Ваниль - читать бесплатно онлайн полную версию книги автора Эрик Оду (Глава 12. Развитие ароматических качеств вяленых ванильных стручков ( Vanilla planifolia G. Jackson)) #14

Глава 12. Развитие ароматических качеств вяленых ванильных стручков (Vanilla planifolia G. Jackson)

Состав летучих соединений в вяленых ванильных стручках

Анализ летучей фракции ванили, которая, как это ни парадоксально, мало исследовалась, позволил обнаружить и идентифицировать более 150 молекул, принадлежащих к многочисленным химическим классам (Klimes and Lamparsky, 1976; Galetto and Hoffman, 1978; Schulte-Elte et al., 1978; Nakasawa et al., 1981; Vidal et al., 1989; Adedeji et al., 1993; Kiridena et al., 1994; Ramaroson-Raonizafinimanana et al., 1997; Werkhoff and Günter, 1997; Sostaric et al., 2000; Perez-Silva et al., 2006).

С химической точки зрения эти различные соединения принадлежат к следующим классам: углеводороды, спирты, альдегиды, кетоны, сложные эфиры, лактоны, кислоты, терпеноиды, гетероциклические соединения и фенолы.

Среди углеводородов было идентифицировано большое количество алканов (таких как н-пентакозан), метилированные и этилированные производные этих алканов, алкены (такие как 1-гентриаконтан), терпеноиды (такие как α-пинен или лимонен) и ароматические кольца (например, бензол и некоторые его производные) (рис. 12.1).

Алифатические кислоты (такие как уксусная и линолевая кислоты) также представлены рядом молекул, также как ароматическими кислотами (такими как бензойная или коричная кислоты) (рис. 12.1).

РИСУНОК 12.1. Химические структуры некоторых летучих соединений из различных химических классов, идентифицированных в вяленых стручках ванили.

Также найдены алифатические и ароматические сложные эфиры (такие как этиловый эфир линолевой кислоты или метиловый эфир коричной кислоты), и даже терпеновые сложные эфиры (такие как α-терпиниловый эфир уксусной кислоты) (рис. 12.1).

Были идентифицированы алифатические спирты (такие как 2,3-бутандиол), ароматические спирты (такие как бензиловый спирт) и даже терпеноиды (такие как линалол) (рис. 12.1).

Также присутствуют алифатические альдегиды (такие как 2-гептеналь), терпеновые альдегиды (такие как β-циклоцитал), алифатические кетоны (такие как 3-гидрокси-2-бутанон) и ароматические кетоны (такие как ацетофенон) (рис. 12.1).).

Сообщалось также, что некоторые лактоны входят в состав летучей фракции ванили (например, γ-бутиролактон) наряду с гетероциклическими соединениями (такими как фурфурол или цис-витиспиран) (рис. 12.1).

Наконец, фенолы, которые являются основными представителями (как качественно, так и количественно) летучей фракции вяленой ванили и которые также могут нести альдегидные группы (такие как 3-метокси-4-гидроксибензальдегид или ванилин), кислотные группы (такие как 4-гидроксибензойная кислота), функциональные группы спирта (такие как 4-гидроксибензиловый спирт) и даже функциональные группы кетонов (такие как ацетованиллон) (рис. 12.1). Существуют многочисленные сложные эфиры (такие как метиловый эфир салициловой кислоты), также как и простые эфиры (такие как 4-гидроксибензилметиловый эфир) (рис. 12.1).

Достаточно исчерпывающий список соединений, обнаруженных в ванили, можно найти в двух недавних обзорных статьях (Dignum et al., 2001 и Ranadive, 2006).

Этот состав может варьироваться в зависимости от географического происхождения (понятие «терруар» в широком смысле) и ботанического происхождения образцов (Adedeji et al., 1993).

Что касается ботанического аспекта, то только виды V. planifolia, Vanilla tahitensis (см. главу 13) и в меньшей степени V. pompona (Ehlers and Pfister, 1997) были предметом исследования их ароматического состава. Но даже в случае V. planifolia предстоит провести много исследований с использованием четко определенного генетического материала и стандартизированного процесса обработки.

Наконец, следует помнить, что методы экстракции и анализа также могут приводить к изменчивости ароматического состава (а также в артефактах).

В количественном отношении основным компонентом в вяленой ванили является ванилин (3-метокси-4-гидроксибензальдегид, рис. 12.2), концентрация которого может достигать нескольких десятков граммов на килограмм сухого веса (другими словами, нескольких десятков тысяч частей на миллион) (ISO 5565-1). Три других соединения также обычно оцениваются количественно, поскольку они считаются индикаторами качества и подлинности (см. главу 15); это пара-гидроксибензальдегид и ванильная кислота (рис. 12.2), концентрации которых обычно измеряются на уровне около 1 г/кг сухого веса (или около 1000 ppm), другими словами, примерно в 10 раз ниже, чем у ванилина, и, наконец, пара-гидроксибензойная кислота (рис. 12.2), средняя концентрация которой составляет около 100 мг/кг сухого веса (или около 100 частей на миллион), другими словами, в 100 раз ниже, чем у ванилина. Эти цифры, конечно, могут значительно варьировать в зависимости от качества продукта (Gassenmeier et al., 2008; Saltron et al., 2002).

Другие соединения также были измерены при концентрациях более 100 ppm, такие как уксусная кислота или 4-гидроксибензил-метиловый эфир (Klimes and Lamparsky, 1976), а также гексадекановая кислота и линолевая кислота (Perez-Silva et al., 2006) (Рисунок 12.2). Есть даже сообщения (Adedeji et al., 1993) о большом количестве соединений с концентрацией более 1000 ppm, таких как 2-фурфурол (который на самом деле является вторым по распространенности соединением после ванилина в образце мексиканской ванили) или 3,5-дигидрокси-6-метил-2,3-дигидро-4H-пиран-4-он (рис. 12.2), который превышает 3000 ppm в большинстве проанализированных образцов, другими словами, концентрации выше, чем у пара-гидроксибензальдегида и ванильной кислоты.

РИСУНОК 12.2. Химические структуры основных соединений (количественно), обнаруженных в летучей фракции вяленых стручков ванили.

Тем не менее, следует отметить, что методы анализа и измерения этих соединений сильно различаются от одного автора к другому, а также сильно отличаются от стандартизированных методов (ISO 5565-2), что объясняет наблюдаемые различия.

Фактически, общепризнанно, что 95% летучих соединений в выдержанной ванили обнаруживаются при концентрациях менее 10 ppm (Hoffman et al., 2005).

Хотя ванилин является основным компонентом количественно, эта молекула сама по себе не объясняет качества общего аромата ванили. Трудно даже показать корреляцию между содержанием ванилина и сенсорным профилем ванильного экстракта (Gassenmeier et al., 2008). На самом деле, что довольно удивительно, было опубликовано очень мало исследований о вкладе различных ароматических соединений в качество аромата и вкуса вяленой ванили.

С использованием ГХ-ольфактометрии (но без подробного описания используемой методологии), найдено, что пара-крезол, 2-фенилэтанол, гваякол и 4-креозол (рис. 12.3) оказывают значительное влияние на аромат ванили (Dignum et al. 2004). Также с помощью ГХ-ольфактометрии обнаружено 26 ароматически активных соединений в экстракте мексиканской ванили (Perez-Silva et al., 2006); из этих соединений 13 являются производными фенилпропаноидного пути (см. главу 10), некоторые из которых, такие как гваякол, 4-креозол, ацетованиллон и метиловый эфир салициловой кислоты (рис. 12.3), по интенсивности сходны с ванилином, в то время как в экстракте их концентрации в 1000 раз (а иногда и меньше) ниже. Следует отметить, что пара-крезол, метиловый эфир коричной кислоты и анизиловый спирт (рис. 12.3) имеют промежуточную интенсивность, хотя их концентрация составляет всего несколько частей на миллион. В целом, эти соединения отвечают за сладкие, древесные, бальзамические, пряные, ванильные и поджаренные ноты. Некоторые алифатические альдегиды, спирты и кислоты также имеют промежуточную интенсивность, несмотря на концентрации менее 10 ppm.

В исследовании, направленном на сопоставление сенсорного анализа и химического анализа с целью классификации качества экстрактов ванили (Hoffman et al., 2005), идентифицировано 14 соединений, которые были обнаружены почти во всех исследованных экстрактах (всего 55 образцов) и положительно или отрицательно повлияли на аромат и вкус.

Этиловый эфир уксусной кислоты, этиловый эфир гексановой кислоты, этиловый эфир октановой кислоты, этиловый эфир нонановой кислоты и этилгексанол (рис. 12.3) сильно коррелируют с критерием «связанный с возрастом»; 4-гидроксибензил-этиловый эфир, этилванилин и ацетальдегид этилацетат (рис. 12.3) сильно коррелируют с критерием «ромовый/смолистый»; пара-гидроксибензальдегид и ванилин (рис. 12.3) сильно коррелируют с критерием «ванильный». Все эти соединения связаны с положительными критериями, в то время как пара-гидроксибензойная кислота, ванильная кислота, гваякол и нонановая кислота (рис. 12.3) сильно коррелируют с критерием «дымный/фенольный» – другими словами, с отрицательным дескриптором.

РИСУНОК 12.3. Химическая структура некоторых ароматически активных соединений, обнаруженных в вяленых стручках ванили.

Наконец, следует упомянуть менее летучие молекулы, которые, следовательно, влияют на качество вкуса, а не на аромат, и являются предметом недавних публикаций (Gatfield et al., 2006; Schwarz and Hofmann, 2009). Семь молекул (рис. 12.4), включая диванилин, были идентифицированы в вяленой ванили и экстрактах и участвуют в создании ощущения бархатистого вкуса во рту. Диванилин, например, был обнаружен в концентрации около 170 ppm в мадагаскарской ванили (Gatfield et al., 2006). Эти молекулы в основном являются продуктами конденсации двух фенольных соединений.

РИСУНОК 12.4. Химические структуры соединений, участвующих в ощущении бархатистого вкуса во рту, идентифицированные в ванильных стручках.

Состав глюкозилированных соединений в зеленых стручкахх ванили

Как упоминалось в предыдущем разделе, наиболее важные соединения в летучей фракции, как количественно, так и качественно, имеют ароматическое кольцо и являются производными фенилпропаноидного пути. Многие из них также содержатся в зеленых плодах в виде гликозидов – другими словами, связанных гликозидной связью (например, O-гликозидом) с одной или несколькими группами сахаров – и не влияют на обоняние.

Исторически давно подозревали присутствие глюкозилированных предшественников аромата в зеленых стручках ванили. После долгих споров (Lecomte, 1901, 1913; Goris, 1924) было установлено, что «ваниллозид» (глюкованилин) был прямым предшественником ванилина и что три других предшественника также существовали, но в меньших количествах. В разных публикациях описаны попытки их выделения и идентификации (Горис, 1947; Janot, 1954). Это глюкозиды ванилинового спирта («ваниллозид»), протокатехинового альдегида (3,4-дигидроксибензальдегид) и неидентифицированного сложного эфира (рис. 12.5).

Совсем недавно глюкозиды ванилина, пара-гидроксибензальдегида, пара-гидроксибензойной кислоты и ванильной кислоты (рис. 12.5) были идентифицированы в зеленой ванили (V. planifolia, происхождение Коморские острова, Реюньон, Мадагаскар, Индонезия) с использованием современных аналитических методов (Leong et al., 1989a,b; Leong, 1991). Более того, глюкоза, по-видимому, является основным сахаром, поскольку кислотный гидролиз предварительно очищенного экстракта ванильных гликозидов с последующим анализом ацетилирования позволяет получить около 20% глюкозы, 1% маннозы и следы рамнозы (процентное содержание выражено по отношению к исходному сухому веществу).

РИСУНОК 12.5. Химические структуры различных агликонов, обнаруженных в виде глюкозидов в зеленых стручках ванили по данным разных авторов.

Канисава (Kanisawa, 1993) идентифицировал глюкозиды 31 молекулы (рис. 12.5) в зеленых стручках ванили (V. planifolia, происхождение из Индонезии), включая ванилин, пара-гидроксибензальдегид, пара-гидроксибензойную кислоту, ванильную кислоту и ванилиновый спирт, уже идентифицированные предыдущими авторами. Такие соединения, как 2-фенилэтанол, метиловый эфир салициловой кислоты, пара-крезол и ацетованиллон – ароматически активные соединения – также были обнаружены в глюкозилированной форме.

Этот автор также выделил и идентифицировал пара-гидридроксибензиловый спирт и два диглюкозида, бис[4-(β-d-глюкопиранозилокси)-бензил] 2-изопропил-тартрат (глюкозид A) и бис бис[4-(β-d-глюкопиранозилокси)-бензил] 2(1-метил-пропил)-тартрат (глюкозид B), которые, тем не менее, являются только посредниками в пути биосинтеза фенольных соединений.

Однако, в более поздней публикации Канисава не подтвердили идентификацию глюкозидов 4 метиловых эфиров: метилового эфира феруловой кислоты, метилового эфира пара-гидроксибензойной кислоты, метилового эфира ванильной кислоты и метилового эфира пара-гидридроксикоричной кислоты (Kanisawa et al., 1994). Что еще более удивительно, он также не подтвердил в этой публикации присутствие глюкозидов пара-гидроксибензойной кислоты и бензилового спирта.

В недавно опубликованном исследовании, в зеленой ванили (V. planifolia, происхождение Индонезия) искались различные глюкозиды (Dignum et al., 2004). Идентифицированы различные глюкозиды ванилина, ванильной кислоты, пара-гидроксибензальдегида, пара-крезола, креозола, ванилинового спирта и двух диглюкозидов A и B (рис. 12.5). В предыдущем исследовании эти авторы также обнаружили глюкозид гваякола, соединение, которое они впоследствии не смогли выделить (Dignum et al., 2002).

Наконец, Перес-Силва идентифицировал 17 глюкозидов в зеленых стручках ванили из Мексики, включая глюкозид анизилового спирта (рис. 12.5), о чем было впервые сообщено (Perez-Silva, 2006).

Однако, важно отметить, что присутствие многих из вышеупомянутых молекул должно быть подтверждено, поскольку, только глюкозиды ванилина, пара-гидроксибензальдегида, пара-гидроксибензойной кислоты, ванильной кислоты и глюкозиды A и B были формально изолированы и идентифицированы. Большинство других упомянутых глюкозидов сначала гидролизованы действием β-глюкозидазы, а потом идентифицированы свободные агликоны. Такой подход может привести к появлению артефактов из-за реакционной способности агликонов после их высвобождения.

Образование ароматических соединений при обработке

Глюкозиды

Как упоминалось в главе 11, наиболее известной реакцией в развитии ароматических качеств ванили во время вяления является гидролиз различных глюкозидов, являющихся предшественниками вышеупомянутых ароматических соединений. Это основная реакция в развитии аромата ванили, поскольку она позволяет агликону, который может обладать запахом, высвобождаться из глюкозида, у которого его нет.

Эта реакция может осуществляться либо химически в кислых условиях, либо ферментативно с использованием β-глюкозидазы (или, в более общем смысле, с помощью гликозидазы, в зависимости от природы сахара, связанного с агликоном). В случае глюкованилина, несмотря на некоторые споры (см. главу 11), теперь признано, что этот гидролиз является результатом одной или нескольких β-глюкозидаз, эндогенных для плода.

Эта идея была впервые выдвинута Миллером в 1754 г. (цитируется по Жано [Janot, 1954]). Затем Лекомт смог доказать существование ферментов гидратант и оксидант – вероятно, происхождением от термина ферментация, который до сих пор часто неправильно ассоциируется с ванильной выдержкой – и изучил их роль в развитии аромата ванили (Lecomte, 1901).

После выделения глюкованилина (и других глюкозидов) и измерения активности глюкозидазы в сырых экстрактах зеленых стручках стало ясно, что основной реакцией, участвующей в ароматическом развитии ванили, является гидролиз глюкозилированных соединений. глюкозидазой (Arana, 1943): фермент гидратант Лекомта. Многие авторы впоследствии измерили эту ферментативную активность в рамках своих исследований процесса трансформации, физиологии плодов и так далее, но исследований по очистке и характеристике этой глюкозидазы опубликовано не было.

Канисава упомянул о существовании двух β-глюкозидаз в зеленых стручках ванили: одна очень специфична для глюкованилина и глюкозида пара-гидроксибензальдегида, а другая имеет гораздо более широкий спектр активности (Kanisawa et al., 1994). Эти результаты были получены после осаждения с использованием сульфата аммония и катионообменной хроматографии. Однако, результаты экспериментов не включены в публикацию.

Оду очистил и охарактеризовал β-глюкозидазу ванили. Был выделен фермент с нативной молекулярной массой 200 кДа, оптимальным pH 6,5, оптимальной температурой 40°C, K_m 1,1 мМ с pNPG и 20 мМ с глюкованилином и V_m около 5 мккатал/мг с двумя субстратами (Odoux et al., 2003).

Ханум получил значение K_m 0,38 мМ с pNPG, а Дигнум – значение K_m, равное 3,3 мМ из сырого ферментного экстракта зеленых стручков (Hanum, 1997; Dignum et al., 2004). Последний также изучал кинетические параметры сырого ферментного экстракта с различными глюкозидами.

Полученные данные показывают, что фермент имеет большее сродство к глюкозидам ванилина, феруловой кислоты и пара-гидроксибензальдегида, чем к глюкозидам ванильной кислоты, гваякола и креозола, и не проявляет активности к глюкозидам пара-крезола и 2-фенилэтанола.

Предыдущее исследование (Dignum et al., 2002), основанное на мониторинге ароматических соединений во время вяления в лабораторных условиях для партии ванили из Индонезии, тем не менее, показало снижение глюкозида гваякола (по крайней мере, глюкозида, идентифицированного как такой), которое оказалось менее очевидным для глюкозида ваниловой кислоты. Результаты, полученные для других соединений (только формы агликона), привели этих авторов к выводу, что образование второстепенных соединений, таких как пара-крезол и 2-фенилэтанол, кажется происходит посредством химического процесса, а не ферментативного, что отсутствие ферментативной активности в отношении глюкозидов этих двух соединений, по-видимому, подтверждает.

В ходе исследования ароматических соединений, во время обработки ванили традиционным способом в Мексике, обнаруженочто из 17 идентифицированных глюкозидов 11 гидролизуются лишь незначительно, если вообще гидролизуются (Perez-Silva 2006), , что, по-видимому, подтверждает предыдущие выводы (Dignum et al., 2002). Эти 11 соединений представляют собой глюкозиды креозола, 4-винилгваякола, метилсалицилата, пара-гидроксибензойной кислоты, пара-крезола, анизилового спирта, 2-фенилэтанола, фенилпропанола, бензилового спирта и коричного спирта (рис. 12.5).

Подводя итог, можно сказать, что действие β-глюкозидазы на определенное количество глюкозидов-предшественников аромата четко установлено в развитии ванильного аромата во время вяления, но гораздо менее очевидно для некоторых других, даже если могут присутствовать их соответствующие агликоны (см. ниже).

Тем не менее следует подчеркнуть, что с учетом очень низких концентраций этих соединений, естественной изменчивости и их реакционной способности (особенно свободных агликонов) и т. д., мониторинг во время вяления очень трудно осуществим и требует особого внимания к размеру образца, чтобы избежать иногда наблюдаемых беспорядочных смещений и колебаний. Это подразумевает конкретные исследования, которые часто отсутствуют.

Подходы, которые заключаются в изучении кинетических параметров различных глюкозидов-предшественников аромата на очищенной β-глюкозидазе(ах), несомненно, более наглядны для установления раз и навсегда, являются ли эти глюкозиды субстратами фермента, но явно подразумевают получение глюкозидов и очищенного фермента, что само по себе представляет собой большой объем работы.

Также можно работать с сырыми экстрактами ферментов, а не с очищенными ферментами, чтобы упростить задачу и убедиться, что все активности β-глюкозидазы (если их несколько) присутствуют в зеленых стручках. Тем не менее следует помнить, что фермент(ы) могут контактировать с продуктами, которые влияют на кинетические параметры (активаторы/ингибиторы), которые в противном случае не вступили бы в контакт с зеленой ванилью или во время вяления.

Исходя из опыта, мы наблюдали во время разработки нашего ферментативного теста, что экстракция фермента с низким соотношением буфер/стручки (например, 4:1 об/мас) приводила к быстрой и значительной потере активности β-глюкозидазы (даже при использовании защитного агента, такого как антипротеаза, антиоксиданты и т. д.), в то время как очень высокое соотношение буфер/стручки (2000:1 об/мас) позволило достичь высокой стабильности в течение более 4 часов хранения при температуре окружающей среды без какого-либо защитного агента в буфере для экстракции (неопубликованные результаты). Эти наблюдения предполагают присутствие соединений, которые ингибируют активность β-глюкозидазы, в умеренно разбавленных экстрактах зеленой ванили.

Другие соединения

В большинстве случаев механизмы реакции, которые приводят к появлению и/или исчезновению других ароматических соединений во время вяления, еще предстоит определить.

Например, альдегиды не обнаруживаются в зеленых стручках ванили (Perez-Silva, 2006), но появляются на поздних стадиях обработки, когда их содержание достигает пика, а затем исчезают, оставаясь лишь следами, обнаруженными в ванили. Некоторые из этих альдегидов могут быть продуктами автоокисления олеиновой кислоты и линолевой кислоты (в больших количествах содержащихся в зеленой ванили).

Напротив, алифатические кислоты, из которых линолевая кислота является основным представителем, содержатся в зеленых стручках, и их концентрация имеет тенденцию к снижению во время обработки. Только уксусная кислота не содержится в зеленых стручках, но после первой термообработки появляется в концентрации около 700 частей на миллион, затем снижается и стабилизируется на уровне около 200 частей на миллион. Образование уксусной кислоты может иметь микробное происхождение (Perez-Silva, 2006).

Алифатические спирты также появляются после термообработки, тогда как сложные эфиры и углеводороды уже присутствуют в зеленых стручках, и их концентрация постепенно снижается во время выдержки.

Как упоминалось ранее, среди соединений фенилпропаноидного пути присутствует определенное количество агликонов, несмотря на (очевидное) отсутствие гидролиза соответствующего глюкозида (как в случае пара-крезола), или они присутствуют в гораздо более высоких пропорциях, чем их концентрация предлагается в глюкозилированной форме (как в случае с ванильной кислотой) или даже присутствуют, когда глюкозилированная форма отсутствует (как в случае гваякола). Фактически, хотя известно, что глюкозилированные формы относительно химически неактивны, агликон, высвобождающийся после гидролиза, может, наоборот, стать субстратом для химических и/или ферментативных реакций и, таким образом, окисляться, восстанавливаться, декарбоксилироваться, метилироваться и т. д. поэтому взаимные превращения одного фенола в другой возможны и даже распространены.

Например, концентрации ванильной кислоты выше ожидаемых можно объяснить окислением ванилина, а ванильная кислота сама может подвергаться декарбоксилированию до гваякола (Perez-Silva, 2006), что также может объяснить отсутствие глюкозида гваякола. Раствор ванилина, выдержанный при 80°C и pH 5 в присутствии кислорода в течение нескольких дней, также обнаруживает присутствие, помимо вышеупомянутых молекул, 2-метоксигидрохинона, в форме хинонов и семихинонов, что может приводить к димерам (Perez-Silva, 2006). Различные молекулы этого типа, включая диванилин, были обнаружены в ванили (рис. 12.4) и считаются положительно влияющими на аромат продукта (Gatfield et al., 2006; Schwarz and Hofmann, 2009). Гарфилд (Gatfield et al., 2006) предполагает, что образование диванилина является результатом действия пероксидазы, форма которой была недавно очищена (Marquez et al., 2008). Такая реакция также может привести к образованию крупных полимеров, которые, по крайней мере, частично ответственны за коричневый цвет ванили.

Эти различные реакции, которые все начинаются с ванилина, частично объясняют значительные потери этого соединения во время вяления (Odoux, 2000; Gatfield et al., 2007), которые уже упоминались в главе 11.

Другие реакции, не имеющие прямого отношения к образованию аромата, также могут объяснить эти потери ванилина, такие как сублимация, совместное испарение с водой (Frenkel and Havkin-Frenkel, 2006) или образование ковалентной связи с лигнином стручков (Gatfield et al. др., 2007).