма сайленсинга в кластерах импринтированных генов}

^{(а) Модель инсулятора для кластера Igf2. Показан паттерн экспрессии для эндодермы. На материнской хромосоме неметилированный ICE связывается с белком CTFC и формирует инсулятор, который не дает общим энхансерам эндодермы (Е) активировать Igf2 и Ins2. Вместо этого эти энхансеры активируют близлежащий промотор ncRNA Н19. На отцовской хромосоме метилированный ICE не может связываться с СТСЕ и инсулятор не образуется, вследствие чего гены иРНК Igf2 и Ins2 экспрессируются только на этой хромосоме. ncRNA Н19 метилируется, скорее всего, из-за распространения с удаленного на 2 т.о.метилированного ICE и является «молчащей», (б) модель ncRNA для кластера Igf2r. Показан паттерн экспрессии для плаценты. На материнской хромосоме метилированный ICE содержит промотор ncRNA Air, который прямо сайленсирован импринтом метилирования ДНК. Гены иРНК Igf2r, Slc22a2 и Slc22a3 экспрессируются только на этой хромосоме. Mas1 и Slc22a1 в плаценте не экспрессируются. На отцовской хромосоме промотор ncRNA Air, лежащий в неметилированном [СЕ, экспрессируется и сайленсирует Igf2r, Slc22a2 и Slc22a3 в cis. Заметьте, что в обеих моделях импринт метилирования ДНК сайленсирует ncRNA и делает возможной экспрессию иРНК: (ICE) — элемент контроля импринта (серый прямоугольник) — импринтированный ген иРНК, (ген-NC) — импринтированный ген ncRNA, (стрелка) экспрессированная аллель импринтированного гена, (черный запрещающий знак) — репрессированная аллель импринтированного гена, (заполненный ромб) — тканеспецифичныи ген, сайленсированныи на обеих родительских хромосомах, (серые стрелки) — удаленный эффект в cis-конфигурации}

ncRNA-класс моделей импринтинга может, однако, быть более обычным. Прорывом, приведшим к идентификации функциональных ncRNAs в импринтированных кластерах, явился эксперимент с укорочением ncRNA Air, имеющей длину 108 т. о., до 3 т. о. (Sleutels et al., 2002). Эта укороченная ncRNA сохраняла импринтированную экспрессию, и промотор Air сохранял импринтированное метилирование ДНК — тем не менее, сайленсинг всех трех генов иРНК в кластере Igf2r был утрачен (рис. 19.7). Сейчас было показано, что сайленсинг, опосредованный ncRNA, действует также в кластере Kcnq1 (Mancini-DiNardo. 2006) В настоящее время неизвестно, каким образом ncRNA Air или Kcnq1ot1 сайленсируют гены в соответсвующих импринтированных кластерах. Возможны многие модели, применимые к обоим кластерам. Две возможности возникают из факта перекрывания смысловой и антисмысловой последовательности иРНК и ncRNA, имеющего место в каждом кластере. Первая возможность заключается в том, что между иРНК и ncRNA может образовываться двунитевая РНК и индуцировать РНК-интерференцию (RNAi) (глава 8). Вторая возможность состоит в том, что это перекрывание смысловой и антисмысловой последовательности становится причиной одной из форм транскрипционной интерференции между двумя промоторами, которая затрагивает лишь транскрипцию с промотора иРНК. В обоих этих случаях первым событием был бы посттранскрипционный сайленсинг перекрывающейся иРНК, сопровождаемый накоплением репрессивного хроматина, способного распространяться и индуцировать транскрипционный сайленсинг генов во всем кластере.

Однако возможно также, что импринтированные ncRNAs действуют, покрывая локальный участок хромосомы и непосредственно рекрутируя репрессивные белки хроматина к репрессированному кластеру примерно таким же образом, как это описано для действия ncRNA Xist в инактивации Х-хромосомы (глава 17). Имеет место большое сходство между сайленсингом, опосредуемым импринтированной ncRNA, и сайленсингом, опосредуемым ncRNA Xist. Наиболее существенно, что оба эти случая представляют cis-действующие эпигенетические механизмы сайленсинга и оба демонстрируют положительную корреляцию между экспрессией ncRNA и сайленсингом множественных генов иРНК. Предположили также, что геномный импринтинг и Х-инактивация развились из общего эпигенетического механизма (Reik and Lewis, 2005). Если бы это было так, можно было бы предсказать, что импринтированные ncRNAs могут сайленсировать гены путем «нацеливания» репрессивного хроматина на кластер импринтированных генов Однако у нас все еще нет четкой информации относительно того, как импринтированные ncRNAs осуществляют свою сайленсирующую функцию. И мы все еще не знаем, сколько других импринтированных ncRNAs также играют функциональную роль в сайленсинге генов.

Antequera E, 2003. Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell Mol. Life Sci. 60: 1647–1658.

Barlow D.R, 1993. Methylation and imprinting: From host defense to gene regulation? Science 260: 309–310.

Barlow D.R, Stoger R., Herrmann B.G., Saito K., and Schweifer N., 1991. The mouse insulin-like growth factor type-2 receptor is imprinted and closely linked to the Tme locus. Nature 349: 84–87.

Bartolomei M.S., Zemel S., and Tilghman S.M., 1991. Parental imprinting of the mouse H19 gene. Nature 351: 153–155.

Bartolomei M.S., Webber A.L., Brunkow M.E., and Tilghman S.M., 1993. Epigenetic mechanisms underlying the imprinting of the mouse H19 gene. Genes Dev. 7: 1663–1673.

Barton S.C., Surani M.A., and Norris M.L., 1984. Role of paternal and maternal genomes in mouse development. Nature 311: 374–376.

Bell A.C. and Felsenfeld G., 2000. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature 405: 482–485.

Bielinska B., Blaydes S.M., Buiting K., Yang T., Krajewska-Walasek M., Horsthemke B., and Brannan C.I., 2000. De novo deletions of SNRPN exon 1 in early human and mouse embryos result in a paternal to maternal imprint switch. Nat. Genet. 25: 74–78.

Bourc’his D. and Bestor T.H., 2006. Origins of extreme sexual dimorphism in genomic imprinting. Cytogenet. Genome Res. 113: 36–40.

Brannan C.I., Dees E.C., Ingram R.S., and Tilghman S.M., 1990. The product of the H19 gene may function as an RNA. Mol. Cell Biol. 10: 28–36.

Cattanach B.M. and Kirk M., 1985. Differential activity of maternally and paternally derived chromosome regions in mice Nature 315: 496–498.

Chaillet J. R., Bader D. S., and Leder P., 1995. Regulation of genomic imprinting by gametic and embryonic processes. Genes Dev. 9: 1177–1187.

Chandra H.S. and Nanjundiah V., 1990. The evolution of genomic imprinting. Dev. Suppl, 1990: 47–53.

Constancia M., Dean W., Lopes S., Moore T., Kelsey G., and Reik W., 2000. Deletion of a silencer element in Igf2 results in loss of imprinting independent of HI9. Nat. Genet. 26: 203–206.

Cooper D.W., VandeBerg J.L., Sharman G.B., and Poole W.E., 1971. Phosphoglycerate kinase polymorphism in kangaroos provides further evidence for paternal X inactivation. Nat New Biol. 230: 155–157.

Crouse H.V., Brown A., and Mumford B.C., 1971 Chromosome inheritance and the problem of chromosome “imprinting” in Sciara (Sciaridae, Diptera). Chromosoma 34: 324–398.

Davis E., Caiment E., Tordoir X., Cavaille J., Ferguson-Smith A., CockettN., Georges M., and ChariierC.. 2005. RNAi-mediated allelic trans-interaction at the imprinted Rtl 1/Peg 11 locus. Curr. Biol. 15: 743–739.

DeChiaraT.M., Robertson E.J., and Efstratiadis A., 1991. Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene. Cell 64: 849–859.

Egger G., Liang G., Aparicio A., and Jones P.A., 2004. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature 429: 457–463.

Fedoriw A.M., Stein P., Svoboda P., Schultz R.M., and Bartolomei M.S., 2004. Transgenic RNAi reveals essential function for CTCF in H19 gene imprinting. Science 303: 238–240.

Ferguson-Smith A.C., Sasaki H., Cattanach B.M., and Suram M.A., 1993. Parental-origin-specific epigenetic modification of the mouse H19 gene. Nature 362: 751–755.

Ferguson-Smith A.C., Cattanach B.M., Barton S.C., Beechey C.V., and Surani M.A., 1991. Embryological and molecular investigations of parental imprinting on mouse chromosome 7. Nature 351: 667–670.

Fitzpatrick G.V., Soloway P.D., and Higgins M.J., 2002. Regional loss of imprinting and growth deficiency in mice with a targeted deletion of KvDMRl. Nat. Genet. 32: 426–431.

Goll M.G. and Bestor T.H., 2005. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu. Rev. Biochem. 74: 481–514.

Hark A.T., Schoenherr C.J., Katz D.J., Ingram R.S., Levorse J.M., and Tilghman S.M., 2000. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus. Nature 405: 486–489.

Haussecker D. and Proudfoot N.J., 2005. Dicer-dependent turnover of intergenic transcripts from the human y-globin gene cluster. Mol Cell Biol. 25: 9724–9733.

Hoppe P.C. and Illmensee K., 1982. Full-term development after transplantation of parthenogenetic embryonic nuclei into fertilized mouse eggs. Proc. Natl. Acad. Sci., 19: 1912–1916.

Hurst L.D., McVean C, and Moore T., 1996. Imprinted genes have few and small introns. Nat. Genet. 12: 234–237.

Jiang Y.H., Bressler J., and Beaudet A.L., 2004. Epigenetics and human disease. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 5: 479–510.

Johnson D.R., 1974. Hairpin-tail: A case of post-reductional gene action in the mouse egg. Genetics 76: 795–805.

Kazazian H.H., Jr., 2004. Mobile elements: Drivers of genome evolution. Science 303: 1626–1632.

KimT.H., Barrera L.O., Zheng M., Qu C., Singer M.A., Richmond T.A., Wu Y., Green R.D., and Ren B., 2005. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature 436: 876–880.

Kono T.. Obata Y., Wu Q., Niwa K., Ono Y., Yamamoto Y., Park E.S., Seo J.S., and Ogawa H., 2004. Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood. Nature 428: 860–864.

Landers M., Bancescu D.L., Le Meur E., Rougeulle C., Glatt-Deeley H., Brannan C., Muscatelli F. and Lalande M., 2004. Regulation of the large (-1000 kb) imprinted murine Ube3a antisense transcript by alternative exons upstream of Snurf/Snrpn. Nucleic Acids Res. 32: 3480–3492.

Lewis A., Mitsuya K., Umlauf D., Smith P., Dean W., Walter J., Higgins M., Feil R. and Reik W, 2004. Imprinting on distal chromosome 7 in the placenta involves repressive histone methylation independent of DNA methylation. Nat. Genet. 36: 1291–1295.

Lin M.S., Zhang A., and Fujimoto A., 1995. Asynchronous DNA replication between 15ql 1.2ql 2 homologs: Cytogenetic evidence for maternal imprinting and delayed replication. Hum. Genet. 96: 572–576.

Lin S.P., Youngson N., Takada S., Seitz H., Reik W., Paulsen M., Cavaille J, and Ferguson-Smith A.C., 2003. Asymmetnc regulation of imprinting on the maternal and paternal chromosomes at the Dlk1-Gtl2 imprinted cluster on mouse chromosome 12. Nat. Genet. 35: 97-102.

Liu J., Litman D., Rosenberg M.J., Yu S., Biesecker L.G., and Weinstein L.S., 2000. A GNAS1 imprinting defect in pseudohypoparathyroidism type IB. J. Clin. Invest. 106: 1167–1174.

Lyle R., Watanabe D., te Vruchte D., Lerchner W., Smrzka O.W., Wutz A., Schageman J., HahnerL., Davies C., and Barlow D.R., 2000. The imprinted antisense RNA at the Igf2r locus overlaps but does not imprint Mas I. Nat. Genet. 25: 19–21.

Mager J., Montgomery N.D., de Villena F.P.. and Magnuson T., 2003. Genome imprinting regulated by the mouse Polycomb group protein Eed. Nat. Genet. 33: 502–507.

Mancini-DiNardo D.S., Levorse J,M., Ingram R.S., and Tilghman S.M., 2006. Elongation of the Kcnqotl transcript is required for genomic imprinting of neighboring genes. Genes Dev., 20: 1268–1282.

Mattick J.S., 2005. The functional genomics of noncoding RNA. Science 309: 1527–1528.

McGrath J. and Solter D., 1984a. Completion of mouse embry0genesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell 37: 179–183.

McGrath J. and Solter D., 1984b. Maternal Thp lethality in the mouse is a nuclear, not cytoplasmic, defect. Nature 308: 550–551.

McLaren A., 1979. Maternal effects in development: The fourth symposium of the British Society for Developmental Biology (ed. D.R. Newth and M. Balls). Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom.

Mitsuya K., Meguro M., Lee M.P.. Katoh M., Schulz T.C., Kugoh H., Yoshida M.A., Niikawa N., Feinberg A.P., and Oshimura M., 1999. LIT1, an imprinted antisense RNA in the human KvLQTl locus identified by screening for differentially expressed transcripts using monochromosomal hybrids. Hum. Mol. Genet. 8: 1209–1217.

Moore T. and Haig D., 1991. Genomic imprinting in mammalian development: A parental tug-of-war. Trends Genet. 7: 45–49.

Moore T., Constancia M., Zubair M., Bailleul B., Feil R., Sasaki H., and ReikW., 1997. Multiple imprinted sense and antisense transcripts, differential methylation and tandem repeats in a putative imprinting control region upstream of mouse Igf2. Proc Natl. Acad. Sci. 94: 12509-12514.

Neumann B., Kubicka P., and Barlow D.P., 1995. Characteristics of imprinted genes. Nat. Genet. 9: 12–13.

O’Neill M.J., 2005. The influence of non-coding RNAs on allele-specific gene expression in mammals. Hum. Mol. Genet. 14: R113-120

Rabinowicz P.D., Palmer L.E., May B.P., Hemann M.T., Lowe S.W.. McCombie W.R., and Martienssen R.A., 2003. Genes and transposons are differentially methylated in plants, but not in mammals. Genome Res. 13: 2658–2664.

Regha K.. Latos P.A., and Spahn L., 2006. The imprinted mouse Igf2r/Air cluster — A model maternal imprinting system. Cytogenet. Genome Res. 113: 165–177.

Reik W., 1989. Genomic imprinting and genetic disorders in man Trends Genet 5: 331–336.

Reik W. and Lewis A.. 2005. Co-evolution of X-chromosome inactivation and imprinting in mammals. Nat. Rev. Genet. 6: 403–410.

ReikW., Howlett S.K., and Surani M.A., 1990. Imprinting by DNA methylation: From transgenes to endogenous gene sequences. Dev. Suppl., 1990: 99-106.

Sasaki E.L., Jones P.A., Chaillet J.R., Ferguson-Smith A.C., Barton S.C., Reik W., and Surani M.A., 1992. Parental imprinting: Potentially active chromatin of the repressed maternal allele of the mouse insulin-like growth factor II (Igf2) gene. Genes Dev. 6: 1843–1856.

Schmidt J.V., Levorse J.M., and Tilghman S.M., 1999. Enhancer competition between H19 and Igf2 does not mediate their imprinting. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 9733–9738.

Searle A.G. and Beechey C.V., 1978. Complementation studies with mouse translocations. Cytogenet. Cell Genet., 20: 282–303.

Seitz E.L., Royo E.L., Lin S.P., Youngson N., Ferguson-Smith A.C., and Cavaille J., 2004. Imprinted small RNA genes. Biol. Chem. 385: 905–911.

Shemer R., Birger Y., Riggs A.D., and Razin A., 1997. Structure of the imprinted mouse Snrpn gene and establishment of its parental-specific methylation pattern. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10267-10272.

Sleutels F., Zwart R., and Barlow D.P., 2002. The non-coding Air RNA is required for silencing autosomal imprinted genes. Nature 415: 810–813.

Sleutels E, Tjon G., Ludwig T, and Barlow D.P., 2003. Imprinted silencing of Slc22a2 and Slc22a3 does not need transcriptional overlap between lgf2r and Air. EMBO J. 22: 3696–3704.

Spahn L. and Barlow D.P., 2003. An ICE pattern crystallizes. Nat. Genet. 35: 11–12.

Stoger R., Kubicka P., Liu C.G., Kafri T., Razin A., Cedar H., and Barlow D.P., 1993. Maternal-specific methylation of the imprinted mouse Igf2r locus identifies the expressed locus as carrying the imprinting signal. Cell 73: 61–71.

Surani M.A., Barton S.C., and Norris M.L., 1984. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature 308: 548–550.

Takada S., Paulsen M., Tevendale M., Tsai C.E., Kelsey G., Cattanach B.M., and Ferguson-Smith A.C., 2002. Epigenetic analysis of the Dlk1-Gtl2 imprinted domain on mouse chromosome 12: Implications for imprinting control from comparison with Igf2-H19. Hum. Mol. Genet. 11: 77–86.

Thorvaldsen J.L., Duran K.L., and Bartolomei M.S., 1998. Deletion of the H19 differentially methylated domain results in loss of imprinted expression of H19 and lgf2. Genes Dev. 12: 3693–3702.

Tierling S., Dalbert S., Schoppenhorst S., Tsai C.E., Oliger S., Ferguson-Smith A.C., Paulsen M., and Walter J., 2005. High-resolution map and imprinting analysis of the Gtl2-Dnchcl domain on mouse chromosome 12. Genomics. 87: 225–235.

Varmuza S. and Mann M., 1994. Genomic imprinting — Defusing the ovarian time bomb. Trends Genet. 10: 118–123.

Verona R.E., Mann M.R., and Bartolomei M.S., 2003. Genomic imprinting: Intricacies of epigenetic regulation in clusters. Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 19: 237–259.

Wilkins J.F. and Haig D., 2003. What good is genomic imprinting: The function of parent-specific gene expression. Nat. Rev. Genet. 4: 359–368.

Williamson CM., Turner M.D., Ball S.T., Nottingham W.T., Glenister P., Fray M., Tymowska-Lalanne Z., Plagge A., Powles-Glover N., Kelsey C., et al., 2006. Identification of an imprinting control region affecting the expression of all transcripts in the Gnas cluster. Nat. Genet. 38: 350–355.

Wroe S.T., Kelsey C., Skinner J.A., Bodle D., Ball S.T., Beechey C.V., Peters J., and Williamson C.M., 2000. An imprinted transcript, antisense to Nesp, adds complexity to the cluster of imprinted genes at the mouse Gnas locus. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3342–3346.

Wutz A., Smrzka O.W., Schweifer N., Schellander K., Wagner E.F., and Barlow D.P., 1997. Imprinted expression of the lgf2r gene depends on an intronic CpG island. Nature 389: 745–749.

Yatsuki H., Joh K., Higashimoto K., Soejima H., Arai Y.. Wang Y., Hatada E., Obata Y., Morisaki H., Zhang Z., et al., 2002. Domain regulation of imprinting cluster in Kip2/Litl subdomain on mouse chromosome 7F4/F5: Large-scale DNA methylation analysis reveals that DMR-Litl is a putative imprinting control region. Genome Res. 12: 1860–1870.

Zwart R., Sleutels E, Wutz A., Schinkel A.H., and Barlow D.P., 2001. Bidirectional action of the lgf2r imprint control element on upstream and downstream imprinted genes. Genes Dev. 15: 2361–2366.

Beechey C. V., Cattanach B.M., Blake A., and Peters J., 2005. MRC Mammalian Genetics Unit, Harwell, Oxfordshire. World Wide Web Site — Mouse Imprinting data and references (http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/research/imprinting/). http://nocode.bioinfo.org.cn/ NONCODE — the database of non-coding RNA.