Эпигенетика

Eric Meyer¹ и Douglas L. Chalker²

¹Laboratoire de Cenetique Moleculaire, CNRS UMR 8541 Ecole Normale Superieure, 75005 Paris, France

²Department of Biology, Washington University, St. Louis, Missouri 63130

Общее резюме

Наверняка любой наблюдавший инфузорий под микроскопом был поражен этими сложными маленькими животными, использующих свои волосковидные реснички для плавания, питания и поисков партнера. Вегетативно растущие клетки удваиваются путем простого бинарного деления; тем не менее, периодически инфузории спариваются с партнерами или, у некоторых видов, претерпевают самооплодотворение, в результате чего получается половое потомство с иным генотипом. Уникальной отличительной чертой этих одноклеточных эукариот является то, что они поддерживают в общей цитоплазме два функционально различающихся генома, содержащихся в отдельных ядрах. Меньшее из них, микронуклеус, содержит геном зародышевой линии. Он транскрипционно «молчит» в ходе роста, но сохраняет генетическую информацию, которая передается потомству в каждом половом поколении. Более крупное ядро, макронуклеус, осуществляет соматические функции, поскольку отвечает за всю экспрессию генов и таким образом управляет фенотипом клетки. Он элиминируется в конце каждого вегетативного цикла, когда из зародышевой линии дифференцируется новый макронуклеус. Во время развития макронуклеуса в результате массивных перестроек ДНК создается отредактированная версия генома, готовая для экспрессии. Часть генома зародышевой линии, включая всю повторяющуюся ДНК, долгое время считавшуюся «мусорной», элиминируется, тогда как все гены, необходимые для выживания организма в жизненном цикле, амплифицируются до высокого уровня плоидности.

Генетические странности инфузорий сделали их очень полезными модельными организмами для обнаружения и понимания эпигенетических механизмов. У некоторых видов два потомка-сибса, развивающиеся после спаривания, начинают свою жизнь с идентичными геномами, но их соматические ядра дифференцируются в контексте двух разных родительских клеток. Это позволяет легко выявлять наследственные признаки, которые не детерминируются исключительно ядерным геномом. Генетические эксперименты, проведенные с Paramecium tetraurelia, прежде всего эксперименты, проведенные Треси Соннеборном, дали одно из самых ранних описаний неменделевского наследования у эукариот вообще. Среди случаев, в которых генетически идентичные сибсы экспрессировали разные варианты специфических признаков, некоторые были истинными примерами цитоплазматической наследственности (материнского наследования ДНК органелл), но другие. такие как наследование типов спаривания особи, были случаями иного рода. Тип спаривания потомка не определялся его генотипом; скорее, он специфицировался предсуществующим типом родительской клетки, в которой развивался его соматический геном. Выражаясь простыми терминами, можно сказать, что разные внешние условия (родительская цитоплазма) направляют экспрессию альтернативных признаков, исходя из идентичных наборов ДНК. А это является отличительной чертой эпигенетики.

Особая генетическая организация инфузорий предполагает также наличие механизмов, дифференциально регулирующих гомологичные последовательности, содержащиеся в разных ядрах. Ранние исследования имели целью выяснить способы, которыми зародышевая линия поддерживалась «молчащей», а соматический геном — транскрипционно активным. Компартментализация состояний генной экспрессии дала исследователям возможность изучать роль белков хроматина и их модификаций в эпигенетической регуляции. Они могли легко соотносить специфические гистоны и их модификации с транскрипционной активностью или стадией клеточного цикла. Например, в результате сравнения белков хроматина из ядер зародышевой линии и соматических ядер Tetrahymena thermophila были идентифицированы некоторые из первых вариантов гистонов. Далее у этой инфузории были идентифицированы такие новые регуляторы хроматина, как первая апетилтрансфераза гистонов (HAT) — отчасти за счет использования того факта, что только макронуклеус содержит ацетилированные гистоны.

Хотя генетика инфузорий может показаться нестандартной, лежащие в ее основе механизмы широко используются для эпигенетической регуляции у эукариот, что иллюстрирует роль РНК-интерференции в перестройках целого генома. Степень и формы этих перестроек удивительно разнообразны у разных видов инфузорий, однако одна общая черта заключается в том, что они в норме направляют элиминацию транспозоноподобных элементов и других повторяющихся последовательностей. И у Paramecium, и у Tetrahymena с генома зародышевой линии во время мейоза генерируются короткие РНК. Обнаружение этих малых РНК, тот факт, что для перестроек ДНК у Tetrahymena требуются гомологи Argonaute и Dicer, позволили осознать, что здесь действует механизм, подобный РНК-интерференции. Полагают, что малые РНК нацеливают метилирование гистона H3 по лизину 9 на гомологичные последовательности, маркируя их для элиминации. Таким образом, с механистической точки зрения перестройки ДНК у инфузорий сходны с более широко используемым РНК-направляемым формированием хроматина. Использование RNAi для элиминации перемещаемых элементов еще более подчеркивает важность этого пути как механизма защиты генома. Далее, многие эксперименты показали, что паттерны перестроек ДНК не строго детерминированы геномом зародышевой линии, но контролируются — по крайней мере отчасти — предсуществующими перестройками в родительском соматическом геноме. Отсюда следует, что геномы зародышевой линии и соматический сравниваются друг с другом в ходе ядерной дифференпировки; это сравнение опосредуется, вероятно, зависящими от гомологии взаимодействиями между РНК зародышевой линии и соматическими. Полное понимание этого процесса несомненно позволит глубже проникнуть в роль РНК в эпигенетическом программировании генома.

1. Инфузории: одноклеточные с двумя разными геномами

Инфузории, образующие монофилетическую группу, возникшую около одного миллиарда лет тому назад (Philippe et al. 2000), были среди первых одноклеточных эукариот, использованных в качестве генетических моделей. В конце 1930-х годов, когда Т.М.Соннеборн открыл типы спаривания у Paramecium aurelia (Sonnebom 1937), хромосомная теория наследственности, разработанная Т.Х.Морганом, всё еще не удовлетворяла многих исследователей, в особенности эмбриологов (исторические детали см. в главе 2). Будучи не способны представить себе, как такие статичные сущности, как гены, могут быть единственной основой наследственности, они полагали, что цитоплазма должна участвовать хотя бы только в координации действия генов (см. Harwood 1985). В то время как генетики в основном были сосредоточены на действии генов, ранний генетический анализ, выполненный Соннеборном, показал, что передачу многих наследуемых признаков нельзя было полностью объяснить менделевскими законами. Изучение инфузорий, благодаря их уникальной биологии, позволило обнаружить некоторые первые примеры цитоплазматической наследственности и продолжает обеспечивать новые возможности проникновения в эпигенетические механизмы.

Одной из наиболее заметных черт инфузорий является ядерный диморфизм. Каждая клетка содержит ядра двух типов, различающихся по структуре и функции. Диплоидные микронуклеусы являются транскрипционно «молчащими» во время вегетативного роста, но содержат геном зародышевой линии. Эти ядра претерпевают мейоз и дают гаметические ядра, которые передают менделевский геном следующему половому поколению (рис. 7.1). В противоположность этому, высокополиплоидные макронуклеусы ответственны за экспрессию генов во время вегетативного роста и таким образом управляют фенотипом клетки, но они утрачиваются во время полового развития и могут, следовательно, рассматриваться как эквивалент сомы (рис. 7.1). Число ядер каждого типа варьирует у разных видов. Например, виды P. aurelia имеют два микронуклеуса и один макронуклеус, тогда как у Tetrahymena thermophila лишь по одному ядру каждого типа.

Макро- и микронуклеусы делятся с помощью разных механизмов. Микронуклеусы делятся путем обычного закрытого митоза. Макронуклеусы, напротив, делятся с помощью все еще недостаточно изученного механизма. который не связан с образованием веретена или с видимой конденсацией не имеющих центромер соматических хромосом. После синтеза ДНК макронуклеус просто расщепляется на две приблизительно равные части. Какой-нибудь механизм, обеспечивающий равное распределение макронуклеарных хромосом в два дочерних ядра, по-видимому, отсутствует. Вместо этого, вероятно, высокий уровень плоидности (~800n у P. tetraurelia, ~45n у Т. thermophila) предотвращает летальную утрату генов на протяжении ряда вегетативных делений. Большинство видов обладают конечной продолжительностью вегетативной жизни, и клональные клеточные линии в конечном счете погибают, если не принимают участие в половом воспроизведении, прежде чем станут старыми.

2. Конъюгация: реципрокное оплодотворение обнаруживает неменделевскую наследственность

Инфузории являются гермафродитными линиями, способными к конъюгации — процессу спаривания, включающему перекрестное оплодотворение между двумя родительскими клетками. Зрелые клетки соответствующего клонального возраста, обычно после легкого голодания, становятся сексуально реактивными и спариваются с клетками совместимых типов спаривания, чтобы начать конъюгацию. Если совместимый партнер отсутствует, некоторые виды обычно претерпевают процесс самооплодотворения, называемый автогамией. В обоих случаях за этим следует ядерная реорганизация, начинающаяся с мейоза микронуклеусов. Последовательность ядерных событий сходна у всех видов (хотя и имеются некоторые вариации) и изображена на рис. 7.1 для видов Р aurelia и Т. thermophila. (см. Sonnebom 1975).

Постмейотическое развитие начинается с выбора единственного гаплоидного ядра в каждой клетке для передачи генома. Выбранное ядро претерпевает дополнительное деление, даюшее два генетически идентичных гаметических ядра. В случае конъюгации два партнера обмениваются одним из двух своих гаплоидных ядер, и поэтому последующая кариогамия (т.е. слияние двух гаплоидных ядер) формирует в каждом конъюганте генетически идентичные зиготические ядра (стадии 3—5 на рис. 7.1). При автогамии два гаметических ядра в одной клетке сливаются и образуют полностью гомозиготный диплоидный геном. В обоих случаях получающееся в результате диплоидное зиготическое ядро (стадия 5) делится еще два раза, и четыре продукта этих делений дифференцируются: два — в новые микронуклеусы, а два — в новые макронуклеусы (стадии 6 и 7). По завершении развития ядерного аппарата в новых вегетативных клонах сохраняются либо оба новых микронуклеуса, как это имеет место у видов P. aurelia, либо одно из двух ядер деградирует, как у Т. thermophila. У обоих видов два новых макронуклеуса при первом клеточном делении не делятся (стадия 9), а распределяются в две дочерние клетки; они начинают делиться только при втором вегетативном делении.

В то время как родительские микронуклеусы дают начало новым микро- и макронуклеусам следующего поколения, родительский макронуклеус утрачивается. У P. aurelia он фрагментируется примерно на 30 кусков, в которых репликация ДНК быстро подавляется, хотя транскрипция активно продолжается на протяжении периода дифференцировки новых макронуклеусов. Когда вегетативный рост возобновляется, эти фрагменты распределяются случайным образом в дочерние клетки, пока не остается ни одного (стадия 9). У Т. thermophila родительский макронуклеус не фрагментируется, но пикнотизируется и деградирует по апоптозоподобному механизму до первого вегетативного деления (Davis et al. 1992) (стадии 7 и 8).

^{Рис. 7.1. Жизненные циклы Paramecium (вверху) и Tetrahymena (внизу)}

^{(Стадия 1) Вегетативные клетки размножаются бинарным делением. Половое развитие (стадии 2—8) обычно начинается после конъюгации двух клеток или автогамии (только у Paramecium).}

^{(Стадии 2—3) Мейоз микронуклеуса заканчивается выбором одного из гаплоидных продуктов на роль гаметического ядра и дегенерацией остальных ядер. У Parmecium родительский макронуклеус начинает формировать лопасти.}

^{(Стадии 4—6) Формирование зиготы. Дополнительное деление выбранного ядра дает два генетически идентичных гаплоидных ядра. В ходе конъюгации одно из этих двух идентичных гаметических ядер обменивается на такое же ядро между двумя партнерами, и последующая кариогамия дает диплоидное зиготическое ядро (красный цвет). В ходе автогамии два идентичных гаметических ядра просто сливаются вместе. Два дополнительных постзиготических деления (6) дают недифференцированные микро- и макронуклеусы.}

^{(Стадии 6—8) Ядерная дифференцировка. После второго постзиготического деления из получившихся в результате ядер два становятся новыми микронуклеусами, тогда как два других начинают дифференцироваться в новые макронуклеусы (розовый цвет). У Paramecium материнский макронуклеус фрагментируется. У Tetrahymena он пикнотизируется. У Tetrahymena же один из новых микронуклеусов дегенерирует.}

^{(Стадия 9) Карионидное деление: Это первое вегетативное деление является особым, поскольку новые макронуклеусы распределяются в дочерние клетки без деления, тогда как микронуклеусы расходятся в клетки-потомки путем митоза. Наконец, фрагменты родительского макронуклеуса у Paramecium не делятся, но сохраняются до тех пор, пока не утрачиваются в результате случайного распределения при последующих делениях}

3. Цитоплазматическая наследственность у инфузорий

Биология конъюгации P. aurelia чрезвычайно благоприятна для выявления эпигенетических явлений, связанных с влиянием цитоплазмы. В то время как реципрокное оплодотворение генерирует в двух конъюгантах генетически идентичные зиготические ядра, между ними почти не происходит обмена цитоплазмой, что позволяет эффективно различать действие ядерных генов от действия наиболее влиятельного фактора внешней среды — цитоплазмы материнской клетки (рис. 7.2). Каждое генетическое скрещивание поэтому эквивалентно изучению монозиготных близнецов, рожденных разными матерями. Исследования Соннеборна показали, что фенотипические различия между двумя родительскими клетками могут поддерживаться у потомков каждой из них даже несмотря на то, что эти потомки обладают идентичными генотипами. Позже оказалось, что в ряде случаев эти фенотипические различия детерминируются экстрануклеарными генами и сегодня не должны квалифицироваться как эпигенетические явления. Например, смертоносные свойства киллерных штаммов P. aurelia обусловлены обитающими в цитоплазме эндосимбиотическими бактериями рода Caedibacter; которые выделяют токсин, убивающий чувствительные штаммы (обзоры см. Preer et al., 1974; Pond et al., 1989). Другие случаи, такие как материнское наследование серотипа, которое требует взаимно исключающую экспрессию одного из нескольких паралогичных генов поверхностных антигенов, являются четкими случаями цитоплазматического влияния на активность генов.

^{Рис. 7.2. Менделевская vs. цитоплазматическая наследственность}

^{(а) Конъюгация и автогамия иллюстрируются скрещиванием между двумя клетками Paramecium, каждая из которых гомозиготна по разным аллелям, М или т. Конъюгация включает реципрокный обмен одним из двух идентичных гаметических ядер. В результате этого образуются клетки-эксконъюганты F1 с идентичными гетерозиготными генотипами. Автогамия (процесс самооплодотворения) генерирует полностью гомозиготный генотип всего в одном половом поколении, так что особи F2 имеют 50 %-ную вероятность стать М/М или m/m.}

^{(б) Фенотипическое различие между клонами F1 выявляет цитоплазматически наследуемые признаки. У Paramecium тип спаривания (О или Е) необратимо детерминируется в ходе развития соматического макронуклеуса (большой кружок) из тотипотентного микронуклеуса зародышевой линии (маленький кружок); однако родительский макронуклеус направляет дифференцировку каждого эксконъюганта в направлении сохранения существующего типа спаривания}

Как и серотипы, два комплементарных типа спаривания у P. tetraurelia, которые обозначаются как О и Е, демонстрируют цитоплазматический паттерн наследования. Признаки О и Е являются терминально дифференцированными фенотипами, которые детерминируются в ходе развития соматического макронуклеуса из тотипотентной зародышевой линии. После конъюгации вегетативный клон, происходящий от родителя О, почти всегда демонстрирует тип спаривания О, тогда как клон, происходящий от родителя Е, почти всегда относится к типу Е, несмотря на то, что оба этих эксконъюганта развиваются из идентичных зиготических геномов (рис. 7.26). Более того, когда между двумя конъюгируюшими клетками образуется большой цитоплазматический мостик, обусловливающий существенный обмен цитоплазмой, потомство обоих родителей обычно развивается как тип Е (Sonnebom, 1977). Таким образом, должен существовать некий цитоплазматический фактор, который направляет развитие типа Е.

Как описывается ниже, геном зародышевой линии во время развития макронуклеуса подвергается масштабным перестройкам ДНК, и хотя предполагаемый ген типа спаривания все еще не идентифицирован, было показано, что одна менделевская мутация, влияющая на детерминацию типа спаривания, нарушает эти перестройки генома в других локусах (Meyer and Keller, 1996). Если тип спаривания определяется регулируемыми геномными перестройками, этот цитоплазматический фактор, определяющий тип Е, должен обладать способностью направлять альтернативную перестройку гена типа спаривания и давать в результате макронуклеарную форму этого гена, специфицирующую тип Е. В ходе конъюгации эта форма должна также производить цитоплазматический фактор, определяющий тип Е и необходимый для дальнейшего наследования. Как описывается в разделе 10, паттерны альтернативных перестроек могут передаваться от материнских макронуклеусов к зиготическим макронуклеусам в результате транс-нуклеарного влияния, которое по-видимому опосредуется молекулами РНК, действующими зависящим от гомологии образом. Таким образом, цитоплазматический фактор, ответственный за неменделевское наследование, является, вероятно, молекулой РНК, контролирующей «мутацию» развития в гене типа спаривания.

4. Кортикальное паттернирование: случай структурной наследственности

Исследования сложной архитектуры клеточного кортекса обнаружили еще одну форму неменделевской наследственности. Клетка Paramecium покрыта примерно 4000 ресничками, расположенными в виде продольных рядов заякоренных ячеек (рис. 7.3а). Каждая ресничка коренится в базальном тельце, или кинетосоме, — сложной структуре, обладающей и передне-задней, и лево-правой асимметрией. Когда клетки делятся, структура цилиарных ячеек накладывает определенные ограничения на дупликацию базальных телец, так что новые базальные тельца остаются в той же самой ориентации (рис. 7.3б). Однако хирургическая пересадка небольшого участка кортекса в перевернутой ориентации (с обращенной полярностью) по мере дупликации пересаженных базальных телец приведет, в конечном счете, к образованию полностью перевернутого ресничного ряда (рис. 7.3в). Эта передне-задняя инверсия будет воспроизводиться в неограниченном числе вегетативных клеточных делений и будет наследоваться по материнской линии в ходе конъюгации (Beisson and Sonnebom, 1965).

^{Рис. 7.3. Структурное наследование полярности кортикальной ячейки у Paramecium}

^{(а) Иммуномечение базальных телец и корешков реснички выявляет регулярную организацию параллельных кортикальных рядов у клеток дикого типа. Показаны вентральный (слева) и дорзальный (справа) виды, (б) Дорзальная сторона клетки, демонстрирующей нарушение этой регулярной организации благодаря обращенной переднее-задней полярности нескольких рядов кортикальных ячеек. Базальные тельца изображены красным цветом, цилиарные корешки — зеленым, (в) Увеличенный вид участка кортекса показывает обращенную ориентацию инвертированных рядов (I) по отношению к нормальным рядам (N). (г) Схематическое изо­ бражение дупликации базальных телец (зеленые кружки) в процессе роста; показано, что каждое тельце фланкировано с правой стороны переднее-ориентированным цилиарным корешком (пурпурный цвет) и двумя микротубулярными лентами. Дупликация происходит с фиксированной геометрией: каждое новое базальное тельце позиционируется спереди от своего родительского тельца, обеспечивая тем самым идентичную полярность, (д) Повторная дупликация базальных телец в пределах каждого ряда поддерживает однородную ориентацию бесконечно долго (фотографии любезно предоставлены Janine Beisson)}

Эти опыты с пересадками показали, что гены не отвечают за наследование таких структурных вариаций, и вскрыли существенную роль предсуществующих структур для правильной сборки новых структур. Ориентированная дупликация центриоли (Beisson and Wright, 2003) и воспроизведение формы жгутика при клеточном делении трипаносом (Moreira-Leite et al., 2001) представляют собой другие примеры этого явления. Прионы — еще один пример самовоспроизводящихся конформаций белков, которые ответственны за цитоплазматическую наследственность у дрожжей и млекопитающих (Shorter and Lindquist, 2005). Даже центромера эукариотических хромосом ведет себя как самореплицирующийся белковый комплекс, который находится на ДНК, но не детерминируется ею (Cleveland et al., 2003; см. Главу 14). Эти эпигенетические явления говорят нам, что не все клеточные структуры могут быть собраны de novo простым считыванием информации, содержащейся в генах. В более широком смысле репликация самой ДНК есть случай структурного наследования, но геном наверняка не является единственной структурой, которую делящиеся клетки вынуждены дуплицировать. Таким образом, «эпигенетическая» структурная наследственность, вместо того чтобы быть редким курьезом, может рассматриваться как один из наиболее фундаментальных механизмов жизни.

5. Макронуклеусы и микронуклеусы: модель активного и «молчащего» хроматина

5.2. Модификации хроматина коррелируют с состояниями активности

Ацетилирование

Типерацетилирование гистонов в макронуклеусе и отсутствие этой модификации в микронуклеусе дали новые данные, позволяющие связать эту посттрансляционную модификацию с активацией генов (Vavra et al., 1982). Ферменты, осуществляющие ацетилирование гистонов у любого организма, оставались неизвестными до середины 1990-х годов, когда С. Дэвид Аллис и его сотрудники очистили первую гистоновую ацетилтрансферазу (HAT) типа А (ядерную) (Brownell and Allis, 1995; Brownell et al., 1996) Эти исследователи начали с высокоочищенных макронуклеусов для того, чтобы отделить эту активность от активности цитоплазматической HAT типа В, и продолжили очистку с помощью тестирования в геле (in-gel assay). Для этого метода очищенные гистоны были заполимеризованы в полиакриламидную матрицу геля, используемого для разделения фракций очищенных белков. После электрофореза эти белки были ренатурированы и проинкубированы с ацетил-СоА, несущим радиоактивную метку, для того чтобы выявить полипептид с кажущейся молекулярной массой 55 kD. который мог бы включить эту метку в гистоновый матрикс.

^{Puc. 7.4. Ядерный диморфизм у инфузорий}

^{Микронуклеус (зародышевая линия), развивающийся макронуклеус и соматический макронуклеус содержат разные наборы гистонов и их модификаций. Перечислены те из них, о которых известно, что они специфически локализованы в ядрах каждого из этих типов или в развивающемся соматическом геноме}

Действительный прорыв произошел после микро-секвенирования этого очищенного белка и клонирования гена. Эта HAT, выделенная из Tetrahymena, оказалась гомологичной хорошо охарактеризованному регулятору транскрипции пекарских дрожжей — белку Gcn5. До этого открытия думали, что активаторы транскрипции в основном действуют, рекрутируя РНК-полимеразу к промоторам, но эта работа показала, что активаторы транскрипции могут также обладать ферментативной активностью, модифицируя хроматин или другие регуляторы транскрипции и меняя таким образом состояние матрицы. Дверь была открыта, и вскоре после этого было показано, что многие известные регуляторы действуют как HATs.

Метилирование

Ядерный диморфизм инфузорий еще раз доказал свои преимущества в выяснении роли метилирования гистонов. Эта модификация у растущих клеток Tetrahymena ограничена макронуклеусами (рис. 7.4). Активность метилтрансферазы лизина гистонов (HKMT), очищенная из этих ядер, специфически модифицировала гистон 3 по лизину 4 (H3K4те), установив тем самым одну из первых корреляций между этой специфической модификацией и транскрипционной активностью (Strahl et al., 1999).

Метилирование гистона H3 по лизину 9 у вегетативно размножающихся клеток отсутствует, но специфически происходит во время развития макронуклеусов на ограниченных зародышевой линией последовательностях, которые элиминируются из соматического генома (Tav-ema et al., 2002). Регулируемое развитием установление H3K9me2 (диметилирование) на этих специфических последовательностях дает нам полезную модель для выяснения нацеливания этой модификации на эквивалент гетерохроматина (в деталях описывается ниже)

Фосфорилирование

Очистка меченных Р³² гистонов из микро- и макронуклеусов показала, что H3, Н2А и линкерные гистоны сильно фосфорилированы (Allis and Gorovsky, 1981). Фосфорилированы множественные сайты макронуклеарного Н1, и эта модификация, как было показано, участвует в регулировании транскрипции специфических генов (Mizzen et al., 1999). С помощью мутационного анализа Доу и Горовски [Dou and Gorovsky] обнаружили, что эту потребность в фосфорилировании можно было имитировать добавлением в Н1 заряженых аминокислот (Dou et al., 1999). Однако эти заряженные остатки не обязательно должны находиться в соответствующих позициях фосфорилированной аминокислоты; для комплементарного эффекта требуется наличие кластера заряженных сайтов (Dou and Gorovsky, 2000,2002). Эти исследования показали, что само по себе фосфорилирование не требовалось, но что соответствующая транскрипция стимулировалась критической плотностью зарядов.

В гистоне H3 фосфорилирована единственная позиция. серии 10 (H3S10ph) (Wei et al., 1998). Эта модификация зависит от клеточного цикла и коррелирует с митозом у многих эукариот. У Tetrahymena в ходе митоза и мейоза она ограничена микронуклеусами. Замещение нормального гена гистона H3 мутантной формой, содержащей замену серина 10 аланином (S10A), вызывает дефекты в делении микронуклеуса, результатом чего оказывается отставание хромосом и анэуплоидия (Wei et al., 1999). Однако амитотическое деление макронуклеуса не затрагивается. Эти результаты демонстрируют, что фосфорилирование H3 играет важную роль в конденсации и (или) сегрегации хромосом. Уникальный ядерный диморфизм инфузорий опять позволил получить ключевые данные о роли модификаций хроматина.

6. В ходе развития макронуклеуса происходят общегеномные перестройки

Секвенирование соматических (макронуклеарных) геномов P. tetraurelia и Т. thermophila обнаружило очень большое число генов (-40 000 и -27 000, соответственно) несмотря на относительно небольшие размеры геномов (-72 Мб и -104 Мб, соответственно). Эта организация согласуется с геномом, оптимизированным для эффективной экспрессии генов (сравнение с другими эукариотными организмами см. на рис. 3.15). Это «упрощение» («streamlining») соматического генома достигается за счет массивных перестроек ДНК хромосом, происходящих из зародышевой линии, которые имеют место на специфических стадиях макронуклеарного развития (обзоры см.: Prescott, 1994: Coyne et al., 1996; Klobutcher and Herrick, 1997; Jahn and Klobutcher, 2002). Таким образом, ядерная дифференцировка генома зародышевой линии и генома соматического включает физическую реорганизацию хромосом в дополнение к установлению только что описанных различных состояний хроматина.

Обычно наблюдаются два типа перестроек, которые поистине уникальны для всех инфузорий, которые только были исследованы: внутренние делеции ДНК и фрагментация хромосом (рис. 7.5). Примеры этого у других эукариот могут быть представлены локализованной рекомбинацией локуса VDJ в лимфоцитах млекопитающих (глава 21). В зависимости от вида инфузории из каждого вновь формирующегося генома в результате этих событий элиминируются от 10 до 95 % генома зародышевой линии Элиминируются фактически все повторяющиеся последовательности, включая перемещаемые элементы, что частично объясняет наблюдаемую высокую плотность генов в макронуклеусах. Число сайтов перестроек также варьирует у разных видов, от примерно 6 000 у Tetrahymena до, вероятно, 100 000 у брюхоресничных инфузорий. Распределение по всему геному этих высоко регулируемых и воспроизводимых событий дает возможность исследовать, каким образом клетки идентифицируют конкретные сегменты ДНК и направляют свое действие на них. Изучение перестроек ДНК у инфузорий уже позволило вскрыть уникальные особенности эпигенетических механизмов, в частности относящихся к зависящим от гомологии процессам. Нижеследующее описание событий, связанных с перестройками ДНК, должно дать достаточную основу для последующего обсуждения связанной с этим эпигенетической регуляции.

^{Рис. 7.5. Перестройки ДНК у инфузорий}

^{В ходе развития нового макронуклеуса происходят широкомасштабные фрагментация хромосом и элиминация ДНК. (Вверху) Перестройки ДНК, происходящие у Paramecium, включают как точные делеции IESs, ограниченных нуклеотидами ТА (цветные прямоугольники, находящиеся в кодирующих (стрелка) и некодирующих районах), так и неточные делециии (оранжевые прямоугольники), дающие в результате либо делецию ДНК. либо фрагментацию (G4T3). (Внизу) У Tetrahymena неточная деления IESs (цветные прямоугольники) происходит примерно в 6000 локусов, а фрагментация хромосом детерминируется консервативной последовательностью длиной 15 пн — CBS (звездочка)}

7. Механизмы перестроек генома

Хотя геномные перестройки инфузорий исследуются более 30 лет, молекулярные механизмы, лежащие в основе этих событий, остаются в основном неизвестными (Yao et al., 2002). Частично задачей, стояшей перед исследователями, было объяснить разнообразие событий, которые наблюдаются у разных инфузорий. Для нескольких инфузорий были описаны эксцизионные интермедиаты, а также (побочные) продукты циркулярной эксцизии (Jaraczewski and Jahn, 1993; Klobutcher et al., 1993; Williams et al., 1993; Saveliev and Cox, 1995, 1996; Betermier et al., 2000; Gratias and Betermier, 2003). Эти данные не позволяют вывести единый механизм эксцизии даже для тех IESs разных инфузорий, которые имеют на своих концах сходные консенсусные последовательности (см. Klobutcher and Herrick, 1995; Gratias and Betermier, 2001; Betermier, 2004).

Несмотря на разнообразие механизмов эксцизии может все же иметь место значительное перекрывание в событиях, направляющих перестройки ДНК. Одной из общих черт является то, что транспозоноподобные и повторяющиеся последовательности элиминируются, по-видимому, преимущественно. Как описывается в этой книге, одна из ролей эпигенетических механизмов заключается в том, чтобы подавлять активность этих потенциально вредоносных ДНК-элементов. Разрешение для транспозона переместиться из «молчащей» зародышевой линии в высоко активный макронуклеус является потенциально гибельным для соматического генома. Многие и разнообразные данные указывают на механизмы, связанные с RNAi и формированием гетерохроматина, как на участников этих процессов перестроек ДНК (Mochizuki and Gorovsky, 2004; Yao and Chao, 2005).

У большинства эукариот гистон H3, метилированный по лизину 9 (H3K9me), в значительной степени ассоциирован с репрессированной ДНК, вычленяемой в ядре как гетерохроматин (см. раздел 7 главы 3). У Tetrahymena эта модификация не обнаруживается в транскрипционно «молчащем» микронуклеусе, как можно было бы предположить, но обнаруживается исключительно в развивающихся макронуклеусах непосредственно перед перестройками ДНК или одновременно с ними (Taverna et al., 2002). Эксперименты по иммунопреципитации хроматина показали, что этой модификацией обогащены гистоны, связанные с IESs. Элиминация ДНК и формирование гетерохроматина были первоначально сцеплены друг с другом в результате идентификации хромодоменсодержащего белка (Pddl — Programmed DNA Degradation 1 protein) — обильно представленного, экспрессируемого в ходе развития белка, колокализующегося в фокусах, содержащих ДНК, ограниченную зародышевой линией и подлежащую элиминации (т.е. IESs) из соматического генома (Madireddi et al., 1994, 1996). Хромодомены — это белковые мотивы, обладающие сродством, способностью связываться с некоторыми остатками метилированных гистонов. Возможно, что архетипическая модель участия хромодоменного белка в регуляции хроматина — это связывание гетерохроматинового белка 1 (НР1 — содержащий хромодомен) с метилированным H3K9 у Drosophila, играющее роль в формировании гетерохроматиновых доменов (детали см в главе 5). Хромодомены Pddl и Pdd3, два белка, требующихся для перестроек ДНК (Coyne et al., 1999; Nikiforov et al., 2002), связываются с пептидами

H3K9me2 (Taverna et al., 2002). Для того чтобы продемонстрировать, что эта модификация хроматина требуется для перестройки ДНК, Лиу, Мочицуки и Горовски [Liu, Mochizuki and Gorovsky] использовали методику гомологичного замещения гена, чтобы заменить гены основного гистона H3 копиями, содержащими мутацию, поменявшую лизин 9 (K9Q) (Liu et al., 2004). Эти клетки не могли эффективно удалять IESs в ходе развития несмотря на тот факт, что Pddl локализовалась соответственно в предшественниках макронуклеусов, показывая тем самым, что H3K9me2 требуется для элиминации ДНК. Из-за того, что установление состояний хроматина является ключевым детерминантом эпигенетической регуляции, важный вопрос заключается в следующем: каким образом метка H3K9me2 специфически нацеливается на сегменты ДНК, обреченные на элиминацию? Как описывается ниже, несколько экспериментов продемонстрировали, что в направлении перестроек ДНК участвуют гомологичные РНК.

8. Зависящий от гомологии сайленсинг генов у инфузорий

9. Перестройки генома направляются зависящими от гомологии механизмами

9.1. Экспериментальная индукция специфических делеций в развивающемся макронуклеусе

Еще до того как посттранскрипционный сайленсинг генов был описан у Paramecium, было обнаружено, что введение клонированных последовательностей в большом числе копий в вегетативный макронуклеус изменяет ДНК-перестройки в половом потомстве трансформированных клонов. Удивительно, что последовательности, гомологичные трансгену, специфическим образом делегировались по неточному механизму, в то время как микронулеарный геном оставался интактным (рис. 7.6) (Meyer, 1992). Это явление, по-видимому, было весьма общим, поскольку все испытанные фрагменты ДНК могли производить делеции (Meyer et al., 1997). Эти эксперименты показывали, что в ходе половых событий сиквенс-специфичная информация передается через цитоплазму из трансформированного материнского макронуклеуса в развивающийся зиготический макронуклеус. Эта всеобщность данного эффекта говорила не в пользу тех трактовок, в которых роль отводилась сиквенс-специфичным ДНК-связывающим белкам, продуцируемым или титруемым инъецированными трансгенами. Наиболее экономное объяснение, согласующееся с наблюдаемой специфичностью, предполагает, что нуклеиновые кислоты, предположительно молекулы РНК, переносятся между ядрами и распознают свои мишени на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании.

^{Рис. 7.6. Индуцированные трансгеном делеции у Paramecium}

^{(а) У дикого типа ген А (красные стрелки) расположен вблизи гетерогенных концов макронуклеарной хромосомы; розовые прямоугольники = макронуклеарные теломеры. Паттерн перестроек макронуклеарной хромосомы надежно репродуцируется в ряду поколений, (б) Введение большого числа копий трансгенов А в материнский макронуклеус может индуцировать полную делецию эндогенного гена А в половом потомстве, когда новый макронуклеус развивается из производного зародышевой линии дикого типа. Новые макронуклеарные теломеры располагаются непосредственно «вверх по течению» от гена А}

Конструкты, которые эффективно индуцируют постзиготические делеции, являются неэкспрессибельными трансгенами, такими как трансгены, содержащие мутации типа сдвига рамки считывания или усечения 5’ или 3’ UTRs (Gamier et al., 2004). Те из них, которые могут продуцировать стабильные, способные транслироваться иРНК, не стимулируют элиминацию гомологичных генов из развивающихся макронуклеусов. Те же конструкты, которые стимулируют делецию ДНК, вызывают также сайленсинг эндогенных материнских генов в ходе вегетативного роста трансформированных клонов. Таким образом, постзиготические делеции коррелируют с презиготическим сайленсингом и с накоплением ~ 2 3 - нукл еотид н ых siRNAs. Эти siRNAs, как было показано далее, сохраняются в клетках на протяжении всего развития, что заставляет предполагать, что они могут отвечать за включение этих делеций.

Если ассоциированные с сайленсингом siRNAs направляют ДНК-перестройки, тогда введение dsRNA до начала или во время развития должно стимулировать элиминацию гомологичной последовательности в потомстве. Чтобы это проверить, клеткам Paramecium, которым скармливались E.coli штамма, продуцирующего dsRNA, гомологичную кодирующей последовательности ND7 — гену, участвующему в регулируемом экзоцитозе секреторных пузырьков, называемых трихоцистами, — дали возможность пройти автогамию и развить новые макронуклеусы из микронуклеусов дикого типа. Некоторое число поставтогамных потомков продемонстрировали мутантный фенотип ND7благодаря элиминации этого гена из их макронуклеусов (Gamier et al., 2004). Даже потомство фенотипически дикого типа показало частичную элиминацию копий гена ND7. Как и~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с трансген-индуцированным сайленсингом, ~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с кормлением dsRNA, сохранялись, как было показано, в этих клетках на протяжении всей аутогамии (Nowacki et al., 2005), подтверждая их участие в «нацеливании» постзиготических делеций. Явление индуцированной ДНК делеции, направляемой dsRNA, не ограничивается Paramecium. Микроинъекция конъюгирующим Tetrahymena смысловой и антисмысловой РНК, транскрибированной in vitro и гомологичной геномным локусам, в норме сохраняющимся в макронуклеусе, приводит к неточной делеции этих последовательностей (Yao et al., 2003).

10. Паттерны перестроек определяются, вероятно, путем сравнения геномов зародышевой линии и соматического

10.1. Парадигма d48: эпигенетическое наследование альтернативных перестроек

Хотя перестройки, индуцируемые трансгенами и dsRNA, иллюстрируют эпигенетическую природу процесса элиминации ДНК, возможно еще более удивительными являются наблюдения, что паттерны индуцированных перестроек могут наследоваться в последовательных раундах макронуклеарного развития. Первое доказательство эпигенетической регуляции перестроек было обнаружено, когда аберрантная делеция из макронуклеуса гена, кодирующего у P.tetraurelia поверхностный антиген А, оказалась цитоплазматически наследующейся в скрещиваниях с диким типом (рис. 7.7) (Epstein and Fomey, 1984). В макронуклеусах дикого типа ген А локализован вблизи конца хромосомы на расстоянии 8,13 либо 26 тн от теломеры, что диктуется тремя альтернативными сайтами фрагментации. Было обнаружено, что вариантная клеточная линия, называемая d48, не экспрессирует ген А, потому что сам этот ген был утерян вместе со всеми последовательностями «вниз по течению», когда формировалась его теломера на 5’-конце этого гена (Fomey and Blackburn, 1988). Эксперименты по трансплантации ядер подтвердили, что микронуклеус зародышевой линии d48 несёт ген А дикого типа. Например, замена микронуклеуса d48 микронуклеусом штамма дикого типа не предотвращает материнской передачи делеции гена А половому потомству; и наоборот, микронуклеус d48, будучи трансплантирован в клетку дикого типа, давал начало после автогамии новому макронуклеусу, который содержал ген A (Harumoto, 1986; Kobayashi and Koizumi, 1990). Сходные эксперименты, сфокусированные на поддержании или делеции еще одного проксимального по отношению к теломере гена поверхностного антигена, гена В, показали, что такие материнские эффекты могут наблюдаться и в других районах генома (Scott et al., 1994). В совокупности эти исследования заставляют предполагать, что некий геномный район должен присутствовать в материнском макронуклеусе для того, чтобы эффективно сохраняться и амплифицироваться в развивающемся макронуклеусе до числа копий, характерного для дикого типа.

^{Рис. 7.7. Эпигенетическое наследование и экспериментальное «спасение» делеций макронуклеарного гена А}

^{(а) Штамм дикого типа. (б) У штамма d48 нет гена А в его макронуклеусе, но его микронуклеус — дикого типа. Ген А воспроизводимо делетируется в ходе развития макронуклеуса в каждом поколении, (в) Трансформация макронуклеуса штамма d48 последовательностями гена А специфически восстанавливает амплификацию гена А зародышевой линии в развивающемся макронуклеусе полового потомства}

10.5. Экспериментальное подавление элиминации IES в развивающемся макронуклеусе

Зависящее от гомологии подавление IES у Paramecium

Если делеция или сохранение клеточных генов контролируются путем сравнения содержания соматического генома и генома зародышевой линии, тогда даже эффективная в норме эксцизия IESs могла бы, возможно, нарушаться, когда копии присутствуют в материнском макронуклеусе. Изучение менделевской мутации, mtF^E, обладающей плейотропными влияниями на развитие макронуклеуса, в том числе влиянием на детерминацию типа спаривания (Brygoo and Keller, 1981a,b), дало возможность проверить это предсказание. Оказалось, что эта мутация, будучи в гомозиготном состоянии, отменяет вырезание IES-последовательности, локализованной в гене поверхностного антигена G. Удивительно, но когда аллель дикого типа гена mtF была реинтродуцирована в мутантный штамм в результате конъюгации, эта IES все еще не вырезалась в ходе последующего развития макронуклеуса (Meyer and Keller, 1996). Генетический анализ получившегося в результате вариантного штамма, названного штамм IES⁴, подтвердил, что генетически он является диким типом и что специфическое сохранение этой IES наследуется по материнской линии в половом потомстве (Duharcourt et al., 1995).

Является ли эксцизия IES в развивающихся макронуклеусах индуцированной материнскими копиями корректно перестроенного гена G или же ингибированной материнскими копиями сохраняющего IES гена G?

Чтобы ответить на этот вопрос, макронуклеусы клеток 1ES⁺ или IES были трансформированы с помощью прямой микроинъекции плазмид, содержащих фрагмент кодирующей последовательности G в ее микронуклеарной (IES⁺) или макронуклеарной (IES ) версиях (рис. 7.8) (Duharcourt et al., 1995). После автогамии трансформированные клоны, содержавшие плазмиду IES", дали линии потомков, которые сохранили IES в своих вновь сформировавшихся макронуклеусах, тогда как клетки IES⁺, трансформированные плазмидой IES", оказались неспособными индуцировать эксцизию, и их потомство оставалось в состоянии IES⁺. Плазмида, содержавшая только IES, без каких-либо фланкирующих последовательностей, также вызывала сохранение IES, показывая тем самым, что одни только материнские копии IES подавляют эксцизию из материнских макронуклеусов (Duharcourt et al., 1995).

«Матерински контролируемые» versus «не матерински контролируемые» IESs у Paramecium

Может ли вырезание других IESs контролироваться подобными материнскими влияниями? Для ответа на этот вопрос макронуклеусы клеток дикого типа трансформировали большими сегментами микронуклеарной ДНК (IES⁺), содержащими гены поверхностных антигенов либо G, либо A (Duharcourt et al., 1998). Эти инъецированные сегменты содержали, соответственно, шесть и девять IESs. Изучали эксцизию 13 из этих IESs, и оказалось, что пять IESs сохранялись в макронуклеусах поставтогамных потомков этих трансформированных клеток. Инъекция плазмид, содержащих одиночные IESs, показала, что подавление было строго специфичным: каждая из этих пять IESs индуцировала сохранение только гомологичной зиготической IES, но не влияла на какие-либо другие. Контрольный фрагмент ДНК, содержавший большую часть макронуклеарного (IES) гена (7, не оказывал никакого влияния на любую из тестируемых IESs. Среди 13 испытанных IESs Paramecium не было сколько-нибудь очевидных различий в величине, составе оснований или в положении внутри генов между этими пятью, которые продемонстрировали материнский эффект, и восьмью, которые его не обнаружили (Duharcourt et al., 1998).

Зависящее от гомологии подавление элиминации IES у Tetrahymena

Эксперименты, аналогичные проведенным на Paramecium, показали, что содержание ДНК родительского макронуклеуса Tetrahymena может регулировать элиминацию гомологичных последовательностей из развивающегося соматического генома Две хорошо охарактеризованные IESs, делеционные элементы М и R, были введены путем микроинъекций в макронуклеусы штаммов дикого типа таким образом, что они поддерживались на высококопийных векторах. Когда у этих клеток была индуцирована конъюгация, потомство клеток, содержащих материнские копии элемента М, оказалось неспособным эффективно элиминировать соответствующие IESs во время развития макронуклеуса (Chalker and

Yao, 1996). Подобным же образом клетки, родительские макронуклеусы которых содержали копии элемента R, оказались неспособными вырезать гомологичную IES. Существенное подавление эксцизии негомологичных элементов не наблюдали. Таким образом, подавление элиминации ДНК было специфичным в отношении последовательности. Последовательности, гомологичные самой IES, были достаточны для этого подавления, а непосредственно фланкирующие ДНК таким эффектом не обладали. Важно отметить, что эта индуцированная неспособность к элиминации ДНК была наследуемой, поскольку последующие поколения также сохраняли геномные копии этой IES в своих макронуклеусах.

Поскольку у Tetrahymena в конъюгирующих парах во время развития происходит интенсивный обмен цитоплазмой, исследователи имели возможность наблюдать, что это подавление передавалось через цитоплазму таким образом, что лишь один из партнеров должен был нести эту IES в своем родительском соматическом геноме для того, чтобы были затронуты гомологичные последовательности во всех развивающихся ядрах в паре, включая ядра в партнере дикого типа. Следовательно, состояние перестройки ДНК, характерное для родительских ядер, передается через цитоплазму и регулирует события, происходящие во время формирования нового соматического генома следующего поколения. Никакого обмена ядрами зародышевой линии не требуется для передачи состояния одного партнера по спариванию другому; это наблюдение исключает возможность того, что передача происходит путем наложения импринта на зародышевую линию в ходе нормального клеточного роста до вступления в развитие (Chalker et al., 2005). Действительно, путем физического разделения конъюгирующих пар, состоящих из клетки дикого типа и ее партнера, содержавшего копии элемента М в своем материнском соматическом ядре, было показано, что передача происходит после мейоза и очень близко к тому моменту, когда развивающиеся ядра впервые начинают дифференцироваться в новые макронуклеусы и микронуклеусы. Следовательно, влияние материнского соматического генома активно устанавливается в ходе развития.

Биологические следствия материнского контроля

Способность инфузорий изменять перестройки ДНК таким образом, чтобы отражать материнский паттерн, дает клеткам простой способ передавать альтернативные соматические версии генома половому потомству. Эта динамическая регуляция означает, что стабильное равновесие между двумя альтернативными генетическими состояниями, например IES⁺(100 % эксцизии) и IES(0 % эксцизии) может достигаться и поддерживаться на протяжении многих половых поколений. Это было показано по крайней мере для одной IES Paramecium, для которой такое материнское влияние достаточно для того, чтобы превратить меньшую долю макронуклеарных копий IES⁺ в большую фракцию в макронуклеусе следующего поколения (Duharcourt et al., 1995). Такое влияние параллельно стабильному, материнскому наследованию типов спаривания О и Еу P.tetraurelia. Сопоставимая асимметрия обнаруживается в обеих системах, потому что и эксцизия IES, и детерминация О-типа, по-видимому, являются путями развития «по умолчанию», тогда как и сохранение IES, и детерминация Е-типа нуждаются в некоем цитоплазматическом сигнале из материнского макронуклеуса для изменения этих своих путей развития. Эти системы вполне могут быть родственными, потому что менделевская мутация mtF^E, нарушающая эксцизию одной IES гена G независимо от родительского состояния, сходным образом делает детерминацию к Е конститутивной — наблюдение, связывающее альтернативные состояния обоих примеров. Выяснение механизма (механизмов), лежащего в основе этих явлений, несомненно вскроет новые способы материнского наследования эпигенетической информации.

^{Рис. 7.8. Зависимое от гомологии подавление эксцизии IES материнским макронуклеусом}

^{В ходе нормального развития IESs (красные и зеленые прямоугольники) эффективно вырезаются. Однако трансформация материнского макронуклеуса данной IES (исходные трансформанты = поколение t) может подавить элиминацию гомологичной IES во время последующих (поколение t + 1) (b будущих) раундов дифференцировки нового макронуклеуса}

11. Trans-нуклеарное сравнение целых геномов, опосредованное РНК-интерференцией

11.2. Транспорт РНК из материнского в зиготические макронуклеусы у Paramecium

Для сравнения последовательностей зародышевой линии и соматических в масштабах всего генома был бы необходим весьма сложный механизм, как для обеспечения массивного транспорта молекул РНК между ядрами, так и для осуществления очень большого числа взаимодействий по механизму спаривания, которые предполагаются в модели сканирования. Участником этих транс -нуклеарных «переговоров» у Paramecium оказался новый белок, Nowal, связывающийся с нуклеиновой кислотой (Nowacki et al., 2005). Nowal синтезируется незадолго до мейоза и сначала аккумулируется в материнском макронуклеусе, а затем, подобно Twil Tetrahymena, релокализуется в развивающийся зиготический макронуклеус. Мечение Nowal фотоактивируемым GFP позволило исследователям убедительно продемонстрировать, что этот белок транспортируется из ядер одного типа в ядра другого. Один домен этого белка может связывать РНК, а второй домен необходим и достаточен для межъядерного транспорта; таким образом, Nowal может быть транспортером РНК.

Nowal является существенным для развития жизнеспособного нового макронуклеуса, в том числе для элиминации транспозонов зародышевой линии и подгруппы IESs. Удивительно, но только те IESs, которые подвержены материнскому контролю, затрагиваются нокдауном Nowal; это позволяет предполагать, что этот белок участвует в trans-нуклеарном сопоставлении. Те IESs, которые нечувствительны к присутствию гомологичных последовательностей в материнском макронуклеусе, не зависят в своей эксцизии от Nowal, что подтверждает существование механистически различных классов IESs у Paramecium. Хотя нуклеиновые кислоты, связываемые Nowal in vivo, пока еще не известны, эффекты удаления Nowal согласуются с предлагаемой моделью сканирования (рис. 7.9) и позволяют предполагать, что этот белок может нести РНК, отобранные для «нацеливания» элиминации находящихся под материнским контролем IESs и транспозонов в развивающемся макронуклеусе.

^{Рис. 7.9. Модель сканирования РНК, объясняющая контроль делеции ДНК}

^{Двунаправленная транскрипция большой части генома зародышевой линии происходит на ранних этапах развития и приводит к продукции scnRNAs. Эти РНК затем транспортируются в материнский макронуклеус, где любая встреча с гомологичной последовательностью включает их удаление из активного пула. Остающиеся, микронуклеус-специфичные РНК перенаправляются в развивающийся макронуклеус, где они «нацеливают» НЗК9-метилирование на гомологичные последовательности, создавая сигнал об их удалении из генома. Модель адаптирована из: Mochizuki et al. (2002)}

12. Заключение: элиминация ДНК как механизм защиты генома

Исследования RNAi, в особенности у растений и нематод, привели к гипотезе, что этот путь развился как защитный механизм, позволяющий клеткам контролировать пролиферацию вирусов и транспозонов путем разрушения mRNAs и «нацеливания» формирования гетерохроматина на этих геномных паразитах (Matzke and Birchler, 2005). Как уже упоминалось, перемещающиеся элементы, присутствующие в геноме зародышевой линии инфузорий, элиминируются в ходе развития соматического макронуклеуса, что эффективно сводит на нет их влияние. Сделанное на Tetrahymena наблюдение, что метилирование H3K9 маркирует геномные районы для делеции ДНК в ходе развития, заставляет предполагать, что использование RNAi у инфузорий в основе своей сходно с его ролью в формировании гетерохроматина у других эукариот: инфузории лишь продвинулись на шаг дальше и элиминируют гетерохроматин из своего соматического генома. Тем не менее, одним оригинальным вкладом, полученным в исследованиях на инфузориях, является идея о том, что специфические последовательности, «предназначаемые» RNAi для формирования (элиминации) гетерохроматина в ходе раннего развития, селектируются с помощью глобального сопоставления материнских соматического генома и генома зародышевой линии, начинающегося во время мейоза. Этот механизм эффективно защищал бы от вредоносных влияний транспозиции в зародышевой линии: любой новый транспозон, интегрирующийся в материнскую зародышевую линию, распознавался бы как чужеродный путем сравнения с соматическим геномом в ходе полового воспроизведения, что вело бы к его удалению из транскрибированного соматического генома потомков, ограничивая тем самым его будущее распространение.

У Tetrahymena scnRNAs, которые «нацеливают» элиминацию ДНК, весьма вероятно опосредуют trans-нуклеарные «переговоры» между геномом зародышевого пути и соматическим геномом. Неясно, весь ли микронуклеарный геном производит scnRNAs, но неопубликованные данные, полученные на Paramecium, позволяют предполагать, что по крайней мере большая его часть делает это. Анализы с помощью Норзерн-блоттинга выявили мейоз-специфичные, эндогенные короткие РНК, соответствующие клеточным генам, а также транспозонам и IESs (M.Nowacki et al., неопубликовано). Эти короткие РНК имеют длину ~25 нуклеотидов и четко отличаются от ~23-нуклеотидных siRNAs. По-видимому, они функционально эквивалентны scnRNAs Tetrahymena, потому что инактивация специфических Dicer- подобных генов у Paramecium супрессирует их образование во время мейоза и устраняет элиминацию транспозонов и находящихся под материнским контролем IESs, а также материнское наследование делеций макронуклеарных генов (V.Serrano et al., неопубликовано).

Оригинальная модель сканирования генома предполагала, что scnRNAs сравниваются с перестроенной ДНК в материнском макронуклеусе, инактивируя те из последовательностей, которые соответствуют макро-нуклеарным последовательностям, и отбирая для пула, специфичного для микронуклеуса (рис. 7.10а). Однако несколько линий доказательств заставляют предполагать. что scnRNAs могут сравниваться с происходящими из макронуклеуса транскриптами, а не с самой ДНК. Это освобождало бы от необходимости открывать ДНК-дуплекс по всему геному, чтобы провести испытание на комплементарность. Те из введенных в материнский макронуклеус Tetrahymena IESs, которые интерферируют с делецией ДНК, транскрибируются, допуская такую возможность (Chalker and Yao, 2001; Chalker et al., 2005). Транскрипты, возникающие с какой-то IES в материнском макронуклеусе, защищали бы зиготическую IES от элиминации, как изначально постулировалось для объяснения IES-подавления у Paramecium, путем титрования гомологичных scnRNAs. Данные в пользу цитоплазматического фактора, который может «спасать» делецию гена А в штамме d48, также говорят в пользу существования протективных транскриптов и позволяют также предполагать что в цитоплазме, как и в материнском макронуклеусе, мог бы происходить отбор scnRNAs Наконец, это объясняло бы, каким образом посттранскрипционный сайленсинг данного гена у Paramecium может вызывать его делецию в следующем поколении: если транскрипты из материнского макронуклеуса разрушаются, 23-нуклеотидные siRNAs, гомологичные scnRNAs, смогут свободно «нацеливать» делеции в новом макронуклеусе, несмотря на присутствие этого гена в материнском макронуклеусе.

Один интересный аспект этой модифицированной гипотезы, которую можно назвать моделью сканирования транскриптома, заключается в том, что все взаимодействия типа образования пар могут происходить между молекулами РНК. Если scnRNAs в конечном счете «нацеливают» формирование гетерохроматина путем взаимодействия с вновь возникающими транскриптами в гомологичном локусе, как это предполагается у S. pombe и растений, эти более поздние взаимодействия по типу образования пар не обязательно должны фундаментально отличаться от взаимодействий, происходящих на этапе селекции. scnRNAs могут просто спариваться с любой доступной РНК после того как они покинут мейотический микронуклеус. Спаривание с многочисленными макронуклеарными транскриптами, присутствующими в клетке на ранних этапах развития, эффективно удаляло бы гомологичные scnRNAs из пула путем их секвестрации или разрушения. К тому времени, когда зиготический макронуклеус формируется и начинает транскрипцию своего неперестроенного генома, для спаривания с образующимися транскриптами оставались бы лишь специфические для микронуклеуса scnRNAs. Эти взаимодействия по типу спаривания могут вести к делеции ДНК, потому что они происходят в развивающемся макронуклеусе или потому, что они происходят на правильной стадии развития.

В этой модели распознавание «своего» (макронуклеарных последовательностей) и «не своего» (геномных паразитов в зародышевой линии) достигается простым онтогенетическим переключением, изменяющим исход простых взаимодействий по типу спаривания. Концептуально это похоже на процесс, посредством которого иммунная система позвоночных научается различать «свое» и «не свое». Изначально генерируется огромный репертуар лимфоцитов, экспрессирующих различные антитела, но на ранних этапах развития все те из них, которые узнают имеющиеся антигены (наиболее вероятно, «свои» антигены), элиминируются из будущего пула. Коль скоро эта стадия пройдена, узнавание сходного антигена (который на этот раз, скорее всего, является чужеродным) ведет к клональному росту соответствующих лимфоцитов. Геномная иммунная система инфузорий, использующая RNAi, обнаруживает, таким образом, поразительный параллелизм с клеточной иммунной системой позвоночных животных.

^{Рис. 7.10. Модель сканирования транскриптома для сравнения соматического генома и генома зародышевой линии}

^{(а) Регулирование «по умолчанию». (1) После начала мейоза большинство или даже все макронуклеарные и микронуклеарные геномы транскрибируются: штриховые линии в макронуклеусе представляют неохарактеризованные транскрипты. В микронуклеусе транскрипция является двунаправленной и приводит к образованию scnRNAs (коротких двунитевых молекул) для последовательностей всех типов (клеточных генов, светлорозовые стрелки: транспозонов, оранжевая двойная стрелка; IES, зеленые прямоугольники). Эти scnRNAs экспортируются в материнский макронуклеус, где они могут спариваться с гомологичными соматическими транскриптами. Спаривание может происходить и в цитоплазме. scnRNAs, спаривающиеся с гомологичными транскриптами, секвестрируются или разрушаются, тогда как scnRNAs, специфичные для микронуклеуса, реэкспортируются в развивающийся зиготический макронуклеус, где они спариваются с гомологичными последовательностями (ДНК или только что образовавшимися транскриптами), «нацеливая» таким образом метилирование по НЗК9 на специфичные для микронуклеуса последовательности (транспозоны и IESs). (4) Маркированные последовательности элиминируются, (б) Эффекты постгранскрипционного сайленсинга гена в материнском макронуклеусе. Экспериментальная индукция постгранскрипционного сайленсинга многокопийными трансгенами или dsRNA приводит к образованию двунитевых siRNAs, гомологичных этому гену (показано красным цветом). Эти siRNAs разрушают гомологичные материнские соматические транскрипты, так что гомологичные scnRNAs не будут инактивированы и смогут «нацеливать» делецию данного гена в развивающемся зиготическом макронуклеусе}

13. Будущий вклад исследований на инфузориях в эпигенетику

Недавнее секвенирование макронуклеарных геномов Tetrahymena и Paramecium сделает эти простые клеточные модели еще более полезными для исследований эпигенетических механизмов. Биология ядерного диморфизма облегчила открытие регуляторов хроматина и останется по-прежнему перспективной системой для новых открытий. Обладая двумя разными путями RNAi — одной, используемой для постгранскрипционного сайленсинга генов, и другой, используемой для эпигенетической модификации генома, — инфузории также уникально сбалансированы для раскрытия сложности направляемых РНК, зависящих от гомологии регуляторных процессов, участвующих в развитии. Рибонуклеазы, родственные Dicer, Argonaute-подобные белки и их партнеры уже идентифицированы или будут идентифицированы, а исследования, ведущиеся в настоящее время, обещают расшифровать их функциональную специализацию. Учитывая филогенетическое положение инфузорий на древе жизни, такая информация без сомнения прольет свет на эволюцию этих механизмов у эукариот.

Именно исследование множественных эпигенетических явлений привело к признанию широкого распространения и использования РНК-опосредованной регуляции у эукариот. Тем не менее, даже до того, как это поняли, наблюдение, что ДНК-содержимое одного ядра оказывает влияние на гомологичные последовательности в другом ядре, заставило исследователей инфузорий постулировать существование Ггая$-активных молекул РНК, направляющих зависимые от гомологии «переговоры». Открытие RNAi и ее роли в перестройках ДНК подтвердило эту спекуляцию. Какие же будущие сведения, имеющие общее значение, могли бы быть получены в результате раскрытия механизмов, опосредующих trans-ядерные «переговоры»?

Если гипотеза «транскрипционного сканирования» (рис. 7.10) верна, материнские соматические транскрипты защищают зиготические ДНК-последовательности от элиминации. Если приравнять элиминацию ДНК формированию гетерохроматина, тогда материнские транскрипты усливали бы, путем блокирования элиминации, эухроматин-специфичные модификации на гомологичных последовательностях. Предполагаемая позитивная роль этих транскриптов на гомологичных генах является, таким образом, непрямой, возникая из их способности инактивировать гомологичные scnRNAs, которые в противном случае «нацеливали» бы формирование гетерохроматина. Тем не менее, этот эффект материнских транскриптов, которые, как заставляют предполагать некоторые эксперименты, не обязательно являются кодирующими белки mRNAs, представлял бы новый механизм, при том, что все известные РНК-опосредованные, зависящие от гомологии механизмы ведут к даун-регуляции гена-«мишени». Деградация или секвестрирование коротких РНК длинными транскриптами является, по существу, оборотной стороной продемонстрированных механизмов, базирующихся на RNAi, где короткие РНК инактивируют длинные.

Если длинные и короткие РНК могут выступать как антагонисты действия друг друга, их взаимодействие должно направлять систему в сторону одного из двух альтернативных состояний, в зависимости от их относительного количества. Это позволяет предполагать, что наследование экспрессионного статуса генов могло бы зависеть от постоянной обратной связи из пула РНК, а не исключительно от механизмов полуконсервативной репликации хроматина. Соблазнительно думать, что такой опосредованный РНК, trans-активный механизм ответствен за стабильность экспрессии генов поверхностных антигенов в ходе вегетативного роста у Paramecium, потому что это объясняло бы также, каким образом, после полового воспроизведения, развивающийся макронуклеус может наследовать материнский серотип через цитоплазму. Таким образом, эпигенетическое наследование паттернов геномных перестроек может быть лишь частным аспектом всеобъемлющей системы наследования у инфузорий, базирующейся на РНК.

По мере того, как будущие исследования на инфузориях будут высвечивать опосредующих такую регуляцию игроков (РНК и белки), должно будет выявляться ее существование у других организмов и ее дальнейшая связь с известными эпигенетическими механизмами. Вполне вероятно, что базирующаяся на РНК наследственность, в ее базовой форме, широко распространена. Недавние исследования транскриптомного выхода у многоклеточных организмов обнаружили неожиданное обилие и сложность некодирующих транскриптов (Mattick, 2004; Meyers et al., 2004; Suzuki and Hayashizaki, 2004; Cheng et al., 2005; Claverie, 2005), а также частую встречаемость коротких РНК, совпадающих по последовательности с геномными районами всех типов (Lu et al., 2005). Многие зависимые от гомологии эффекты, в том числе мейотический сайленсинг у грибов и парамутация у растений (главы 6 и 9), остаются не до конца понятыми. Только комплексная картина, которая будет получена в будущих экспериментах на всех эукариотах, включая инфузорий, даст нам полное представление об эпигенетических процессах.

Литература

Allis C.D. and Gorovsky M.A. 1981. Histone phosphorylation in macro- and micronuclei of Tetrahymena thermophila. Biochemistry 20: 3828-3833.

Allis C.D., Glover C.V., Bowen J.K., and Gorovsky M.A. 1980. Histone variants specific to the transcriptionally active, amitotically dividing macronucleus of the unicellular eucaryote, Tetrahymena thermophila. Cell 20: 609-617.

Beisson J. and Sonnebom T.M. 1965. Cytoplasmic inheritance of the organization of the cell cortex in Paramecium aurelia. Proc. Natl. Acad. Sci. 53: 275-282.

Beisson J. and Wright M. 2003. Basal body/centriole assembly and continuity. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 96-104.

Betermier M. 2004. Large-scale genome remodelling by the devel-opmentally programmed elimination of germ line sequences in the ciliate Paramecium. Res. Microbiol. 155: 399-408.

Betermier M., Duharcourt S., Seitz H., and Meyer E. 2000. Timing of developmentally programmed excision and circularization of Paramecium internal eliminated sequences. Mol. Cell. Biol. 20: 1553-1561.

Brownell J.E. and Allis C.D. 1995. An activity gel assay detects a single, catalytically active histone acetyltransferase subunit in Tetrahymena macronuclei. Proc. Natl. Acad. Sci.A 92: 6364-6368.

Brownell J.E., Zhou J., Ranalli T, Kobayashi R., Edmondson D.G., Roth S.Y., and Allis C.D. 1996. Tetrahymena histone acetyltransferase: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851.

Brygoo Y. and Keller A.-M. 1981a. A mutation with pleitropic effects on macronuclearly differentiated functions in Paramecium tetraurelia. Dev. Genet. 2: 23-34.

Brygoo Y. and Keller A.-M. 1981b. Genetic analysis of mating type differentiation in Paramecium tetraurelia. III. A mutation restricted to mating type E and affecting the determination of mating type. Dev. Genet. 2: 13-22.

Cassidy-Hanley D., Bisharyan Y., Fridman V., Gerber J., Lin C, Orias E., Orias J.D., Ryder H., Vong L., and Hamilton E.R 2005. Genome-wide characterization of Tetrahymena thermophila chromosome breakage sites. II. Physical and genetic mapping. Genetics 170: 1623-1631

Chalker D.L. and Yao M.C. 1996. Non-Mendelian, heritable blocks to DNA rearrangement are induced by loading the somatic nucleus of Tetrahymena thermophila with germ line-limited DNA. Mol. Cell. Biol. 16: 3658-3667.

Chalker D.L. and Yao M.C. 2001. Nongenic, bidirectional transcription precedes and may promote developmental DNA deletion in Tetrahymena thermophila. Genes Dev. 15: 1287-1298.

Chalker D.L., Fuller P., and Yao M.C. 2005. Communication between parental and developing genomes during Tetrahymena nuclear differentiation is likely mediated by homologous RNAs. Genetics 169: 149-160.

Cheng J., Kapranov P., Drenkow J., Dike S., Brubaker S., Patel S., Long J., Stem D., Tammana H., Helt G., et al. 2005. Transcriptional maps of 10 human chromosomes at 5-nucleotide resolution. Science 308: 1149-1154.

Claverie J.M. 2005. Fewer genes, more noncoding RNA. Science 309: 1529-1530.

Cleveland D.W., Mao, Y., and Sullivan K.F. 2003. Centromeres and kinetochores: From epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Cell 112: 407-421.

Coyne R.S., Chalker D.L., and Yao M.C. 1996. Genome downsizing during ciliate development: Nuclear division of labor through chromosome restructuring. Annu. Rev. Genet. 30: 557—578.

Coyne R.S., Nikiforov M.A., Smothers J.F., Allis C.D., and Yao M.C. 1999. Parental expression of the chromodomain protein Pddlp is required for completion of programmed DNA elimination and nuclear differentiation. Mol. Cell 4: 865-872.

Davis M.C, Whrd J.G., Herrick G., and Allis C.D. 1992. Programmed nuclear death: Apoptotic-like degradation of specific nuclei in conjugating Tetrahymena. Dev. Biol. 154: 419-432.

Dou Y. and Gorovsky M.A. 2000. Phosphorylation of linker histone HI regulates gene expression in vivo by creating a charge patch Mol. Cell 6: 225-231.

Dou Y. and Gorovsky M.A. 2002. Regulation of transcription by H1 phosphorylation in Tetrahymena is position independent and requires clustered sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 6142-6146.

Dou Y.. Mizzen C.A., Abrams M., Allis C.D., and Gorovsky M.A. 1999. Phosphorylation of linker histone HI regulates gene expression in vivo by mimicking HI removal. Mol. Cell 4: 641-647.

Duharcourt S., Butler A., and Meyer E. 1995. Epigenetic self-regulation of developmental excision of an internal eliminated sequence on Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 9: 2065-2077.

Duharcourt S., Keller A.M., and Meyer E. 1998. Homology-dependent maternal inhibition of developmental excision of internal eliminated sequences in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell. Biol. 18: 7075-7085.

Epstein L.M. and Forney J.D. 1984. Mendelian and non-Mendelian mutations affecting surface antigen expression in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell. Biol. 4: 1583-1590.

Fan Q. and Yao M.-C. 1996. New telomere formation coupled with site-specific chromosome breakage in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 16: 1267-1274.

Forney J.D. and Blackburn E.H. 1988. Developmentally controlled telomere addition in wild-type and mutant paramecia. Mol. Cell. Biol. 8: 251-258.

Forney J.D., Yantiri E., and Mikami K. 1996. Developmentally controlled rearrangement of surface protein genes in Paramecium tetraurelia. J. Eukaryot. Microbiol. 43: 462-467.

Galvani A. and Sperling L. 2001. Transgene-mediated post-transcriptional gene silencing is inhibited by 3’ non-coding sequences in Paramecium. Nucleic Acids Res. 29: 4387-4394.

Galvani A. and Sperling L. 2002. RNA interference by feeding in Paramecium. Trends Genet. 18: 11-12.

Gamier O., Serrano V., Duharcourt S., and Meyer E. 2004. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell. Biol. 24: 7370-7379.

Gratias A. and Betermier M. 2001. Developmentally programmed excision of internal DNA sequences in Paramecium aurelia. Biochimie 83: 1009-1022.

Gratias A. and Betermier M. 2003. Processing of doublestrand breaks is involved in the precise excision of Paramecium internal eliminated sequences. Mol. Cell. Biol. 23: 7152-7162.

Hamilton E., Bruns P., Lin C., Merriam V., Orias E., Vong L., and Cassidy-Hanley D. 2005. Genome-wide characterization of Tetrahymena thermophila chromosome breakage sites. I. Cloning and identification of functional sites. Genetics 170: 1611-1621.

Harumoto T. 1986. Induced change in a non-Mendelian determinant by transplantation of macronucleoplasm in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell. Biol. 6: 3498-3501.

Harwood J. 1985. The erratic career of cytoplasmic inheritance. Trends Genet. 1: 298-300.

HayashiT., Hayashi H., Fusauchi Y., and Iwai K. 1984. Tetrahymena histone H3. Purification and two variant sequences. J. Biochem. 95: 1741-1749.

Hayashi T., Hayashi H., and Iwai K. 1987. Tetrahymena histone HI. Isolation and amino acid sequence lacking the central hydrophobic domain conserved in other HI histones. J. Biochem. 102: 369-376.

Jahn C.L. and Klobutcher L.A. 2002. Genome remodeling in ciliated protozoa. Annu. Rev. Microbiol. 56: 489-520.

Jaraczewski J.W. and Jahn C.L. 1993. Elimination of Tec elements involves a novel excision process. Genes Dev. 7: 95-105.

Jessop-Murray H., Martin L.D., Gilley D., Preer J.R., and Polisky B. 1991. Permanent rescue of a non-Mendelian mutation of Paramecium by microinjection of specific DNA sequences. Genetics 129: 727-734.

Klobutcher L.A. 1999. Characterization of in vivo developmental chromosome fragmentation intermediates in E. crassus. Mol. Cell 4: 695-704.

Klobutcher L.A. and Herrick G. 1995. Consensus inverted terminal repeat sequence of Paramecium IESs: Resemblance to termini of Tel-related and Euplotes Tec transposons. Nucleic Acids Res. 23: 2006-2013.

Klobutcher L.A. and Herrick G. 1997. Developmental genome reorganization in ciliated protozoa: The transposon link. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 56: 1-62.

Klobutcher L.A., Turner L.R., and LaPlante J. 1993. Circular forms of developmentally excised DNA in Euplotes crassus have a heteroduplex junction. Genes Dev. 7: 84-94.

Kobayashi S. and Koizumi S. 1990. Characterization of non-Mendelian and Mendelian mutant strains by micronuclear transplantation in Paramecium tetraurelia. J. Protozool. 37: 489-492.

Koizumi S. and Kobayashi S. 1989. Microinjection of plasmid DNA encoding the A surface antigen of Paramecium tetraurelia restores the ability to regenerate a wild-type macronucleus. Mol. Cell. Biol. 9: 4398-4401.

Landweber L.F., Kuo T.C., and Curtis E.A. 2000. Evolution and assembly of an extremely scrambled gene. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3298-3303.

Le Mouel A., Butler A., Caron F, and Meyer E. 2003. Developmentally regulated chromosome fragmentation linked to imprecise elimination of repeated sequences in Paramecia. Eukaryot. Cell 2: 1076-1090.

Lee S.R. and Collins K. 2006. Two classes of endogenous small RNAs in Tetrahymena thermophila. Genes Dev. 20: 28-33.

Liu Y., Mochizuki K., and Gorovsky M.A. 2004. Histone H3 lysine 9 methylation is required for DNA elimination in developing macronuclei in Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 1679-1684.

Liu Y., SongX., Gorovsky M.A., and Karrer K.M. 2005. Elimination of foreign DNA during somatic differentiation in Tetrahymena thermophila shows position effect and is dosage dependent. Eukaryot. Cell 4: 421-431.

Lu C., Tej S.S., Luo S., Haudenschild C.D., Meyers B.C., and Green P.J. 2005. Elucidation of the small RNA component of the transcriptome. Science 309: 1567-1569.

Madireddi M.T., Davis M., and Allis D. 1994. Identification of a novel polypeptide involved in the formation of DNA-containing vesicles during macronuclear development in Tetrahymena. Dev. Biol. 165: 418-431.

Madireddi M.T., Coyne R.S., Smothers J.F., Mickey K.M., Yao M.C, and Allis CD. 1996. Pddlp, a novel chromodomain-containing protein, links heterochromatin assembly and DNA elimination in Tetrahymena. Cell 87: 75-84.

Malone C.D., Anderson A.M., Motl J.A., Rexer C.H., and Chalker D.L. 2005. Germ line transcripts are processed by a Dicer-like protein that is essential for developmentally programmed genome rearrangements of Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 25: 9151-9164.

Mattick J.S. 2004. RNA regulation: A new genetics? Nat. Rev. Genet. 5: 316-323.

Matzke M.A. and Birchler J.A. 2005. RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nat. Rev. Genet. 6: 24-35.

Meyer E. 1992. Induction of specific macronuclear developmental mutations by microinjection of a cloned telomeric gene in Paramecium primaurelia. Genes Dev. 6: 211-222.

Meyer E. and Keller A.M. 1996. A Mendelian mutation affecting mating-type determination also affects developmental genomic rearrangements in Paramecium tetraurelia. Genetics 143: 191-202.

Meyer E., Butler A., Dubrana K., Duharcourt S., and Caron F. 1997. Sequence-specific epigenetic effects of the maternal somatic genome on developmental rearrangements of the zygotic genome in Paramecium primaurelia. Mol. Cell. Biol. 17: 3589-3599.

Meyers B.C., Vu T.H., Tej S.S., Ghazal H., Matvienko M., Agrawal V., Ning J., and Haudenschild C.D. 2004. Analysis of the transcriptional complexity of Arabidopsis thaliana by massively parallel signature sequencing. Nat. Biotechnol. 22: 1006-1011.

Mizzen C.A., Dou Y., Liu Y., Cook R.G., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 1999. Identification and mutation of phosphorylation sites in a linker histone. Phosphorylation of macronuclear HI is not essential for viability in Tetrahymena. J. Biol. Chem. 274: 14533-14536.

Mochizuki K. and Gorovsky M.A. 2004. Small RNAs in genome rearrangement in Tetrahymena. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 181-187.

Mochizuki K. and Gorovsky M.A. 2005. A Dicer-like protein in Tetrahymena has distinct functions in genome rearrangement, chromosome segregation, and meiotic prophase. Genes Dev. 19: 77-89.

Mochizuki K., Fine N.A., Fujisawa T., and Gorovsky M.A. 2002. Analysis of a piwi-related gene implicates small RNAs in genome rearrangement in Tetrahymena. Cell 110: 689-699.

Moreira-Leite F.F., SherwinX, Kohl L., and Gull K. 2001. A tiypano-some structure involved in transmitting cytoplasmic information during cell division. Science 294: 610-612.

-Nikiforov M.A., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 2000. A novel chromo-domain protein, pdd3p, associates with internal eliminated sequences during macronuclear development in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 20: 4128-4134.

Nowacki M., Zagorski-Ostoja W., and Meyer E. 2005. Nowalp and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr. Biol. 15: 1616-1628.

Paschka A.G., Jonsson F., Maier V., Mollenbeck M., Paeschke K., Postberg J., Rupprecht S., and Lipps H.J. 2003. The use of RNAi to analyze gene function in spirotrichous ciliates. Eur. J. Protistol 39: 449-454.

Philippe H., Germot A., and Moreira D. 2000. The new phylogeny of eukaryotes. Curr. Opin. Genet. Dev. 10: 596-601.

Pond F.R., Gibson I., Lalucat J., and Quackenbush R.L. 1989. R-body-producing bacteria. Microbiol. Rev. 53: 25-67.

Preer J.R., Jr., Preer L.B., and Jurand A. 1974. Kappa and other endosymbionts in Paramecium aurelia. Bacterial. Rev. 38: 113-163.

Prescott D.M. 1994. The DNA of ciliated protozoa. Microbiol. Rev 58: 233-267.

Prescott D.M. 1999. The evolutionary scrambling and developmental unscrambling of germline genes in hypotrichous ciliates. Nucleic Acids Res. 27: 1243-1250.

Prescott D.M., Ehrenfeucht A., and Rozenberg G. 2003. Template-guided recombination for IES elimination and unscrambling of genes in stichotrichous ciliates. J. Theor. Biol. 222: 323-330.

Ruiz E., Vayssie L., Klotz C., Sperling L., and Madeddu L. 1998. Homology-dependent gene silencing in Paramecium. Mol. Biol. Cell 9: 931-943.

Saveliev S.V. and Cox M.M. 1995. Transient DNA breaks associated with programmed genomic deletion events in conjugating cells of Tetrahymena thermophila. Genes Dev. 9: 248-255.

Saveliev S.V. and Cox M.M. 1996. Developmentally programmed DNA deletion in Tetrahymena thermophila by a transposition-like reaction pathway. EMBO J. 15: 2858-2869.

Scott J.M., Mikami K., Leeck C.L., and Forney J.D. 1994. Non-Mendelian inheritance of macronuclear mutations is gene specific in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell. Biol. 14: 2479-2484.

Shen X. and Gorovsky M.A. 1996. Linker histone HI regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell 86: 475-483.

ShenX., Yu L., Weir J.W., and Gorovsky M.A. 1995. Linker histones are not essential and affect chromatin condensation in vivo. Cell 82: 47-56.

Shorter J. and Lindquist S. 2005. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat. Rev. Genet. 6: 435-450

Sonnebom T.M. 1937. Sex, sex inheritance and sex determination in Paramecium aurelia. Proc. Natl. Acad. Sci. 23: 378-385.

Sonnebom T.M. 1975. Paramecium aurelia. In Handbook of genetics (ed. R. King), pp. 469-594. Plenum, New York.

Sonneborn T.M. 1977. Genetics of cellular differentiation: Stable nuclear differentiation in eucaryotic unicells. Annu. Rev. Genet. 11: 349-367.

Strahl B.D., Ohba R., Cook R.G., and Allis C.D. 1999. Methylation of histone H3 at lysine 4 is highly conserved and correlates with transcriptionally active nuclei in Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 14967-14972.

Suzuki M. and Hayashizaki Y. 2004. Mouse-centric comparative transcriptomics of protein coding and non-coding RNAs. Bioessays 26: 833-843.

Taverna S.D., Coyne R.S., and Allis C.D. 2002. Methylation of histone h3 at lysine 9 targets programmed DNA elimination in Tetrahymena. Cell 110: 701-711.

Timmons L. and Fire A. 1998. Specific interference by ingested dsRNA. Nature 395: 854.

Timmons L., Court D.L., and Fire A. 2001. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene 263: 103-112.

Vavra K.J., Allis C.D., and Gorovsky M.A. 1982. Regulation of histone acetylation in Tetrahymena macro- and micronuclei. J. Biol. Chem. 257: 2591-2598.

Wei Y., Yu L., Bowen J., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 1999. Phosphorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97: 99-109.

Wei Y., Mizzen C.A., Cook R.G., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 1998. Phosphorylation of histone H3 at serine 10 is correlated with chromosome condensation during mitosis and meiosis in Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 7480-7484.

Williams K., Doak T.G., and Herrick G. 1993. Developmental precise excision of Oxytricha trifallax telomere-bearing elements and formation of circles closed by a copy of the flanking target duplication. EMBO J. 12: 4593-4601

Wu M., Allis C.D., Richman R., Cook R.G., and Gorovsky M.A. 1986. An intervening sequence in an unusual histone HI gene of Tetrahymena thermophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8674-8678.

Yao M.C. and Chao J.L. 2005. RNA-guided DNA deletion in Tetrahymena. An RNAi-based mechanism for programmed genome rearrangements. Annu. Rev. Genet. 39: 537-559.

Yao M.C, Duharcourt S., and Chalker D.L. 2002. Genome-wide rearrangements of DNA in ciliates. in Mobile DNA IJ (ed. A. Lambowitz), pp. 730-758. Academic Press, New York.

Yao M.C., Fuller P., and Xi X. 2003. Programmed DNA deletion as an RNA-guided system of genome defense. Science 300: 1581-1584.

You Y., Aufderheide K., Morand J., Rodkey K., and Forney J. 1991. Macronuclear transformation with specific DNA fragments controls the content of the new macronuclear genome in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell Biol. 11: 1133-1137.

Yu L. and Gorovsky M.A. 1997. Constitutive expression, not a particular primary sequence, is the important feature of the H3 replacement variant hv2 in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 17: 6303-6310.