Эпигенетика

1.1. Гипотеза

В клетках млекопитающих метилирование цитозина происходит преимущественно в динуклеотидах CpG (рис. 18.1). Мысль о том, что метилирование ДНК у животных могло бы представлять механизм клеточной памяти, возникла независимо в двух лабораториях (Holliday and Pugh, 1975; Riggs, 1975). Отдавая себе отчет в том, что динуклеотид CpG является самокомплементарным, обе группы предположили, что паттерны метилированных и неметилированных CpG могли бы копироваться при делении клеток. Сразу же после репликации ДНК родительская нить ДНК сохраняла бы свой паттерн модифицированных цитозинов, но вновь синтезированная нить была бы немодифицированной. Для того чтобы обеспечить копирование родительского паттерна на эту дочернюю нить, они постулировали существование «поддерживающей метилтрансферазы», которая метилировала бы исключительно те CpG, которые спарены основаниями с метилированным родительским CpG. Неметилированные CpG не являлись бы субстратом для поддерживающей метилтрансферазы (рис. 18.2). Следствием работы этого простого механизма была бы полуконсерватавная репликация паттернов метилирования ДНК, подобно нуклеотидной последовательности самой ДНК

1.2. Данные о наследуемых паттернах метилирования

Паттерн метилирования ДНК в единичном геномном локусе первоначально был установлен с помощью рестрикционных эндонуклеаз, чувствительных к метилированию ДНК.

^{Рис. 18.1. Метилирование цитозинов в ДНК}

^{(а) добавление метильной группы (красный цвет) в положении 5 пиримидинового кольца цитозина (черная стрелка) стерически не интерферирует со спариванием оснований ПС (голубые линии). ДНК-метилтрансферазы ковалентно связываются с углеродом в положении 6 (зеленая стрелка) во время переноса метильной группы (б) Модель В-формы ДНК, метилированной по цитозинам в двух самокомплементарных последовательносях CpG. Спаренные метальные части (пурпурный и желтый цвета) лежат в большой бороздке двойной спирали}

Многие из этих ферментов не могут расщеплять сходные распознаваемые ими последовательности в ДНК, если имеет место метилирование специфического основания. Паттерн метилированных и неметилированных сайтов был картирован в генах рибосомной РНК Xenopus laevis с помощью таких энзимов, о которых известно, что они расщепляют ДНК по сайтам, содержащим CpG, но блокированы метилированием цитозинов (Bird and Southern, 1978). Нашли, что на конкретной нити ДНК большинство CpG метилированы, но что неметилированные сайты распределены случайным образом. Существенно, что эти сайты были всегда симметричными. Другими словами, либо оба CpG в комплементарной паре были метилированы, либо ни один из них не был метилирован (Bird, 1978). Это открытие вполне соответствовало предсказаниям, сделанным на основе модели поддержания (Holliday and Pugh, 1975; Riggs, 1975). Более прямая проверка наследуемости паттернов метилирования Д Н К стала возможной при использовании трансфекции искусственно метилированной ДНК в культивируемые клетки (Wigler, 1981). Неметилированные плазмиды обычно не становятся метилированными, даже после многих клеточных поколений. Однако плазмиды, которые были метилированы по сайтам CCGG метилтрансферазой M.Hpall, сохраняют свой метилированный статус на протяжении многих поколений, хотя надежность этого процесса, по крайней мере у культивируемых клеток, меньше 100 %.

1.3. Поддерживающая ДНК-метилтрансфераза млекопитающих

Прогресс в понимании любого биологического процесса на молекулярном уровне зависит от выделения ключевых игроков. Активность ДНК-метилтрансферазы была довольно рано обнаружена в грубых клеточных экстрактах, но в конечном счете ее удалось очистить как белок с массой, 200 кД (Bestor and Ingram, 1983). Фермент Dnmtl специфичен для CpG и обладает значительной активностью против неметилированной ДНК. Однако предпочтительным ДНК-субстратом для него является ДНК, метилированная по CpG только на одной нити (так называемая полуметилированная ДНК), в силу этого свойства казалось возможным, что это поддерживающая ДНК-метилтрансфераза. Последующие исследования существенно подкрепили этот взгляд, поскольку инактивация Dnmtl в эмбриональных стволовых клетках мыши (табл. 18.1) ведет к утрате метилирования CpG по всему геному (Li et al., 1992). Имеющиеся данные согласуются с точкой зрения, согласно которой Dnmtl поддерживает метилирование ДНК по CpG, завершая метилирование полуметилированных сайтов, как постулировали Риггс с Холлидеем и Пью (рис. 18.2).

2.1. De novo метилирование ДНК у ранних эмбрионов

Нам необходимо понять не только то, каким образом паттерны метилирования ДНК стабильно поддерживаются, но и то, как они вообще возникают Ранние эксперименты по трансфекции клеток показали, что неметилированная ДНК, введенная в культивируемые соматические клетки, имеет тенденцию оставаться в неметилированном состоянии спустя много клеточных делений. С другой стороны, ретровирусные провирусы и другие трансгены, введенные мышиным предимплантапионным эмбрионам, становятся стабильно метилированными в клетках животного (Jahner et al., 1982). Это позволяло предполагать, что процесс de novo метилирования ДНК ограничен тотипотентными стадиями эмбриогенеза. Эта идея была проверена с помощью клеток эмбриональной карциномы (ЕС) мышей и, впоследствии, эмбриональных стволовых (ES) клеток в качестве модельной системы. Ретровирусная ДНК была неинфекционной, будучи введенной в эти клетки, в противоположность соматическим клеткам, которые поддерживали инфекционный цикл вируса (Stewart et al., 1982). Кроме того, провирусная ДНК становилась метилированной по динуклеотидам CpG, а уменьшение метилирования путем клонирования их метилированных геномов в бактериях (и тем самым стирание метилирования ДНК) восстанавливало способность к экспрессии вирусного гена. Эти результаты показывали, что метилирование ДНК может сайленсировать экспрессию вирусного генома in vivo, а также что эмбриональные клетки действительно обладают способностью метилировать ДНК de novo. Первоначально была известна только одна ДНК-метилтрансфераза, Dnmt 1, и поэтому считалось, что этот фермент способен de novo метилировать ДНК на этих стадиях развития. Делеция гена Dnmtl, однако, не интерферирует с de novo метилированием провирусной ДНК в ES-клетках (Lei et al., 1996), доказывая, что работают другие ДНК-метилтрансферазы.

^{Рис. 18.2. Метилирование de novo и поддерживающее метилирование ДНК}

^{Отрезок геномной ДНК показан как линия с самокомплементарными парами CpG, маркированными как вертикальные штрихи. Неметилированная ДНК (верхняя часть рисунка) становится метилированной “de novo” благодаря Dnmt3a и Dnmt3b и дает в результате симметричное метилирование в определенных парах CpG. После полуконсервативной репликации ДНК дочерняя нить ДНК спарена основаниями с одной из метилированных родительских нитей (другой продукт репликации не показан). Симметрия восстанавливается поддерживающей ДНК-метилтрансферазой Dnmtl, которая завершает метилирование полуметилированных сайтов, но не метилирует немодифицированные CpG}

2.2. Открытие de novo метилтрансфераз

Все известные прокариотические цитозиновые ДНК-метилтрансферазы обладают общим набором диагностических белковых мотивов (Postfai et al., 1989). Эти особенности были обнаружены и у поддерживающей ДНК-метилтрансферазы Dnmtl. Поиски в базах данных по тегам экспрессируемых последовательностей (EST) выявили три транскрипта, которые потенциально могли кодировать дополнительные ДНК-метилтрансферазы (рис. 18.3). Один из кандидатов, белок Dnmt2, обладает миниальной ДНК-метилтрансферазной активностью in vitro и его отсутствие не оказывает никакого заметного влияния на уровни метилирования ДНК. Другие два кандидата, Dnmt3a и Dnmt3b, кодировали родственные каталитически активные полипептиды, которые, в отличие от Dnmtl, in vitro не проявляли никакого предпочтения в отношении метилирования полуметилированной ДНК (Okano et al., 1998). Дизрупция генов, кодирующих Dnmt3a и Dnmt3b у мышей, подтвердила, что эти белки представляют собой недостающие de novo метилтрансферазы (табл. 18.1), поскольку ES-клетки и эмбрионы, лишенные этих белков, были неспособны к метилированию de novo провирусных геномов и повторяющихся элементов (Okano et al., 1999). Более того, мужские и женские зародышевые клетки, лишенные белка Dnmt3a или ассоциированного регуляторного фактора, Dnmt3L, не могли установить отличающиеся паттерны метилирования в импринтированных генах (табл. 18.1) (Hata et al., 2002; Kaneda et al., 2004). В то время как инактивация и Dnmt3a, и Dnmt3b приводила к ранней эмбриональной летальности, утрата любого из этих генов вызывала серьезные дефекты, приводящие к постнатальной (Dnmt3a) или эмбриональной (Dnmt3b) летальности. Доказательства аналогичной роли у человека появились с открытием, согласно которому синдром ICF, редкое состояние, характеризующееся иммунодефицитом, центромерной нестабильностью и лицевыми аномалиями, связан с мутациями в гене, кодирующем Dnmt3b (Ehrlich, 2003). Анализ геномной ДНК лимфобластоидных клеток, взятых от больных ICF, показало пониженный уровень метилирования генома, особенно в повторяющихся последовательностях ДНК, ассоциированных с перицентромерными районами хромосом.

2.3. Островки CpG и паттерны метилирования ДНК

ДНК из соматических тканей млекопитающих метилирована в 70 % всех сайтов CpG (Ehrlich, 1982). Исследования по картированию (см. врезку на с. 338) показывают, что в число высокометилированных последовательностей входят сателлитные ДНК, повторяющиеся элементы, в том числе транспозоны и их инертные остатки, неповторяющаяся межгенная ДНК и экзоны генов. Среди этих категорий нуклеотидных последовательностей ДНК при метилировании, по-видимому, нет очевидного предпочтения последовательностей какого-то одного типа по сравнению с другим. CpG в сателлитных ДНК метилируются в общем в той же степени, что и CpG в перемещающихся элементах или экзонах. Таким образом, большинство последовательностей метилируются в соответствии с частотой находящихся в них динуклеотидов CpG, которая обычно отражает состав их оснований. Ключевыми исключениями из этого глобального метилирования являются островки CpG. Островки CpG были выявлены как фракция ДНК позвоночных, которая необычно часто расщепляется рестрикционными ферментами, чувствительными к метилированию ДНК (Cooper et al., 1983). Клонирование этих так называемых «крохотных HpaII-фрагементов» показало, что они происходят из последовательностей, обогащенных CpG и имеющих длину около 1 т. п.н., которые не метилированы в зародышевых клетках, у ранних эмбрионов и обычно также во всех соматических тканях (Bird et al.. 1985). Островки CpG (рис. 18.4) являются поэтому исключением из «глобального» метилирования CpG, преобладающего в большей части генома млекопитающих. Ранние работы по картированию промоторов индивидуальных генов выявили районы, обогащенные GC, вблизи промоторов генов (McKeon et al., 1982), и сейчас очевидно, что большинство (если не все) островки CpG маркируют промоторы и 5’-домены генов. Приблизительно 60 % генов человека имеют промоторы с островками CpG.

2.4. Динамические изменения в паттернах метилирования ДНК в ходе развития

Паттерны метилирования ДНК обнаруживают видимое общее постоянство при исследовании разных типов соматических клеток, хотя локальные изменения в специфических последовательностях ДНК очевидны. Например, островки CpG на одной Х-хромосоме в большом числе становятся de novo метилированными в ходе эмбрионального процесса инактивации Х-хромосомы у самок плацентарных млекопитающих (Wolf et al., 1984). Этот процесс имеет существенное значение для надежного сайленсинга генов на инактивированной хромосоме (рис. 18.4), потому что дефектные по метилированию ДНК мыши или клетки обнаруживают частую транскрипционную реактивацию генов, сцепленных с Х-хромосомой. В транскрипционную активацию некоторых генов во время дифференцировки также вовлечена запрограммированная утрата метилирования ДНК. Например, ген interleukin-2 утрачивает метилирование CpG в своем промоторном районе по мере того, как этот ген становится экспрессируемым в ходе дифференцировки Т-клеток (Bruniquel and Schwartz, 2003). Это деметилирование оказывается существенным предварительным условием для активации гена и является поэтому ключевой частью программы дифференцировки Т-клеток.

^{Рис. 18.3. Метилтрансферазы ДНК у млекопитающих}

^{Каталитические домены членов семейства Dnmtl, Dnmt2 и Втье3 консервативны (сигнатурные мотивы, I, IV, VI, IX и X, наиболее консервативны во всех нитозиновых метилтрансферазах), но между их аминотерминальными регуляторными доменами сходства мало. (PCNA) взаимодействующий с PCNA домен; (NLS) сигнал ядерной локализации; (RFT) домен, «нацеливающий» на фокусы репликации; (СХХС) богатый цистеином домен, который, как предполагается, связывается с последовательностями ДНК, содержащими динуклеотиды CpG; (ВАН) домен «bromo-adjacent homology», участвующий в белок-белковых взаимодействиях; (PWWP) домен, содержащий высококонсервативный мотив «пролин-триптофан-триптофан-пролин». участвующий в ассоциации с гетерохроматином; (ATRX) родственный ATRX богатый цистеином район, содержащий «цинковый палец» С2-С2 и атипичный домен PHD, участвующий в белок-белковых взаимодействиях}

Картирование метилирования ДНК

Чтобы понять функции метилирования ДНК, необходимо сначала выяснить, где оно происходит в геноме. Для этого существуют несколько методов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

¦ Поскольку метилирование ограничено в основном последовательностями CpG, для картирования широко использовали расщепление рестрикционными ферментами, распознающими содержащие CpG нуклеотидные последовательности ДНК (Bird and Southern, 1978). Преимущество этого метода заключается в том, что можно протестировать большие участки генома, но он ограничен динуклеотидами CpG, которые обнаруживаются в сайтах рестрикционных ферментов.

^{¦ Надежный метод тестирования всех цитозинов в данном участке включает бисульфитную модификацию однонитевой ДНК (Frommer et al., 1992). Это приводит к дезаминированию немодифицированных цитозинов, но 5-метилцитозин остается защищенным. В результате цитозины, сохраняющиеся после обработки бисульфитом, идентифицируются как метилированные. Благодаря своей высокой разрешающей способности и позитивной идентификации метилированных цитозинов этот метод является предпочтительным для анализа паттернов метилирования ДНК, хотя детальный анализ больших участков занимает много времени.}

^{¦ Несколько методов, базирующихся на ПЦР, которые зависят от предшествующей бисульфитной обработки, были разработаны для того, чтобы ускорить анализ интересующих исследователя районов (см., например, Herman et al., 1996). Эти методы очень удобны, но, фокусируясь на нескольких немногих сайтах CpG, они жертвуют детальной информацией, которая была бы получена при бисульфитном секвенировании.}

^{¦ Недавно для картирования метилирования ДНК были использованы микрочипы (microarrays). Например, ДНК, устойчивая к деградации специфичной к 5-метилцитозину нуклеазой МсгВС, может быть использована как зонд для работы с последовательностями геномной ДНК методом tiled arrays, чтобы получить общую картину уровня метилирования в специфическом участке (Martienssen et al., 2005). Можно также провести иммунопреципитацию зондов для tiled arrays, используя специфичные к 5-метилцитозину антитела, что позволяет получить общую картину уровней метилирования ДНК (Weber et al., 2005).}

2.5. Активное деметилирование зиготического отцовского генома

Помимо этих локальных изменений в метилировании ДНК имеет место значительное изменение уровней глобального метилирования ДНК в оплодотворенном яйце. Анализ уровней метилирования хромосомной ДНК с использованием анти-5-метилцитозиновых антител первоначально показал, что один хромосомный набор на ранних стадиях эмбрионального дробления удивительным образом дефектен в отношении метилирования ДНК (Rougier et al., 1998). Происхождение этого различия обнаружили, изучая зиготу до слияния материнского и отцовского пронуклеусов и используя для этого иммуноокрашивание 5-метилцитозина (Mayer et al., 2000). Вначале и материнский, и отцовский пронуклеусы демонстрировали равное окрашивание, что позволяло предполагать, что геномы яйцеклетки и спермия имели, грубо говоря, эквивалентные уровни метилирования цитозинов. Однако через несколько часов после оплодотворения наблюдали резкую утерю 5-метилцитозинов исключительно из отцовского генома. Бисульфитное секвенирование подтвердило, что один из двух геномов действительно деметилирован. Механизм утраты метилирования ДНК неизвестен, но он должен включать «активное» удаление этой модификации, поскольку в этот период нет никакой репликации ДНК. Интересно, что материнский геном тоже теряет метилирование ДНК в раннем эмбриогенезе, но в этом случае процесс является «пассивным» благодаря отсутствию поддерживающего метилирования ДНК во время ранних делений дробления. В целом предполагается, что в этот период удаляется более половины всего геномного метилирования. Затем, при имплантации происходит реметилирование, зависящее от Dnmt3a и Dnmt3b.

Об активном деметилировании ДНК сообщалось и в нескольких других случаях. Например, деметилирование промотора гена interleukin-2 в дифференцирующихся Т-хэлперных клетках (см. выше и: Bruniquel and Schwartz, 2003) происходит быстро и в отсутствие репликации ДНК. Сравнимый эффект был воспроизведен искусственно в системе ооцита лягушки, где сайленсированный, метилированный ген Oct-4 млекопитающего можно было транскрипционно реактивировать посредством процесса, зависящего от предшествующего деметилирования этого гена (Simonsson and Gurdon, 2004) Эта стадия, по-видимому, установлена для изоляции самой деметилазы.

^{Рис. 18.4. Островки CpG}

^{Островки CpG — это участки высокой плотности CpG, лишенные метилирования CpG, обнаруживаемого на промоторах большинства генов человека Долговременный сайленсинг гена может быть обеспечен метилированием района островков CpG. Например, таким путем сайленсированы гены на неактивной Х-хромосоме и некоторые импринтированные гены. Кроме того, некоторые гены в раковых клетках аберрантно сайленсированы метилированием островков CpG}

2.6. Что защищает островки CpG от метилирования ДНК?

Исследования паттернов метилирования ДНК оказались сфокусированными на вопросе о том, каким образом островки CpG у млекопитающих в норме остаются иммунными к метилированию ДНК, в остальном глобальному. Простейшее возможное объяснение заключается в том, что (1) островки CpG внутренне не способны к метилированию de novo метилтрансферазами ДНК, но это кажется невероятным, поскольку они становятся плотно метилированными на неактивной Х-хромосоме, тогда как островки на активной Х-хромосоме в той же клетке являются резистентными. Кроме того, в раковых клетках и клеточных линиях многие в норме неметилированные островки CpG поддаются метилированию. Поэтому были приняты во внимание несколько альтернативных (не обязательно взаимоисключающих!) объяснений паттерна метилирования ДНК у млекопитающих; (2) островки CpG защищены от метилирования связыванием факторов, каким-то образом исключающих Dnmt. Имеются доказательства, что связывающиеся факторы действительно исключают метилирование ДНК, но «футпринтинг» [footprinting, метод определения участков нуклеиновых кислот, образующих комплексы с белками] и тесты на чувствительность к нуклеазам показывают, что островки CpG (Lin et al., 2000) в ядре в высокой степени доступны; (3) островки CpG поддерживаются в свободном от метилирования состоянии с помощью ДНК-деметилаз, которые активно удаляют метил-CpG (Frank etal., 1991). Несмотря на несколько сообщений о деметилирующих активностях, все современные кандидатуры на роль ДНК-деметилаз не получили подтверждения. Однако этот сценарий нельзя исключить; (4) атипичный состав оснований и отсутствие метилирования отражают аномальный метаболизм ДНК в этих островках CpG. Например, имеются данные о том, что островки CpG являются ориджинами репликации [точками начала репликации], и на них>южет влиять структура интермедиата инициации репликации (Antequera and Bird, 1999). В качестве альтернативы можно предположить, что в этих сайтах может концентрироваться рекомбинация и (или) репарация, что приводит к высоким уровням обновления ДНК. Каким образом эти предполагаемые актвности могли бы исключать Dnmt — неясно. (5) Ранняя эмбриональная транскрипция с промотора островка CpG необходима для того, чтобы гарантировать, что метилирование ДНК исключено. В тестах с трансгенозом мутации промотора провоцируют метилирование островков CpG (Brandeis et al., 1994; MacLeod et al., 1994), и у ранних эмбрионов промоторы островков CpG в высокой степени тканеспецифичных генов обычно экспрессируются, но формальные доказательства того, что транскрипция исключает метилирование CpG, отсутствуют.

2.7. Переключается ли метилирование ДНК структурой хроматина?

Вышеописанные сценарии предполагают, что метилирование CpG является состоянием генома «по умолчанию» и что островки CpG поэтому возникают посредством исключения глобальной метилирующей активности. Недавно был предложен несколько иной взгляд: (6) паттерны метилирования ДНК определяются состоянием модификации лежащего в основе хроматина. В этом случае метилирование ДНК или его отсутствие включалось бы более ранним решением определенным образом модифицировать гистоновые белки. У гриба Neurospora crassa и растения Arabidopsis thaliana получены серъезные данные в пользу этой идеи (главы 6 и 9). Метилирование в этих системах не ограничено сайтами CpG и, как было показано, зависит от наличия метилирования гистона H3 по лизину 9 (H3K9me) (Tamaru and Selker, 2001; Jackson et al., 2002). У растений оказалось, что РНК-интерференция (RNAi) может служить «прицельным» механизмом для модификации хроматина, сайленсинга генов и метилирования ДНК (см.: Aufsatz et al., 2002; глава 8). Хотя у млекопитающих, у которых метилирование CpG преобладает, эти отношения были установлены хуже, отсутствие двух метилтрансфераз, метилирующих лизины гистонов (HKMTs) и специфичных к остаткам H3K9, как было показано, уменьшает метилирование CpG в повторяющихся последовательностях гетерохроматина (Lehnertz et al., 2003). Кроме того, было показано, что уменьшение содержания белка EZH2 из группы Polycomb (PcG), НКМТ, специфичной к остаткам H3K27, вызывает утрату метилирования CpG промоторов, являющихся мишенями для EZH2 (Vire et al., 2006). Имеются также убедительные данные о том, что у млекопитающих анти-смысловая транскрипция включает метилирование ДНК. Хиггс и сотрудники (Tufarelli et al., 2003) показали, что проведение [driving] антисмыслового транскрипта через ген ?-глобина в дифференцирующихся клетках мышиного эмбриона обеспечивает метилирование островков CpG-Механизм, лежащий в основе этого эффекта, остается неясным, но высказывались спекулятивные соображения, что здесь играет роль RNAi, подобно тому, что имеет место при некоторых событиях de novo метилирования у растений (Zilberman et al., 2003). Сообщалось о de novo метилировании, включаемом RNAi, в культивируемых клетках млекопитающих (Kawasaki and Taira, 2004), но современные данные заставляют считать, что этот феномен менее ясен, чем у растений или грибов

2.8. Роль SWI/SNF-подобных белков ремоделинга хроматина

Данные о том, что для обеспечения соответствующего метилирования необходимы также вспомогательные факторы хроматина, первоначально были получены на растениях, где было показано, что для полного метилирования генома A. thaliana существенное значение имеет SNF2-подобный белок DDM1 (Jeddeloh et al., 1999). Аналогичная зависимость наблюдается и у животных, поскольку мутации в генах ATRX человека (Gibbons et al., 2000) и Lsh2 мыши (Dennis et al., 2001), которые оба кодируют белки, родственные белку ремоделинга хроматина, SNF2, существенно влияют на паттерны глобального метилирования ДНК. В частности, утрата белка LSH2 соответствует фенотипу мутации DDM1 у Arabidopsis, поскольку оба мутанта утрачивают метилирование высокоповторяющихся последовательностей ДНК, но сохраняют некоторое метилирование в других местах генома. Возможно, эффективное глобальное метилирование генома требует изменений структуры хроматина этими ремоделируюшими хроматин белками, чтобы DNMTs могли получить доступ к ДНК. «Сотрудничество» между DNMTs и факторами хроматина, позволяющее им получить доступ к специализированным участкам хромосом, может иметь особенно важное значение в районах, являющихся «гетерохроматиновыми» и недоступными.

3.1. Ранние данные

Влияние метилирования ДНК на экспрессию генов было протестировано несколькими способами, В репортерном гене аденовируса искусственное метилирование подгруппы сайтов CpG с помощью М.НраН предотвращало экспрессию этого гена, когда его инъецировали в ядра ооцитов лягушки (Vardimon et al., 1982). Аналогичным образом ген аденинфосфорибозилтрансферазы (Stein et al., 1982) был сайленсирован метилированием CpG при трансфекции в культуральные клетки млекопитающих Исследования эффектов метилирования ДНК в природной геномной ДНК стали возможными с открытием того, что химический агент 5-азацитидин может подавлять метилирование ДНК в живых клетках (Jones and Taylor, 1980). Этот аналог нуклеозида включается в ДНК вместо цитидина и формирует ковалентный адцукт с ДНК-метилтрансферазами, изымая их из круговорота и предотвращая дальнейшее метилирование ДНК. Ранее было показано, что сайленсинг нескольких генов, включая вирусные геномы (Harbers et al., 1981) и гены на неактивной Х-хромосоме (Wolf et al., 1984), коррелирует с их метилированием. Способность воздействия 5-аза-цитидином восстанавливать их экспрессию (Mohandas et al., 1981) свидетельствовала о том, что это метилирование ДНК играет причинную роль в их репрессии. То, что этот эффект действительно был обусловлен изменениями в метилировании ДНК, а не каким-то другим влиянием этого вещества, было продемонстрировано с помощью тестирования очищенной ДНК, выделенной из клеток, обработанных агентом. ДНК из клеток, обработанных 5-азацитидином, будучи трансфецированной в клетки, была способна к активной экспрессии «молчащего» гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, сцепленного с Х-хромосомой, тогда как ДНК из необработанных контрольных клеток не могла обеспечить экспрессию (Venoliaet al., 1982).

3.2. Интерференция со связыванием транскрипционного фактора

Каким образом метилирование ДНК интерферирует с экспрессией генов? Одна очевидная возможность заключается в том, что присутствие метильных групп в большой бороздке (рис. 18.1) интерферирует со связыванием транскрипционных факторов, активирующих транскрипцию со специфического гена. Ряд транскрипционных факторов распознает мотивы обогащенных GC последовательностей, которые могут содержать GC-последовательности. Некоторые из них не способны связываться с ДНК, когда последовательность GC метилирована (Watt and Molloy, 1988). Доказательства участия этого механизма в регуляции генов поступают из исследований роли белка CTCF в импринтинге в локусе H19/Igf2 у мышей (Bell and Felsenfeld, 2000). CTCF ассоциирован с границами транскрипционного домена (Bell et al. 1999) и может изолировать промотор от влияния удаленных энхансеров. Полученная от матери копия гена Igf2 является «молчащей» из-за связывания CTCF между его промотором и энхансером, находящимся «вниз по течению». Однако в отцовском локусе богатые CpG сайты связывания CTCF метилированы, что предотвращает связывание CTCF и тем самым позволяет энхансеру, находящемуся «вниз по течению», активировать экспрессию Igf2 Хотя имеются данные о том, что импринтинг H19/Igf2 включает дополнительные процессы, роль CTCF представляет собою яркий пример транскрипционного регулирования посредством метилирования ДНК (детали см. в главе 19).

3.3. Притяжение белков, связывающихся с метил-CpG

Второй способ репрессии противоположен первому, поскольку он связан с белками, которые притягиваются, а не отталкиваются метил-CpG (рис. 18.5 и табл. 18.2). Этот способ репрессии вначале был обнаружен в экстрактах из клеток млекопитающих, которые были способны поддерживать транскрипцию добавленных генов. Добавление следовых количеств ДНК-матрицы сделало возможной транскрипцию с неметилированных репортерных генов, тогда как метилированные репортеры были репрессированы (Boyes and Bird, 1991). Увеличение количества добавляемой ДНК вызывало транскрипцию метилированных и неметилированных матриц на эквивалентных уровнях, что заставляло предполагать, что лимитирующие количества транскрипционного ингибитора, специфичного к метилированию ДНК, раститровывались [were being titrated out]. В соответствии с этой интерпретацией находящаяся в избытке метилированная неспецифическая конкурентная ДНК [excess methylated nonspecific competitor DNA] снимала репрессию метилированных генов в этих экстрактах. Доказательства непрямого подавления транскрипции также поступили из опытов, в которых метилированная ДНК, введенная в клетки млекопитающих и ооциты лягушки, сделала возможной транскрипцию генов только в начале (Buschhausen et al., 1987; Kass et al., 1997). Сайленсинг происходил несколькими часами позже, заставляя предполагать, что сайленсинг может зависеть от сборки хроматина Для того чтобы обнаружить белки, которые могли бы специфически связываться с метилированными генами и обусловливать наблюдаемую репрессию, были применен метод задержки в электрофорезном геле [bandshift assay] с использованием случайных метилированных последовательностей ДНК в качестве зондов. Комплекс ДНК — белок, специфичный к метилированной ДНК (MeCP1), наблюдали в ряде клеточных типов у млекопитающих (Meehan et al., 1989). Индивидуальный связывающийся с метил-CpG белок, МеСР2, был, однако, первым белком, подлежащим очистке и клонированию. Белки с мотивами связывания с ДНК, родственными мотивам МеСР2, были идентифицированы в результате поисков в базах данных и обозначены как семейство метил-CpG-связывающих доменов, охватывающее МеСР2, MBD1, MBD2, MBD3 и MBD4 (табл. 18.2) (Bird and Wolffe. 1999). Один из этих белков (MBD2) является связывающимся с ДНК компонентом комплекса MeCP1 (см. выше).

^{Рис. 18.5. Белки, связывающиеся с метил-CpG}

^{Пять членов белкового семейства MDB, выравненные по их MBD-доменам (пурпурный цвет). Обозначены и другие домены, в том числе домены репрессии транскрипции (TRD, transcriptional repression domains); домены СХХС, «цинковые пальцы» (предполагается участие некоторых из них в связывании неметилированных CpG); повторы GR с неизвестной функцией; гликозилазный домен с неправильным спариванием оснований T:G, участвующий в репарации дезаминирования 5-метилцитозина. Белок Kaiso не имеет домена MDB, но связывается с метилированной ДНК через «цинковые пальцы» (оранжевый цвет) и обладает доменом РОВ/ВТВ, общим с другими транскрипционными репрессорами}

Из белков MBD три — MBD1, MBD2 и МеСР2 — участвуют, как предположили, в зависимой от метилирования репрессии транскрипции (Bird and Wolffe, 1999). Как было показано, неродственный белок, Kaiso, тоже связывается с метилированной ДНК и осуществляет зависящую от метилирования репрессию в модельных системах (табл. 18.2) (Prokhortchouk et aL, 2001; Yoon et al., 2003). Понимание механизма репрессии пришло вместе с осознанием, что МеСР2 связывается корепрессорным комплексом mSin3a и зависит в своем действии от деацетилирования гистонов (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998). Это открытие показало, что метилирование ДНК может «считываться» МеСР2 и служить сигналом к изменению структуры хроматина (рис. 18.6). С тех пор было показано, что каждый из этих четырех связывающихся с метил-CpG белков ассоциирован с отдельным корепрессорным комплексом. Особый интерес представляет MBD1, который связывается с метилтрансферазой лизина гистонов, SETDB1, лишь в ходе репликации ДНК (Sarraf and Stancheva, 2004). Продолжающееся метилирование H3K9 гистонов в последовательностях-«мишенях» хромосомной MBD1 и стабильный сайленсинг ассоциированных генов зависят от периодического рекрутирования этой активности, модифицирующей хроматин.

Знание сайтов-«мишеней» MBD в геноме является предпосылкой для понимания его биологической роли. Можно было бы ожидать, что они конкурируют друг с другом за доступ к метилированным сайтам в силу их перекрывающейся специфичности нуклеотидной последовательности ДНК. Удивительно, что связывающиеся с MBD сайты в геноме в основном не перекрывались, когда их исследовали, используя клетки первичной клеточной линии человека; это позволяет предполагать, что каждый белок, связвающийся с метил-CpG, становится «мишенью» независимым образом (Klose et al., 2005). Это соответствует появляющимся данным, показывающим, что связывание MBD обнаруживает специфичность к нуклеотидной последовательности ДНК (см. табл. 18.2). Например, МеСР2 обнаруживает сильное предпочтение к сайтам mCpG. которые фланкируются цепочкой ДНК, обогащенной AT (Klose et al., 2005). Более того, MBD1 обладает дополнительным связывающимся с ДНК доменом, специфичным к неметилированным CpG, a Kaiso узнает пару соседних мотивов mCpG (Prokhortchouk et al., 2001). Пока что лишь MBD2, по-видимому, обладает эксклюзивным сродством к mCpG.

3.4 МеСР2 и синдром Ретта

Существование множественных связывающихся с метил-CpG белков с репрессивными свойствами говорит о том, что эти белки могут быть важными медиаторами сигнала метилирования. Это наиболее поразительным образом иллюстрируется тем, что мутации в гене МЕСР2 человека оказываются ответственными за серьезное нейрологическое нарушение, называемое синдромом Ретга (Rett syndrome, RTT). RTT поражает женщин, гетерозиготных по новым мутациям в сцепленном с Х-хромосомой гене МЕСР2(табл.

18.2) (Amir et al., 1999). Благодаря инактивации случайной Х-хромосомы больные оказываются мозаиками по экспрессии либо мутантного гена, либо гена дикого типа (wt). Пораженные синдромом девочки развиваются внешне нормально 6—18 месяцев, после чего у них наступает кризис, после которого они остаются с сильно нарушенными моторными навыками, повторяющимися движениями рук, аномальным дыханием, микроцефалией и другими симптомами (табл. 18.2). Мужчины, гемизиготные по таким же мутациям, не выживают. Лишенные Меср2мыиш рождаются и развиваются нормально на протяжении нескольких недель, но в возрасте 6 недель приобретают ряд нейрологических симптомов, которые в возрасте приблизительно 10 недель приводят их к гибели. Несколько особенностей этого задержанного фенотипа, который полностью пенетрантен, напоминают синдром Ретга у человека (Amir et al., 1999). Условная делеция гена Меср2, затрагивающая только мозг мыши, вызывает те же симптомы, что и делеция Меср2 в целой мыши (табл. 18.2) (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001). Следовательно, хотя MeCP2 экспрессируется клетках такой мыши повсеместно, «нулевой» по Меср2 фенотип, по-видимому, полностью обусловлен его отсутствием в мозге. В соответствии с этим открытием, биохимические и иммуноцитохимические исследования позволили установить, что самые высокие уровни экспрессии МеСР2 — в мозге, особенно в нейронах. Существенно, что экспрессия МеСР2 в одних только нейронах предотвращает появление этого мышиного фенотипа (Luikenhuis et al., 2004).

С учетом роли МеСР2 как транскрипционного репрессора привлекательная гипотеза, объясняющая это заболевание, заключается в том, что гены в мозге, которые должны быть сайленсированы МеСР2, в его отсутствие избегают репрессии, и это приводит к аберрантной функции нейронов. Первый идентифицированный ген млекопитающих, служащий «мишенью» для МеСР2, кодирует нейротрофный фактор мозга (Bdnf) (Chen et al., 2003; Martinowich et al., 2003). Bdnf принадлежит к группе белков, синтезируемых в ответ на активность нейронов; полагают, он важен для превращения временных стимулов в долговременные изменения в активности мозга. Поэтому можно предполагать, что его неправильная регуляция играет роль в патологии RTT. Сообщалось об измененной экспрессии нескольких других генов у мышей, но масштабы этих эффектов невелики (менее чем трехкратные). Тем не менее, возможно, что одно или несколько этих изменений также вносят вклад в фенотип RTT.

3.5. MBD2 опосредует зависящую от метилирования репрессию транскрипции

MBD2 является связывающимся с ДНК компонентом MeCP1 (см. табл. 18.2), который, рассматривался вначале как репрессор транскрипции в клеточных экстрактах (Meehan et al., 1989; Boyes and Bird, 1991). MeCP1 — крупный мультибелковый комплекс, включающий корепрессорный комплекс NuRD (или Mi-2) и MBD2 (Wade et al., 1999). В состав NuRD входят деацетилазы гистонов (HDAC) и крупный белок ремоделинга хроматина (Mi-2). NuRD может рекрутироваться к ДНК несколькими связывающимися с ДНК белками помимо MBD2. (Интересно, что MBD3, который похож на MBD2, но не связывается с метилированной ДНК, является компонентом комплекса NuRD.) Клетки, не имеющие MBD2, не способны эффективно репрессировать метилированные репортерные конструкты, несмотря на присутствие в этих клетках других связывающихся с метил-CpG белков; это говорит о том, что это важный компонент системы репрессии (Hendrich et al., 2001). Недостаточные по MBD2 мыши жизнеспособны и фертильны, хотя и обнаруживают дефекты в материнском поведении (Hendrich et al., 2001), а тщательное исследование позволило обнаружить отклонения в тканеспецифичной экспрессии генов. Экспрессия генов interleukin-4 и interferon-? в ходе дифференцировки Т-хелперных клеток существенно нарушена (Hutchins et al., 2002). Например, значительное число клеток Thl, которые должны были бы экспрессировать только interferon-?, экспрессировали также interleukin-4 (табл. 18.2). Поскольку было обнаружено, что MBD2 связан с геном interleukin-4, вполне вероятно, что его отсутствие ослабляет репрессию этого гена в клетках Thl.

4.1. Метилирование ДНК и мутации

Преимуществам метилирования ДНК как эпигенетической системы клеточной памяти противостоит недостаток, связанный с мутабильностью 5-метилцитозина. Цитозин (С) дезаминируется спонтанно, давая урацил (U), который затем неправильно спаривается с гуанином (Lindahl, 1974). Эта потенциальная мутация распознается урациловыми ДНК-гликозилазами, которые эффективно удаляют несоответствующее основание и инициируют репарацию, чтобы восстановить С на месте U. Однако, когда дезаминируется 5-метилцитозин, образуется тимин (Т). Результатом этого также оказывается неправильное спаривание, но тот факт, что Т, в отличие от U, является природным основанием ДНК, по-видимому, интерферирует с эффективным устранением повреждения. В результате мутантное тиминовое основание может сохраняться при репликации ДНК и передается дочерним клеткам как мутация типа транзиции С к Т. Мутации этого рода являются, по-видимому, одной из наиболее частых единичных причин генетического заболевания у людей, поскольку приблизительно одна треть всех точечных мутаций являются транзициями С к Т в последовательностях CpG (Cooper and Youssoufian, 1988). Эту нестабильность CpG в эволюционных масштабах демонстрирует далее 4—5-кратная недостача CpG в геноме млекопитающих (Bird, 1980). Единственным исключением оказываются островки CpG, в которых CpG не метилированы и поэтому стабильны.

Среди белков, связывающихся с метил-CpG, MBD4 остается пока уникальным в том отношении, что он обладает ферментативной активностью. Карбокситерминальный домен MBD4 является ДНК-гликозилазой, которая может in vitro избирательно удалять Т из неправильно спаренных Т—G (Hendrich et al., 1999). Эту активность можно было бы ожидать от системы репарации ДНК, которая исправляет дезаминирование 5-метилнитозина. В подтверждение этой гипотезы мыши, лишенные MBD4, обнаруживают повышенную мутабельность метилированных остатков цитозина в хромосомной репортерной последовательности (Millar et al., 2002). Кроме того, мыши, лишенные Mbd4, приобретают мутации типа транзиций С к Т в гене аденоматозного полипоза coli (АРС) и обладают повышенной частотой кишечных новообразований (табл. 18.2). Стоит отметить, что несмотря на существование специальной системы репарации, сайты метилирования цитозина сохраняются как «горячие точки» для мутаций.

^{Рис. 18.6. Гипотетический переход между активным, неметилированным генным промотором и репрессированным промотором, «молчание» которого обусловлено метилированием ДНК, опосредованным МеСР2}

^{Эта переходная фаза представляет собой промежуточный этап, во время которого транскрипция сайленсирована и происходит метилирование ДНК. Предполагается, что МеСР2 рекрутирует комплекс деацетилазы гистонов (HDAC) Sin3A и активность метилтрансферазы лизинов гистонов (НКМТ) к метилированным сайтам. Кроме того, имеются некоторые данные о том, что МеСР2 может прямо репрессировать транскрипцию путем контакта с комплексом инициации транскрипции (DR). Другие связывающиеся с метил-CpG белки взаимодействуют с разными корепрессорами, включающими активность НКМТ и (или) HDAC, и потенциально рекрутируют их}

4.2. Метилирование ДНК и нестабильность хромосом

Хотя метилирование ДНК является явно мутагенным, имеются данные, что его наличие выгодно в отношении стабильности хромосом. Мыши, обладающие примерно 10 % от нормального уровня метилирования ДНК благодаря гипоморфной мутации Dnmtl, приобретают агрессивные Т-клеточные лимфомы, которые нередко демонстрируют трисомию по хромосоме 15 (Gaudet et al., 2003). Мутации DNMT3B у пациентов с синдромом ICF или инактивация Dnmt3b у мышей приводят к различным хромосомным аберрациям, в том числе слиянию хромосом, разрывам и анеуплоидии (Ehrlich, 2003; Dodge et al., 2005). Эти результаты представляют интерес потому, что рак часто обнаруживает пониженные уровни метилирования ДНК, что может вносить свой вклад в инициацию или прогрессию опухолей. Одно возможное объяснение этих результатов заключается в том, что метилирование ДНК вносит вклад в точное расхождение хромосом и в его отсутствие чаще имеет место нерасхождение, приводящее к хромосомным нарушениям. Альтернативная возможность состоит в том, что метилирование ДНК может подавлять экспрессию и рекомбинацию ретротранспозонов в геноме млекопитающих, тем самым защищая хромосомы от вредоносной рекомбинации. Действительно, было показано, что метилирование ДНК играет критическую роль в сайленсировании транскрипции ретротранспозонов во время эмбрионального развития и сперматогенеза (Walsh et al., 1998; Bourc’his and Bestor, 2004).

Наше понимание биологических функций метилирования ДНК у млекопитающих постоянно растет, но еще далеко не является полным. Например, в отличие от генетических мутаций мы очень мало знаем о скорости изменений в метилировании CpG у млекопитающих и о внутренних и внешних факторах, индуцирующих изменения в паттернах метилирования ДНК. Накапливающиеся данные указывают на то, что изменения в метилировании ДНК и модификации гистонов могут вносить свой вклад в патогенез многих комплексных заболеваний. Таким образом, модуляция эпигенетических состояний обладает определенным потенциалом, чтобы стать новым терапевтическим подходом для лечения этих заболеваний. В будущем мы ожидаем больших успехов в этих важных областях исследования.

5.1. Факторы внешней среды, индуцирующие эпигенетические изменения

Твердо установлено, что паттерны метилирования ДНК генома млекопитающих в высокой степени регулируются в ходе развития. Каким образом факторы внешней среды могут влиять на метилирование ДНК и экспрессию генов — понятно в гораздо меньшей мере. Некоторые исследования последнего времени начинают проливать свет на то, как факторы внешней среды могут индуцировать эпигенетические изменения, которые могут иметь длительные биологические эффекты. Одним таким примером может служить наблюдение, что материнское поведение у крыс производит стабильные изменения в метилировании ДНК у потомства. Уивер и сотрудники сообщили, что крысята, получающие разные уровни материнской заботы, обладают различным метилированием ДНК в промоторном участке гена рецептора глюкокортикоида (GR), обнаруживающим обратную корреляцию с экспрессией GR, и эти различия сохраняются вплоть до взрослого состояния (Weaver et al., 2004). Другим примером является сообщение о том, что диета взрослой самки мыши может изменять метилирование ДНК у потомков. У мышей agouti является доминантным признаком, придающим меху коричневатую (агути) окраску. Несколько аллелей agouti viable yellow возникают спонтанно благодаря вставке перемещаемого ретровирусного элемента в этот ген. У мышей с такой аллелью экспрессия agouti контролируется длинным терминальным повтором (LTR) этого ретровирусного элемента. Окраска меха у этих мышей, варьирующая от желтой или пятнистой до агути дикого типа, определяется состояниями метилирования промотора LTR. Таким образом, в этой системе окраска меха может служить показателем метилирования ДНК. Когда беременные самки содержатся на диете, содержащей такие доноры метильной группы, как фолат, холин и бетаин, их потомство демонстрирует сдвиг окраски меха в сторону агути, что коррелирует с увеличенным метилированием промотора LTR (Cooney et al., 2002; Waterland and Jirtle, 2003). Эти результаты заставляют предполагать, что внешние факторы могут индуцировать стабильные изменения эпигенетических состояний, обеспечивая механизм, посредством которого факторы внешней среды могут вызывать долговременные биологические эффекты. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, в какой степени эпигенетические механизмы вовлечены в во взаимодействия генов и среды у млекопитающих и как факторы внешней среды могут преобразовываться в эпигенетические состояния.

5.2. Эпигенетическая нестабильность и комплексные заболевания

Многие комплексные заболевания, такие как диабет II типа, шизофрения, аутоиммунные болезни и рак, обнаруживают наследуемый компонент, но не проявляют четкого менделевского паттерна наследования. Динамический эпигенетический механизм позволяет дать альтернативное объяснение некоторых особенностей комплексных заболеваний, в том числе позднего начала, гендерных эффектов, эффектов, связанных с происхождением от того или иного родителя, дискордантности монозиготных близнецов, и флуктуации симптомов при комплексных заболеваниях (Petronis, 2001). Хотя все увеличивающееся количество данных позволило связать аберрантное метилирование ДНК и модификации гистонов с раком, роль эпигенетических механизмов в этиологии многих других комплексных заболеваний в основном неизвестна. Сравнительные исследования общегеномных паттернов метилирования ДНК в популяциях здоровых и больных могут позволить проникнуть в эпигенетические основы разных комплексных заболеваний, при которых трудно выявить генетические мутации.

5.3. Модуляция обратимых эпигенетических состояний

Большинство, если не все эпигенетические модификации являются обратимыми, что делает модуляцию эпигенетических состояний новой потенциальной терапевтической альтернативой для рака и других заболеваний Ряд агентов, изменяющих паттерны метилирования ДНК или подавляющих HDACs, испытываются в настоящее время в клинике (Egger et al., 2004). Некоторые из них продемонстрировали многообещающие противоопухолевые эффекты. Действительно, деметилируюший агент 5-азацитидин был недавно одобрен U.S. Food and Drug Administration для лечения миелодиспластического синдрома — гетерогенного заболевания, характеризующегося морфологической дисплазией гематопоэтических клеток. Клиническое использование 5-азацитидина и других аналогов нуклеозидов ограничивается их токсичностью, отчасти потому что эти соединения включаются в ДНК Это вдохновило на поиски агентов, которые могут подавлять метилтрансферазы непосредственно или «нацеливать» другие эпигенетические регуляторы. Поскольку метилирование ДНК является всего лишь одним из компонентов сложной эпигенетической регуляторной сети, одним из подходов к тому чтобы максимизировать терапевтические эффекты и минимизировать токсичность, является комбинационная терапия, использующая ингибиторы ДНК-метилтрансфераз или HDAC в сочетании с другими противораковыми терапевтическими средствами (детали см. в главе 24).