Ваниль

Введение

Ваниль относится к самым ценным и самым дорогим специям в мире. Она представляет собой важнейший вкусовой ароматизатор, с многомиллионным годовым промышленным производством (Krueger and Krueger, 1983). Мировое производство ванили составляет 2000 метрических тонн в год. Экстракты ванили широко используются в шоколаде и выпечке, но чаще всего в мороженом. Главный ароматизатор экстрактов ванили – ванилин. Промышленный химический синтез ванилина начался более 130 лет назад (Tiemann and Haarmann, 1874). Это один из наиболее широко применимых ароматизирующих компонентов, применяемых в настоящее время в ароматической промышленности. Общее потребление ванилина оценивается в 12 000 метрических тонн в год (Eurofins Newsletter, 2003): около 82% в пищевых добавках, 5% для отдушек и косметики и 13% как фармацевтическое промежуточное соединение. Спрос на ваниль намного превышает естественное предложение. Бенсаид (Eurofins Newsletter, 2003) утверждает, что только 0,33% потребляемого ванилина происходит из ванильных стручков. Натуральный ванилин может быть в 100 раз дороже, чем ванилин синтетического происхождения, а в некоторые годы, в зависимости от урожая, даже больше (Eurofins Food Newsletter, 2007). Эта разница в цене в сочетании с «биотрендом» и спросом на натуральные продукты побудила индустрию ароматизаторов разработать альтернативные источники натурального ванилина, например, основанные на биотрансформации природных соединений.

Следовательно, фальсификация экстрактов ванили является серьезной проблемой на коммерческом рынке для этой категории продуктов. Поэтому, существует множество правительственных постановлений, касающихся подлинности экстрактов ванили, для выявления фальсификаций и предотвращения случаев мошенничества.

Чтобы защитить производителей и потребителей от фальсификации, необходимо иметь мощные аналитические инструменты, позволяющие подтвердить подлинность соответствующих ванильных продуктов. В зависимости от характера предполагаемых мошеннических действий, а также от конкретных категорий затронутых продуктов (ванильные стручки, экстракты ванили, ванильные ароматизаторы или пищевые продукты с ванилью) применяются разные стратегии для обнаружения этих фальсификаций.

Известно множество возможностей того, как можно повлиять на правовой и сенсорный статус ванильного продукта:

• Добавление соединений, не являющихся производными натуральной ванили, для придания аромата. Они включают:

- идентичный натуральному или искусственный ванилин синтетического происхождения

- искусственный этилванилин

- экстракт бобов тонка

- кумарин

• Фальсификация ванильных стручков: добавление частиц металла, таких как гвозди, или даже металлической ртути для увеличения веса очень дорогих ванильных стручков (это было особенно актуально, когда цены на ванильные стручки были очень высокими и достигали нескольких сотен долларов за килограмм несколько лет назад).

• Фальсификация неправильным ботаническим происхождением: известно более 100 различных видов ванили, и только три из них имеют коммерческое значение: Vanilla planifolia Jacks./Andrews, Vanilla tahitiensis J.W. Moore и Vanilla pompona Schiede. Например, бурбонская ваниль относится к видам V. planifolia.

• Фальсификация неправильным географическим происхождением: поскольку географическое происхождение ванильных стручков имеет значение по причинам регулирования [например, пометка «бурбонская ваниль» разрешена только при использовании экстрактов, полученных из ванили, выращенной на Мадагаскаре, острове Реюньон (ранее называвшийся «остров Бурбон»), Коморских островах, Сейшельских островах или Маврикии].

• Неправильное указание концентрации x-кратных экстрактов ванили: количество ванильных стручков, используемых для производства экстрактов ванили, актуально, например, на рынке США. Это выражено в «Стандарте идентичности» (Кодекс федеральных правил FDA). Всего из 100 г ванильных стручков, использованных для производства 1 кг ванильного экстракта, получается так называемый однократный экстракт.

Аналитические методы, которые могут применяться для определения подлинного ванильного продукта, могут быть основаны на идентификации отдельных ингредиентов, а также на комбинации ингредиентов, обычно присутствующих в ванили. Например, основное ароматически активное соединение, присутствующее в ванили, ванилин, можно конкретно контролировать с помощью таких методов, как газовая хроматография (ГХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), масс-спектрометрия соотношения изотопов (МССИ) или специальные методы ЯМР (см. ниже). Кроме того, определяется наличие типичных побочных продуктов в ванили, таких как ванильная кислота, пара-гидроксибензальдегид или пара-гидроксибензойная кислота. По соотношению этих компонентов также судят о подлинности ванили и ванильных продуктов. Кроме того, отсутствие соединений, которые обычно не присутствуют в ванили, таких как (искусственный) этилванилин или ванилин, полученный в результате химического синтеза, может быть использовано для оценки качества. Для обнаружения указанных фальсификаций были разработаны различные специальные аналитические методы, которые представлены в следующих разделах.

Как потребители, так и производители могут быть защищены от мошенничества использованием современных комплексных аналитических методов для оценки подлинности пищевого сырья, а также продуктов питания.

ВЭЖХ анализ

В наши дни анализ ВЭЖХ является рутинно применяемым инструментальным методом для анализа вкусовых соединений в ванильных продуктах или их экстрактах. Анализ ВЭЖХ используется для идентификации и количественного определения соответствующих соединений, а также для дальнейшей оценки подлинности или фальсификации. Были опубликованы и другие методы, такие как анализ ГХ (Mosandl and Scharrer, 2001), но они не применялись для контроля качества и проверки подлинности. Была исследована проверка подлинности, основанная на энантиоселективном анализе летучей фракции экстрактов ванили (Mosandl and Hener, 2001). Среди прочего, γ-ноналактон является одним из второстепенных хиральных соединений ванили, и его экстрагировали и разделяли на R- и S-энантиомеры. Низкий энантиомерный избыток R-γ-ноналактона в 45–63% был признан незначительно высоким, чтобы предоставить однозначное доказательство фальсификации рацемическим γ-ноналактоном. Методы ВЭЖХ, разработанные для ванили, являются надежными, быстрыми и хорошо подходят для рутинного анализа. Подготовка образцов для анализа ВЭЖХ выполняется путем экстракции, в случае стручков, или просто разбавлением экстрактов. Было исследовано влияние методов подготовки проб на аналитические результаты (Ehlers et al., 1999). Эти результаты показывают, что соотношения типичных ванильных ингредиентов, таких как ванилин, ванильная кислота, пара-гидроксибензальдегид и пара-гидроксибензойная кислота, могут варьироваться в зависимости не только от сырья, но и от используемого метода подготовки образца.

Были разработаны и опубликованы различные методы ВЭЖХ, которые, наконец, были приняты в качестве официальных методов (Taylor, 1993; ISO, 1999) или даже стали частью пищевого законодательства Франции (Arrêté du juin 11, 1987).

Стационарные фазы представляют собой преимущественно материалы с обращенной фазой, в основном материалы RP-18, но также RP-8 и другие, такие как модифицированный алкилгалогеном силикагель (Taylor, 1993).

Способы, применяющие обращенно-фазовое разделение, обычно работают с подвижными фазами метанол/вода в изократическом режиме или, чаще, с градиентным элюированием при кислых значениях pH и, наконец, с использованием УФ- или ДМД-детекции (диодно-матричный детектор). Количественное определение может быть основано на внутренних стандартах, а также на внешней калибровке, поскольку большинство обнаруженных соединений доступны в виде чистых химикатов. Время работы около 20 минут; однако с помощью специальных колонок с выбранными стационарными фазами время анализа можно сократить до менее 5 минут (Tracy et al., 2008).

Типичные параметры для анализа ВЭЖХ экстрактов ванили приведены в таблице 15.1. Выявленные соединения также опубликованы и описаны в других разделах этой книги (см. главу 12). Типичными соединениями, которые обнаруживаются с помощью этих анализов, являются ванилин, ванильная кислота, пара-гидроксибензальдегид и пара-гидроксибензойная кислота. Эти аналиты рассматриваются как импактные соединения и представляют собой типичный профиль (рис. 15.1). Простая проверка подлинности может быть выполнена на основании наличия нетипичных соединений, таких как этилванилин, а также отсутствия одного или нескольких из этих импактных соединений. Другие второстепенные соединения, обнаруживаемые с помощью ВЭЖХ, такие как анисальдегид, могут служить индикаторами, позволяющими отличить V. planifolia от V. tahitiensis (Ehlers et al., 1994; Oberdieck, 1998).

РИСУНОК 15.1. ВЭЖХ-хроматограмма соединений ванильного экстракта.

Их количественное распределение типично для вида ванильного продукта и методики экстракции. Различные исследования изучали профиль, полученный в результате воздействия этих импактных соединений в экстрактах ванили, и обнаружили, что они специфичны и, следовательно, подходят для оценки подлинности экстракта ванили (Fayet et al., 1987; Juergens, 1981). Чтобы преобразовать профиль этих соединений в числовую шкалу, были рассчитаны отношения их концентраций и предложены пределы. Пять соотношений ванильных соединений были введены во французское законодательство для оценки подлинности ванильных продуктов (République Française, 1988). В 2003 г. эти коэффициенты были изменены Главным управлением по согласованию, объединению и борьбе с мошенничеством (DGCCRF), чтобы отразить результаты за более длительный период времени и дополнительную информацию о последних урожаях того времени (Note d’information, 2003 г.). Пределы показаны в таблице 15.2. Эта оценка подходит только для спиртовых экстрактов цельных ванильных стручков. Изменения в составе растворителя или использование альтернативных экстракционных агентов, таких как CO₂, приводят к соотношениям, которые не обязательно соответствуют ограничениям, приведенным в таблице 15.2 (Quirin and Gerard, 1998). Источник ванильных стручков, используемых для приготовления экстрактов, также влияет на профиль и, следовательно, на соотношения. Дальнейшие исследования частично опровергли вывод о мошенничестве, когда соотношение находится за пределами указанных диапазонов (John and Jamin, 2004; Littmann-Nienstedt and Ehlers, 2005; Gassenmeier et al., 2008), и обосновывают пригодность так называемых соотношений. Международная организация производства ароматизаторов (IOFI) выразила в информационном письме свою оговорку в отношении применимости этих соотношений и переоценки их достоверности (IOFI Information Letter, 2000 г.), несмотря на то, что эти соотношения иногда ошибочно цитируются как «значения IOFI». Сомнительная достоверность соотношений применялась не только к ванильным стручкам и экстрактам, но также к ванильным ароматизаторам и даже к ароматизированной пище. Интерпретация соотношений для ароматизаторов и продуктов питания выходит далеко за рамки того, что серьезно исследовалось на научном уровне. Таким образом, так называемые соотношения являются предварительной проверкой подлинности ванильных стручков и их экстрактов в случае, если условия экстракции хорошо известны оценщику. Другие методы, такие как масс-спектрометрия стабильных изотопов (МССИ) или количественная сайт-специфическая спектроскопия ядерно-магнитного резонанса, обеспечивают гораздо более четкое указание на фальсификацию ванильных продуктов (Kempe and Kohnen, 1999).

^a République Française (1988).

^b Note d’information (2003).

МССИ

Очень продвинутым аналитическим методом аутентификации экстрактов ванили и ванильных ароматизаторов является анализ соотношения стабильных изотопов (АССИ). Он был разработан в 1970-х годах и стал наиболее важным инструментом для проверки подлинности нехиральных соединений. Этот анализ может быть выполнен либо с помощью МССИ, в основном в сочетании с газовым хроматографическим разделением, либо путем количественного ЯМР-измерения естественного содержания на отдельных атомных позициях (Schmidt et al., 2007).

В природе основные биоэлементы, такие как водород, углерод, кислород и азот, встречаются в виде смесей изотопов. Природные содержания стабильных изотопов имеют среднемировые значения. Из-за физических процессов, (био)химических реакций, таких как фотосинтез, географические параметры и климат, их относительное соотношение может варьировать. «Легкие» изотопы (¹H, ¹²C и ¹⁶O) всегда намного преобладают по сравнению с обилием «тяжелых» (²H, ¹³C и ¹⁸O). Продукты, образующиеся в растениях (или животных), и ингредиенты экстрактов или пища, приготовленная из них, имеют характерное соотношение изотопов, которое позволяет соотнести его с процессами фотосинтеза, а также климатическими и географическими условиями.

Соединения с ароматическим кольцом – например, ванилин – обычно синтезируются в растениях посредством пути шикимовой кислоты из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата. Образование продуктов этого пути сопровождается соответствующим истощением ¹³C по сравнению с основными растительными продуктами − углеводами.

Эти углеводы производятся в процессе фотосинтеза растений с использованием CO₂ и воды. Первичный этап катализируется ферментативно, при этом ¹³CO₂ реагирует несколько медленнее, чем ¹²CO₂. Это явление получило название «кинетический изотопный эффект».

Однако, дефицит ¹³C не одинаков для всех растений.

Для растений известны три основных фотосинтетических пути фиксации CO₂: C3, C4 и CAM. Так называемые растения C3 (например, пшеница, ячмень, сахарная свекла и большинство деревьев) используют реакцию рибулозабисфосфат-карбоксилазы, путь Кальвина, в то время как растения C4 (например, сахарный тростник, кукуруза, сорго и просо) используют фосфоенолпируват-карбоксилазную реакцию, путь Хетча-Слэка. CAM-растения, такие как суккуленты, орхидеи (например, V. planifolia) и некоторые тропические травы, обладают метаболизмом крассулацеиновой кислоты. Каждая группа показывает разные значения соотношений ¹³C/¹²C, ²H/¹H и ¹⁸O/¹⁶O для своих метаболитов, что может быть показано с помощью МССИ (например, углеводов, жирных кислот, изопреноидов, аминокислот, фенилпропанов и т. д.). Анализируя эти соотношения, можно различать соединения, продуцируемые растениями в ходе биохимических процессов, и соединения, продуцируемые путем синтеза.

Изменения в соотношении изотопов, вызванные этими эффектами, очень малы. Потому их не указывают в атомной шкале. Эти минимальные изменения сравниваются со значениями международных стандартов и выражаются в промилле (‰), как отклонение от стандартного, так называемого, дельта-значения (Schmidt, 2003):

δ¹³C (‰) = (([ ¹³C_sample ]/[ ¹²C_sample ])/([ ¹³C_standard ]/[ ¹²C_standard ]) − 1) × 1000

Стандартным соотношением ¹³C/¹²C является δ¹³C: V-PDB (Vienna-PeeDee Belemnite). Анализ значений δ¹³C для растений C3 (так называемые «легкие растения») дает значения от −30 ‰ до −24 ‰, для растений C4 (так называемые «тяжелые растения») от −16 ‰ до −10 ‰. CAM-растения имеют значения δ¹³C от −10 ‰ до −30 ‰, что очень затрудняет дифференциацию от двух других типов.

Подтверждение подлинности ароматизирующих веществ путем определения их среднего значения δ¹³C подразумевает сжигание очищенных органических образцов при температуре около 1000°C для преобразования их в CO₂. Онлайн-соединение газовой хроматографии и МССИ через интерфейс сжигания уменьшило количество проб и упростило измерения. Позже была разработана интерактивная связь газовой хроматографии и МССИ через интерфейс пиролиза (около 1300°C), в первую очередь для анализа ¹⁸O, что позволило одновременно измерять в режиме онлайн значения δ¹⁸O и δ¹³C. Этот интерфейс также позволяет определять δ²H пиролизом при температуре около 1450°C. Хенер (Hener et al. 1998) сравнил значения δ¹³C различных образцов ванилина, измеренные через CO₂ и CO, и показал, что значения в большинстве случаев хорошо согласуются. В настоящее время для определения используется в основном онлайн-соединение газовой хроматографии с сжиганием или восстановительным пиролизом с масс-спектрометрией соотношения изотопов (ГХ-С-МССИ или ГХ-П-МССИ) для определения значений δ углерода ¹³C, водорода ²H и кислорода ¹⁸O.

V. planifolia принадлежит к САМ-растениям, и ванилин из стручков показывает значения δ¹³C в диапазоне от −16,8‰ (V. tahitiensis) до −22,0‰ (V. planifolia) (см. таблицу 15.3).

Помимо экстракции из ванильных стручков, ванилин также можно получать химическим синтезом или биотехнологическими путями из различных источников (лигнин, гваякол, эвгенол, куркумин и феруловая кислота).

V-PDB – Венский стандарт PeeDee Belemnite.

V-SMOW – Венский стандарт средней воды в океане.

^a Scharrer and Mosandl, 2002; ^b Gatfield et al., 2007; ^c Bensaid et al., 2002; ^d Schmidt et al., 2007; ^e IOFI, 1989; ^f Kempe and Kohnen, 1999; ^g Koziet, 1997; ^h Hoffman and Salb, 1979; ⁱ Culp and Noakes, 1992; ^j Hoffman, 1997; ^k Brenninkmeijer and Mook, 1982; ^l Werner, 1998; ^m Note d’information, 2003; ⁿ Krammer et al., 2000.

Значения δ¹³C ванилина, полученного из других источников, кроме ванильных стручков или его экстрактов, находятся в диапазоне от −24,9 до −37,0. Следовательно, ванилин в экстрактах ванили или полученный из ванильных стручков можно аналитически отличить от других источников по значению δ¹³C. Это может быть использовано для обозначения подлинности ванильных продуктов на основе ванили или её экстрактов.

Согласно рекомендации IOFI, подлинность ванильных ароматизаторов оценивается путем определения значения δ¹³C для ванилина. Считается, что значения δ¹³C в районе −21,0 ‰ ± 0,5 ‰ указывают на растительное происхождение анализируемого ванилина из ванильных стручков (Информационное письмо IOFI, 1989). Различия, возникающие в результате применяемых методов выделения, в настоящее время исследуются посредством кольцевых испытаний, проводимых специальной аналитической рабочей группой Немецкого химического общества.

Поскольку ванилин получают в результате биотехнологических процессов, таких как ферментация натуральной феруловой кислоты, он может считаться натуральным и впоследствии применяться в натуральных ароматизаторах. В связи с тем, что значения δ¹³C ванилина, полученного из натуральной феруловой кислоты путем ферментации, очень низкие, его обычно можно отличить от синтетического ванилина, не отвечающего требованиям натуральности.

Чтобы обнаружить фальсификацию экстракта стручков ванили с ванилином из других источников, можно применить многоэлементную ГХ-МССИ; это означает также определение отношения ²H/¹H и ¹⁸O/¹⁶O и оценить этот трехмерный набор данных. Стандарт для этих двух соотношений – это Венский стандарт средней воды в океане (V-SMOW). В недавней статье показано, что sp₂ атом кислорода в альдегидном положении может химически обмениваться с водой в промышленных или лабораторных процедурах (Bensaid et al. 2002). Поэтому авторы использовали значение δ¹⁸O гваякола, которое образуется в результате разложения молекулы ванилина. Однако, они заявляют, что на практике соотношение изотопов кислорода не играет важной роли в процедурах аутентификации.

Разложение молекулы ванилина стало использоваться, когда оборудование для многоэлементного МССИ еще не было хорошо разработано (Krueger and Krueger, 1983). Фальсификаторы научились имитировать значение δ¹³C природного ванилина, смешивая этот «идентичный натуральному» ванилин, с продуктами, искусственно обогащенными в концентрации ¹³C (Krueger and Krueger, 1983, 1985).

МССИ измеряет среднее значение δ¹³C всей молекулы ванилина. Поскольку его метильную или карбонильную группу относительно просто обогатить ¹³C, синтетический ванилин, смешанный с фракцией, обогащенной ¹³C, может быть ошибочно принят за натуральный.

Чтобы проверить [метил-¹³C]-ванилин, метильный углерод удаляют как CH₃I в кипящем HI. Затем МССИ выполняется на CH₃I (Krueger and Krueger, 1983).

Для анализа [карбонил-¹³C]-ванилина, молекула должна быть окислена до ванильной кислоты. После декарбоксилирования образовавшийся СО₂ анализируется с помощью МССИ (Krueger and Krueger, 1985).

ЯМР

В настоящее время проверка обогащенных частей легче анализируется с помощью количественных измерений ЯМР содержания ²H или ¹³C в различных положениях молекулы. Этот метод получил название сайт-специфическая спектроскопия фракционирования природных изотопов ядерно-магнитным резонансом (СФНИ-ЯМР) и основан на том факте, что распределение ²H или ¹³C в разных участках молекулы не является статистическим и зависит от происхождения конкретного соединения.

Спектроскопия СФНИ-²H-ЯМР – мощный инструмент, позволяющий глубже понять биохимические механизмы путем определения содержания изотопов в определенных участках молекулы. В этом отношении МССИ, которая обычно требует сжигания пробы перед анализом, не подходит для измерения «внутримолекулярного» распределения изотопов. Фундаментальные исследования показали, что дейтерий далеко не случайно распределен в органических молекулах (Мартин и Мартин, 1981). Следовательно, необходимо определить отношения D/H в различных положениях молекулы.

Относительная чувствительность ЯМР для ¹³C теоретически примерно в 100 раз выше, чем для дейтерия. Но из-за того, что кинетические изотопные эффекты для углерода намного меньше, чем для дейтерия, и из-за более короткого времени релаксации для дейтерия, количественный ²H-ЯМР стал лучшим инструментом для контроля подлинности в области ароматов.

Первое применение этого метода к молекуле ванилина появилось в 1983 г. (Toulemonde et al., 1983). Теперь СФНИ-²H-ЯМР принят в качестве официального метода AOAC (№ 2006.05) для аутентификации ванилина. СФНИ-²H-ЯМР в сочетании с ¹³C-МССИ также позволяет характеризовать биотехнологический ванилин, полученный из феруловой кислоты, эвгенола/изоэвгенола или куркумина.

В молекуле ванилина шесть монодейтерированных изотопомеров. В ²H-ЯМР-спектрах трех различных качеств ванилина на рисунке 15.2 можно увидеть пять сигналов, два дейтерия в орто-положении попадают в один сигнал. Таблица 15.4 показывает, что ванилин, синтезированный из гваякола (2-метоксифенола) путем введения альдегидной группы, четко отделен от других вариантов высокой степенью обогащения дейтерием по карбонильной функции. Ванилин из лигнина демонстрирует истощение дейтерия во всех положениях по сравнению с натуральным ванилином, полученным из стручков ванили. Экспериментальные значения для гидроксильной группы не включены в таблицу 15.4, так как они могут быть легко искажены процессами обмена H/D.

РИСУНОК 15.2. ²H-ЯМР-спектры ванилина из ванильных стручков, синтетического происхождения (из лигнина, из гваякола) и ванилина биотехнологического происхождения из феруловой кислоты.

^a Remaud et al., 1997.

^b John and Jamin, 2004.

Также продолжается разработка количественного ¹³С-ЯМР. Уже получены первые характерные распределения ¹³C по качеству ванилина различного происхождения (Caer et al., 1991; Tenailleau et al., 2004a, 2004b).

Заключение

Аналитическое определение типичных ингредиентов ванили (экстракта) с помощью ВЭЖХ и расчет их соотношений можно рассматривать как предварительную проверку для оценки подлинности ванили. ВЭЖХ – мощный инструмент для подтверждения подлинности ванильных продуктов. Тем более, что с онлайн-методом обеспечения связи ГХ с ВЭЖХ, эти измерения стали доступны без громоздких шагов по изоляции. Многоэлементный анализ с наборами данных значений δ¹³C-, δ²H- и δ¹⁸O должен позволить выявлять случаи мошенничества.

Когда можно выделить достаточное количество ванилина, количественные измерения ²H- и ¹³C-ЯМР особенно эффективны для определения различного происхождения ванилина.