Эпигенетика

С. David Allis, Thomas Jenuwein, and Danny Reinberg

The Rockefeller University, New York; ‘Research Institute of Molecular Pathology, Vienna, Austria; UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, New Jersey

Общее резюме

Секвенирование ДНК генома человека и геномов многих модельных организмов вызвало в последние несколько лет значительное возбуждение в биомедицинском сообществе и среди обычной публики. Эти генетические «синьки», демонстрирующие общепринятые правила менделевской наследственности, оказываются теперь легко доступными для тщательного анализа, открывая дверь для более глубокого понимания биологии человека и его болезней. Эти знания порождают также новые надежды на новые лечебные стратегии. Тем не менее, многие фундаментальные вопросы остаются без ответа. Например, как осуществляется нормальное развитие, при том что каждая клетка обладает одной и той же генетической информацией и все же следует своим особым путем развития с высокой временной и пространственной точностью? Каким образом клетка решает, когда ей делиться и дифференцироваться, а когда сохранять неизменной клеточную идентичность, реагируя и проявляя себя согласно своей нормальной программе развития? Ошибки, случающиеся в вышеупомянутых процессах, могут вести к возникновению таких болезненных состояний, как рак. Закодированы ли эти ошибки в ошибочных «синьках», которые мы унаследовали от одного или обоих родителей, или же имеются какие-то другие слои регуляторной информации, которые не были правильно считаны и декодированы?

У человека генетическая информация (ДНК) организована в 23 пары хромосом, состоящих из примерно 25 000 генов. Эти хромосомы можно сравнить с библиотеками, содержащими разные наборы книг, которые в совокупности обеспечивают инструкции для развития целого человеческого организма. Нуклеотидная последовательность ДНК нашего генома состоит из примерно 3 × 10⁹ оснований, сокращенно обозначаемых в этой последовательности четырьмя буквами А, С, G и Т, которые образуют определенные слова (гены), предложения, главы и книги. Однако чем же диктуется, когда именно и в каком порядке эти разные книги нужно читать, остается далеко не ясным. Ответ на этот экстраординарный вызов заключается, вероятно, в том, чтобы выяснить, каким образом клеточные события скоординированы в процессе нормального и ненормального развития.

Если просуммировать все хромосомы, молекула ДНК у высших эукариот имеет длину около 2 метров и, следовательно, должна быть максимально сконденсирована — примерно в 10 000 раз, — чтобы поместиться в клеточном ядре — том компартменте клетки, в котором хранится наш генетический материал Накручивание ДНК на «шпульки» из белков, так называемых гистоновых белков, обеспечивает элегантное решение этой проблемы упаковки и дает начало полимеру, в котором повторяются комплексы белок: ДНК и который известен как хроматин. Однако в процессе упаковки ДНК для лучшего соответствия ограниченному пространству задача усложняется — во многом так же, как при расстановке слишком большого числа книг на библиотечных полках: становится все труднее и труднее найти и прочесть книгу по выбору, и, таким образом, становится необходимой система индексирования. Такое индексирование обеспечивается хроматином как платформой для организации генома. Хроматин не однороден по своей структуре; он выступает в различных формах упаковки — от фибриллы высококонденсированного хроматина (известного как гетерохроматин) до менее компактизированной формы, где гены обычно экспрессируются (известной как эухроматин). В основной полимер хроматина могут вводиться изменения путем включения необычных гистоновых белков (известных как варианты гистонов), измененных структур хроматина (известных как ремоделинг хроматина) и добавления химических «флажков», меток к самим гистоновым белкам (известного как ковалентные модификации). Более того, добавление метальной группы непосредственно к цитозиновому основанию (С) в матрице ДНК (известное как метилирование ДНК) может создавать сайты для присоединения белков, чтобы изменить состояние хроматина или повлиять на ковалентную модификацию резидентных гистонов. Полученные в последнее время данные позволяют предполагать, что некодирующие РНК могут «направлять» переход специализированных участков генома в более компактные состояния хроматина. Таким образом, на хроматин следует смотреть как на динамический полимер, который может индексировать геном и усиливать сигналы, поступающие из внешней среды, определяя в конечном счете, какие гены должны экспрессироваться, а какие нет.

В совокупности эти регуляторные возможности наделяют хроматин неким организующим геномы началом, которое известно как «эпигенетика» и которое является предметом этой книги. В некоторых случаях паттерны эпигенетического индексирования оказываются наследующимися в ходе клеточных делений, обеспечивая тем самым клеточную «память», которая может расширять потенциал наследуемой информации, заключенный в генетическом (ДНК) коде. Таким образом, в узком смысле слова эпигенетику можно определять как изменения в транскрипции генов, обусловленные модуляциями хроматина, которые не являются результатом изменений в нуклеотидной последовательности ДНК.

В этом обзоре мы объясняем основные концепции, связанные с хроматином и эпигенетикой, и обсуждаем, каким образом эпигенетический контроль может дать нам ключ для решения некоторых давнишних тайн — таких как клеточная идентичность, опухолевый рост, пластичность стволовых клеток, регенерация и старение. По мере того, как читатели будут «продираться» через последующие главы, мы советуем им обратить внимание на широкий спектр экспериментальных моделей, которые, по-видимому, имеют эпигенетическую (неДНКовую) основу. Выраженное в механистических терминах понимание того, как функционирует эпигенетика, будет, вероятно, иметь важные и далеко идущие последствия для биологии и болезней человека в эту «постгеномную» эру.

1. Генетика vs. эпигенетика

Определение структурных деталей двойной спирали ДНК явилось одним из ключевых открытий всей биологии. ДНК является главной макромолекулой, хранящей генетическую информацию (Avery et al. 1944), и она передает эту запасенную информацию следующему поколению через зародышевый путь. На базе этого и других открытий возникла «центральная догма» современной биологии. Эта догма в краткой форме выражает процессы, связанные с поддержанием и транслированием генетической матрицы и необходимые для жизни. Существенными этапами являются (1) самовоспроизведение ДНК путем полуконсервативной репликации; (2) однонаправленная (от 5’ — к 3’-концу) транскрипция — матричный процесс, определяемый генетическим кодом (ДНК); образование промежуточного соединения — информационной РНК (иРНК); (3) трансляция иРНК и образование полипептидов, состоящих из линейных (от амино- к карбоксильной группе) цепочек аминокислот, колинеарных с 5’—3’-последовательностью ДНК. Говоря простыми словами: ДНК → РНК → белок. Центральная догма обеспечивает обратную связь от РНК к ДНК на основе процесса обратной транскрипции, сопровождающейся интеграцией в существующую ДНК (что демонстрируется ретровирусами и ретротранспозонами). Однако эта догма не признает наличие обратной связи от белка к ДНК, хотя новым поворотом в судьбе генетической догмы явился тот факт, что редкие белки, известные как прионы, могут наследоваться в отсутствие матриц ДНК или РНК. Таким образом, эти специализированные самоаггрегирующиеся белки обладают свойствами самой ДНК, в том числе механизмом репликации и хранения информации (Cohen and Prusiner, 1998; Shorter and Lundquist, 2005). Кроме того, новые данные заставляют предполагать, что очень большая часть нашего генома транскрибируется в «некодирующие» РНК. Функция этих некодирующих РНК (т. е. не кодирующих белки, не считая tRNAs, rRNAs, snoRNAs) интенсивно исследуется и лишь начинает проясняться в ограниченном числе случаев.

Происхождение эпигенетики берет свое начало в давнишних исследованиях внешне аномальных (т. е. неменделевских) и ни с чем не сравнимых паттернов наследования у многих организмов (см. исторический обзор в главах 1 и 2). Классическое менделевское наследование фенотипических признаков (например, окраски горошин, числа пальцев или недостаточности гемоглобина) является результатом аллельных различий, вызываемых мутациями в нуклеотидной последовательности ДНК. В совокупности мутации лежат в основе определения фенотипических признаков, которые вносят вклад в детерминацию видовых границ. Эти границы затем формируются давлением естественного отбора, как объясняет дарвинова теория эволюции. Подобные концепции помещают мутации в самую сердцевину классической генетики. Напротив, неменделевское наследование (например, изменчивость эмбрионального роста, мозаичная окраска меха, случайная инактивация Х-хромосомы, парамутация у растений) (рис. 3.1) может быть, например, проявлением экспрессии только одной (из двух) аллелей в одном и том же ядерном окружении. Важно, что в этих обстоятельствах нуклеотидная последовательность ДНК не изменяется. Это отличается от другого паттерна, также относимого к неменделевской наследственности, который является результатом материнского наследования митохондрий (Birky, 2001). Потребность в эпигенетическом исследовании возникает в связи с избирательной регуляцией одной аллели внутри ядра. Чем различаются две идентичные аллели и каков механизм, посредством которого это различие устанавливается и поддерживается в последовательных клеточных поколениях? Что лежит в основе различий, наблюдаемых у монозиготных («идентичных») близнецов и делающих их не полностью идентичными? На эпигенетику иногда ссылаются как на одно из возможных объяснений различий во внешних признаках за счет перевода влияния внешней среды, диеты и других внешних источников влияния в экспрессию генома (Юаг, 2004; см. главы 23 и 24). Выяснение того, какие компоненты затрагиваются на молекулярном уровне и как изменения в этих компонентах влияют на биологию и заболевания человека — главный вызов для будущих исследований.

Другой ключевой вопрос в этой области заключается в следующем: насколько эпигенетическая информация важна для нормального развития? Каким образом нарушается функционирование нормальных путей развития, приводя к аномальному развитию и неопластической трансформации (т. е. раку)? Как упоминалось выше, «идентичные» близнецы обладают одинаковой нуклеотидной последовательностью ДНК, и их фенотипическая идентичность как таковая часто используется для того, чтобы подчеркнуть определяющую силу генетики. Однако даже такие близнецы могут обнаруживать внешние фенотипические различия, вероятно обусловленные теми эпигенетическими модификациями, которые имели место на протяжении жизни этих индивидуумов (Fraga et al., 2005). Таким образом, нам еще предстоит понять всю степень важности эпигенетики в определении судьбы, идентичности и фенотипа клеток. В случае регенерации тканей и старения остается неясным, диктуются ли эти процессы изменениями в генетической программе клеток или же эпигенетическими модификациями. Интенсивность исследований, ведущихся в мировом масштабе, подтверждает мнение, что в эту постгеномную эру эпигенетика представляет собой новый важный рубеж.

Говоря словами других исследователей, «мы — нечто большее, чем просто сумма наших генов» (Юаг, 1998); или: «вы можете наследовать нечто помимо нуклеотидных последовательностей ДНК. Вот где сейчас действительно волнующая проблема в генетике» (Watson, 2003). Важнейшим мотивом для решения издавать эту книгу была общая вера в то, что мы (редакторы) и все авторы этого тома могли бы передать это волнение будущим поколениям студентов, ученых и врачей, большинство из которых обучалось в свое время генетическим, но не эпигенетическим, принципам, управляющим наследственностью и расхождением хромосом.

^{Рис. 3.1. Биологические примеры эпигенетических фенотипов}

^{Эпигенетические фенотипы у широкого круга организмов и типов клеток; все они могут быть связаны с негенетическими различиями. Близнецы, легкие изменения, которые частично можно связать с эпигенетикой (©Randy Harris, New York). Тельце Бара: Эпигенетически сайленсированная, «заглушенная» Х-хромосома в клетках самок млекопитающих, видимая цитологически как конденсированный гетерохроматин. Политенные хромосомы: гигантские хромосомы в слюнных железах Drosophila, идеально подходящие для установления корреляции генов с эпигенетическими метками (воспроизведено из: Schotta et al. 2003 [©Springer]). Тип спаривания у дрожжей: пол определяется активным локусом МАТ, в то время как копии обоих генов, кодирующих типы спаривания, эпигенетически сайленсированы, «заглушены» (©Alan Wheals, University of Bath). Мазок крови: гетерогенные клетки одного и того же генотипа, но эпигенетически детерминированные для выполнения разных функций (с любезного разрешения проф. Christian Sillaber). Опухолевая ткань: клетки метастазов (слева), демонстрирующие повышенные уровни эпигенетических меток на срезе ткани (воспроизведено, с любезного разрешения, из Seligson etal. 2005 [©Macmillan]). Мутантное растение: эпифенотипы цветков Arabidopsis, генетически идентичные, с эпигенетически индуцированными мутациями (воспроиведено, с любезного разрешения, из Jackson etal. 2002 [©Macmillan]). Клонированная кошка: генетически идентичная, но с варьирующим фенотипом по окраске меха (воспроизведено, с любезного разрешения, из Shin et al. 2002 [©Macmillan])}

2. Модельные системы для изучения эпигенетики

Изучение эпигенетики обязательно требует наличия хороших экспериментальных моделей, и, как часто случается, эти модели, на первый взгляд, кажутся очень далекими от исследований, проводимых на клетках человека (или других млекопитающих). В совокупности, однако, результаты, полученные на многих системах, дали богатые знания. Авторы исторических обзоров (главы 1 и 2) ссылаются на несколько важных, ключевых открытий, которые явились плодом ранней цитологии, роста генетики, появления молекулярной биологии и сравнительно новых успехов в изучении регуляции генов, опосредованной хроматином. Различные модельные организмы (рис. 3.2) сыграли решающую роль в постановке и решении разнообразных вопросов, выдвигаемых эпигенетическими исследованиями. В самом деле, сделанные на различных модельных организмах и как будто бы несопоставимые эпигенетические открытия сыграли важную роль в объединении исследовательского сообщества Задача данного раздела — осветить некоторые из этих главных открытий, которые более детально обсуждаются в последующих главах этой книги. По мере знакомства с этими открытиями читателям следует сосредоточиться на фундаментальных принципах, выявленных в исследованиях с использованием этих модельных систем; в совокупности они чаще указывают на общие концепции, чем на разобщающие их детали.

Одноклеточные и «низшие» эукариотические организмы — Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Neurospora crassa — позволяют проводить детальный генетический анализ, отчасти облегчаемый их коротким жизненным циклом. Переключение типов спаривания (МАТ), случающееся у S. cerevisiae (глава 3) и S. pombe (глава 6), дало весьма демонстративные примеры, показывающие значение контроля генов, опосредованного хроматином. У почкующихся дрожжей S. cerevisiae было показано, как уникальные белки — регуляторы «молчашей» информации (SIR — silent information regulator) привлекают специфические модифицированные гистоны. Этому предшествовали элегантные эксперименты с использованием генетики для обоснования активного участия гистоновых белков в регуляции генов (Clark-Adams et al., 1988; Kayne et al., 1988). У дробянковых дрожжей S. pombe паттерны модификаций гистонов, действующие как активирующие и репрессирующие сигналы, замечательным образом сходны с таковыми у многоклеточных организмов. Это открыло путь для использования мощных генетических фильтров в поисках генных продуктов, которые супрессируют или усиливают сайленсинг генов. Совсем недавно для дробянковых дрожжей был предложен целый ряд механистических моделей, связывающих механизм PH К-интерференции (RNAi) с индукцией модификаций гистонов, репрессирующих экспрессию генов (Hall et al., 2002; Volpe et al., 2002). Вскоре после этого был сделан вывод об участии механизма RNAi и в транскрипционном сайленсинге генов у растения Arabidopsis thaliana. что подчеркнуло потенциальное значение регуляции этого типа у широкого круга организмов (см. раздел 10).

Другие нетрадиционные организмы также внесли несоразмерно большой вклад, вначале казавшийся необычным, в расшифровку эпигенетических путей. Гриб N. crassa продемонстрировал необычный неменделевский феномен индуцируемых повторами точечных мутаций (RIP — repeat-induced point mutations) как модель для изучения эпигенетического контроля (глава 6). Позже этот организм был использован для демонстрации первой функциональной связи между модификациями гистонов и метилированием ДНК (Tamaru and Selker 2001); это открытие впоследствии было распространено на «высшие» организмы (Jackson et al. 2002). Такие ресничные простейшие, как Tetrahymena и Paramecium, обычно используемые в биологических лабораториях в качестве удобных объектов для микроскопирования, весьма способствовали важным эпигенетическим открытиям благодаря своему уникальному ядерному диморфизму. Каждая клетка несет два ядра: транскрипционно активный соматический макронуклеус и ядро зародышевого пути — микронуклеус, который является транскрипционно неактивным. Используя макронуклеусы в качестве источника, богатого «активным» хроматином, исследователи смогли выполнить биохимическую очистку первого гистон-модифицирующего фермента— ацетилтрансферазы гистонов или HAT (Brownell et al., 1996). Инфузории хорошо известны также благодаря характерному для них особому явлению запрограммированной элиминации ДНК в ходе их полового жизненного цикла, включаемой малыми некодируюшими РНК и модификациями гистонов (глава 7).

У многоклеточных организмов размер генома и сложность организма в целом возрастают в ряду от беспозвоночных (Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster) или растений (A. thaliana) до «высших» и, так сказать, «имеющих к нам более прямое отношение» позвоночных организмов (млекопитающих). Растения, однако, сыграли более важную роль для всей эпигенетики, оказавшись богатейшим источником эпигенетических открытий (глава 9) от перемещающихся элементов и парамутаций (McClintock, 1951) до первого описания некодирующих РНК, участвующих в транскрипционном сайленсинге (Ratcliff et al., 1997). Исследования, выполненные на растениях, обнаружили важные связи между метилированием ДН К, модификациями гистонов и компонентами механизма RNAi. Открытие эпиаллелей растений, получивших такие комические названия как SUPERMAN и KRYPTONITE (например, Jackson et al., 2002), и нескольких генов яровизации (Bastow et al., 2004; Sung and Amasino, 2004) создало далее целую область исследований по выяснению роли эпигенетики в развитии и клеточной памяти. Меристемные клетки растений обусловили также возможность изучать такие ключевые вопросы, как соматическая регенерация и пластичность стволовых клеток (главы 9 и 11).

^{Рис. 3.2. Модельные организмы, используемые в эпигенетических исследованиях}

^{Схематическое изображение модельных организмов, используемых в эпигенетических исследованиях. S. cerevisiae: переключение типов спаривания для изучения эпигенетического контроля на уровне хроматина. S. pombe: мозаичный сайленсинг генов, проявляющийся как секторирование колонии. Neurospora crassa: эпигенетические системы защиты генома связаны с точечными мутациями, индуцированными повторами, подавлением [quelling] и мейотическим сайленсингом неспаренных нитей ДНК; все это выявляет взаимодействие между путями РНК-интерферениии, ДНК и метилированием гистонов. Tetrahymena: Хроматин в соматических ядрах и ядрах зародышевого пути различается эпигенетически регулируемыми механизмами. Arabidopsis: модель для репрессии с помощью механизмов сайленсинга ДНК. гистонов и сайленсинга, направляемого РНК. Кукуруза: модель для импринтинга. парамутации и сайленсинга, индуцируемого транспозонами. С. elegans: эпигенетическая регуляция в зародышевом пути. Drosophila: обусловленный эффектом положения мозаицизм проявляется в виде клональных пятен экспрессии и сайленсинга гена белой окраски глаз (white). Млекопитающие: инактивация Х-хромосомы.}

Что касается понимания развития у животных. Drosophila с давних пор была и остается постоянным генератором генетической энергии Основываясь на пионерской работе Меллера (Muller, 1930), было получено множество мутаций, влияющих на развитие, в том числе мутации, вызывающие гомеотические трансформации и эффект положения мозаичного типа; эти мутации описываются ниже (глава 5). Мутации, вызывающие гомеотические трансформации, привели к мысли, что могли бы существовать регуляторные механизмы для установления и поддержания клеточной идентичности/памяти; позже было показано, что они регулируются системами Polycomb и tnthorax (главы 11 и 12). Что касается эффекта положения мозаичного типа (PEV), то активность гена диктуется структурой окружающего хроматина, а не нуклеотидной последовательностью ДНК. Эта система оказалась особенно информативной для выявления факторов, участвующих в эпигенетическом контроле (глава 5). Полагают, что свыше 100 супрессоров мозаичности [Su(var)] кодируют компоненты гетерохроматина. Без фундамента, созданного этими имеющими важное значение исследованиями, были бы невозможны открытие первых метилтрансфераз лизинов в гистонах (HKMTs) (Rea et al. 2000) и вытекающие из него достижения в области метилирования лизина гистонов. Как нередко случается в биологии, у дробянковых дрожжей и у растений был проведен сравнительный скрининг, выявивший мутанты по сайленсингу, которые оказались функционально консервативными с генами Su(var) у Drosophila.

Применение методов обратной генетики с использованием библиотек RNAi у червя-нематоды С. elegans внесло существенный вклад в наше понимание эпигенетического регулирования в ходе развития многоклеточных. Здесь исследования, в которых тщательно прослеживалась судьба клеток и которые позволили детализировать все пути развития для каждой клетки, позволили высветить тот факт, что системы Polycomb и tritorax, вероятно, возникли одновременно с появлением многоклеточности (см. разделы 12 и 13). В частности, эти механизмы эпигенетического контроля имеют существенное значение для регуляции генов в зародышевом пути (глава 15).

Роль эпигенетики в развитии млекопитающих в основном была выяснена на мышах, хотя ряд исследований был распространен на разнообразные линии клеток человека и первичные клеточные культуры. Технологии нокаута и направленных вставок («knock-out» и «knock-in») оказались мощным инструментом для функционального расчленения ключевых эпигенетических регуляторов. Например, мыши, мутантные по метилтрансферазе ДНК, Dnmt1, позволили выяснить функциональную роль метилирования ДНК у млекопитающих (Li et al., 1992). Эта мутация является эмбриональной леталью и демонстрирует нарушение импринтинга (глава 18). Было также показано, что нарушение метилирования ДНК вызывает нестабильность генома и возобновление активности транспозонов, в частности в зародышевых клетках (Walsh et al., 1998; Bourc’his and Bestor, 2004). Охарактеризовано приблизительно 100 факторов, регулирующих хроматин (т. е. ферменты, модифицирующие гистоны и ДНК, компоненты комплексов ремоделинга нуклеосом и механизма РНКи), которые повреждены у этих мышей. Мутантные фенотипы затрагивают пролиферацию клеток, коммитирование клеточных линий, пластичность стволовых клеток, стабильность генома, репарацию ДНК и процессы сегрегации хромосом, как в соматических клетках, так и в зародышевом пути. Неудивительно, что большинство этих мутаций связаны также с развитием заболеваний и рака. Таким образом, многие из этих ключевых успехов в изучении эпигенетического контроля были достигнуты с использованием тех преимуществ, которые обеспечивались уникальными биологическими особенностями, свойственными многим, если не всем, вышеупомянутым модельным организмам. Без этих биологических процессов и их тщательного функционального анализа (генетического и биохимического) многие из недавних успехов в области эпигенетического контроля оставались бы труднодостижимыми.

3. Определение эпигенетики

Из вышеприведенного обсуждения вытекает один острый вопрос: какова та обшая нить, которая связывает разнообразные эукариотические организмы с фундаментальными эпигенетическими принципами? Различные эпигенетические явления объединены, главным образом, тем обстоятельством, что у всех организмов, обладающих настоящим ядром (эукариоты), ДНК не является «голой». Напротив, эта ДНК существует в виде тесного комплекса со специализированными белками, и вместе они составляют хроматин. В своей простейшей форме хроматин — т. е. ДНК, накрученная вокруг нуклеосомных единиц, состоящих из небольших гистоновых белков (Kornberg, 1974), — первоначально рассматривался как пассивная упаковочная структура, служащая для сворачивания и организации ДНК. Однако с помощью разнообразных ковалентных и нековалентных механизмов, выявляемых в настоящее время с большой быстротой, возникают разные формы хроматина (см. раздел 6). В число этих механизмов входит множество посттрансляпионных модификаций гистонов, энергозависимые процессы ремоделинга хроматина, мобилизующие или изменяющие структуру нуклеосом, динамические вставка новых гистонов (вариантов) в нуклеосомы и выход из них, а также направляющая роль малых некодирующих РНК. Сама ДНК у многих высших эукариот также может ковалентно модифицироваться путем метилирования цитозиновых остатков (обычно, но не всегда в динуклеотидах CpG). В совокупности эти механизмы создают набор взаимосвязанных метаболических путей, которые все вместе порождают вариации в полимере хроматина (рис. 3.3).

Многие, хотя и не все из этих модификаций и изменений хроматина, являются обратимыми и, следовательно, вряд ли воспроизводятся в зародышевом пути. Временные метки привлекательны потому, что они вызывают изменения в хроматиновой матрице в ответ на внутренние и внешние стимулы (Jaenisch and Bird. 2003) и тем самым регулируют доступность для транскрипционной машины и (или) возможность ее работы, необходимые для того, чтобы «прочесть» лежащую в основе хроматина матрицу ДНК (Sims et al., 2004; Глава 10). Некоторые модификации гистонов (такие как метилирование лизинов), участки метилированной ДНК и измененные нуклеосомные структуры могут, тем не менее, оставаться стабильными на протяжении нескольких клеточных делений. Благодаря этому возникают «эпигенетические состояния», обеспечивающие клеточную память, которые до сих пор остаются недооцененными и малопонятными. С этой точки зрения, «сигнатуры» хроматина могут рассматриваться как высокоорганизованные системы хранения информации, которые могут индексировать отдельные участки генома и обеспечивать ответ на сигналы, поступающие из внешней среды и диктующие программы экспрессии генов.

^{Рис. 3.3. Генетика vs. эпигенетика}

^{ГЕНЕТИКА: мутации (красные звездочки) в матрице ДНК (зеленая спираль) наследуются соматически и через зародышевый путь. ЭПИГЕНЕТИКА: изменения в структуре хроматина модулируют использование генома с помощью (1) модификаций гистонов (mod), (2) ремоделинга хроматина (remodeler). (3) вариантного состава гистонов (желтая нуклеосома), (4) метилирования ДНК (Me) и (5) некодирующих РНК. Метки на хроматиновой матрице могут наследоваться при клеточных делениях и в совокупности вносят вклад в детерминацию клеточного фенотипа}

Значение хроматиновой матрицы, способной реализовать генетическую информацию, заключается в том, что она обеспечивает многомерность уровней считывания информации с ДНК. Возможно, это действительно необходимо, учитывая огромные размеры и сложность эукариотического генома, особенно у многоклеточных организмов (см. детали в разделе 11). У таких организмов оплодотворенное яйцо претерпевает развитие, начиная с единичного генома, который становится эпигенетически запрограммированным на образование множества различных «эпигеномов» в более чем 200 разных типов клеток (рис. 3.4). Было высказано предположение, что эта запрограммированная изменчивость составляет некий «эпигенетический код», существенно расширяющий информационный потенциал генетического кода (Strahl and Allis, 2000; Turner, 2000; Jenuwein and Allis, 2001). Несмотря на всю привлекательность этой гипотезы, мы подчеркиваем, что для ее проверки и проверки других соблазнительных теорий требуется еще поработать. Выдвигаются и альтернативные точки зрения, согласно которым в гистонах чисто комбинаторные «коды», подобные триплетному генетическому коду, мало вероятны или, во всяком случае, далеко еще не установлены (Schreiber and Bernstein, 2002; Henikoff, 2005). Несмотря на такую неопределенность, мы склоняемся к общему мнению, что комбинация ковалентных и нековалентных механизмов действует таким образом, что создаются состояния хроматина, которые могут матрицироваться [be templated] при клеточных делениях и в процессе развития с помощью механизмов, которые только еще начинают выясняться. Вопрос о том, каким именно образом эти измененные состояния хроматина надежно воспроизводятся при репликации ДНК и в митозе, остается одной из фундаментальных проблем для будущих исследований.

^{Рис. 3.4. ДНК vs. хроматин}

^{Геном: инвариантная нуклеотидная последовательность ДНК (зеленая двойная спираль) особи. Эпигеном: общий состав хроматина, индексирующий весь геном в любой данной клетке. Он варьирует в зависимости от типа клетки и реакции на внутренние и внешние сигналы, которые он получает. (Нижняя часть рисунка) эпигеномная диверсификация у многоклеточных организмов происходит в ходе развития по мере того, как дифференцировка прогрессирует от единичной стволовой клетки (оплодотворенный эмбрион) к более коммитированным клеткам. Реверсия дифференцировки или трансдифференцировка (голубые линии) требует репрограммирования эпигенома клетки}

Фенотипические изменения, происходящие в ряду клеточных поколений в ходе развития многоклеточного организма, были описаны Уодцингтоном как «эпигенетический ландшафт» (Waddington, 1957). Тем не менее, весь спектр клеток, от стволовых до полностью дифференцированных, обладает идентичными нуклеотидными последовательностями ДНК, но заметно различается по профилю генов, которые реально экспрессируются этими клетками. Исходя из этого, позднее пришли к определению эпигенетики как «ядерной наследственности, которая не основывается на различиях в нуклеотидной последовательности ДНК» (Holliday, 1994).

Со времени открытия двойной спирали ДНК и ранних трактовок эпигенетики наши знания об эпигенетическом контроле и лежащих в его основе механизмах существенно возросли, заставляя некоторых описывать эти знания в таких более «возвышенных» терминах, как «область науки», а не просто «феномены» (см Wolfe and Matzke, 1999; Roloff and Nuber, 2005; глава 1). За последнее десятилетие значительный прогресс был достигнут в отношении многих семейств энзимов, активно модифицирующих хроматин (см. ниже). Таким образом, используя современную терминологию, эпигенетику можно в молекулярном (механистическом) плане определить как «сумму изменений в хроматиновой матрице, которые в совокупности устанавливают и воспроизводят различные паттерны экспрессии генов (транскрипции) и сайленсинга на основе одного и того же генома».

4. Хроматиновая матрица

Нуклеосома является фундаментальной повторяющейся единицей хроматина (Komberg, 1974). С одной стороны, эта базовая единица хроматина состоит из белкового октамера, содержащего по две молекулы каждого канонического (или корового) гистона (Н2А, Н2В, H3 и Н4), вокруг которого накручены 147 п.н. ДНК. Детальные межмолекулярные взаимодействия между коровыми гистонами и ДНК были определены в выдающихся исследованиях, приведших к получению рентгеновской картины (с атомным, 2.8 Е, разрешением) нуклеосомы, собранной из рекомбинантных частей (рис. 3.5) (Lugeret al., 1997). Картины мононуклеосом, а также возникающих структур более высокого порядка (тетрануклеосом), имеющие более высокое разрешение (Schalch et al., 2005), продолжают привлекать наше внимание, обещая помочь в объяснении физиологически важного субстрата, на котором развертывается действие если не всего, то большей части ремоделинга хроматина и механизма транскрипции

Коровые гистоновые белки, составляющие нуклеосому, являются очень небольшими и сильно основными. Они состоят из глобулярного домена и гибких (относительно неструктурированных) «гистоновых хвостов», торчащих с поверхности нуклеосомы (рис. 3.5). Судя по аминокислотной последовательности, гистоновые белки крайне консервативны в диапазоне от дрожжей до человека. Такая высокая степень консервативности подкрепляет общий взгляд, согласно которому эти белки, даже неструктурированные хвостовые домены, вероятно выполняют критичные функции. Хвосты, особенно хвосты гистонов H3 и Н4, в действительности содержат важный ключ к изменчивости нуклеосом (и, отсюда, хроматина), поскольку многие из остатков являются объектами экстенсивных посттрансляционных модификаций (см. стандартную номенклатуру, используемую в этом руководстве, на обратной стороне задней части переплета и список известных модификаций гистонов в Приложении 2).

Ацетилирование и метилирование коровых гистонов, особенно H3 и Н4, были одними из первых описанных ковалентных модификаций, и долгое время предполагалось, что они коррелируют с положительными и отрицательными изменениями в транскрипционной активности. Со времени пионерских работ Олфри и сотрудников (Allfrey et al., 1964) были идентифицированы и охарактеризованы многие типы ковалентных модификаций гистонов; в их числе — фосфорилирование, убиквитинирование, сумоилирование, АДФ-рибозилирование, биотинилирование гистонов, изомеризация пролина и другие вероятные типы, ожидающие своего описания (Vaquero et al., 2003). Эти модификации происходят в специфических сайтах и остатках, некоторые из них изображены на рис. 3.6 и перечислены в Приложении 2. Эту ковалентную маркировку катализируют специфические ферменты и ферментные комплексы, часть которых описывается далее в этом обзоре и в отдельных главах. Поскольку в ближайшие годы эти перечни будут продолжать расти, нашим намерением было упомянуть лишь отдельные метки и энзимы, которые могли бы проиллюстрировать то, что, как нам кажется, является общими понятиями и принципами.

^{Рис. 3.5. Структура нуклеосомы}

^{(Слева) Модель нуклеосомы с разрешением 2.8 Е. (Справа) Схематическое представление организации гистонов внутри октамерного кора, вокруг которого обернута ДНК (черная линия). Образование нуклеосомы происходит сперва через откладку на ДНК тетрамера H3/Н4. а затем двух наборов димеров Н2А/Н2В. Неструктурированные аминотерминальные гистоновые хвосты выпячиваются из нуклеосомного кора, состоящего из структурированных глобулярных доменов восьми гистоновых белков}

В определенных районах хроматина нуклеосомы могут содержать вариантные гистоновые белки вместо какого-нибудь корового (канонического) гистона. Текущие исследования показывают, что это различие в составе способствует выполнению специализированных функций этими маркированными районами хромосом. В настоящее время известны вариантные белки для коровых гистонов Н2А и H3, но не известно ни одного для гистонов Н2В и Н4. Мы подозреваем, что варианты гистонов, хотя они нередко являются минорными в смысле их количества и потому более трудными для исследования, весьма богаты в отношении содержащейся в них информации и играют весьма существенную роль в отношении их вклада в эпигенетическое регулирование (детали см в разделе 8 и главе 13).

5. Более высокие уровни организации хроматина

Хроматин, этот состоящий из ДНК и нуклеосом полимер, является динамической молекулой, существующей во многих различных конфигурациях. Ранее в течение длительного времени хроматин разделяли на эухроматин и гетерохроматин, исходя из картины окрашивания ядра красителями, которые цитологи использовали для визуализации ДНК. Эухроматин представляет собой деконденсированный хроматин, хотя он может быть активным или неактивным в отношении транскрипции. Гетерохроматин можно определить в широком смысле как высококомпактизированный и «молчащий» хроматин. Он может существовать как постоянно «молчащий» хроматин (конститутивный гетерохроматин), где гены организма лишь изредка экспрессируются в клетках любого типа, или как хроматин, репрессированный в некоторых клетках в ходе специфического клеточного цикла или на специфической стадии развития (факультативный гетерохроматин) Таким образом, имеется спектр состояний хроматина, и накопленная за многие годы литература позволяет предполагать, что хроматин является высоко динамичной структурой, склонной к ремоделингу и реструктурированию по мере получения физиологически релевантных сигналов, поступающих по «идущим вверх» (upstream) сигнальным путям. Однако лишь недавно достигнут значительный прогресс в раскрытии молекулярных механизмов, управляющих этими процессами ремоделинга.

^{Рис. 3.6. Сайты, по которым происходят модификации гистоновых «хвостов»}

^{Аминотерминальные «хвосты» гистонов составляют четверть массы нуклеосомы. На них находится огромное большинство известных сайтов, по которым происходит ковалентная модификация и которые изображены на рисунке. Модификации происходят также и в глобулярном домене (заключено в прямоугольник) некоторые из них указаны на рисунке. В целом в число активных меток входят ацетилирование (бирюзовый флажок Ас), метилирование аргинина (желтый шестиугольник Ме) и метилирование некоторых лизинов, таких как H3К4 и H3K36 (зеленый шестиугольник Ме). Функция H3К79 в глобулярном домене — антисайленсинг. В число репрессивных меток входят H3К9, H3К27 и H4K20 (красный шестиугольник Ме). Зеленый цвет — активная метка, красный — репрессивная метка}

Фигурирующая в учебниках 11-нанометровая матрица типа «бусинок на нити» представляет собой активную и в основном «развернутую» интерфазную конфигурацию, в которой ДНК периодически оборачивается вокруг повторяющихся единиц — нуклеосом (рис. 3.7). Однако эта хроматиновая фибрилла не всегда составлена из нуклеосом, расположенных на регулярном расстоянии друг от друга. Нуклеосомы могут быть упакованы нерегулярно и могут сворачиваться в структуры более высокого порядка, анализ которых при атомном разрешении еще только начинается (Khorasanizadeh, 2004). Характерные конформации хроматина более высокого порядка возникают в разных районах генома во время спецификации судьбы клеток или на разных стадиях клеточного цикла (интерфазный vs. митотический хроматин).

Расположение нуклеосом на 11-нанометровой матрице может быть изменено в результате cis-эффектов и trans-эффектов ковалентно модифицированных «хвостов» гистонов (рис. 3.8). Cis-эффекты возникают в результате изменений в физических свойствах модифицированных хвостов гистонов, таких как модуляции в электростатическом заряде или в структуре «хвостов», которые, в свою очередь, изменяют межнуклеосомные контакты. Хорошо известным примером может служить ацетилирование гистонов, которое, как давно подозревали, нейтрализует положительные заряды сильно основных гистоновых «хвостов», порождая в результате локальное растяжение хроматиновой фибриллы и тем самым обеспечивая лучший доступ транскрипционной машины к двойной спирали ДНК. Фосфорилирование, благодаря добавлению суммарного отрицательного заряда, может создавать «очажки зарядов» [charge patches] (Dou and Gorovsky, 2000), которые, как полагают, изменяют упаковку нуклеосом или экспонируют аминоконцы гистонов, изменяя у хроматинового полимера состояние сворачивания более высокого порядка (Wei et al., 1999; Nowak and Corces, 2004). Считается, что во многом таким же образом линкерные гистоны (Н1) стимулируют упаковку фибрилл более высокого порядка, экранируя отрицательный заряд линкерной ДНК между соседними нуклеосомами (Thomas, 1999; Khochbin, 2001; Harvey and Downs, 2004; Kimmins and Sassone-Corsi, 2005). Добавление таких объемистых аддуктов, как убиквитин и АДФ-рибоза, также может индуцировать разное расположение гистоновых «хвостов» и открывать группы нуклеосом. В какой мере гистоновые «хвосты» могут индуцировать компактизацию хроматина посредством механизмов, зависящих от модификаций и не зависящих от них, — еще не ясно.

^{Рис. 3.7. Структурирование хроматина более высоких порядков}

^{11-нанометровая фибрилла представляет собой ДНК, накрученную вокруг нуклеосом 30-нанометровая фибрилла компактизирован а далее во все еще неподтвержденную структуру (изображена здесь как соленоидная конформация), включающую линкерный гистон Н1. 300—700-нанометровое волокно представляет собой динамическое «выпетливание» более высокого порядка, которое обнаруживается как в интерфазном, так и в метафазном хроматине. 1,5-микрометровая конденсированная хромосома представляет собой наиболее компакгизированную форму хроматина, которая обнаруживается только во время ядерного деления (митоза или мейоза). Еще не ясно, каким образом картины бэндинга (т. е. G- или R-бэндинга) митотической хромосомы коррелируют с конкретными структурами хроматина}

^{Рис. 3.8. Переходы в хроматиновой матрице (cis/trans)}

^{cis-эффекты: ковалентная модификация остатка гистонового «хвоста» приводит к изменению структуры или заряда, проявляющемуся как изменение в организации хроматина, trans-эффекты: ферментативная модификация остатка гистонового «хвоста» (напр., метилирование H3К9) приводит к возникновению сродства к ассоциированному с хроматином белку (modbinder, напр., НР1). Ассоциация mod binder (или комплексов ассоциированных белков) вызывает изменения в структуре хроматина «вниз по течению». Замещение гистонов: ковалентная модификация гистонов (или другой стимул) может послужить сигналом для замещения какого-то корового гистона вариантным гистоном с помощью комплекса-обменника, осуществляющего ремоделинг нуклеосом}

Модификации гистонов могут также вызывать то, что мы обозначаем как trans-эффекты, рекрутируя в хроматин связанные с модификацией молекулы-партнеры. Это может рассматриваться как «считывание» конкретной ковалентной метки гистона зависимым от контекста образом. Некоторые партнеры по связыванию обладают особым сродством и поэтому говорят, что они «помещаются как в док» («dock») на специфические «хвосты» гистона и нередко делают это, играя роль хроматиновой «застежки-липучки» («Velcro») для одного полипептида в составе значительно более крупного ферментативного комплекса, которому нужно связаться с хроматиновым полимером. Например, бромодомен — мотив, распознающий ацетилированные остатки гистона — часто, хотя и не всегда, является частью фермента ацетилтрансферазы гистонов (HAT), функция которого — ацетилирование гистонов-мишеней (см. рис. 3.10 в разделе 7) и который существует как часть более крупного комплекса, осуществляющего ремоделинг хроматина (Dhalluin et al. 1999; Jacobson et al. 2000). Аналогичным образом метилированные остатки лизина, встроенные в гистоновые «хвосты», могут считываться хромодоменами (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001; Nakayama et al., 2001) или сходными доменами (например, МВТ, tudor) (Maurer-Stroh et al., 2003; Kim et al., 2006) и облегчать модуляции хроматина, происходящие «ниже по течению». В некоторых случаях, например, ассоциация хромодоменных белков ускоряет распространение гетерохроматина путем катализируемого гистоновой метилтрансферазой (HKMT) метилирования соседних гистонов, которые затем считываются хромодоменными белками (глава 5).

Модификации как «хвостовых» участков, так и глобулярного корового участка гистонов (Cosgrove et al., 2004) могут также «нацеливать» зависимые от АТФ ремоделирующие комплексы на 11-нанометровую фибриллу, необходимую для перехода от готового к действию эухроматина к транскрипционно активному состоянию. Эта мобилизация нуклеосом может происходить путем скольжения октамера, изменения структуры нуклеосомы в результате выпетливания ДНК (детали см. в главе 12) или замещения специфических коровых гистонов гистоновыми вариантами (глава 13). Зависимые от АТФ ремоделеры хроматина (такие как SWI/SNE — исторически важный пример!) путем гидролиза высвобождают энергию для того, чтобы осуществить значительные изменения в контактах гистон: ДНК, приводящие к выпетливанию, скручиванию и скольжению нуклеосом. Как было показано, эти нековалентные механизмы имеют критически важное значение для событий регуляции генов (Narlikar et al., 2002) в такой же мере, как и механизмы, связанные с ковалентной модификацией гистонов (глава 10). Тот факт, что специфические зависимые от АТФ ремоделеры могут перетасовывать варианты гистонов, включая их в хроматин и выводя их из него, дает возможность связать вместе с is-, trans-механизмы и механизмы ремоделинга. В свою очередь, понимание того, как эти взаимосвязанные механизмы действуют согласованным образом, варьируя эпигенетические состояния в хроматине все еще остается далеко не полным.

Более компактные и репрессивные хроматиновые структуры более высокого порядка (30-нанометровые) могут быть также получены в результате рекрутирования линкерного гистона Н1 и (или) зависящих от модификации, или «архитектурных», факторов, связанных с хроматином, — таких, как белок 1 гетерохроматина (НР1) или Polycomb (PC). Хотя обычно считают, что компактизация нуклеосомного хроматина (11-нанометрового) в 30-нанометровую транскрипционно некомпетентную конформацию осуществляется путем включения линкерного гистона Н1 в интерфазе, функциональное и структурное расчленение этого гистона до недавнего времени было затруднено (Fan et al., 2005). Одна вероятная проблема, связанная с этими исследованиями, заключается в том, что гистон Н1 существует в виде разных изоформ (около 8 у млекопитающих), затрудняя проведение детального генетического анализа. Таким образом, имеет место дублирование между некоторыми изоформами Н1, тогда как другие изоформы могут выполнять тканеспецифичные функции (Kimmins and Sassone-Corsi, 2005). Интересно, что сам Н1 может быть ковалентно модифицирован (фосфорилирован, метилирован, поли(АТФ)рибозилирован и т. д.), создавая возможность того, что cis- и trans-механизмы, проанализированные в настоящее время на коровых гистонах, вполне могут быть распространены и на этот важный класс линкерного гистона, а также на негистоновые белки (Sterner and Berger, 2000).

Значительные споры имели место по вопросу о деталях того, каким образом организована 30-нанометровая фибрилла хроматина. В целом были описаны либо «соленоидные» (одностартовая спираль) модели, в которых нуклеосомы постепенно сворачиваются вокруг центральной оси (6–8 нуклеосом на один оборот), либо более открытые модели типа «зигзага», предполагающие самосборку более высокого порядка (двухстартовая спираль). Новые данные, в том числе данные рентгеноструктурного анализа с использованием модельной системы, содержащей четыре нуклеосомы, позволяют предполагать такую организацию фибриллы, которая в большей мере согласуется с двухстартовой, зигзагообразной конформацией линкерной ДНК, соединяющей две стопки нуклеосомных частиц (Khorasanizadeh, 2004; Schalch et al., 2005). Несмотря на этот прогресс, мы отмечаем, что линкерный гистон не присутствует в действительно существующих [current] структурах и даже если бы он там присутствовал, 30-нанометровая хроматиновая фибрилла компактизирует ДНК всего лишь примерно в 50 раз. Таким образом, в организации хроматина существует значительно больше уровней более высокого порядка, которые еще предстоит различить за рамками свето- и электронно-микроскопического исследования и которые обусловливают либо интерфазное, либо митотическое состояния хроматина. Недавние результаты, полученные на живых клетках, несмотря на некоторую структурную неопределенность, уже выявили в интерфазных хромосомах существование множественных уровней сворачивания хроматина выше уровня 30-нанометровой фибриллы. Заслуживающим внимания достижением было развитие новых подходов, позволяющих метить специфические нуклеотидные последовательности ДНК в живых клетках, что создает возможность изучать динамику «открытия» и «закрытия» хроматина in vivo в реальном времени. Интересно, что эти результаты выявляют динамическое взаимодействие позитивных и негативных факторов ремоделинга хроматина в установлении хроматиновых структур более высокого порядка для состояний, в большей или меньшей мере совместимых с экспрессией генов (Fisher and Merkenschlager, 2002; Felsenfeld and Groudin, 2003; Misteli, 2004).

Имеет место организация в более крупные петлевидные хроматиновые домены (300–700 нм), возможно путем заякоривания хроматиновой фибриллы на периферии ядра или на других ядерных скаффолдах (остовах) с помощью таких ассоциированных с хроматином белков, как ядерные ламины Остается неясным, в какой степени эти ассоциации дают начало значимым [meaningful] «хромосомным территориям», но многочисленные сообщения показывают, что эта концепция заслуживает серьезного внимания. Например, наблюдали образование кластеров множественных сайтов активного хроматина с транскрипционными факторами РНК-полимеразы II (RNA pol II); аналогичные концепции, по-видимому, приложимы к образованию кластеров вокруг реплицирующейся ДНК и ДНК-полимеразы. Напротив, образование кластеров «молчащего» гетерохроматина (в особенности перицентромерных фокусов) и генов, локализованных в trans-положении, также было документировано (главы 4 и 21). Каким образом эти ассоциации контролируются и насколько ядерная локализация хроматиновых доменов затрагивает регуляцию генома — еще не ясно. Тем не менее, все большее количество данных показывает наличие корреляций активной или «молчащей» конфигурации хроматина с определенной ядерной территорией (Cremer and Cremer, 2001; Gilbert et al., 2004; Janicki et al., 2004; Chakalova et al., 2005).

Наиболее конденсированная структура ДНК наблюдается на стадии метафазы митоза или мейоза. Это делает возможным надежное расхождение, с помощью хромосом, точных копий нашего генома (одной или двух копий каждой хромосомы, в зависимости от наблюдаемого типа деления) в каждую дочернюю клетку. Эта конденсация связана с серьезным реструктурированием ДНК из состояния двухметровой, полностью растянутой молекулы в состояние дискретных хромосом размером в среднем 1,5 мкм в диаметре (рис. 3.7). Это не меньше, чем 10 000-кратная компактизация и она достигается путем гиперфосфорилирования линкерного (Н1) и корового гистона H3 и зависящего от АТФ действия конденсиновых и когезиновых комплексов и топоизомеразы II. Остается еще определить, как конкретно негистоновые комплексы затрагивают митотический хроматин (или модификации хроматина фазы М) и по каким правилам происходит (зависимым от клеточного цикла образом) их ассоциация с хроматином и высвобождение из него (Bernard et al., 2001; Watanabe et al., 2001). Здесь может оказаться важным хорошо известное митотическое фосфорилирование гистона H3 (т. е. серинов 10 и 28) и членов семейства Н1, но полного понимания того, в чем заключается функция этих митотических меток, предстоит еще достичь в генетических и биохимических экспериментах. Интересно, что была предложена формальная теория, согласно которой специфические метки, обусловленные метилированием, при сочетании с более динамичными и обратимыми метками, обусловленными фосфорилированием, могут действовать в гистоновых белках как «двоичный переключатель», управляя связыванием и высвобождением эффекторов, находящихся «вниз по течению» и затрагивающих хроматиновую матрицу (Fischle et al., 2003а). Используя связывание НР1 с метилированным по лизину 9 гистоном H3 (H3К9ше) и митотическое фосфорилирование серина 10 (H3S10ph), недавно получили данные в поддержку митотического «метил/фос-переключателя» (Daujat et al., 2005; Fischle et al., 2005; Hirota et al., 2005).

Такие специализированные хромосомные домены, как теломеры и центромеры, выполняют другие функции, направленные на динамику хромосом как таковую. Теломеры действуют как хромосомные концы, обеспечивая защиту и уникальное решение проблемы репликации самых кончиков молекул ДНК. Центромеры обеспечивают места прикрепления для микротрубочек веретена во время деления ядра. Оба этих специализированных домена играют фундаментальную роль в событиях, приводящих к надежному расхождению хромосом. Интересно, что и теломерный, и центромерный гетерохроматин отличается от эухроматина и даже других гетерохроматиновых районов (см. ниже) присутствием уникальных хроматиновых структур, которые в основном оказывают репрессивное действие на активность генов и рекомбинацию. Перемещение экспрессируемых генов из их нормального положения в эухроматине в новое положение в центромерном и теломерном гетерохроматине или поблизости от него (главы 4–6) может заставить эти гены «замолчать», создавая возможность описанного ранее скрининга для поиска и идентификации супрессоров или энхансеров эффекта положения мозаичного типа (PEV) или эффектов прителомерного положения (ТРЕ, telomere-position effects; Gottschling et al., 1990; Aparicio et al., 1991). Центромеры и теломеры имеют молекулярные сигнатуры, в том числе, например, гипоацетилированные гистоны. Интересно, что центромеры «маркированы» также присутствием гистонового варианта CENP-A, играющего активную роль в сегрегации хромосом (глава 14). Таким образом, правильная сборка и поддержание различающихся центромерного и перицентромерного гетерохроматина являются критичными для завершения митоза или мейоза и, отсюда, для жизнеспособности клеток. В дополнение к хорошо изученным центромерной и перицентромерной формам конститутивного гетерохроматина успешно исследуются механизмы эпигенетического контроля центромерной (и теломерной) «идентичности». Остроумными экспериментами удалось показать, что вместо нормальных центромер могут функционировать «неоцентромеры», демонстрируя тем самым, что идентичность центромер не диктуется нуклеотидными последовательностями ДНК (главы 13 и

14). Вместо этого данный специализированный хромосомный домен маркируют эпигенетические особенности [hallmarks], в том числе паттерны специфичных для центромер модификаций и варианты гистонов. В вопросе о том, каким образом другие кодирующие, не кодирующие и повторяющиеся участки хроматина вносят свой вклад в эти эпигенетические сигнатуры, достигнут значительный прогресс. Как те или иные из этих механизмов соотносятся (если соотносятся вообще) с паттернами бэндинга хромосом — неизвестно, но остается интригующей возможностью. Необходимо достичь понимания того, как эпигенетически регулируются эти части уникальных хромосомных районов, особенно в свете того, что многочисленные виды рака у человека характеризуются геномной нестабильностью, которая является маркером прогрессии некоторых заболеваний и неоплазии.

6. Различие между эухроматином и гетерохроматином

В этом обзоре эухроматин и гетерохроматин обсуждались раздельно, хотя мы признаем, что существуют множественные формы хроматинов обоих классов. Эухроматин, или «активный» хроматин, состоит в основном из кодирующих последовательностей, составляющих лишь небольшую долю (менее 4 %) генома млекопитающих Какие же молекулярные сигналы маркируют тогда кодирующие последовательности, обладающие потенциалом для продуктивной транскрипции, и каким образом структура хроматина вносит свой вклад в этот процесс? Обширная литература позволяет предполагать, что эухроматин существует в «открытой» (декомпактизированной), более чувствительной к нуклеазам конфигурации, делающей его «готовым» к экспрессии генов, хотя и не обязатаельно транскрипционно активным. Некоторые из этих генов экспрессируются повсеместно (гены «домашнего хозяйства»); другие регулируются ходом развития или индуцируются в ответ на внешние стрессорные факторы. Транскрипцию генов включает совместное действие избранных сА-действующих нуклеотидных последовательностей ДНК (промоторов, энхансеров и участков контроля локусов), связанных с комбинациями trans-действующих факторов, вместе с РНК-полимеразой и ассоциированными факторами (Sims et al., 2004). В совокупности эти факторы подверглись жесткому отбору в ходе эволюции, чтобы инструментовать сложные ряды биохимических реакций, которые должны происходить в «правильной» пространственной и временной последовательности. Обеспечивает ли хроматин «систему индексирования», гарантирующую, что вышеописанная машинерия сможет получить доступ к своим целевым последовательностям в клетках соответствующего типа?

На уровне ДНК соседние с промоторами области, богатые АТ, часто лишены нуклеосом и могут существовать в жесткой, неканонической конфигурации ДНК (В-форма), способствующей размещению транскрипционного фактора (TF) (Mito et al., 2005; Sekinger et al., 2005). Однако размещения TF недостаточно для обеспечения транскрипции. Рекрутирование механизмов [machines] ремоделинга нуклеосом посредством индукции активирующих модификаций гистонов (например, ацетилирование и метилирование H3К4) облегчает взаимодействие с механизмами транскрипции; в настоящее время определяют, каким образом это происходит (рис. 3.9 и глава 10). Замена вытесненных гистонов гистоновыми вариантами, после того как механизм транскрипции распутал и транскрибировал хроматиновую фибриллу, обеспечивает целостность хроматиновой матрицы (Ahmad and Henikoff, 2002). Однако образование полностью созревших иРНК также требует протекания посттранскрипционных процессов, в том числе сплайсинга, полиаденилирования и экспорта из ядра. Таким образом, собирательный термин «эухроматин» скорее всего обозначает сложное состояние (состояния) хроматина, охватывающее динамичную и сложную смесь механизмов [machines], тесно взаимодействующих друг с другом и с хроматиновой фибриллой и предназначенных для осуществления транскрипции функциональных РНК. Выяснение «правил», определяющих, каким образом, в самом общем смысле, эти «активирующие механизмы» [«activating machinery»] взаимодействуют с аппаратом транскрипции, а также с хроматиновой матрицей — волнующая область современных исследований, хотя в силу динамичной природы матрицы эту область, строго говоря, можно относить не к эпигенетике, а, скорее, к исследованиям динамики транскрипции и хроматина.

Что же тогда обозначает термин «гетерохроматин»? Хотя в исторической ретроспективе он изучен хуже, чем эухроматин, новые открытия заставляют считать, что гетерохроматин играет критически важную роль в организации и правильном функционировании геномов, начиная с дрожжей и кончая человеком (хотя у S. cerevisiae особая форма гетерохроматина). Его потенциальное значение подчеркивается тем фактом, что 96 % генома млекопитающих состоит из некодирующих и повторяющихся последовательностей. Новые открытия, касающиеся механизмов формирования гетерохроматина, выявили неожиданные вещи. Например, транскрипция, неспецифичная по отношению к последовательности и дающая двуспиральную РНК (dsRNA), подвержена сайленсингу по механизму, подобному РНК-интерференции (RNAi) (см. раздел 10). Образование таких dsRNAs действует как «сигнал тревоги», отражая тот факт, что соответствующая нуклеотидная последовательность ДНК не может генерировать функциональный продукт или инвазирвана РНК-транспозонами или вирусами. Эта dsRNA подвергается затем процессингу с помощью Dicer и нацеливается на хроматин комплексами, предназначенными для инициации каскада событий, ведущих к формированию гетерохроматина. В результате использования ряда модельных систем был достигнут заметный прогресс в анализе того, что, по-видимому, является высококонсервативным метаболическим путем, ведущим к «запертому» [«locked-down»] состоянию гетерохроматина. Хотя точная последовательность и детали событий могут варьировать, этот общий путь включает деацетилирование гистоновых «хвостов», метилирование специфических остатков лизина (например, H3К9), рекрутирование ассоциированных с гетерохроматином белков (например, НР1) и метилирование ДНК (рис. 3.9). Вполне вероятно, что секвестрирование отдельных участков генома в репрессивных ядерных доменах или территориях может усилить формирование гетерохроматина. Интересно, что все большее количество данных позволяет предполагать, что гетерохроматин может быть «состоянием по умолчанию», по крайней мере у высших организмов, и что присутствие сильного промотора или энхансера, продуцирующего эффективный транскрипт, может «пересилить» гетерохроматин Общие концепции сборки гетерохроматина приложимы, по-видимому, даже к низшим эукариотам. В число основных особенностей входят гипоацетилированные «хвосты» гистонов, что сопровождается связыванием чувствительных к ацетилированию белков гетерохроматина (например, белки SIR; детали см. в главе 4). В зависимости от вида грибов (например, почкующиеся vs. дробянковые дрожжи) наблюдаются различные объемы метилирования гистонов и HP 1-подобных белков. Даже при том, что эти геномы в большей степени настроены на общее, «по умолчанию», состояние готовности к транскрипции, имеются некоторые гетерохроматин-подобные районы генома (локусы спаривания, теломеры, центромеры и т. д.), которые способны супрессировать транскрипцию генов и генетическую рекомбинацию, когда тестируемые гены оказываются в этом новом соседстве.

Какие полезные функции мог бы обслуживать гетерохроматин? Определение центромер, участка конститутивного гетерохроматина, хорошо коррелирует с неким наследуемым эпигенетическим состоянием и, как полагают, эволюционно направляется самым крупным объединением в кластеры повторов и повторяющихся элементов на хромосоме. Это разбиение [partitioning] обеспечивает крупные и относительно стабильные гетерохроматиновые домены, маркированные репрессивными «эпигенетическими сигнатурами», облегчающими сегрегацию хромосом в митозе и мейозе (глава 14). Здесь стоит заметить, что центромерные повторы и соответствующие эпигенетические метки, ассоциирующиеся с ними, дуплицировались и переместились на другие хромосомные плечи для создания «молчащих доменов» у таких организмов, как дробянковые дрожжи. Конститутивный гетерохроматин в теломерах (защитных концах хромосом) аналогичным образом обеспечивает стабильность генома, выступая в роли хромосомных «кэпов». Наконец, известно, что формирование гетерохроматина является механизмом защиты от инвазивной ДНК В совокупности эти открытия подчеркивают тот общий взгляд, что гетерохроматин обслуживает важные функции по поддержанию генома, которые могут соперничать даже с функциями самого эухроматина.

Подводя итог, можно сказать, что широкие функциональные различия между эухроматином и гетерохроматином в настоящее время можно приписать трем известным характеристикам хроматина. Во-первых, это природа нуклеотидной последовательности ДНК — например, содержит ли она обогащенную АТ «жесткую» ДНК поблизости от промоторов, повторяющиеся последовательности и (или) последовательности, связывающие репрессоры, которые сигнализируют об ассоциации фактора. Во-вторых, качество РНК, продуцируемой в ходе транскрипции, определяет, будет ли она полностью подвергнута процессингу в иРНК, которая может быть транслирована, или же эта РНК будет деградирована или помечена для использования механизмом RNAi в целях гетерохроматинизации. В-третьих, пространственная организация в ядре может играть существенную секвестрирующую роль в поддержании локальных конфигураций хроматина.

^{Рис. 3.9. Различие между эухроматиновыми и гетерохроматиновыми доменами}

^{Рисунок, суммирующий различия между эухроматином и конститутивным гетерохроматином. В их числе — различия в типе продуцируемых транскриптов, в рекрутировании связывающихся с ДНК белков (т. е. транскрипционного фактора [TF]), в ассоциированных с хроматином белках и комплексах, в ковалентных модификациях гистонов и в составе вариантных гистонов}

7. Модификации гистонов и гистоновый код

Мы рассмотрели, каким образом модификации гистонов могут изменять хроматиновую матрицу посредством cis-эффектов, изменяющих межнуклеосомные контакты и промежуточные расстояния, или же trans-эффектов, вызываемых ассоциациями гистоновых и негистоновых белков с матрицей. Каков же вклад и биологический результат модификаций гистонов? Типы структуры хроматина, коррелирующие с модификациями гистоновых «хвостов», выявились в результате исследований, в которых использовалась основная масса гистонов и которые позволили предположить, что эпигенетические метки могут обеспечить сигнатуры «ВКЛЮЧЕНО» (т. е. активно) или «ВЫКЛЮЧЕНО» (т. е. неактивно). Это выяснилось в результате длительных исследований большей частью коррелятивного характера, которые показали, что определенные модификации гистонов, в особенности их ацетилирование, связаны с доменами активного хроматина или с участками, в целом пермиссивными для транскрипции В противоположность этому другие метки, такие как некоторые фосфорилированные остатки гистонов, давно ассоциировались с конденсированным хроматином, который, в целом, не поддерживает транскрипционную активность. Модификации гистонов, приведенные в Приложении 2, суммируют известные в настоящее время сайты модификаций. Здесь мы подчеркиваем, что приведенный материал отражает модификации и сайты, которые не обязательно характерны для любого организма.

Прежде всего, обсудим, каким образом производятся или удаляются модификации гистонов. Большая работа, проведенная в области исследования хроматина, позволила предположить, что модификации «хвостов» гистонов образуются («записываются») или удаляются («стираются») в результате каталитического действия ассоциированных с хроматином ферментативных систем. Однако исследователям годами не удавалось идентифицировать эти ферменты. За последнее десятилетие было идентифицировано очень большое число модифицирующих хроматин энзимов из различных источников; большая часть этих данных собрана в Приложении 2. Этот успех был достигнут в результате многочисленных биохимических и генетических исследований. Эти ферменты часто входят в состав крупных, состоящих из многих субъединиц комплексов, которые могут катализировать включение или удаление ковалентных модификаций как в гистоновых, так и в негистоновых мишенях. Более того, многие из этих энзимов катализируют свои реакции с замечательной специфичностью по отношению к остатку-мишени и к клеточному контексту (т. е. в зависимости от внешних или внутренних сигналов). Для ясности, а также в качестве примера, мы кратко обсудим четыре главные ферментативные системы, которые катализируют модификации гистонов, вместе с ферментативными системами противоположного действия, обеспечивающими реверсию этих модификаций (рис. 3.10) (Vaquero et al., 2003; Holbert and Marmorstein, 2005). В совокупности эти антагонистические активности управляют устойчивым балансом каждой рассматриваемой модификации.

Ацетилазы гистонов (HATs) ацетилируют остатки специфических лизинов в гистоновых субстратах (Roth et al., 2001); реверсия обеспечивается действием деацетилаз гистонов (HDACs) (Grozinger and Schreiber, 2002). Ферменты семейства гистоновых киназ фосфорилируют остатки специфических серинов или треонинов. а фосфатазы (РРТазы) удаляют метки, созданные фосфорилированием. Особенно хорошо известны митотические киназы, такие как циклин-зависимая киназа или киназа «aurora», катализирующая фосфорилирование корового (H3) и линкерного (Н1) гистонов. Менее очевидны в каждом из этих случаев противостоящие РРТазы, действие которых ревертирует результат этого фосфорилирования, когда клетки выходят из митоза.

Были описаны два общих класса метилирующих ферментов: PRMTs (protein arginine methyltransferases — метилтрансферазы аргининов белка), субстратом которых является аргинин (Lee et al., 2005), и HKMTs (histone lysine methyltransferases — метилтрансферазы лизинов гистонов), действующие на остатки лизина (Lachner et al., 2003). Метилирование аргининов косвенным образом ревертируется действием дезиминаз, которые конвертируют метиларгинин (или аргинин) в остаток цитруллина (Bannister and Kouzarides, 2005). Метилированные остатки лизина оказываются химически более стабильными. Было показано, что метилированный лизин существует в моно-, ди- и триметилированном состояниях. Несколько триметилированных остатков на аминоконцах H3 и Н4, по-видимому, обладают возможностью стабильно воспроизводиться в ходе клеточных делений (Lachner et al., 2004), как и метка H4K20mel в имагинальных дисках Drosophila (Reinberg et al., 2004). Недавно была описана лизин-специфичная «деметилаза» (LSD1) как аминооксидаза, способная удалять метилирование H3К4 (Shi et al., 2004). Этот энзим действует путем FSD-зависимой окислительной дестабилизации аминометильной связи, что приводит к образованию немодифипированного лизина и формальдегида. Было показано, что LSD1 действует избирательно в отношении активирующей H3К4 метки, созданной метилированием, и может дестабилизировать только моно- и ди-, но не триметилирование. Эта деметилаза является частью большого репрессивного белкового комплекса, который содержит также HDACs и другие энзимы Другие данные позволяют предполагать, что LSD1 может соединяться в комплекс вместе с рецептором андрогена в локусах-мишенях и деметилирует репрессивную гистоновую метку H3K9me2, внося вклад в транскрипционную активацию (Metzger et al., 2005). Другой класс гистоновых деметилаз, согласно данной ему храктеристике. работает с помощью более мощного механизма, механизма радикальной атаки, известного как гидроксилазы или диоксигеназы (Tsukada et al., 2006). Одна из них дестабилизирует только H3K36me2 (активная метка), но не триметилированное состояние. Эта новая гистоновая деметилаза jumonji (JHDM1) содержит консервативный домен jumonji, которых в геноме млекопитающих известно около 30; это позволяет предполагать, что некоторые из этих энзимов, может быть, могут атаковать и другие остатки, так же как триметильное состояние (Fodor et al., 2006; Whetstine et al., 2006).

Значительный прогресс был достигнут в анализе систем ферментов, управляющих устойчивым балансом этих модификаций, и мы подозреваем, что в этой увлекательной области будут достигнуты гораздо большие успехи. Остается понять, как регулируются эти ферментативные комплексы и как становятся мишенями их физиологически релевантные субстраты и сайты. Кроме того остается неясным, как ковалентные механизмы влияют на эпигенетические явления.

^{Рис. 3.10. энзимы, модифицирующие гистоны}

^{Ковалентные модификации гистонов трансдуцируются ферментами, модифицирующими гистоны («писателями»), и удаляются активностями противоположного действия. Они делятся на классы в соответствии с типом ферментативного действия (например. ацетилирование или фосфорилирование). Белковые домены со специфическим сродством к модификации гистонового «хвоста» называются «читателями» (HAT) ацетилтрансфераза гистона; (PRMT) протеин-аргинин-метилтрансфераза; (HKMT) метилтрансфераза лизина гистонов; (HDAC) деацетилаза гистонов; (РРТаза) протеинфосфатазы; (Ас) ацетилирование; (Р) фосфорилирование; (Ме) метилирование}

Модификации гистонов происходят не изолированно, а на основе комбинирования, как это предполагается — для модификационных кассет (т. е. ковалентных модификаций в соседних остатках определенного гистонового «хвоста», например H3К9те и H3S10ph или H4Slph, H4R3me и H4K4ас) и trans-гистоновых путей (ковалентных модификаций между разными «хвостами» гистонов или нуклеосомами; рис. 3.11). Интригует тот факт что почти все известные модификации гистонов коррелируют с активирующей или репрессивной функциями, в зависимости от того, какой аминокислотный остаток (остатки) в аминоконце гистона модифицирован Описаны как синергистические, так и антагонистические пути (Zhang and Reinberg, 2001; Berger, 2002; Fischle et al., 2003b), которые могут постепенно индуцировать комбинации активных меток, одновременно противодействуя репрессивным модификациям. Неизвестно, однако, сколько разных комбинаций модификаций по различным аминотерминальным позициям гистонов существует для любой данной нуклеосомы, потому что большинство исследований было выполнено на препаратах суммарных гистонов. Недавно было показано, что на структуру и сборку хроматина влияют, кроме аминоконцов, модификации в глобулярных доменах гистонов (Cosgrove et al., 2004), регулируя тем самым экспрессию генов и репарацию повреждений ДНК (van Attikum and Gasser, 2005; Vidanes et al., 2005). Стоит также упомянуть, что несколько модифицирующих гистоны энзимов избирают своей мишенью и негистоновые субстраты (Sterner and Berger, 2000; Chuikov et al., 2004). Рисунок 11 иллюстрирует два примера установленных иерархий гистоновых модификаций, которые, по-видимому, индексируют транскрипцию активного хроматина или, напротив, определяют рисунок гетерохроматиновых доменов.

Эти исследования ставят вопрос о том, существует ли «гистоновый код» или даже «эпигенетический код». Хотя эта теоретическая концепция оказалась весьма стимулирующей, и было показано, что в некоторых своих предсказаниях она правильна, вопрос 6 том, действительно ли существует некий код, остается в значительной степени открытым. Для сравнения скажем, что генетический код оказался крайне полезным ввиду возможности делать предсказания на его основе и благодаря его почти полной универсальности Он использует в основном «алфавит» из четырех оснований в ДНК (т. е. нуклеотидов), образуя в целом инвариантный и почти универсальный язык. В противоположность этому современные данные заставляют считать, что картины гистоновых модификаций значительно варьируют от организма к организму, особенно между низшими и высшими эукариотами, например дрожжами и человеком. Таким образом, даже если гистоновый код и существует, он, вероятно, не универсален. Эта ситуация становится еще более сложной, когда учитывается динамическая природа гистоновых модификаций, варьирующих в пространстве и во времени. Более того, хроматиновая матрица вовлекает в процесс ошеломляющее количество факторов ремоделинга (Vignali et al., 2000; Narlikar et al., 2002; Langst and Becker, 2004; Smith and Peterson, 2005). Однако анализ с использованием иммунопреципитации хроматина (ChIP) в масштабах целого генома (ChIP on chip) начал выявлять неслучайные и в какой-то мере предсказуемые паттерны в нескольких геномах (например, S. pombe, A. thaliana, клетки млекопитающих) — такие как сильные корреляции H3К4me3 с активированными участками промотора (Strahl et al. 1999; Santos-Rosa et al., 2002; Bernstein et al., 2005), a также метилирования H3K9 (Hall et al. 2002; Lippman et al., 2004; Martens et al., 2005) и H3K27 (Litt et al., 2001; Ringrose et al., 2004) с «молчащим» гетерохроматином. Возможно, ограничением гистонового кода является то обстоятельство, что одна модификация не транслируется неизменно в один биологический выходной сигнал. Однако действуя в комбинации или кумулятивным образом, модификации, по-видимому, действительно определяют биологические функции и вносят свой вклад в них (Henikoff, 2005).

^{Рис. 3.11. Координированная модификация хроматина}

^{Переход не подвергавшейся воздействию хроматиновой матрицы в активный эухроматин (слева) или образование репрессивного гетерохроматина (справа), включающие ряд скоординированных модификаций хроматина. В случае активации транскрипции это сопровождается действием комплексов ремоделинга нуклеосом и замещением коровых гистонов гистоновыми вариантами (желтый цвет, а именно H3.3)}

8. Комплексы, осуществляющие ремоделинг хроматина, и варианты гистонов

Другим важным механизмом, посредством которого индуцируются переходы в хроматиновой матрице, является выработка сигналов [signaling] для рекрутирования комплексов «ремоделинга» хроматина, использующих энергию (гидролиз АТФ) для изменения хроматина и состава нуклеосом нековалентным образом. Нуклеосомы, особенно когда они связаны репрессивными факторами, ассоциированными с хроматином, нередко «навязывают» транскрипционной машине состояние значительного подавления. Отсюда лишь некоторые транскрипционные факторы и регуляторы, специфичные к определенным последовательностям (хотя и не базовая транскрипционная машина), способны получать доступ к сайту (сайтам) своего связывания. Эта проблема доступа решается, хотя бы отчасти, белковыми комплексами, которые мобилизуют нуклеосомы и (или) изменяют нуклеосомную структуру. Ремоделинг хроматина часто функционирует совместно с ферментами, активирующими модификации хроматина, и связанные с ним активности в целом можно разделить на два семейства: семейство SNF2H, или ISWI, и семейство Brahma, или SWI/SNF. Семейство SNF2H/ ISWI мобилизует нуклеосомы вдоль ДНК (Tsukiyama et al., 1995: Varga-Weisz et al., 1997), тогда как Brahma/SWI/ SNF на время изменяет структуру нуклеосомы, экспонируя контакты ДНК: гистон с использованием механизмов, которые только сейчас начинают раскрываться (глава 12).

Кроме того, некоторые из гидролизующих АТФ активностей схожи с «обменными комплексами», которые сами предназначены для замещения обычных коровых гистонов специализированными «вариантными» гистоновыми белками. Эта осуществляемая с затратами АТФ перетасовка в действительности может быть средством замещения существующих модифицированных гистоновых «хвостов» новым, свободным от старого, набором вариантных гистонов (Schwartz and Ahmad, 2005). Альтернативная возможность заключается в том, что рекрутирование таких комплексов ремоделинга хроматина, как SAGA (Spt-Ada-Gcn5-aцeтилтpaнcфepaзa), может быть также усилено пред существующими модификациями гистонов, чтобы обеспечить транскрипционную компетентность промоторов-мишеней (Grant et al., 1997; Hassan et al., 2002).

В дополнение к инициации транскрипции и установлению первичного контакта с промоторным районом прохождению РНК-полимеразы II (или РНК-полимеразы 1) во время происходящей в ходе транскрипции элонгации препятствует, сверх того, присутствие нуклеосом Поэтому требуются механизмы для обеспечения завершения образующихся транскриптов (особенно с длинных генов). В частности, ряд гистоновых модификаций и докинг-эффекторов действуют совместно с такими комплексами ремоделинга хроматина, как SAGA и FACT (для облегчения транскрипции хроматина) (Orphanides et al., 1998), обеспечивая прохождение РНК-полимеразы II через нуклеосомные порядки. Эта совместная активность обычно индуцирует, например, увеличенную мобильность нуклеосом, смещает димеры Н2А/Н2В и стимулирует обмен коровых гистонов на гистоновые варианты. Как таковая, она дает прекрасный пример тесного взаимодействия между модификациями гистонов, ремоделингом хроматина и обменом на гистоновые варианты для облегчения инициации транскрипции и последующей элонгации (Sims et al., 2004). Были охарактеризованы и другие комплексы ремоделинга, такие как Mi-2 (Zhang et al., 1998; Wade et al., 1999) и INO-80 (Shen et al., 2000), участвующие в стабилизации репрессированного, а не активного хроматина.

Композиционные различия хроматиновой фибриллы, которые возникают благодаря присутствию гистоновых вариантов, вносят вклад в индексирование участков хромосом для специальных функций Каждый гистоновый вариант представляет собой замену для конкретного корового гистона (рис. 3.12), хотя гистоновые варианты часто составляют малую долю от всей массы гистонов, в силу чего их труднее исследовать, чем регулярные гистоны. Возрастающий объем литературы (обзор см.: Henikoff and Ahmad, 2005; Sarma and Reinberg, 2005) свидетельствует, что гистоновые варианты обладают своей собственной характеристикой восприимчивости к модификациям, вероятно определяемой небольшим числом аминокислотных замен, отличающих их от членов их семейства. С другой стороны, некоторые варианты гистонов имеют отличающиеся амино- и карбокситерминальные домены с уникальной, в отношении регуляции хроматина, активностью и различным сродством к связывающимся факторам. В качестве примера можно привести транскрипционно активные гены, у которых гистон H3 заменен вариантом H3.3, в связанном с транскрипцией механизме, который не требует репликации ДНК (Ahmad and Henikoff, 2002). Замещение корового гистона Н2А вариантом H2A.Z коррелирует с транскрипционной активностью и может индексировать 5 — конец свободных от нуклеосом промоторов. Однако H2A.Z был ассоциирован также и с репрессированным хроматином. CENP-A, специфичный для центромеры вариант гистона H3, существен для центромерной функции и, отсюда, для сегрегации хромосом. Н2А.Х, вместе с другими гистоновыми метками, ассоциируется с выявлением повреждений ДНК и, по-видимому, индексирует повреждение в ДНК для рекрутирования комплексов репарации повреждений ДНК. МакроН2А — вариант гистона, специфически ассоциирующийся с неактивной Х-хромосомой (Xi) у млекопитающих (дальнейшие детали по вариантам гистонов см. в главе 13).

^{Рис. 3.12. Варианты гистонов}

^{Доменная структура белка для коровых гистонов (H3, Н4, Н2А, Н2В), линкерного гистона Н1 и вариантов гистонов H3 и Н2А. Показаны свернутый домен гистона (HFD — histone fold domain), где происходит димеризация гистона, и участки белка, отличающиеся у гистоновых вариантов (показаны красным цветом)}

Важно отметить (и это противоречит обычно встречающемуся в учебниках утверждению, что гистоны синтезируются и занимают свое место только во время S-фазы), что синтез и замещение многих из этих гистоновых вариантов происходят независимо от репликации ДНК. Следовательно, замещение коровых гистонов гистоновыми вариантами не ограничено стадиями клеточного цикла (т. е. S-фазой), но может немедленно вступать в силу в ответ на действующие в данный момент механизмы (например, транскрипционную активность или напряжение кинетохора во время клеточного деления) или стрессовые сигналы (например, повреждение ДНК или голодание). Элегантные биохимические исследования позволили документировать ремоделинг хроматина или обменные комплексы, специфичные для замещения отдельных гистоновых вариантов, таких как H3.3, H2A.Z или Н2А.Х (Cairns, 2005; Henikoff and Ahmad, 2005; Sarnia and Reinberg, 2005). Например, замещение H3 вариантом H3.3 опосредуется действием обменного комплекса HIRA (регулятор гистона A) (Tagani et al., 2004), а Н2А замещается H2A.Z благодаря активности обменного комплекса SWR1 (связанная с Swi2/ Snf2 АТФаза I) (Mizuguchi et al., 2004). В совокупности эти замещения позволяют вариантным нуклеосомам строить особенно активный хроматин. Для некоторых других гистоновых вариантов механизм «нацеливания» и обмена еще остается определить; они осуществляются либо через зависимый от АТФ комплекс обмена гистонов, либо через шаперонный белок гистонов Сейчас даже постулировали, что обменные комплексы могут существовать для замещения модифицированных гистонов их модифицированными партнерами как механизм для стирания более прочных эпигенетических меток, размещенных в аминоконцах гистонов.

Метилирование ДНК — эпигенетический механизм, о котором раньше других стало известно, что он коррелирует с репрессией генов (Razin and Riggs, 1980). В той

9. Метилирование ДНК

или иной степени оно имеет место у всех эукариот за исключением дрожжей. Эта модификация заключается в добавлении метальной группы к цитозиновым остаткам матрицы ДНК. У млекопитающих она происходит по динуклеотидам, тогда как у N. crassa и растений известны другие паттерны метилирования, симметричные, асимметричные и не по CpG. Распределение метилированной ДНК по геному показывает ее повышенное содержание в некодирующих районах (например, центромерном гетерохроматине) и в рассеянных (interspersed) повторяющихся элементах (транспозонах), но не в островках CpG активных генов (Bird, 1986). Действительно, повышенные уровни метилирования ДНК коррелируют с относительным увеличением содержания некодирующей и повторяющейся ДНК в геномах высших эукариот (рис. 3.15 в разделе 11). Экспериментальные данные показывают, что это происходит потому, что метилирование ДНК служит главным образом как защитный механизм, чтобы подавлять значительную часть генома чужеродного происхождения (т. е. реплицированные перемещающиеся элементы, вирусные последовательности и другие повторяющиеся последовательности).

ДНК-метилтрансферазы (DNMTs) являются «эффекторами» метилирования ДНК и катализируют либо метилирование de novo (т. е. в новых сайтах), либо поддерживающее метилирование полуметилированной ДНК после репликации ДНК (глава 18). Утрата способности поддерживать метилирование ДНК может приводить к некоторым заболеваниям, таким как ICF (Immunodeficiency, Centromeric instability, and Facial abnormalities — иммунодефицит, центромерная нестабильность и лицевые аномалии) (главы 18 и 23) Дерегуляция в уровнях метилирования ДНК вносит вклад и в прогрессию рака (глава 24).

Что представляют собой сигналы, направляющие DNMTs для метилирования определенных участков ДНК? В настоящее время известно, что для того, чтобы «направить» метилирование ДНК de novo, высокоповторяющиеся тандемные последовательности в геноме (например, перицентромерный хроматин) «опираются» на репрессивные метки метилирования по H3К9, как это показано у N. crassa и растений (главы 6 и 9). Рассеянные (interspersed) повторы также могут сигнализировать о метилировании ДНК de novo, как это описано в контексте RIP у N. crassa (Tamaru and Selker, 2001) и сайленсинга ретротранспозонов в зародышевом пути у самцов млекопитающих. Отвечающий за это белок идентифицирован (Dnmt3L) и мог бы функционировать путем сканирования генома для отыскания высоких уровней границ «гомология — гетерология», служащих сигналом о необходимости метилирования ДНК (Bourc’his and Bestor, 2004). У растений сигнал для метилирования ДНК de novo обеспечивают РНК посредством уникального механизма, названного РНК-зависимым метилированием ДНК (RdDM; глава 9). Имеются данные о том, что для глобальных паттернов метилирования ДНК почему-то необходимы комплексы, осуществляющие ремоделинг хроматина и относящиеся к семейству SWI/SNF, как это показано на растениях (Jeddeloh et al., 1999) для белка DDM1 и на млекопитающих с помощью гомолога Lshl (Yan et al. 2003). Наконец, белок EZH2 (относящийся к HKMT-PcG) тоже может участвовать в «направлении» метилирования ДНК в некоторых промоторах у млекопитающих (Vire et al., 2005).

Способ, посредством которого установившееся метилирование ДНК может обусловливать сайленсинг хроматина, выяснен еще не полностью, хотя данные указывают на trans-регуляцию. Белки, связывающиеся с метилированными цитозинами и названные доменными белками, связывающимися с метил-CpG (MBD), могут рассматриваться как основанный на метилировании ДНК эквивалент элементов связывания [binders] (или «считывателей») модифицированных гистоновых мотивов (рис. 3.13). Например, белок, связывающийся с метил цитозином (МеСР2), связывается с метилированными CpG и рекрутирует HDACs, служа связующим звеном для репрессивных гистоновых меток (глава 18) Известно также, что метилирование ДНК нарушает сайты распознавания регуляторов транскрипции (например, СЕСА), участвующих в геномном импринтинге (глава 19).

Наличие метилированной ДНК в импринтированных локусах, обусловливающей сайленсинг либо материнской, либо отцовской аллели у растений и плацентарных млекопитающих, позволяет предположить, что в ходе эволюции эти организмы уникальным образом приспособили этот эпигенетический механизм для стабилизации репрессии генов. Интересно отметить, что у сумчатых метилирования ДНК в импринтированных локусах нет, что указывает на то, что вовлечение этого механизма в импринтинг у млекопитающих является относительно недавним эволюционным событием (главы 17 и 19). Напротив, у таких двукрылых насекомых, как Drosophila, метилирование ДНК как функциональный эпигенетический механизм в основном утрачено (Lyko, 2001).

Высокоповторяющиеся участки генома млекопитающих, обычно метилированные, становятся все более мутагенными, когда они не метилированы, — до такой степени, что вызывают глобальную геномную нестабильность (Chen et al., 1998). В результате возникают хромосомные аномалии, являющиеся главной причиной многих болезней и прогрессии рака (см. раздел 15). Это подчеркивает решающую роль метилирования ДНК в обеспечении целостности генома. С другой стороны, отдельные метилированные остатки цитозинов весьма предрасположены к спонтанному мутированию. Таким образом, со временем в результате реакции дезаминирования возникают транзиции С-Т (рис. 3.13), но полагают, что эта характеристика благоприятна для защиты хозяйского генома, потому что она постоянно дезактивирует такие паразитические нуклеотидные последовательности ДНК, как транспозоны. В ином контексте эта же самая химическая реакция активно катализируется дезаминазой, индуцируемой активацией, или AID (activation-induced deaminase). Экспрессия этого энзима в В- и Т-клетках вызывает «соматические гипермутации» в иммуноглобулиновом локусе (lg). Это важный механизм расширения репертуара рецепторов антигенов и, отсюда, усиления иммунитета у млекопитающих (Petersen-Mahrt, 2005; Глава 21). Экспрессия AID, наблюдаемая в раннем развитии млекопитающих, привела к предположению, что она может обеспечивать альтернативный путь к деметилированию ДНК, хотя это происходило бы на фоне риска повышенной частоты точечных мутаций.

^{Рис. 3.13. Метилирование и дезаминирование ДНК}

^{Метилированные (Ме) цитозиновые нуклеотиды могут быть связаны с метилДНК-связывающимися белками (MBD) Несвязанный 5-метилцитозин склонен спонтанно мутировать в результате дезаминирования (реакция, изображенная в нижней части рисунка); в результате в нуклеотидной последовательности ДНК происходит траH3иция 5-метил-СрС в ТрА}

Метилирование ДНК и метилирование гистонов являются известными механизмами эпигенетической регуляции генома Некодирующие РНК, как описано в следующем разделе, являются важными первичными триггерами для индукции «молчащего» хроматина. Известно также, что молекулы РНК могут быть интенсивно метилированы по сахарному или нуклеозидному скелету. Более того, показано, что метилирование малых некодирующих РНК на З’-конце стабилизирует эти молекулы (Yu et al., 2005). Любопытно, что Dnmt2 недавно была идентифицирована как метилтрансфераза тРНК (Goll et al., 2006). Поэтому похоже, что РНК-метилтрансферазы, подобные DNMTs и HKMTs, могут существовать как «считыватели» эпигенетической информации, хотя прямых данных, подтверждающих это, нет. Однако метилирование РНК, по-видимому, «чувствуется» определенными Toll-подобными рецепторами (трансмембранными рецепторами, которые распознают молекулярные мотивы обычных патогенов), чтобы опосредовать врожденный иммунитет (Ishii and Akira, 2005), что говорит в пользу такой гипотезы. Возникает интересная возможность, что метилирование РНК может все же быть эпигенетической модуляцией на основе третьей формы метилирования.

10. РНКи и сайленсинг генов, направляемый РНК

Сведения о том, что конститутивный гетерохроматин в центромерах и теломерах играет инструктивную роль в обеспечении целостности генома, способствовали сдвигу парадигмы во взглядах на повторяющуюся некодирующую «мусорную» ДНК. Возможно ли, что эти повторяющиеся последовательности служат каким-то «незряшным» целям, которые еще только начинают проясняться? Не может ли даже быть так, что эти нуклеотидные последовательности ДНК не являются полностью «молчащими»?

Такая возможность вытекает из фундаментальной серии открытий, связывающих РНКи с образованием «молчащего» хроматина (гетерохроматина). РНКи является защитным механизмом организма-хозяина, который разбивает dsRNA на мелкие молекулы РНК (известные как короткие интерферирующие РНК или siRNA). Этот процесс в конечном счете приводит к деградации РНК или к использованию этих малых РНК для подавления трансляции, известного как посттранскрипционный сайленсинг (PTGS). Открытый позже механизм транскрипционного сайленсинга генов (TGS), ведущего к образованию гетерохроматина, был обнаружен в результате конвергенции независимых линий исследования хроматина и механизма РНК-интерференции. С одной стороны, многое известно о репрессивном метилировании ДНК (у грибов, растений и млекопитающих), модификациях хроматина (например, H3К9me3) и ассоциированных с хроматином факторах (НР1), характерных для доменов гетерохроматина. С другой стороны, исследователи преуспели в идентификации факторов механизма РНКи (например, Dicer, Argonaute, РНК-зависимой РНК-полимеразы, или RdRP). Наиболее убедительный прогресс, связавший вместе эти вроде бы разные области, был достигнут в элегантных исследованиях на S. pombe, в которых мутации любого компонента механизма РНКи приводили к дефектам в расхождении хромосом (Hall et al., 2002; Reinhart and Bartel, 2002; Volpe et al., 2002). Это было вызвано неспособностью стабилизировать центромерный гетерохроматин и подчеркивало, по-видимому, широко распространенную роль механизмов, опосредованных РНКи, в образовании доменов «молчащего» гетерохроматина. Это также высветило значение гетерохроматина помимо транскрипционного сайленсинга генов — его роль в поддержании целостности генома и, отсюда, жизнеспособности, как показывает необходимость центромерного гетерохроматина для процесса расхождения хромосом. Появляющиеся данные позволяют также предполагать, что siRNAs требуются для определения других специализированных районов функционального гетерохроматина, таких как теломеры.

Транскрипция с обеих нитей ДНК прицентромерных районов у S. pombe и выявление прошедших процессинг дериватов siRNAs явились сильным доказательством того, что дериват dsRNA был важнейшим субстратом для «нацеливания» комплекса RITS на центромеры для сайленсинга (рис. 3.14) (Verdel et al., 2004). Более того, мутанты clr4 (имеющийся у S. pombe ортолог Suv39h HKMT млекопитающих) были не способны процессировать dsRNA до siRNAs, усиливая тем самым доводы в пользу взаимосвязи между механизмом РНКи и сборкой гетерохроматина (Motamedi et al., 2004). Каким именно образом siRNAs, генерируемые механизмом RNAi (т. е. Dicer, Argonaute, RdRP), инициируют сборку гетерохроматина или направляют ее на соответствующие локусы в геноме, все еще неизвестно Была предложена модель, в которой сложное взаимодействие между входящим в состав механизма RNAi комплексом RITS и центромерными повторами ведет к самоусиливающемуся циклу формирования гетерохроматина, включающему Clr4, HDACs, Swi6 (ортолог НР1 млекопитающих) и когезин, вероятно через направляемый Ago отжиг гибридов РНК: РНК до образующегося транскрипта (рис. 3.14) (главы 6 и 8).

У Tetrahymena аналогичный механизм «нацеливания», опосредованного РНК, направляет уникальный процесс элиминации ДНК в соматическом ядре. В этом случае на соответствующей стадии полового процесса происходит, с обеих нитей, транскрипция внутреннего элиминируемого сегмента (IES — internal eliminated segment) в «молчащем» геноме зародышевого пути (микронуклеарном геноме) (Chalker and Yao, 2001; Mochizuki et al., 2002). Аналогично модели TGS, зависимого от RNAi, была предложена модель сканирующей РНК (scnRNA) для объяснения того, как нуклеотидные последовательности ДНК в родительском макронуклеусе могут эпигенетически контролировать геномные изменения в новом макронуклеусе с участием малых РНК (детали см. в главе 7). Эти волнующие результаты впервые демонстрируют RNAi-подобный процесс, непосредственно изменяющий соматический геном. Возникает любопытная возможность, что межгенные РНК, продуцируемые в локусе V-DJ (Bolland et al., 2004), потенциально могут направлять элиминацию нуклеотидной последовательности ДНК в ходе V-DJ-рекомбинации локуса тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) в В-клетках и локусов Т-клеточного рецептора (TCR) в Т-клетках.

^{Рис. 3.14. Направляемое РНК формирование гетерохроматина}

^{Комплементарные транскрипты dsRNA, получающиеся путем транскрипции обеих нитей ДНК или складывания на себя транскриптов с инвертированных повторов, приводят к образованию siRNAs благодаря действию Dicer (верхняя часть рисунка). Включение этих siRNAs в комплекс RITS посредством связывания с белком Argonaute (Ago) активирует этот комплекс к «нацеливанию» его на комплементарную ДНК или вновь образующуюся РНК. Этот комплекс привлекает Clr4. который трансдуцирует гистон H3K9me2. Специфичный для этой модификации «связыватель», Swi6, связывается с этими модифицированными гистонами, облегчая распространение репрессивного хроматинового домена. Действие RdRP амплифицирует уровни содержания siRNAs, используя существующие siRNAs в качестве праймеров и усиливая тем самым способность комплекса RITS «нацеливаться» на специфические участки ДНК}

У растений имеется ряд ортологов для многих компонентов RNAi, обусловливающих разнообразие путей РНК-сайленсинга, которые могут действовать с большей специфичностью по отношению к конкретным нуклеотидным последовательностям ДНК, хотя имеет место некоторая избыточность между факторами. Исследования TGS, опосредованного RNAi, выявили новый класс РНК-полимераз — РНК-полимеразу IV (или RNA pol IV), — которые могут транскрибировать ДНК исключительно в гетерохроматиновых районах (Herr et al., 2005; Pontier et al., 2005). Опять-таки только для растений характерно, что пути RNAi непосредственно влияют на метилирование ДНК (Chan et al., 2004) (детальные объяснения в главе 9).

RNAi-подобные хроматиновые эффекты были также обнаружены у Drosophila и млекопитающих. Например, обработка пермеабилизированных клеток млекопитающих РНКазой А быстро удаляет гетерохроматиновые метки H3К9me3, что позволяет предполагать, что часть молекул РНК могут быть структурным компонентом околоцентромерного гетерохроматина (Maison et al., 2002). У позвоночных удаление факторов, процессирующих siRNA, нарушает метилирование H3К9 и связывание НР1 в перицентромерном гетерохроматине (Fukugawa et al., 2004). Любопытно, что у мутантов, лишенных Dicer, эмбриональные стволовые (ES) клетки все еще пролиферируют, но не могут дифференцироваться (Kanellopoulou et al., 2005), что заставляет предположить существование сегодня еще непонятной связи между механизмом RNAi и развитием млекопитающих. У Drosophila сайленсинг тандемных наборов гена mini-white, подверженных PEV, также оказывается зависимым от механизма RNAi (Pal-Bhadra et al., 2004).

В совокупности эти исследования указывают на ключевую и, вероятно, первичную роль некодирующих РНК в переключении эпигенетических переходов и наследственно поддерживаемых специфических состояний хроматина хроматиновой матрицы. В самом деле, эти некодирующие РНК дали ответ на вопрос о том, как различные повторяющиеся последовательности у разных организмов достигают состояния гетерохроматинизации посредством механизма, «нацеливаемого» с помощью РНК. Стремясь идентифицировать новые мишени для RNAi, обнаружили, путем секвенирования малых РНК, что у растений, Drosophila, млекопитающих и других организмов они в основном транскрибируются с эндогенных транспозонов и других повторяющихся последовательностей (Almeida and Allshire, 2005; Bernstein and Allis, 2005). В совокупности эти результаты показывают, что RNAi эволюировала, отчасти, в целях поддержания стабильности геномов посредством сайленсирующих мобильных элементов ДНК и вирусов и у большинства эукариотических видов представляет собою консервативный механизм. Сейчас, однако, оказывается, что не только РНК-сайленсинг репрессирует инвазивные последовательности, но что, кроме того, этот базовый механизм был использован клеткой для гетерохроматинизации центромер, обеспечивая тем самым корректное расхождение хромосом и целостность генома.

Все приведенные выше примеры показывают удивительное изменение центральной догмы контроля генов, формулировка которого начинает выглядеть следующим образом: ДНК → некодирующие РНК → хроматин → функция гена. Никто не предвидел появление представлений о том, что некодирующие РНК активно участвуют в работе RNAi-подобных механизмов, которые также «нацеливают» локус-специфичные домены на ремоделинг хроматина и сайленсинг генов.

11. От одноклеточных систем к многоклеточным

5000–6000 генов, содержащихся в геномах почкующихся и дробянковых дрожжей, достаточны для регуляции основных метаболических процессов и процессов клеточного деления. Здесь, однако, нет потребности в клеточной дифференпировке, поскольку эти одноклеточные организмы в основе своей являются клональными и, как таковые, многократно повторяющимися «бессмертными» существами. В противоположность им млекопитающие кодируются приблизительно 25000 генами, требующимися в клетках примерно 200 разных типов. Понимание того, каким образом с одной и той же генетической матрицы генерируется и координируется связанная с многоклеточностью сложность организма, является ключевым вопросом в эпигенетических исследованиях.

Сравнение размеров генома у дрожжей, мух, растений и млекопитающих показывает, что размер генома существенно растет с увеличением сложности соответствующего организма. Имеет место более чем 300-кратное различие между размерами геномов у дрожжей и у млекопитающих, при том что общее число генов возрастает всего в какие-нибудь 4–5 раз (рис. 3.15). Однако показателем сложности генома может служить отношение кодирующих последовательностей к некодирующим и повторяющимся: в основном «открытые» геномы одноклеточных грибов имеют сравнительно мало некодирующей ДНК по сравнению с высоко гетерохроматинизированными геномами многоклеточных организмов. В частности, млекопитающие накопили значительное количество повторяющихся элементов и некодирующих участков, которые составляют большую часть их нуклеотидных последовательностей ДНК (52 % некодирующей и 44 % повторяющейся ДНК). Таким образом, лишь 4 % генома млекопитающих кодируют белковые функции (включая интронные последовательности) Эта массивная экспансия повторяющихся и некодирующих последовательностей у многоклеточных организмов, вероятнее всего, обусловлена включением инвазивных элементов, таких как ДНК-транспозоны, ретротранспозоны и другие повторяющиеся элементы. Хотя эти последние и представляют собою нагрузку для программ координированной экспрессии генов, они в то же время делают возможной эволюцию генома и обусловливают его пластичность, а также некоторую степень стохастической регуляции генов. Экспансия повторяющихся элементов инфильтрировала даже транскрипционные единицы генома млекопитающих. Результатом явились транскрипционные единицы, нередко гораздо более крупные (30—200 т. н.) и обычно содержащие множественные промоторы и повторы ДНК внутри нетранслируемых интронов. В противоположность этому растения, обладающие такими же большими геномами, обычно обладают меньшими транскрипционными единицами с меньшими интронами, потому что у них развились защитные механизмы, не позволяющие «терпеть» вставку транспозона в пределах транскрипционной единицы.

^{Рис. 3.15. Круговые диаграммы, характеризующие организацию генома у разных организмов}

^{Над каждой диаграммой указаны размеры генома для основных модельных организмов, используемых в эпигенетических исследованиях. Увеличение размеров генома у более сложных многоклеточных организмов коррелирует со значительной экспансией некодирующих (т. е. интронных, межгенных и рассеянных повторяющихся последовательностей) и повторяющихся (например, сателлитной. LINE, SINE ДНК) нуклеотидных последовательностей ДНК Эта экспансия сопровождается увеличением числа эпигенетических механизмов (в особенности репрессивных), регулирующих геном Расширение генома коррелирует также с увеличением размеров и сложности единиц транскрипции, за исключением растений; эти последние выработали механизмы, не допускающие вставок или дупликаций в транскрипционной единице. Р — промоторный элемент ДНК}

Существуют важные различия между организмами, проявляющиеся в типах эпигенетических путей, используемых, несмотря на высокую степень функционального консерватизма, во многих механизмах у разных видов. Полагают, что эти различия отчасти имеют отношение к величине генома. Широкая экспансия в геном некодирующих и повторяющихся ДНК у высших эукариот требует наличия более экстенсивных эпигенетических механизмов сайленсинга. Это коррелирует с тем фактом, что млекопитающие и растения используют весь диапазон репрессивного метилирования лизина гистонов, метилирования ДНК и механизмов сайленсинга посредством RNAi. Другим вопросом, связанным с многоклеточностью, является вопрос о том, каким образом могут координироваться и поддерживаться множественные клеточные типы (клеточная идентичность) Для регуляции генома имеет место тонкое равновесие с участием групп белковых комплексов Polycomb (PcG) и Trithorax (trxG). С появлением многоклеточности в особенности коррелируют белки PcG (см. раздел 12).

Клетки в многоклеточном организме по своим функциям могут быть разделены на два основных компартмента: зародышевые клетки (тотипотентные и требующиеся для передачи генетической информации следующему поколению) и соматические клетки (дифференцированная «силовая станция» организма). Существуют важные вопросы относительно того, как компартмент зародышевых клеток поддерживает тотипотентность своего эпигенома и какие механизмы вовлечены в стирание, установление и поддержание клеточной судьбы (клеточная память). Поскольку одна зародышевая клетка дает начало другой зародышевой клетке, она в сущности обладает неограниченным пролиферативным потенциалом, подобно одноклеточным «бессмертным» организмам. Однако для того чтобы выполнять эту роль, зародышевые клетки находятся по большей части «в покое» и не реагируют на внешние стимулы, так что целостность их эпигенома может быть защищена. Действительно, ооциты млекопитающих могут сохраняться в покоящемся состоянии более 40 лет. Аналогичным образом, взрослые стволовые клетки (мультипотентные) представляют собой в основном популяцию «спящих» клеток, пролиферирующую (и самовозобновляющуюся) только тогда, когда они. эти клетки, активируются митогенными стимулами и проходят ограниченное число клеточных делений. Таким образом, на состав и структуру эпигенома влияют многие внутренние (например, транскрипция, репликация ДНК, расхождение хромосом) и внешние (например, цитокины, гормоны, повреждение ДНК или общая реакция на стресс) сигналы, в особенности если соматическая дифференцировка вынудила клетки покинуть среду, защищающую зародышевые и стволовые клетки.

12. Polycomb и Trithorax

К числу основных эффекторов, способных передавать сигналы к хроматиновой матрице и участвовать в поддержании клеточной идентичности (т. е. обеспечивать клеточную память), относятся члены групп генов PcG и trxG (Ringrose and Раго 2004). Эти гены были открыты у Drosophila благодаря их роли в регуляции кластера генов Нох в ходе развития и регуляции гомейотических генов. С тех пор было показано, что PcG и trxG являются ключевыми регуляторами пролиферации клеток и клеточной идентичности у многоклеточных эукариот. Кроме того, эти группы генов участвуют в нескольких сигнальных каскадах, которые реагируют на митогены и морфогены; регулируют идентичность и пролиферацию стволовых клеток, яровизацию у растений, гомеотические трансформации и трансдетерминацию, коммитирование линий в ходе дифференцировки В- и Т-клеток и многие другие аспекты развития Metazoa (главы 11 и 12). Теперь мы обратимся вкратце к тому, что известно о том, как семейства PcG и trxG превращают связанные с развитием сигналы в «эпигенетическую память» через посредство структуры хроматина.

Группы белков PcG и trxG функционируют по большей части антагонистически: семейство белков PcG устанавливает «молчащее» состояние хроматина, а семейство белков обычно способствует генной активности. Молекулярная идентификация гена Рс, о котором известно, что он стабилизирует паттерны репрессии генов на протяжении нескольких клеточных генераций, обеспечила первые данные о молекулярном механизме клеточной или эпигенетической памяти Равным образом РС явился примером белка, содержащего хромодомен с высокой степенью сходства с хромодоменом ассоциированного с гетерохроматином белка НР1 (Раго and Hogness, 1991). Как упоминалось выше, хорошо доказано, что хромодомены являются специфическими модулями, связывающимися с метиллизином гистона (изображено на рис. 3.10). У Drosophila идентифицированы 20 генов PcG и, по меньшей мере, 15 разных генов trxG. Функциональные анализы показали, что эти группы генов составляют спектр разных белков, но, тем не менее, они высококонсервативны у эукариот. Гены PcG кодируют продукты, в число которых входят белки, связывающиеся с ДНК (например, YY1), энзимы, модифицирующие гистоны (например. EZH2), и другие репрессивные ассоциированные с хроматином факторы, которые содержат хромодомен, обладающий сродством к H3K27me3 (например, РС). Гены группы trxG кодируют транскрипционные факторы (например, GAGA, или Zeste), энзимы АТФ-зависимого ремоделинга хроматина (например, Brahma) и HKMTs, такие как Ash 1 и Trx (или его гомологи у млекопитающих, MLL, Setl и семейство MLL). В большинстве случаев семейства белков PcG и trxG функционируют как компоненты разнообразных комплексов, устанавливая стабильные хроматиновые структуры, которые облегчают экспрессию или сайленсинг генов, регулируемых в развитии (главы 11 и 12).

Несмотря на успехи последнего времени механизм, посредством которого комплексы, содержащие PcG или trxG, «нацеливаются» на регулируемые в развитии районы хроматина, еще не вполне выяснен У Drosophila наследуемая репрессия гена требует рекрутирования белковых комплексов PcG к элементам ДНК, называемым «элементы ответа polycomb» (PREs, polycomb response elements). Эквивалентные последовательности у млекопитающих установить не удалось. Неясно, каким образом белковые комплексы PcG вызывают протяженный сайленсинг зависимым от PRE образом, потому что PREs обычно локализованы на расстоянии килобаз от сайта старта транскрипции генов-мишеней. Можно постулировать, что отталкивание или, наоборот, рекрутирование комплексов PcG могут дискриминироваться изменениями в транскрипционной активности или различиями в продуктивном versus непродуктивном процессинге иРНК (Pirrotta, 1998; Dellino et al., 2004; Schmitt et al., 2005). В современных моделях поддерживается представление о связывании PcG через взаимодействие с белками, связывающимися с ДНК, и сродство хромодомена в белке PcG к модифицированным гистонам (H3K27me3) (Cao et al., 2002). Однако комплексы PcG могут также ассоциироваться in vitro с нуклеосомами, лишенными гистоновых хвостов (Francis et al., 2004) и, более того, элементы PRE имеют сниженную плотность нуклеосом (Schwartz et al., 2005). Наиболее логичное объяснение некоторых из этих не согласующихся друг с другом наблюдений заключается в том, что обычно связывание PcG in vivo первоначально нуждается во взаимодействии с факторами, связанными с ДНК, которое затем стабилизируется ассоциацией — с нуклеосомами и модифицированными H3K27me3 в прилегающем участке хроматина. Очевидно, необходимы дальнейшие исследования для того, чтобы связать существующие данные о том, как комплексы PcG «нацеливаются» на участки хроматина, и о том, каким образом они опосредуют репрессию. Вполне вероятно, что Это зависит от организма, поскольку имеет место большая гетерогенность комплексов PcG (глава 11).

Белки группы Trithorax поддерживают обычно активное состояние генной экспрессии в генах-мишенях и преодолевают сайленсинг, опосредованный PcG (или предотвращают его). Этот переход еще менее понятен, но последние данные позволяют предполагать, что некий, базирующийся на РНК, механизм мог бы служить триггером для рекрутирования Ashl к промоторам-мишеням (Sanchez-Eisner et al., 2006). Полагают, что в результате может происходить ряд временных и стабильных изменений в структуре хроматина, которые могут облегчаться межгенной транскрипцией, способной устанавливать открытый хроматиновый домен и опосредовать активное замещение гистонов В число документированных изменений хроматина входят вставка «активных» метальных меток по лизинам гистонов с помощью таких trxG HKMTs, как Trx и Ashl, и считывание этих меток (например, распознавание H3К4те с помощью WDR5; Wysocka et al., 2005). Требуется также действие зависимых от АТФ факторов ремоделинга хроматина, таких как Brahma, хотя еще предстоит определить, каким именно образом взаимосвязаны эти механизмы (детали см. в главе 12).

Многие белки PcG и trxG действуют кооперативно, поддерживая в нормальной клетке жестко контролируемый уровень репрессированного гетерохроматина по отношению к активному эухроматину. У млекопитающих в соматических интерфазных ядрах морфология ядер показывает, что конститутивные домены околоцентромерного гетерохроматина сгруппированы в 15–20 фокусов (рис 3.16). Дерегуляция клеточной судьбы и контроля пролиферации, приводящая к аномалиям развития и раку, нередко проявляется в аномальной морфологии ядер. Например, ядерная организация в клетках больных PML-лейкемией (родственной смешанной лимфоцитарной лейкемии [MLL]) демонстрирует отсутствие перицентромерных фокусов (Di Сгосе, 2005). В противоположность этому стареющие (непролиферирующие) клетки обнаруживают ядерную морфологию с крупными эктопическими кластерами гетерохроматина (Narita et al., 2003; Scaffidi et al., 2005). Таким образом, морфология ядер оказывается хорошим маркером, позволяющим различать нормальные и аберрантные клеточные состояния; это показывает, что архитектура ядра может, помимо всего прочего, играть регуляторную роль в поддержании специализированных доменов хроматина.

Изучение уровней модификации гистонов является еще одним индикатором нормальности или ненормальности клеток. Многие из этих изменений приписываются дерегуляции HKMTs группы PcG (например, Ezh2) или trxG (например, MLL), что вносит вклад в прогрессию и даже метастатический потенциал опухолей (см. раздел 15). Действительно, увеличение общих уровней содержания любого из вышеупомянутых белков связано с повышенным риском возникновения рака простаты, рака груди, множественной миеломы или лейкемии (Lund and van Lohuizen, 2004; Valk-Lingbeek et al., 2004). В других случаях неопластической трансформации имеют место явное снижение уровня репрессивных гистоновых меток и увеличение общего ацетилирования (Seligson et al., 2005), вызывающие повышение уровня транскрипции генов и нестабильности генома. Очевидно, что изменения в глобальном контроле хроматина, может быть через нарушение работы энзимов, модифицирующих гистоны, влияют на функциональность генома и нарушают специфический профиль экспрессии генов в нормальной клетке.

^{Рис. 3.16. Клеточная идентичность, определяемая белками PcG u trxG}

^{В ходе эмбриогенеза устанавливаются два клеточных компартмента, различающихся по своему дифференцировочному потенциалу: это зародышевые клетки (тотипотентные) и соматические клетки (включая стволовые клетки) с ограниченными дифференцировочными потенциями. Пластичность потенциала экспрессии генома зародышевых или стволовых клеток отражается в сниженных уровнях репрессивных гистоновых меток, которые больше не видны в околоцентромерных фокусах. Нормальные пролиферирующие клетки обычно обладают ядерной морфологией с 15–20 гетерохроматиновыми фокусами. Комплексы, содержащие Polycomb и Trithorax, действуют, определяя эпигенетическую и, отсюда, клеточную идентичность разных линий. Они функционируют также в ответ на внешние «стрессорные» воздействия, стимулируя клеточную пролиферацию и соответствующую экспрессию генов. В стареющих клетках происходит утрата пластичности генома и пролиферационного потенциала, что находит свое отражение в аномально крупных гетерохроматиновых фокусах и в общем повышенном уровне репрессивных гистоновых меток. Однако интенсивно пролиферирующие опухолевые клетки обнаруживают изменения в балансе репрессивных и активирующих гистоновых меток через дерегуляцию модифицирующих гистоны энзимов PcG и trxG. Это сопровождается нарушениями ядерной морфологии}

В случае клеточного старения увеличение уровня реперессивных меток гистонов также является индикатором клеточной дисфункции. Такое увеличение, сопровождаемое сниженным выявлением ацетилирования гистонов, может укрепить и даже повысить уровни «молчащего» хроматина, блокируя клеточную пластичность и направляя клетки в антипролиферативное состояние (Scaffidi et al., 2005). Это в значительной мере связанный с возрастом эффект, хотя особое болезненное состояние, прогерия, может преждевременно ускорять старение. Напротив, когда у мутантов, не имеющих трансдуцирующего энзима (Suv39h), снижается уровень репрессивных перицентромерных метальных меток, клетки обнаруживают повышенные скорости иммортализации, отсутствие старения и повышенную нестабильность генома (Braig et al., 2005). Эти примеры являются иллюстрацией того, что дерегуляция хроматина, которая проявляется в уровнях характерных гистоновых меток, часто трансдуцируемых энзимами PcG и trxG, и ядерная морфология оказываются важным индикатором прогрессии болезни.

13. Инактивация Х-хромосомы и факультативный гетерохроматин

Сайленсинг генов, опосредованный PcG, и инактивация Х-хромосомы являются лучшими примерами регулируемых в развитии переходов между активным и неактивным состояниями хроматина (рис. 3.17), часто называемого факультативным гетерохроматином. Он назван так в противоположность конститутивному гетерохроматину (например, в околоцентромерных доменах), который, по умолчанию, может быть индуцирован в некодирующих и высокоповторяющихся районах. Факультативный гетерохроматин встречается в кодирующих районах генома, где сайленсинг генов зависит от принимаемых в ходе развития решений, определяющих различные клеточные судьбы (а иногда и ревертируется этими решениями).

Один из лучше всего изученных примеров образования факультативного гетерохроматина — инактивация одной из двух Х-хромосом у самок млекопитающих для выравнивания дозы экспрессии сцепленных с Х-хромосомой генов с самцами, обладающими только одной Х-хромосомой (и гетероморфной У-хромосомой) (глава 17). Здесь сайленсинг генов по всей неактивной Х-хромосоме (Xi) индуцирует высокую степень компактизации Xi, которая видна как тельце Бара, локализованное на периферии ядра клеток у самок млекопитающих. Как подсчитываются две аллели Х-хромосом и каким образом одна определенная Х-хромосома выбирается для инактивации — эти вопросы стоят на повестке дня сегодняшних эпигенетических исследований.

Инактивация Х-хромосомы происходит с участием большой (~17 т. н.) РНК, Xist, которая, по-видимому, действует как первичный триггер ремоделинга хроматина в Xi. Хотя существует возможность образования dsRNA между Xist и антисмысловым транскриптом Tsix (экспрессируемым лишь до начала инактивации X), нет никаких сколько-нибудь убедительных доказательств участия зависящих от РНКи механизмов в инициации инактивации X. Центр инактивации X (XIC, X inactivation center) и вероятные сайты «вхождения» или «докинга» в ДНК (постулируется, что это специализированные повторяющиеся элементы ДНК, которыми обогащены Х-хромосомы) играют роль в ассоциации A7tf-PHK и функционирования ее в качестве молекулы-скаффолда, декорируюшей Xi в cis. Xist стимулирует рекрутирование, а также действие и комплекса PRC 1 (репрессивный комплекс polycomb), и комплекса PRC2, участвующих в образовании стабильной неактивной Х-хромосомы. В число компонентов PRC2 входит, например, модифицирующий хроматин фермент EZH2 из группы HKMT, который катализирует H3K27me3. Связыванию комплекса PRC1 могут способствовать и H3K27me3, и механизмы, не зависящие от модификации гистонов, тогда как другие компоненты этого комплекса, такие как белки Ringl, убиквитинируют Н2А. Гетерогенность комплексов PcG такова, что различные его компоненты могут действовать независимо от других компонентов комплекса. Модификации хроматина, связывание комплекса PcG, последующее включение гистонового варианта макроН2А вдоль Xi и экстенсивное метилирование ДНК — все эти процессы вносят вклад в образование структуры факультативного гетерохроматина во всей хромосоме Xi. Коль скоро стабильная гетерохроматиновая структура установлена, для ее поддержания Xist-РНК больше не нужна (Avner and Heard, 2001; Heard, 2005). Аналогичной формой моноаллельного сайленсинга является геномный импринтинг, также использующий некодирующую или антисмысловую РНК для сайленсирования одной аллельной копии в зависимости от того, от кого из родителей эта копия происходит (глава 19). В настоящее время неясно, влияют ли ES-клетки от мутантных по Dicer мышей на процессы инактивации X или на геномный импринтинг и, если влияют, то каким образом.

^{Рис. 3.17. Индукция репрессированных состояний хроматина, направляемая РНК}

^{Разные формы «молчащего» хроматина имеют различные первичные сигналы, но многие из них, вероятно, связаны с РНК-транскриптами (от аберрантных транскриптов к Xist-PHK и, далее, к dsRNAs), в зависимости от природы соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК. Это включает установление набора изменений хроматина, в том числе комбинации модификаций гистонов (метилирование H3К9, H3К27 и H4K20), связывание репрессивных белков или комплексов (например, РС или НР1) с хроматином, метилирование ДНК и присутствие вариантов гистонов (например, макроH2A на неактивной Х-хромосоме) Факультативный или конститутивный гетерохроматины образуют видимые кластеры в ядре Эухроматиновую репрессию по картинам ядерной морфологии определить нельзя}

Общая парадигма компенсации дозы — классического эпигенетически контролируемого процесса — была также исследована у других модельных организмов, в особенности у С. elegans (Meyer et al., 2004; глава 15) и Drosophila (Gilflllan et al., 2004; глава 16). Пока что неясно, происходит ли компенсация дозы у птиц, несмотря на тот факт, что они являются гетеросаметными организмами. У Drosophila компенсация дозы между полами происходит не за счет инактивации Х-хромосомы у самки, а путем двукратного усиления [up-regulation] работы единственной Х-хромосомы самца. Любопытно, что существенными компонентами являются, как известно, две некодирующие РНК, roX1 и rоХ2, и их экспрессия специфична для самцов. Хотя и существуют, вероятно, аналогичные механистические различия в каких-то деталях между мухами и млекопитающими, ясно, что активирование ремоделинга хроматина и модификаций гистонов, в особенности зависящее от MOF ацетилирование H4K16 на Х-хромосоме самца, играет ключевую роль в компенсации дозы у Drosophila. Каким именно образом энзимы, модифицирующие гистоны, такие как MOF-ацетилтрансфераза гистонов, «нацеливаются» на Х-хромосому самца, остается предметом будущих исследований. Более того, полагают, что такие зависящие от АТФ энзимы ремоделинга хроматина, как фактор ремоделинга нуклеосом (NURF, nucleosome-remodeling factor), являются антагонистами активностей комплекса компенсации дозы (DCC, dosage compensation complex).

В совокупности в этом разделе и в разделах 10 и 11 дано описание механизмов для модификаций хроматина, направляемых РНК, в том виде, как это происходит с конститутивным гетерохроматином, хромосомой Xi и, возможно, также и сайленсингом генов, опосредованным PcG. Исходя из этих любопытных параллелей, можно постулировать, что часть РНК или неспаренных ДНК могли бы обеспечить привлекательный первичный триггер для стабилизации комплексов PcG в PREs или «компрометированной» промоторной функции, где они могли бы «чувствовать» качество транскрипционного процессинга. Аберрантная или блокированная элонгация и (или) ошибки в сплайсинге могли бы стимулировать взаимодействие между PcG, связанным с PRE, и промотором, приводя к выключению транскрипции. Таким образом, инициация PcG-сайленсинга индуцировалась бы переходом от продуктивной транскрипции к непродуктивной. Сейчас только лишь начинает проясняться, в какой мере комплексы trxG могут использовать контроль качества РНК и (или) процессинг первичных РНК-транскриптов как часть поддержания «включенных» транскрипционных состояний (Sanchez-Elsner et al., 2006).

14. Репрограммирование клеточной судьбы

Вопрос о том, каким образом можно изменить или ревертировать судьбу клетки, давно интересовал ученых. Зардышевая клетка и ранние эмбриональные клетки отличаются от других клеточных компартментов как «конечные» [«ultimate»] стволовые клетки свойственной им тотипотентностью. Хотя спецификация клеточной судьбы у млекопитающих допускает около 200 разных клеточных типов, в принципе существуют два главных дифференцировочных перехода: от стволовой (тотипотентной) клетки к полностью дифференцированной клетке и между покоящейся (quiescent, или G₀) и пролиферирующей клеткой. Эти типы представляют собой крайние конечные точки среди множества промежуточных состояний, согласующихся с множеством различных компоновок эпигенома в развитии млекопитающих. В ходе эмбриогенеза динамическое увеличение эпигенетических модификаций проявляется в переходе от оплодотворенного ооцита к стадии бластоцисты и затем в имплантации, гаструляции, развитии органов и росте плода. Большинство этих модификаций или импринтов может быть стерто путем переноса ядра дифференцированной клетки в цитоплазму денуклеированного ооцита. Однако некоторые метки могут сохраняться, ограничивая тем самым нормальное развитие клонированных эмбрионов, а некоторые из них могут даже наследоваться как модификации зародышевого пути (g-mod) (рис. 3.18), которые у млекопитающих, вероятно, включают метилирование ДНК.

Регенерация печени и репарация мышечной клетки представляют собою исключения среди тканей млекопитающих, поскольку эти органы могут регенерировать в ответ на повреждение, хотя большинство других тканей не способны к репрограммированию. У других организмов, таких как растения и Axolotl, некоторые соматические клетки могут действительно репрограммировать свой эпигеном и вновь вступать в клеточный цикл, чтобы регенерировать утраченную или поврежденную ткань (Tanaka, 2003). В целом, однако, репрограммирование соматических клеток невозможно, если они не подвергаются клеточно-инженерным манипуляциям с целью рекапитулировать раннее развитие после пересадки ядра (NT, nuclear transfer) в денуклеированный ооцит. Впервые это было продемонстрировано клонированием лягушек (Xenopus), а в более недавнее время — созданием Долли, первого клонированного млекопитающего (Campbell et al., 1996; глава 22).

^{Рис. 3.18. Репрограммирование путем пересадки ядра}

^{В течение жизни особи в разных клеточных линиях приобретаются эпигенетические модификации (mod) (левая часть рисунка). Пересадка ядра (NT) соматической клетки приводит к реверсии процесса терминальной дифференцировки, уничтожая большинство эпигенетических меток (mod); однако некоторые модификации, которые обычно присутствуют и в зародышевом пути (g-mod), не могут быть удалены. В ходе неопластической трансформации (из нормальной клетки в опухолевую), вызываемой серией генетических мутаций (красные звезды), накапливаются эпигенетические нарушения. Эти эпигенетические нарушения (mod), но не мутации, могут быть стерты в процессе репрограммирования после NT. Этот подход позволяет оценивать взаимодействие между генетическим и эпигенетическим вкладами в генез опухоли (из R. Jaenisch, с изменениями)}

У млекопитающих были идентифицированы три основных препятствия для эффективного соматического репрограммирования. Во-первых, некоторые соматические эпигенетические метки (например, репрессивные H3К9me3) стабильно передаются в ряду делений соматических клеток и устойчивы к репрограммированию в ооците. Во-вторых, ядро соматической клетки не способно рекапитулировать асимметрию репрограммирования. возникающую в оплодотворенном эмбрионе как следствие дифференциальных эпигенетических меток, унаследованных мужским и женским гаплоидными геномами (см. Mayer et al., 2000; van der Heiden et al., 2005; глава 20). В-третьих, передача импринтированных локусов, которые особенно важны на стадии фетального и плацентарного развития, недостаточно надежно поддерживается после NT (Morgan et al., 2005). Большинство клонированных эмбрионов абортируют, и это заставляет предполагать, что нарушение эпигенетических импринтов является основным узким местом для нормального развития и может быть причиной низкой эффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ART, assisted reproductive technologies) и ухудшенного физического состояния клонированных животных.

Использование эмбриональных стволовых клеток вместо соматических демонстрирует значительно увеличенные возможности репрограммирования. Демонстрация того, что покоящиеся клетки (частая характеристика стволовых клеток) обнаруживают снижение уровня состояний H3К9me3 и H4K20 me3, могла бы указывать на увеличенную пластичность эпигенома (Baxter et al., 2004). Это согласуется также с тем фактом, что у «бессмертных» одноклеточных организмов (например, дрожжей) с их открытым, в значительной степени, и активным геномом отсутствуют несколько репрессивных эпигенетических механизмов

Другой особенностью нормального эпигенетического репрограммирования у млекопитающих после оплодотворения является его отчетливая асимметрия. Это можно приписать прежде всего различным программам эпигенетической спецификации в мужских и женских зародышевых клетках (главы 19 и 20). Геном спермия в основном составлен из протаминов, хотя имеется и остаточный, но достоверный уровень CENP-А (вариант гистона H3) и другие предполагаемые эпигенетические импринты (Kimmins and Sassone-Corsi, 2005), тогда как ооцит состоит из регулярного хроматина, содержащего нуклеосомы. После оплодотворения гаплоидные геномы спермия и ооцита проделывают еще один цикл репрограммирования, включающий деметилирование ДНК и обмен гистоновых вариантов. В первом клеточном цикле эти модификации могут либо усиливать, либо уравновешивать эпигенетические различия двух родительских геномов перед слиянием ядер. В ходе дифференцировки эмбриональной (внутренняя клеточная масса [ICM, inner cell mass]) и экстраэмбриональной (трофэктодерма [ТЕ] и плацента) тканей между линями устанавливаются различные профили метилирования ДНК и модификации гистонов (Morgan et al., 2005). Соматическое клонирование не может надежно рекапитулировать эти паттерны репрограммирования, демонстрируя быстрое, но менее экстенсивное деметилирование в первом клеточном цикле и нарушенное метилирование ДНК и метилирование лизинов гистонов при сравнении клеток ICM и ТЕ.

С проблемой репрограммирования соматических клеток тесно связана судьба импринтированных генных локусов. Для нормального эмбрионального развития требуется правильная аллельная экспрессия в импринтированных локусах (глава 19). Это было продемонстрировано оригинальными экспериментами по получению однородительских эмбрионов (Barton et al., 1984; McGrath and Solter, 1984; Surani et al., 1984). Ah-дрогенетические эмбрионы (оба генома которых имеют отцовское происхождение) обнаружили замедленное эмбриональное развитие, но гиперпролиферацию экстраэмбриональных тканей (например, плаценты). У гино- или партеногенетических эмбрионов (оба генома которых имеют материнское происхождение) плацента недоразвита. Следовательно, после стирания предсуществовавших меток в зародышевой клетке должен быть установлен специфичный по отношению к родителю импринт (глава 20). Полагают, что это происходит приблизительно для 100 или даже большего числа импринтированных генов, в основном участвующих в системах обеспечения ресурсами эмбрионального и плацентарного развития (например, ростовой фактор Igf2). Любопытно отметить данные о том, что импринтинг может быть нарушен во время культивирования in vitro эмбрионов, полученных с помощью ART или пересадки ядра (Maher, 2005).

15. Рак

Существует тонкое равновесие между самообновлением и дифференцировкой. Неопластическая трансформация (называемая также туморогенезом) рассматривается как процесс, посредством которого клетки претерпевают изменения, включающие бесконтрольную клеточную пролиферацию, утрату checkpoint-контроля, делающую возможными накопление хромосомных аберраций и геномную анеуплоидию, и неправильно регулируемую дифференцировку (Lengauer et al., 1998). Обычно полагают, что эти изменения вызываются по крайней мере одним генетическим повреждением — точечной мутацией, делепией или транслокацией, разрушающими либо ген-супрессор опухоли, либо онкоген (Hanahan and Weinberg, 2000). В опухолевых клетках гены, супрессирующие опухоль, становятся «молчащими». Онкогены активируются посредством доминантных мутаций или сверхэкспрессии нормального гена (протоонкогена). Важно, что с опухолевыми клетками связано также накопление аберрантных эпигенетических модификаций (глава 24) Эти эпигенетические изменения включают измененные паттерны метилирования ДНК, модификации гистонов и структуру хроматина (рис. 3.19). Таким образом, неопластическая трансформация — это сложный, многоэтапный процесс, включающий случайную активацию онкогенов и (или) сайленсинг генов-супрессоров опухоли и осуществляемый посредством генетических или эпигенетических событий Все это называют «двухударной теорией Кнудсона» (Feinberg, 2004; Feinberg and Tyko, 2004). Проиллюстрируем это следующим образом Сайленсинг гена ретинобластомы (Rb) — гена-супрессора опухоли — вызывает утрату checkpoint-контроля, что не только обеспечивает пролиферативное преимущество, но и стимулирует «второй удар», влияя на функции «ниже по течению», связанные со структурой хроматина, поддерживающие целостность генома (Gonzalo and Blasco, 2005). Сходный эффект может давать несвоевременная активация онкогенного продукта, такого как ген туе, (Knoepfler et al., 2006).

Один из вопросов, порождаемых современными исследованиями, заключается в следующем: до какой степени аберрантные эпигенетические изменения способствуют возникновению опухоли и определяют ее общее поведение? Этот вопрос был исследован в опытах по пересадке ядер с использованием клеток меланомы в качестве донора ядер (Hochedlinger et al., 2004). Любые генетические повреждения донорской клетки сохраняются; однако NT стирает эпигенетический «грим». Затем исследовали возникновение опухолей у клонированных зародышей мышей; выяснилось, что спектр опухолей, возникших de novo, сильно варьировал в соответствии с различным вкладом эпигенетических модификаций в разных тканях, в которых включалась неопластическая прогрессия.

Гипометилирование ДНК (в противоположность гиперметилированию) может происходить в отдельных локусах или на протяженных участках хромосомы, /ияометилирование ДНК было, по сути, первым типом эпигенетического перехода, который удалось связать с раком (Feinberg and Vogelstein, 1983). Оно оказалось широко распространенным фенотипом раковых клеток На уровне индивидуальных генов гипометилирование ДНК может быть неопластическим благодаря активации протоонкогенов, дерепрессии генов, вызывающих аберрантные функции клеток, или биаллельной экспрессии импринтированных генов (что также называется утратой импринтинга, или LOI — loss of imprinting) (главы 23 и 24). В более глобальных масштабах, масштабах всего генома обширное гипометилирование ДНК, особенно в участках конститутивного гетерохроматина, обусловливает предрасположение клеток к хромосомным транслокациям и анеуплоидии, способствующим раковой прогрессии. Этот эффект рекапитулируется у мутантов по Dnmt1 (Chen et al., 1998). Геномная нестабильность, возникающая в условиях гипометилирования ДНК, обусловлена, вероятно, мутагенным эффектом реактивации транспозонов. Когда обратили внимание на существенную роль репрессивных модификаций гистонов в поддержании гетерохроматина в центромерах и теломерах, появились данные о том, что если эти метки утрачиваются, возникает также нестабильность генома, вносящая свой вклад в раковую прогрессию (Gonzalo and Blasco, 2005).

^{Рис. 3.19. Эпигенетические модификации при раке}

^{(а) аберрантные эпигенетические метки в локусах, вызывающих рак, как правило, вызывают дерепрессию онкогенов или сайленсинг генов-супрессоров опухоли В число эпигенетических меток, о которых известно, что они изменяют нормальную клетку, входят метилирование ДНК, репрессивное метилирование гистонов и деацетилирование гистонов; (б) использование эпигенетических терапевтических агентов для лечения рака имеет свои последствия на уровне хроматиновой матрицы, показанной на примере локуса-супрессора опухоли. Воздействие ингибиторами Dnmt приводит к потере метилирования ДНК, а воздействие ингибиторами HDAC — к приобретению ацетильных гистоновых меток и последующим модификациям «вниз по течению», включая активные метильные метки гистонов и включение гистоновых вариантов. Эти кумулятивные изменения хроматина приводят к возобновлению экспрессии гена}

Напротив, гиперметилирование ДНК при многих раковых заболеваниях сконцентрировано в промоторных участках CpG-островков. Сайленсинг генов-супрессоров опухолей посредством такого аберрантного гиперметилирования ДНК имеет особо важное значение в раковой прогрессии. Недавние исследования показали, что имеет место существенное взаимовлияние [cross-talk] между модификациями хроматина и метилированием ДНК, показывающее, что в сайленсинг гена-супрессора опухоли может быть вовлечен не один эпигенетический механизм. Приведем пример: известно, что гены-супрессоры опухолей, р16 и hMLHl, сайленсируются при раке как метилированием ДНК, так и репрессивным метилированием лизинов гистона (МсGarveyet al., 2006).

Предполагается, что при многих формах рака имеет место дерегуляция модификаторов хроматина. Некоторые энзимы, модифицирующие гистоны, — например, белок EZH2 группы PcG и белок MLL группы trxG — становятся онкогенными и действуют, нарушая эпигенетическую идентичность клетки, вследствие чего возникает либо транскрипционный сайленсинг, либо активация «несоответствующих», «не тех» генов (Schneider et al., 2002; Valk-Lingbeek et al., 2004). Ясно, что эпигенетическая идентичность является ключевым фактором для клеточной функции. Действительно, рисунок глобальных ацетильных и метильных меток гистонов оказывается признаком, имеющим важное значение для прогрессии некоторых раковых заболеваний, как показывают исследования прогрессии опухоли простаты (Seligson et al., 2005).

Разработка мишеней для лекарственных агентов с целью подавления функции эффекторных энзимов, модифицирующих хроматин, открыла новые горизонты для лечения рака (рис. 3.19). Использование ингибиторов DNMT и HDAC находится на наиболее продвинутой стадии клинических испытаний этого нового поколения противораковых терапевтических средств. Двумя такими ингибиторами являются, соответственно, Зебуларин и SAHA. Они особенно эффективны по отношению к раковым клетам, у которых имеются репрессированные гены-супрессоры опухолей (J.C. Cheng et al., 2004; Garcia-Manero and Issa, 2005; Marks and Jiang. 2005), потому что воздействие ими приводит к стимуляции транскрипции. Основная доля репрессивного метилирования лизинов гистонов утрачивается в ходе воздействия, скорее всего благодаря сочетанному с транскрипцией обмену гистонов и замещению нуклеосом; однако эти ингибиторы не изменяют сколько-нибудь существенно H3К9me3 в промоторных участках, являющихся мишенями (McGarvey et al., 2006). Остается выяснить, могут ли сохраняющиеся репрессивные метки индуцировать последующий ресайленсинг генов-супрессоров опухоли, когда воздействие временно прерывается, противодействуя тем самым пользе «эпигенетической терапии». Возможно, что стратегия двойной эпигенетической терапии, использующая ингибиторы DNMT и HDAC, может обеспечить более благоприятный прогноз в клинических испытаниях.

Идентификация ингибиторов для других классов модификаторов гистонов, а именно HKMTs и PRMTs, находится в настоящее время на стадии разработки. В геноме млекопитающих имеются приблизительно 50 одних только HKMTs с доменом SET. Большинство хорошо охарактеризованных энзимов, таких как SUV39H, EZH2, MLL и RIZ, уже связывали с развитием опухолей (Schneider et al., 2002). Так, используются методы высокопроизводительного скрининга (HTS) в надежде идентифицировать низкомолекулярные ингибиторы, которые можно было бы использовать в исследовательской работе и, в конечном счете, в противораковой терапии. Для такого подхода годятся все классы энзимов, модифицирующих гистоны, поскольку их специфические сайты связывания с субстратом (т. е. гистоновыми пептидами), в противоположность сайтам связывания общего кофактора (например, СоАи SAM), позволяют разрабатывать лекарственные препараты более селективного действия. HTS оказался успешным в случае HDACs (Su et al., 2000), PRMTs (D. Cheng et al., 2004) и HKMTs (Greiner et al., 2005).

Для того чтобы произошел переход знаний из фундаментальных исследований в прикладные, требуются как основанные на гипотезах, так и эмпирические подходы, чтобы окончательно определить эффективность и полезность какого-нибудь ингибитора энзима, модифицирующего гистоны. Например, селективные ингибиторы HKMT против MLL или EZH2 могут быть ценными терапевтическими агентами против лейкемии или рака простаты. В качестве альтернативы использование HKMT-ингибитора SUV39H (что интуитивно кажется неправильным из-за потребности в этом энзиме для поддержания конститутивного гетерохроматина и стабильности генома) могло бы все же избирательно сенсибилизировать опухолевые клетки. Кроме того, анализ HDAC-ингибитора SAHA показал, что он может действовать через дополнительные пути, не связанные с реактивацией транскрипции (Marks and Jiang, 2005). Например, HDAC-ингибиторы могут также сенсибилизировать повреждения хроматина, подавляя эффективную репарацию ДНК и делая возможным возникновение геномной нестабильности, которая может включить апоптоз в опухолевых клетках. Эти наблюдения необходимо будет проконтролировать при оценке эффективности двойной комбинационной терапии. Однако, судя по результатам, имеющимся на сегодняшний день, можно себе представить, что комбинационная терапия с использованием HDAC- и HKMT-ингибиторов может быть более избирательной в уничтожении пронеопластических клеток, переводя их в состояние информационной избыточности и катастрофы с хроматином. Можно надеяться, что продолжение исследований позволит идентифицировать жизнеспособные кандидатуры для эффективной эпигенетической противораковой терапии.

16. В чем же в действительности заключается эпигенетический контроль?

В транскрипции или регуляции хроматина играют роль приблизительно 10 % пула белков, закодированных в геноме млекопитающих (база данных Swiss-Prot). Исходя из того, что геном млекопитающих состоит из 3 × 10⁹ п.н., он должен вмещать ~ 1 × 10⁷ нуклеосом. Это дает начало огромному разнообразию возможных регуляторных сигналов, включая взаимодействия при связывании с ДНК, модификации гистонов, варианты гистонов, ремоделинг нуклеосом, метилирование ДНК и некодирующие РНК. Один только процесс регуляции транскрипции весьма сложен и часто требует сборки крупных мультипротеиновых комплексов (>100 белков), чтобы обеспечить инициацию, элонгацию и правильный процессинг информационной РНК с одиночного выбранного промотора. Если уж регуляция, специфическая по отношению к нуклеотидной последовательности ДНК, столь сложна, можно ожидать, что еще сложнее окажутся характеризующиеся низким сродством ассоциации вдоль динамического полимера, состоящего из ДНК и гистонов. Исходя из этих соображений, можно ожидать, что лишь изредка какая-то одна модификация будет коррелировать с одним каким-то эпигенетическим состоянием. Более вероятно (и в пользу этого говорят экспериментальные данные), что эпигенетические состояния стабилизируются и воспроизводятся определенной комбинацией или кумулятивным влиянием нескольких (возможно, многих) сигналов на протяженном участке хроматина (Fischle et al., 2003b; Lachner et al., 2003; Henikoff, 2005).

По большей части, связывание транскрипционного фактора является временным и утрачивается в последующих клеточных делениях. Для сохраняющихся паттернов генной экспрессии транскрипционные факторы нужны при каждом последующем клеточном делении. Как таковой, эпигенетический контроль может усиливать первичный сигнал (например, стимуляцию промотора, сайленсинг генов, определение центромеры) в последовательных клеточных генерациях (но не бесконечного их числа) путем наследственной передачи информации через хроматиновую матрицу (рис. 3.20). Интересно отметить, что у S. pombe эпигенетический мозаицизм, зависящий от Swi6, можно репрессировать на много клеточных делений во время как митоза, так и мейоза (Grewal and Klar, 1996) модификациями гистонов (вероятнее всего, H3K9me2). Аналогичные исследования были выполнены на Drosophila с использованием импульса некоего активирующего транскрипционного фактора для передачи клеточной памяти об экспрессии гена Нох в зародышевом пути самок (Cavalli and Раго, 1999). В обоих этих примерах эпигенетическая память опосредуется изменениями хроматина, в том числе отдельными модификациями гистонов и, вероятнее всего, включением гистоновых вариантов.

Если модификации гистонов функционируют совместно, импринт может остаться на хроматиновой матрице, что поможет маркировать нуклеосомы, в особенности если сигнал восстанавливается после репликации ДНК (рис. 3.20). Для еще более стабильного наследования сотрудничество между модификациями гистонов, включением гистоновых вариантов и ремоделингом хроматина может превратить протяженный участок хроматина в устойчиво измененные структуры, которые затем будут воспроизводиться на протяжении многих клеточных делений. Хотя это объяснение относится к наследованию состояний «включения» транскрипции, аналогичный синергизм между репрессивными эпигенетическими механизмами будет более устойчиво закреплять «молчащие» участки хроматина, и это далее будет усилено дополнительным метилированием ДНК.

Двойная спираль ДНК может тогда рассматриваться как самоорганизующийся полимер, который, через его упорядочивание в хроматин, может реагировать на эпигенетический контроль и усиливать первичный сигнал, превращая его в более долговременную «память». Кроме того, многие модификации гистонов, вероятно, развились в ответ на внутренние и внешние стимулы. В соответствии с этим энзимы, модифицирующие хроматин, нуждаются в кофакторах, таких как АТФ (киназы), ацетил-СоА (HATs) и SAM (HKMTs), уровни которых диктуются изменениями внешних условий (например, диетой). Таким образом, измененные условия могут транслироваться в более динамичный или более стабильный полимер из ДНК и гистонов. Прекрасным примером этого является зависящий от NAD Sir2 (группа HDAC), который действует как «сенсор» для пищевых веществ и веществ и клеток на протяжении их жизни или уже стареющих (life-span/aged клеток) (Guarente and Picard, 2005; Rine, 2005). Понимание того, как эти сигналы из внешней среды превращаются в биологически значимые эпигенетические сигнатуры и каким образом они прочитываются, транслируются и наследуются, находится в центре современных эпигенетических исследований. Важно, однако, подчеркнуть, что эпигенетический контроль требует сложного равновесия между многими факторами и что функциональное взаимодействие не всегда надежно восстанавливается после каждого клеточного деления. В этом состоит функциональный контраст с генетикой, которая имеет дело с изменениями нуклеотидной последовательности ДНК, всегда стабильно воспроизводящимися в митозе и мейозе, если эти мутации происходят в зародышевом пути.

Важным вопросом, вытекающим из рассмотренного выше материала, является вопрос о том, каким образом информация, содержащаяся в хроматине, поддерживается при передаче от материнской клетки дочерним клеткам. Если клетка утрачивает свою идентичность в силу заболевания, неправильной регуляции или репрограммирования, сопровождается ли эта потеря идентичности изменениями в структуре хроматина? Основной синтез большинства коровых гистонов очень сильно регулируется на протяжении клеточного цикла. Транскрипция генов коровых гистонов происходит обычно в S-фазе, на стадии, когда реплицируется ДНК (т. е. связана с репликацией). Эта «координация» гарантирует что с удвоением количества ДНК в клетке имеется достаточное количество коровых гистонов для связывания со вновь реплицированной ДНК; таким образом, упаковка ДНК происходит одновременно с ее репликацией. Как показано выше, различные участки хроматина могут иметь отчетливые различия по гистоновым модификациям, программирующим данный участок в отношении того, будет ли он транскрибироваться или нет. Каким образом домены вновь синтезированного дочернего хроматина сохраняют эту информацию, ключевую для экспрессии соответствующих генов? Каким образом эта программа надежно реплицируется от одного клеточного поколения к следующему или же проходит через мейоз и формирование зародышевой клетки (спермия или яйца)? Эти центральные вопросы ожидают будущих исследований.

^{Рис. 3.20. Эпигенетическое усиление первичного сигнала (память/наследование)}

^{Классическая генетика предсказывает, что экспрессия гена зависит от наличия и связывания соответствующего набора транскрипционных факторов (TF). Удаление таких факторов (т. е. первичный сигнал) приводит к утрате экспрессии гена и, таким образом, составляет преходящий активирующий сигнал (<верхняя часть рисунка). Структура хроматина вносит свой вклад в экспрессию гена: здесь некоторые конформации являются репрессивными, а другие активными. Активация локуса может поэтому происходить посредством первичного сигнала и приводить к изменению в структуре хроматина «вниз по течению», включающему активные ковалентные гистоновые метки (mod) и замещение коровых гистонов их вариантами (например, H3.3). При клеточном делении эта структура хроматина может быть восстановлена в присутствии активирующего сигнала (обозначается как «повторяющийся сигнал»). Результатом эпигенетической памяти оказывается поддержание состояния хроматина при клеточном делении, даже в отсутствие первичного активирующего сигнала. Такая система памяти не является абсолютной, но включает множественные уровни эпигенетического регулирования для ремоделинга структуры хроматина. Динамическая природа хроматина означает, что хотя состояние хроматина может быть митотически стабильным, — оно тем не менее склонно к изменению, влияя тем самым на продолжительность эпигенетической памяти}

Хотя первоначальные исследования указывали на полуконсервативный процесс, в ходе которого откладывается новый тетрамер H3/Н4, вслед за чем инкорпорируются два новых димера Н2А/Н2В, данные последнего времени подвергли эту гипотезу сомнению. В этой недавней модели «новые» полипептиды H3 и Н4, которые уже могут нести несколько посттрансляционных модифкаций, включаются как вновь синтезированные гистоновые димеры H3/Н4 вместе со «старыми» димерами H3/Н4, расходящимися между материнской и дочерней ДНК. Если это так. тогда эти модифицированные, родительские димеры H3/Н4 также присутствуют теперь вместе с вновь синтезированными димерами на одной и той же ДНК. Их совместное присутствие могло бы тогда диктовать, какие «правильные» модификации должны размещаться на вновь добавленных димерах (Tagami et al., 2004). Эта модель выглядит привлекательной и может помочь объяснить наследование гистоновых модификаций и, таким образом, воспроизведение эпигенетической информации в ходе репликации ДНК и при клеточном делении. Однако необходимы новые данные в поддержку этой или других моделей, предназначенных для объяснения передачи хроматиновых меток в ходе клеточного деления.

Заканчивая эту главу, мы задаем вопрос: отличается ли эпигенетический контроль сколько-нибудь фундаментальным образом от основных генетических принципов? Хотя мы можем захотеть рассматривать «эпигенетический ландшафт» Уодцингтона как разграниченные участки активирующих и репрессивных гистоновых модификаций на континууме хроматинового полимера, этот взгляд легко может оказаться чрезмерной детализацией. Ведь только в последние годы мы узнали об основных ферментных системах, посредством которых могли воспроизводиться модификации гистонов. Это оформило наши современные представления о стабильности и, отсюда, наследовании некоторых гистоновых меток. Кроме того, это подчеркивается недавними исследованиями, которые показывают, что мутации по активностям, модифицирующим хроматин, таким как ремоделеры нуклеосом (Cho et al., 2004; Mohrmann and Verrijzer, 2005), DNMTs (Robertson, 2005), HDACs или HMKTs (Schneider et al., 2002), поскольку они часто обнаруживаются при ненормальном развитии и неоплазиях, являются красноречивыми примерами конечного могущества генетического контроля. Как таковое, возникновение опухоли у этих мутантных мышей обычно рассматривается как генетическое заболевание. В противоположность этому изменения в структуре хромосом, метилировании ДНК и профилях модификаций гистонов — которые не вызываются мутировавшим геном — обычно классифицируются как «истинные» эпигенетические аберрации. Превосходными примерами этих более пластичных систем являются стохастические «выборы» в раннем эмбриональном развитии, репрограммируемые пересадкой ядра, транскрипционная память, геномный импринтинг, мозаичная инактивация Х-хромосомы, центромерная идентичность и прогрессия опухоли. Генетика и эпигенетика, таким образом, оказываются тесно связанными явлениями, и обеим им присуще их воспроизведение в ходе клеточных делений, которое, в том что касается генетического контроля, охватывает также и зародышевый путь, если мутации возникают в зародышевых клетках В случае других — часто слишком легко классифицируемых — эпигенетических модификаций мы не знаем, являются ли они лишь отражением мелких и преходящих реакций на изменения во внешней среде или же вносят существенный вклад в фенотипические различия, которые затем могут поддерживаться на протяжении многих делений соматических клеток, хотя и не бесконечного их числа, и иногда могут затрагивать зародышевый путь. Даже при наших весьма продвинутых сегодня знаниях об эпигенетических механизмах какие-либо новые доводы в пользу ламаркизма отсутствуют или почти отсутствуют.

17. Основные вопросы в эпигенетических исследованиях

В этой книге обсуждаются фундаментальные концепции и общие принципы, объясняющие, как происходят эпигенетические явления, какими бы загадочными они не казались. Наша конечная цель — представить читателю современные представления о механизмах, направляющих и формирующих эти концепции, на фоне разнообразных биологических данных, из которых они возникли. Всего лишь за несколько лет эпигенетические исследования дали интригующие и замечательные сведения и революционные открытия; тем не менее, многие давно поставленные вопросы остаются без ответа (рис. 3.21). Хотя и соблазнительно набросать широкими мазками выводы и предложить на обсуждение общие правила, основывающиеся на этом прогрессе, мы предостерегаем от этой тенденции, подозревая, что будут обнаружены многочисленные исключения из этих правил. Например, ясно, что имеют место значительные различия между организмами. В особенности степень и тип гистоновых модификаций, варианты гистонов, метилирование ДНК и использование механизма РНКи существенно варьируют от одноклеточных до многоклеточных организмов.

Имеются, однако, множество оснований с новой энергией взяться за исследовательские программы, нацеленные на молекулярный анализ эпигенетических явлений. Элегантные биохимические и генетические исследования уже позволили успешно и беспрецедентным образом проанализировать многие функциональные аспекты этих путей. Поэтому можно было бы предсказать, что тщательный анализ эпигенетических переходов в разных типах клеток (например, стволовые versus дифференцированные; покоящиеся versus пролиферирующие) выявит ключевые признаки плюрипотентности (Bernstein et al., 2006; Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006). Весьма вероятно, что это окажется ценным в определении того, какие изменения хроматина существенны во время нормальной дифференцировки в сравнении с болезненными состояниями и туморогенезом. Например, ожидается, что использование таких подходов, как крупномасштабное картирование на нормальных, опухолевых или ES-клетках — получение «эпигенетического ландшафта» вдоль по длине целых хромосом (Brachen et al., 2006b; Squazzo et al., 2006; Epigenomics AG, ENCODE, GEN-AU, EPIGENOME NoE) — позволит получить сведения, которые могли бы быть использованы для новых подходов в области терапевтического вмешательства и способствовали бы созданию всемирного консорциума для картирования всего эпигенома человека (Jones and Martienssen, 2005). Можно себе представить, что различия в относительных количествах разных гистоновых модификаций, такие например, как явно слабая представленность репрессивного триметилирования лизинов в гистонах у S. pombe и A. thaliana, могут отражать больший пролиферативный и регенераторный потенциал у этих организмов по сравнению с более ограниченными программами развития многоклеточных систем. Кроме того, функциональные связи между механизмом РНКи, метилированием лизинов гистонов и метилированием ДНК по-прежнему будут дарить нам интригующие сюрпризы относительно сложных механизмов, необходимых для детерминации клеточной судьбы в ходе развития. Аналогично этому многое в этом отношении даст углубленное понимание динамики и специфичности механизмов ремоделинга нуклеосом. Мы предсказываем, что будут открыты новые «экзотические» энзиматические активности, катализирующие эпигенетические переходы посредством модификаций гистонов и негистоновых субстратов. Может оказаться, что изменения хроматина, индуцируемые вышеперечисленными механизмами, действуют в значительной степени как фильтр реакций на внешние воздействия. Таким образом, есть надежда, что эти знания в конечном счете можно будет применить к стратегиям интенсивной терапии с целью «перенастройки» некоторых эпигенетических реакций индивидуума, связанных со старением, заболеваниями и раком Сюда входят регенерация тканей, терапевтическое клонирование (использование ES-клеток и их дериватов) и терапевтические стратегии с использованием стволовых клеток взрослых организмов. Предполагается, что такие стратегии увеличат продолжительность жизни клеток, позволят модулировать стрессовый ответ на внешние стимулы, вызывать реверсию прогрессии заболевания и улучшить вспомогательные репродуктивные технологии. Мы предсказываем, что понимание «хроматиновой основы» плюрипотентности и тотипотентности окажется в центре понимания биологии стволовых клеток и ее возможностей для терапевтического вмешательства.

^{Рис. 3.21. Основные вопросы в эпигенетических исследованиях}

^{Многие экспериментальные системы, используемые в эпигенетических исследованиях, вскрыли многочисленные пути и новые механизмы эпигенетического контроля Однако многие вопросы, как показано на этом рисунке, все еще остаются без ответа и нуждаются в дальнейшем выяснении или в подтверждении с использованием новых и уже существующих систем и методов}

Остается еще много фундаментальных эпигенетических вопросов. Например, что отличает одну нить хроматина от другой, аллельной, хотя обе содержат одинаковые нуклеотидные последовательности ДНК в одном и том же ядерном окружении? Что определяет механизмы, обеспечивающие наследование и воспроизведение эпигенетической информации? Какова молекулярная природа клеточной памяти? Существуют ли эпигенетические импринты в зародышевом пути, которые служат для удержания этого генома в тотипотентном состоянии? Если да, то как эти метки стираются в ходе развития? Добавляются ли в ходе развития новые метки, которые служат для «запирания», фиксации дифференцированных состояний? Мы предвкушаем появление следующего поколения исследований (и исследователей), достаточно смелых, чтобы попытаться ответить на эти вопросы со всей страстностью, свойственной предшествующему поколению исследователей-генетиков и эпигенетиков.

Подводя итог, можно утверждать, что генетические принципы, описанные Менделем управляют, вероятно, огромным большинством характеристик нашего развития и нашего внешнего фенотипа Однако исключения из этого правила могут иногда обнаружить новые принципы и новые механизмы, обеспечивающие наследование, которые ранее недооценивались и в некоторых случаях были малопонятными. Цель этой книги — представить читателю новую оценку основ фенотипической изменчивости, лежащих за пределами изменений в ДНК. Мы надеемся, что системы и концепции, описанные в этой книге, заложат полезный фундамент для будущих поколений студентов и исследователей, таких же, как те, кого увлекли странности эпигенетических явлений.

Литература

Ahmad K. and Henikoff S. 2002. The histone variant H3.3 marks ac­tive chromatin by replication-independent nucleosome assembly. Mol. Cell 9: 1191-1200.

Allfrey V.G., Faulkner R., and Mirsky A.E. 1964. Acetylation and methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis. Proc. Natl Acad. Sci. 51: 786-794.

Almeida R. and Allshire R.C. 2005. RNA silencing and genome regulation. Trends Cell Biol. 15: 251-258.

Aparicio O.M., Billington B.L., and Gottschling D.E. 1991. Modi­fiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S cerevisiae. Cell 66: 1279-1287.

Avery O.T., Macleod C.M., and McCarty M. 1944. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a desoxy­ribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus Type III. J. Exp. Med. 79: 137-158.

Avner R and Heard E. 2001. X-chromosome inactivation: Counting, choice and initiation. Nat. Rev. Genet. 2: 59-67.

Bannister A.J. and Kouzarides T. 2005. Reversing histone methyla­tion. Nature 436: 1103-1106.

Bannister A. J., Zegerman R, Partridge J.E, Miska E.A., Thomas J.O., Allshire R.C, and Kouzarides T. 2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410: 120-124.

Barton S.C., Surani M.A., and Norris M.L. 1984. Role of paternal and maternal genomes in mouse development. Nature 311: 374-376.

Bastow R., Mylne J.S., Lister C, Lippman Z., Martienssen R.A., and Dean C. 2004. Vernalization requires epigenetic silencing of FLC by histone methylation. Nature 427: 164-167.

Baxter J., Sauer S., Peters A., John R., Williams R., Caparros M.L., Amey K., Otte A., Jenuwein T, Merkenschlager M., and Fisher A. G. 2004. Histone hypomethylation is an indicator of epigenetic plasticity in quiescent lymphocytes. EMBO J. 23: 4462-4472. Berger S.L. 2002. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 142-148.

Bernard P., Maure J.E, Partridge J.F., Genier S., Javerzat J.P., and Allshire R.C. 2001. Requirement of heterochromatin for cohesion at centromeres. Science 294: 2539-2542.

Bernstein B.E., Kamal M., Lindblad-Toh K., Bekiranov S., Bailey D. K., Huebert D.J., McMahon S., Karlsson E.K., Kulbokas E. J., III, Gitigeras T.R., et al. 2005. Genomic maps and com­parative analysis of histone modifications in human and mouse. Cell 120: 169-181.

Bernstein B.E., Mikkelsen T.S., Xie X., Kamal M., Huebert D.J., Cuff J., Fry B., Meissner A., Wemig M., Plath K., et al. 2006. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 125: 315-326.

Bernstein E. and Allis C.D. 2005. RNA meets chromatin. Genes Dev. 19: 1635-1655.

Bird A.P. 1986. CpG-rich islands and the function of DNA methyla­tion. Nature 321: 209-213.

Birky C.W., Jr. 2001. The inheritance of genes in mitochondria and chloroplasts: Laws, mechanisms, and models. Annu. Rev. Genet. 35: 125-148.

Bolland D.J., Wood A.L., Johnston CM., Bunting S.F., Morgan G., Chakalova L., Fraser P.J., and Corcoran A.E. 2004. Antisense inter-genic transcription in V(D)J recombination. Nat. Immunol. 5: 630-637.

Bourc’his D. and Bestor T.H. 2004. Meiotic catastrophe and ret- rotransposon reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. Nature 431: 96-99.

Boyer L.A., Plath K., Zeitlinger J., Brambrink T., Medeiros L.A., Lee T.I., Levine S.S., Wemig M., Tajonar A., Ray M.K., et al. 2006 Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature 441: 349-353.

Bracken A.P, Dietrich N., Pasini D., Hansen K.H., and Helin K. 2006. Genome-wide mapping of Polycomb target genes unravels their roles in cell fate transitions. Genes Dev. 20: 1123-1136. Braig M., Lee S.. Loddenkemper C, Rudolph C, Peters A.H., Schlegelberger B., Stein H., Dorken B., Jenuwein T., and Schmitt C. A. 2005. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature 436: 660-665.

Brownell J.E., Zhou J., Ranalli T., Kobayashi R., Edmondson D. G., Roth S.Y., and Allis C.D. 1996. Tetrahymena histone acetyltrans-ferase A: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851.

Caims B.R. 2005. Chromatin remodeling complexes: Strength in diversity, precision through specialization. Curr. Opin. Genet. Dev. 15: 185-190.

Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., and Wilmut 1.1996. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380: 64-66.

Cao R., Wang L., Wang H., Xia L., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Jones R.S.,and Zhang Y. 2002. Role ofhistone H3 lysine 27 methy­lation in Polycomb-group silencing. Science 298: 1039-1043.

Cavalli G. and Paro R. 1999. Epigenetic inheritance of active chro­matin after removal of the main transactivator. Science 286: 955-958.

Chakalova L., Debrand E., Mitchell J.A., Osbome C.S., and Fraser P. 2005. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6: 669-677.

Chalker D.L. and Yao M.C. 2001. Nongenic, bidirectional transcrip­tion precedes and may promote developmental DNA deletion in Tetrahymena thermophila. Genes Dev. 15: 1287-1298.

Chan S.W., Zilberman D., Xie Z., Johansen L.K., Carrington J.C., and Jacobsen S.E.2004. RNA silencing genes control de novo DNA methylation. Science 303: 1336.

Chen R.Z., Pettersson U., Beard C., Jackson-Grusby L., and Jaenisch R. 1998. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates. Nature 395: 89-93.

Cheng D., Yadav N., King R.W., Swanson M.S., Weinstein E.J., and Bedford M.T. 2004. Small molecule regulators of protein arginine methyltransferases. J. Biol. Chem. 279: 23892-23899.

Cheng J.C., Yoo C.B., Weisenberger D.J., Chuang J., Wozniak C., Liang G., Marquez V.E., Greer S., Omtoft T.F., Thykjaer T., and Jones P.A. 2004. Preferential response of cancer cells to zebularine. Cancer Cell 6: 151-158.

Cho K.S., Elizondo L.I., and Boerkoel C.F. 2004. Advances in chromatin remodeling and human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 308-315.

Chuikov S., Kurash J.K., Wilson J.R., Xiao B., Justin N., Ivanov G.S., McKinney K., Tempst P., Prives C., Gamblin S.J.. et al. Regulation of p53 activity through lysine methylation. Nature 432: 353-360.

Clark-Adams C.D., Noms D., Osley M.A., Fassler J.S., and Winston F. 1988. Changes in histone gene dosage alter transcription in yeast. Genes Dev. 2: 150-159.

Cohen F.E. and Prusiner S.B. 1998. Pathologic conformations of prion proteins. Annu. Rev. Biochem. 67: 793-819.

Cosgrove M.S., Boeke J.D., and Wolberger C. 2004. Regulated nu- cleosome mobility and the histone code. Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 1037-1043.

Cremer T. and Cremer C. 2001. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat. Rev. Genet. 2: 292-301.

Daujat S., Zeissler U., Waldmann T., Happel N., and Schneider R. 2005. HP1 binds specifically to Lys26-methylated histone H1.4, whereas simultaneous Ser27 phosphorylation blocks HPl bind­ing. /. Biol. Chem. 280: 38090-38095.

Dellino G.I., Schwartz Y.B., Farkas G., McCabe D.. Elgin S.C.. and Pirrotta V. 2004. Polycomb silencing blocks transcription initiation. Mol. Cell 13: 887-893.

Dhalluin C, Carlson J.E., Zeng L., He C., Aggarwal A.K., and Zhou M.M. 1999. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodomain. Nature 399: 491-496.

Di Croce L. 2005. Chromatin modifying activity of leukaemia associated fusion proteins. Hum. Mol. Genet. 14 Spec. No. 1: R77-R84.

Dou Y. and Gorovsky M.A. 2000. Phosphorylation of linker histone HI regulates gene expression in vivo by creating a charge patch. Mol. Cell 6: 225-231.

Fan Y, Nikitina T., Zhao J., Fleury T.J., Bhattacharyya R., Bouhas- sira E.E., Stein A., Woodcock C.L., and Skoultchi A.I. 2005.

Histone HI depletion in mammals alters global chromatin structure but causes specific changes in gene regulation. Cell 123: 1199-1212.

Feinberg A.P. 2004. The epigenetics of cancer etiology. Semin. Cancer Biol 14: 427-432.

Feinberg A. P. and Tycko B. 2004. The history of cancer epigenetics Nat. Rev. Cancer 4: 143-153.

Feinberg A.P. and Vogelstein B. 1983. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 301: 89-92.

Felsenfeld G. and Groudine M. 2003. Controlling the double helix. Nature 421: 448-453.

Fischle W., Wang Y., and Allis C.D. 2003a. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature 425: 475-479.

Fischle W., Wang Y., and Allis C.D. 2003b Histone and chromatin cross-talk. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 172-183.

Fischle W., Tseng B.S., Dormann H.L., Ueberheide B.M., Garcia B. A., Shabanowitz J., Hunt D.F., Funabiki H., and Allis C.D. 2005. Regulation of HP 1-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation. Nature 438: 1116-1122.

Fisher A.G. and Merkenschlager M. 2002. Gene silencing, cell fate and nuclear organisation. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 193-197.

Fodor B.D., Kubicek S., Yonezawa M., O’Sullivan R.J., Sengupta R., Perez-Burgos L., Opravil S., Mechtler K., Schotta G., and Jenuwein T. 2006. Jmjd2b antagonizes H3K9 trimethylation at pericentric heterochromatin in mammalian cells. Genes Dev. 20: 1557-1562.

Fraga M.F., Ballestar E., Paz M.E., Ropero S., Setien F. Ballestar M.L., Heine-Suner D., Cigudosa J.C., Urioste M., Benitez J., et al. 2005. Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 10604-10609.

Francis N.J., Kingston R.E., and Woodcock C.L. 2004. Chromatin compaction by a polycomb group protein complex. Science 306: 1574-1577.

Fukagawa T, Nogami M., Yoshikawa M., Ikeno M., Okazaki T., Takami Y., Nakayama T., and Oshimura M. 2004. Dicer is essen­tial for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 6: 784-791.

Garcia-Manero G. and Issa J.P. 2005. Histone deacetylase inhibitors: A review of their clinical status as antineoplastic agents. Cancer Invest. 23: 635-642.

Gilbert N., Boyle S., Fiegler H., Woodfine K., Carter N.P., and Bickmore W.A. 2004 Chromatin architecture of the human genome: Generich domains are enriched in open chromatin fibers. Cell 118: 555-566.

Gilfillan G.D., Dahlsveen I.K., and Becker P.B. 2004. Lifting a chromosome: Dosage compensation in Drosophila melanogaster. FEBSLett. 567: 8-14.

Goll M.G., Kirpekar E., Maggert K.A., Yoder J.A., Hsieh C.L., Zhang X., Golic K.G., Jacobsen S.E., and Bestor T.H. 2006. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase ho­molog Dnmt2. Science 311: 395-398.

Gonzalo S. and Blasco M.A. 2005. Role of Rb family in the epigenetic definition of chromatin Cell Cycle 4: 752-755.

Gottschling D.E., Aparicio O.M., Billington B.L., and Zakian V.A. 1990. Position effect at S. cerevisiae telomeres: Reversible repres­sion of Pol II transcription. Cell 63: 751-762.

Grant P.A., Duggan L., Cote J., Roberts S.M., Brownell I.E., Candau R., Ohba R., Owen-Hughes T., Allis CD., Winston E, et al. 1997. Yeast Gcn5 functions in two multisubunit complexes to acetylate nucleosomal histones: Characterization of an Ada complex and the SAGA (Spt/Ada) complex. Genes Dev. 11: 1640-1650.

Greiner D., BonaldiT., Eskeland R., RoemerE., and ImhofA. 2005. Identification of a specific inhibitor of the histone methyltrans­ferase SU(VAR)3-9. Nat. Chem. Biol. 1: 143-145.

Grewal S.I. and Klar A.J. 1996. Chromosomal inheritance of epi­genetic states in fission yeast during mitosis and meiosis. Cell 86: 95-101.

Grozinger C.M. and Schreiber S.L. 2002. Deacetylase enzymes: Biological functions and the use of small molecule inhibitors. Chem. Biol. 9: 3-16.

Guarente L. and Picard E 2005. Calorie restriction — The SIR2 connection. Cell 120: 473-482.

Hall I.M., Shankaranarayana G.D., Noma K., Ayoub N., Cohen A., and Grewal S.L. 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2232-2237.

Hanahan D. and Weinberg R.A. 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70.

Harvey A.C. and Downs J .A. 2004. What functions do linker histones provide? Mol. Microbiol. 53: 771-775.

Hassan A.H., Prochasson P., Neely K.E., Galasinski S.C., Chandy M., Carrozza M.J., and Workman J.L. 2002. Function and se­lectivity of bromodomains in anchoring chromatin-modifying complexes to promoter nucleosomes. Cell 111: 369-379.

Heard E. 2005. Delving into the diversity of facultative heterochro­matin: The epigenetics of the inactive X chromosome. Curr. Opin. Genet. Dev. 15: 482-489.

Henikoff S. 2005. Histone modifications: Combinatorial complex­ity or cumulative simplicity? Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 5308- , 5309.

Henikoff S. and Ahmad K. 2005. Assembly of vanant histones into chromatin. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 21: 133-153.

Herr A.J., Jensen M.B., DalmayT., and Baulcombe D.C. 2005. RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science 308: 118-120.

Hirota T., Lipp J.J., Toh B.H., and Peters J.M. 2005. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature 438: 1176-1180.

Hochedlinger K., Blelloch R., Brennan C, Yamada Y, Kim M., Chin L., and Jaenisch R. 2004. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes Dev. 18: 1875-1885.

Holbert M.A. and Marmorstein R. 2005. Structure and activity of enzymes that remove histone modifications. Curr. Opin. Struct. Biol. 15: 673-680. Holliday R. 1994. Epigenetics: An overview. Dev. Genet. 15: 453-457.

Ishii K.J. and Akira S. 2005. TLR ignores methylated RNA? Im­munity 23: 111-113.

Jackson J.P., Lindroth A.M., CaoX., and Jacobsen S.E. 2002. Con­trol of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase. Nature 416: 556-560.

Jacobson R.H., Ladumer A.G., King D.S. andTjian R. 2000. Struc­ture and function of a human TAFII250 double bromodomain module. Science. 288: 1422-1425.

Jaenisch R. and Bird A. 2003. Epigenetic regulation of gene expres­sion: How the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet, (suppl.) 33: 245-254.

Janicki S.M., Tsukamoto T., Salghetti S.E., Tansey W.P., Sachidanan- dam R., Prasanth K.V., Ried T., Shav-Tal Y., Bertrand E., Singer R.H., and Spector D.L. 2004. From silencing to gene expression: Real-time analysis in single cells. Cell 116: 683-698.

Jeddeloh J.A., Stokes..L., and Richards E.J. 1999. Maintenance of genomic methylation requires a SWI2/SNF2-like protein. Nat. Genet. 22: 94-97.

Jenuwein T. and Allis C.D. 2001. Translating the histone code. Sci­ence 293: 1074-1080.

Jones RA. and Martienssen R. 2005. A blueprint for a Human Epigenome Project: The AACR Human Epigenome Workshop. Cancer Res. 65: 11241-11246.

Kanellopoulou C, Muljo S.A., Kung A.L., Ganesan S., Drapkin R., Jenuwein T., Livingston D.M., and Rajewsky K. 2005. Dicer- deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentia­tion and centromeric silencing. Genes Dev. 19: 489-501.

Kayne P.S., Kim U.J., Han M., Mullen J.R., Yoshizaki E, and Grunstein M. 1988. Extremely conserved histone H4 N terminus is dispensable for growth but essential for repressing the silent mating loci in yeast. Cell 55: 27- 39.

Khochbin S. 2001. Histone HI diversity: Bridging regulatory signals to linker histone function. Gene 271: 1-12.

Khorasanizadeh S. 2004. The nucleosome: From genomic organiza­tion to genomic regulation. Cell 116: 259-272.

Kim J., Daniel J., Espejo A., Lake A., Krishna M., Xia L., Zhang Y., and Bedford M.X. 2006. Tudor, MBT and chromo domains gauge the degree of lysine methylation. EMBO Rep. 4: 397-403.

Kimmins S. and Sassone-Corsi P. 2005. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature 434: 583-589.

KlarAJ. 1998. Propagating epigenetic states through meiosis: Where Mendel’s gene is more than a DNA moiety. Trends Genet. 14: 299-301.

KlarAJ. 2004. An epigenetic hypothesis for human brain laterality, handedness, and psychosis development. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 499-506.

Knoepfler P.S., ZhangX.-Y., Cheng R.E., Gafken P.R., McMahon S.B., and Eisenman R.N 2006. Myc influences global chromatin structure. EMBO J. 25: 2723-2734.

Komberg R.D. 1974. Chromatin structure: A repeating unit of his­tones and DNA. Science 184: 868-871.

Lachner M., O’Sullivan R.J., and Jenuwein T 2003. An epigenetic road map for histone lysine methylation. J. Cell Sci. 116: 2117-2124.

Lachner M., Sengupta R., Schotta G., and Jenuwein T. 2004. Trilo­gies of histone lysine methylation as epigenetic landmarks of the eukaryotic genome. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 209-218.

Lachner M., O’Carroll D., Rea S., Mechtler K., and Jenuwein T. 2001 Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410: 116-120.

Langst G. and Becker P.B. 2004. Nucleosome remodeling: One mecha­nism, many phenomena? Biochim. Biophys. Acta 1677: 58-63.

Lee D.Y., Teyssier C, Strahl B.D., and Stallcup M.R. 2005. Role of protein methylation in regulation of transcription. Endocr. Rev. 26: 147-170.

Lee T.L, Jenner R.G., Boyer L.A., Guenther M.G., Levine S.S., Kumar R.M., Chevalier B., Johnstone S.E., Cole M.F., Isono K., et al. 2006. Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125: 301-313.

LengauerC., KinzlerK.W., and Vogelstein B. 1998. Genetic instabili­ties in human cancers. Nature 396: 643-649.

Li E., Bestor T.H., and Jaenisch R. 1992. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69: 915-926.

Lippman Z., Gendrel A.V., Black M., Vaughn M.W., Dedhia N., McCombie W.R., Lavine K., Mittal V., May B., Kasschau K.D., et al. 2004. Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control. Nature 430: 471-476.

Litt M.D., Simpson M., Gaszner M., Allis C.D., and Felsenfeld G. 2001. Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus. Science 293: 2453-2455.

Luger K., Mader A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., and Richmond T.J. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 E resolution. Nature 389: 251-260.

Lund A.H. and van Lohuizen M. 2004. Polycomb complexes and silencing mechanisms. Curr. Opin. Cell Biol. 16: 239-246.

Lyko F. 2001. DNA methylation learns to fly. Trends Genet. 17: 169- 172.

Maher E.R. 2005. Imprinting and assisted reproductive technology. Hum. Mol. Genet 14 Spec. No. 1: R133-R138.

Maison C., Bailly D., Peters A.H., Quivy J.P., Roche D., Taddei A., Lachner M., Jenuwein T., and Almouzni G. 2002. Higher-order structure in pericentric heterochromatin involves a distinct pattern of histone modification and an RNA component. Nat. Genet. 30: 329-334.

Marks P. A. and Jiang X. 2005. Histone deacetylase inhibitors in pro­grammed cell death and cancer therapy. Cell Cycle 4: 549-551.

Martens J.H., O’Sullivan R.J., Braunschweig U., Opravil S., Radolf M , Steinlein P., and Jenuwein T. 2005. The profile of repeat- associated histone lysine methylation states in the mouse epig­enome. EMBO J. 24: 800-812.

Maurer-Stroh S., Dickens N.J., Hughes-Davies L., Kouzarides T., Eisenhaber R., and Ponting C.P. 2003. The Tudor domain ‘Royal Family’: Tudor, plant Agenet, Chromo, PWWP and MBT domains. Trends Biochem. Sci. 28: 69-74.

MayerW., Niveleau A., Walter J., Fundele R., and HaafT. 2000. Dem- ethylation of the zygotic paternal genome. Nature 403: 501-502.

McClintock B. 1951. Chromosome organization and genic expres­sion. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 16: 13-47.

McGarvey K., Fahmer J., Green E., Martens J., Jenuwein T., and Baylin S.B. 2006. Silenced tumor suppressor genes reactivated by DNA demethylation do not return to a fully euchromatic chromatin state. Cancer Res. 66: 3541-3549.

McGrath J. and Solter D. 1984. Completion of mouse embryogenesis re­quires both the maternal and paternal genomes. Cell 37: 179-183.

Metzger E., Wissmann M., Yin N., Muller J.M., Schneider R., Pe­ters A.H., Gunther T, Buettner R., and Schule R. 2005. LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen- receptor-dependent transcription. Nature 437: 436-439.

Meyer B.J., McDonel P., Csankovszki G., and Ralston E. 2004. Sex and X-chromosome-wide repression in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 71-79.

Misteli T. 2004. Spatial positioning; a new dimension in genome function. Cell 119: 153-156.

Mito Y., Henikoff J.G., and Henikoff S. 2005. Genome-scale pro­filing of histone H3.3 replacement patterns. Nat. Genet. 37: 1090-1097.

Mizuguchi G, Shen X., Landry J., Wu W.H., Sen S., and Wu C. 2004 ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science 303: 343-348.

Mochizuki K., Fine N.A., Fujisawa T., and Gorovsky M.A. 2002. Analysis of a piwi-related gene implicates small RNAs in genome rearrangement in tetrahymena. Cell 110: 689-699.

Mohrmann L. and Verrijzer C.P. 2005. Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling com­plexes. Biochim. Biophys. Acta 1681: 59-73.

Morgan H.D., Santos F, Green K., Dean W., and Reik W. 2005. Epigenetic reprogramming in mammals. Hum. Mol. Genet. 14 Spec. No. 1: R47-R58.

Motamedi M.R., Verdel A., Colmenares S.U., Gerber S.A., Gygi S.R, and Moazed D. 2004. Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to noncoding centromeric RNAs. Cell 119: 789-802.

Muller H.J. 1930. Types of visible variations induced by X-rays in Drosophila. J. Genet. 22: 299-334.

Nakayama J., Rice J.C., Strahl B.D., Allis C.D., and Grewal S.I. 2001. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. Science 292: 110-113.

Narita M., Nunez S., Heard E., Narita M., Lin A.W., Hearn S.A., Spector D.L., Hannon G.J., and Lowe S.W. 2003. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell 113: 703-716.

Narlikar G.J., Fan H.Y., and Kingston R.E. 2002. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and tran­scription. Cell 108: 475-487.

Nowak S.J. and Corces V.G. 2004. Phosphorylation of histone H3: A balancing act between chromosome condensation and tran­scriptional activation. Trends Genet. 20: 214-220.

Orphanides C., LeRoy G., Chang C.H., Luse D.S., and Reinberg D. 1998. FACT, a factor that facilitates transcript elongation through nucleosomes. Cell 92: 105-116.

Pal-Bhadra M., Leibovitch B.A., Gandhi S.G., Rao M., Bhadra U., Birchler J.A., and Elgin S.C. 2004. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303: 669-672.

Paro R. and Hogness D.S. 1991. The Polycomb protein shares a homologous domain with a heterochromatin-associated protein of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 263-267.

Petersen-Mahrt S. 2005. DNA deamination in immunity. Immunol. Rev. 203: 80-97.

Pirrotta V. 1998. Polycombingthe genome: PcG, trxG, and chromatin silencing. Cell 93: 333-336.

Pontier D., Yahubyan G., Vega D., Bulski A., Saez-Vasquez J., Hakimi M.A., Lerbs-Mache S., Colot V., and Lagrange T. 2005. Reinforcement of silencing at transposons and highly repeated sequences requires the concerted action of two distinct RNA polymerases IV in Arabidopsis. Genes Dev. 19: 2030-2040.

Ratcliff R., Harrison B.D., and Baulcombe D.C. 1997. A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: 1558-1560.

Razin A. and Riggs A.D. 1980. DNA methylation and gene function. Science 210: 604-610.

Rea S., Eisenhaber E., O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W., Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., Allis C.D., and Jenuwein T 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599.

Reinberg D., Chuikov S., Famham P., Karachentsev D., Kirmizis A., Kuzmichev A., Margueron R., Nishioka K., Preissner T.S., Sarma K., et al. 2004. Steps toward understanding the inheritance of repressive methyl-lysine marks in histones. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 171-182.

Reinhart B.J. and Bartel D.P. 2002. Small RNAs correspond to cen­tromere heterochromatic repeats. Science 297: 1831.

Rme J. 2005. Cell biology. Twists in the tale of the aging yeast. Sci­ence 310: 1124-1125.

Ringrose L. and Paro R. 2004 Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins. Annu. Rev. Genet. 38: 413-443.

Ringrose L., Ehret H., and Paro R. 2004. Distinct contributions of histone H3 lysine 9 and 27 methylation to locus-specific stability of polycomb complexes. Mol. Cell 16: 641-653.

Robertson K.D. 2005. DNA methylation and human disease. Nat. Rev. Genet. 6: 597-610.

RoloffT.C. and Nuber U.A. 2005. Chromatin, epigenetics and stem cells. Eur. J. Cell Biol. 84: 123-135.

Roth S.Y., Denu J.M., and Allis C.D. 2001. Histone acetyltrans- ferases. Annu. Rev. Biochem. 70: 81-120.

Sanchez-Eisner T., Gou D., Kremmer E., and Sauer F. 2006. Non­coding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ashl to ultrabithorax. Science 311: 1118-1123.

Santos-Rosa H., Schneider R., Bannister A. J., Sherriff J., Bernstein B. E., Emre N.C., Schreiber S.L., Mellor J., and Kouzarides T. 2002. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature 419: 407-411.

Sarma K. and Reinberg D. 2005. Histone variants meet their match. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 139-149.

Scaffidi P., Gordon L., and Misteli T. 2005. The cell nucleus and aging: Tantalizing clues and hopeful promises. PLoS. Biol. 3: e395.

Schalch T., Duda S., Sargent D.E, and Richmond T.J. 2005. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chro­matin fibre. Nature 436: 138-141.

Schmitt S., Prestel M., and Paro R. 2005. Intergenic transcription through a polycomb group response element counteracts silenc­ing. Genes Dev. 19: 697-708.

Schneider R., Bannister A. J., and Kouzarides T. 2002. Unsafe SETs: Histone lysine methyltransferases and cancer. Trends Biochem. Sci. 27: 396-402.

Schreiber S.L. and Bernstein B.E. 2002. Signaling network model of chromatin. Cell 111: 771-778.

Schwartz B.E. and Ahmad K. 2005. Transcnptional activation trig­gers deposition and removal of the histone variant H3.3. Genes Dev. 19: 804-814.

Schwartz Y.B., Kahn T.G., and Pirrotta V. 2005. Characteristic low density and shear sensitivity of cross-linked chromatin containing polycomb complexes. Mol. Cell Biol. 25: 432-439.

Sekinger E.A., Moqtaderi Z., and Struhl K. 2005. Intrinsic histone- DNA interactions and low nucleosome density are important for preferential accessibility of promoter regions in yeast. Mol Cell 18: 735-748.

Seligson D.B., Horvath S., Shi T., Yu H., Tze S., Grunstein M., and Kurdistani S.K. 2005. Global histone modification patterns pre­dict risk of prostate cancer recurrence. Nature 435: 1262-1266.

ShenX., Mizuguchi G., Hamiche A., and Wu C. 2000. A chromatin remodeling complex involved in transcription and DNA process­ing. Nature 406: 541-544

Shi Y., Lan E., Matson C, Mulligan P., Whetstine J.R., Cole P.A., Casero R.A., and Shi Y. 2004. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119: 941-953.

Shorter J. and Lindquist S. 2005. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat. Rev. Genet. 6: 435-450.

Sims R.J., III, Belotserkovskaya R., and Reinberg D. 2004. Elonga­tion by RNA polymerase II : The short and long of it. Genes Dev. 18: 2437-2468.

Smith C.L. and Peterson C.L. 2005. ATP-dependent chromatin remodeling. Curr. Top. Dev. Biol. 65: 115-148.

Squazzo S.L., O’Geen H., Komashko V.M., Krig S.R., Jin V.X., Jang S.W., Margueron R., Reinberg D., Green R., and Famham RJ. 2006 Suzl2 binds to silenced regions on the genome in a cell- type-specific manner. Genome Res. 16: 890-900.

Sterner D.E. and Berger S.L. 2000. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 435- 459.

Strahl B.D. and Allis C.D. 2000. The language of covalent histone modifications. Nature 403: 41-45.

Strahl B.D., Ohba R., Cook R.G., and Allis C.D. 1999. Methylation of histone H3 at lysine 4 is highly conserved and correlates with transcriptionally active nuclei in Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 14967-14972.

Su G.H., Sohn T.A., Ryu B., and Kern S.E. 2000. A novel histone deacetylase inhibitor identified by high-throughput transcription­al screening of a compound library. Cancer Res. 60: 3137-3142.

Sung S. and Amasino R.M. 2004. Vernalization in Arabidopsis thaliana is mediated by the PHD finger protein VIN3. Nature 427: 159-164.

Surani M.A., Barton S.C, and Norris M.X. 1984. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature 308: 548-550.

Tagami H., Ray-Gallet D., Almouzni G., and Nakatani Y. 2004 Histone H3.1 and H3.3 complexes mediate nucleosome as­sembly pathways dependent or independent of DNA synthesis. Cell 116: 51-61.

Tamaru H. and Selker E.V. 2001. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 414: 277-283.

Tanaka E.M. 2003. Regeneration: If they can do it, why can’t we? Cell 113: 559-562.

Thomas J.O. 1999. Histone HI: Location and role. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 312-317.

Tsukada Y., Fang J., Erdjument-Bromage H., Warren M.E., Borch- ers C.H., Tempst P., and Zhang Y. 2006. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins. Nature 439: 811-816

TsukiyamaT., Daniel C., Tamkun J., and Wu C. 1995. ISWI, amember of the SWI2/SNF2 ATPase family, encodes the 140 kDa sub­unit of the nucleosome remodeling factor Cell 83: 1021-1026.

Turner B.M. 2000. Histone acetylation and an epigenetic code. Bio Essays 22: 836-845.

Valk-Lingbeek M.E., Bruggeman S.W., and van Lohuizen M. 2004. Stem cells and cancer; the polycomb connection. Cell 118: 409-418

van Attikum H. and Gasser S.M. 2005. The histone code at DNA breaks: A guide to repair? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 757-765.

van der Heijden G.W., Dieker J.W., DerijckA.A., Muller S., Berden J.H , Braat D.D., van der Vlag J., and de Boer P. 2005. Asymmetry in histone H3 variants and lysine methylation between paternal and maternal chromatin of the early mouse zygote. Mech. Dev. 122: 1008-1022.

Vaquero A., Loyola A., and Reinberg D. 2003. The constantly changing face of chromatin. Sci. Aging Knowledge Environ. 2003: RE4.

Varga-Weisz P.D., Wilm M., Bonte E., Dumas K., Mann M., and Becker P.B. 1997. Chromatin-remodeling factor CHRAC contains the ATPases ISWI and topoisomerase II. Nature 388: 598-602

Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T., Gygi S., Grewal S.L, and Moazed D. 2004. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science 303: 672-676.

Vidanes C.M., Bonilla C.Y., and Toczyski D.P. 2005. Complicated tails: Histone modifications and the DNA damage response. Cell 121: 973-976.

Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., and Workman J.L.. 2000. ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol. Cell. Biol. 20: 1899-1910.

Vire E., Brenner C., Deplus R., Blanchon L., Fraga M., Didelot C. , Morey L., Van E.A., Bernard D., Vanderwinden J.M., et al. 2005. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation Nature 439: 861-874.

Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng C., Grewal S.L, and Mar- tienssen R.A. 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 1833-1837.

Waddington C.H. 1957. The strategy of the genes. MacMillan, New York.

Wade P.A., Gegonne A., Jones P.L., Ballestar E., Aubry E., and Wolffe A.P. 1999. Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodeling and histone deacetylation. Nat. Genet. 23: 62-66.

Walsh C.P., Chaillet J .R., and Bestor T.H. 1998. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation. Nat. Genet. 20: 116-117.

Watanabe Y., Yokobayashi S., Yamamoto M., and Nurse P. 2001. Premeiotic S phase is linked to reductional chromosome segregation and recombination. Nature 409: 359-363.

Watson J.D. 2003. Celebrating the genetic jubilee: A conversation with James D. Watson. Interviewed by John Rennie. Sci. Am. 288: 66-69.

Wei Y., Yu L., Bowen J., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 1999. Phos­phorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97: 99-109.

Whetstine J.R., Nottke A., Lan R., Huarte M., Smolikov S., Chen Z., Spooner E., Li E., Zhang G., Colaiacovo M., and Shi Y. 2006. Reversal of histone lysine trimethylation by the JMJD2 family of histone demethylases. Cell 125: 467-481.

Wolffe A.P. and Matzke M.A. 1999. Epigenetics: Regulation through repression. Science 286: 481-486.

Wysocka J., Swigut T., Milne T.A., Dou Y., Zhang X., Burlingame A.L., Roeder R.G., Brivanlou A.H., and Allis C.D. 2005. WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for H3 K4 methylation and vertebrate development. Cell 121: 859-872.

Yan Q., Huang J., Fan T., Zhu H., and Muegge K. 2003. Lsh, a modulator of CpG methylation. is crucial for normal histone methylation. EMBO J. 22: 5154-5162.

Yu B., Yang Z., Li J., Minakhina S., Yang M., Padgett R.W., Steward R., and Chen X. 2005. Methylation as a crucial step in plant micro RNA biogenesis. Science 307: 932-935.

Zhang Y. and Reinberg D. 2001. Transcription regulation by histone methylation: Interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15: 2343-2360.

Zhang Y., LeRoy G., Seeiig H.R, Lane W.S., and Reinberg D. 1998. The dermatomyositis-specific autoantigen Mi2 is a component of a complex containing histone deacetylase and nucleosome remodeling activities. Cell 95: 279-289.