Ваниль

CymMV является наиболее распространенным и экономически опасным вирусом, поражающим орхидеи (Zettler et al., 1990). С момента первого описания CymMV Дженсеном в Калифорнии (Jensen, 1950; Jensen and Gold, 1955) сообщалось о CymMV у большинства культивируемых видов орхидей во многих странах, и теперь считается, что он присутствует во всем мире. CymMV был впервые обнаружен в ванили во время исследования во Французской Полинезии (Wisler et al., 1987). Впоследствии он был обнаружен на участках ванили многих стран: островов Кука, Фиджи, Ниуэ и Тонга (Pearson et al., 1993), Мадагаскара (Grisoni et al., 1997), острова Реюньон (Pearson, 1997), Маврикия (Rassaby, 2003), Индии (Bhat et al., 2006), а также в материалах, хранящихся в ботанических садах (Grisoni et al., 2007).

Структура вируса и генетическое разнообразие

Как представитель рода Potexvirus, семейства Flexiviridae (Adams et al., 2004), CymMV имеет изогнутые частицы (~ 13 нм × 480 нм), содержащие геном однонитевой РНК(+) размером около 6,3 т.п.н. с пятью открытыми рамками считывания (ORF), фланкированных 5′- и 3′-некодирующими областями, и 3′-polyA-хвост (Francki, 1970; Wong et al., 1997).

База данных GenBank содержала (на октябрь 2009 г.) полную последовательность генома для девяти изолятов CymMV и более 100 последовательностей гена белка оболочки (CP), большинство из которых имеют азиатское происхождение. Общее разнообразие изолятов низкое на уровне аминокислот, с расхождением менее 14% для CP (Ajjikuttira et al., 2002; Bhat et al., 2006; Gourdel and Leclercq-Le Quillec, 2001; Moles et al., 2007; Sherpa et al., 2006) и менее 3% расхождения для РНК-зависимой РНК-полимеразы (Moles et al., 2007). Однако, анализ нуклеотидной последовательности показал, что популяция CymMV разделяется на две расходящиеся гаплогруппы, что может отражать двойное происхождение изолятов, обнаруженных во всем мире. Однако, не наблюдается биологической разницы между двумя кластерами штаммов, которые могут сосуществовать и рекомбинировать в пределах одного хозяина (Sherpa et al., 2007; Vaughan et al., 2008). Штаммы, принадлежащие к обеим подгруппам CymMV, были обнаружены в ванили (Moles et al., 2007).

Симптомы и диагностика

У декоративных орхидей CymMV вызывает хлоротичные или некротические пятна и полосы на листьях и цветах (Albouy, Devergne, 1998; Gibbs et al., 2000; Yamane et al., 2008) и замедляет рост растений (Izaguirre-Mayoral et al., 1993; Pearson, Cole, 1991; Wannakrairoj, 2008). У ванили инфекция CymMV, как правило, протекает бессимптомно, но иногда она связана с пятнами на листьях (у Vanilla planifolia и Vanilla tahitensis) и некротическими пятнами на стебле и листьях (у V. planifolia) (Grisoni et al., 1997, 2004; Leclercq Le Quillec et al., 2001) (рис. 7.1). На основании полевых наблюдений было высказано предположение, что CymMV ослабляет лиану и увеличивает влияние стрессов, возникающих в результате чрезмерной плотности посадок или заражения другим патогеном (Benezet et al., 2000), но это еще предстоит продемонстрировать. Даже при отсутствии симптомов, инфекция CymMV может быть причиной снижения роста стебля до 40% (Bartet, 2005). Влияние CymMV на содержание ароматических веществ в стручках до сих пор не исследовано.

РИСУНОК 7.1. Хлоротичные (слева) и некротические (справа) пятна, индуцированные CymMV на листьях ванили.

Наблюдения в ходе полевых исследований показали, что симптомы CymMV были более серьезными у V. planifolia (в районе Индийского океана), чем у V. tahitensis (в Тихом океане). Оценка тяжести заболевания в сопоставимых тепличных условиях с использованием штамма местной подгруппы А на острове Реюньон не показала каких-либо различий в вирусной болезни между этими двумя видами ванили. Однако, удивительно, что образец Vanilla pompona, включенный в испытание, проявил частичную резистентность к этому вирусу. Эта резистентность состояла из двух компонентов: (1) устойчивости к инокуляции (более низкий процент зараженных растений в тестах на механическую инокуляцию по сравнению с образцами V. tahitensis и V. planifolia) и (2) снижении титра вируса в инфицированных листьях, произошедшего несколькими месяцами после инокуляции с очевидной элиминацией вируса (таблица 7.1). Эта устойчивость вызывает временное подавление посттранскрипционной экспрессии генов CymMV у V. pompona, а не гиперчувствительную реакцию (Baures et al., 2008), но механизм, лежащий в основе этой резистентности, неясен и требует дальнейшего изучения.

Н.о. – не определен.

CymMV нельзя надежно обнаружить в ванили на основании симптомов, и поэтому диагноз должен основываться на обнаружении вируса. Для обнаружения CymMV были описаны многочисленные инновационные молекулярные методы, такие как: ДНК-биосенсоры на основе кварцевых микровесов (Eun et al., 2002), иммуно-капиллярный зональный электрофорез (Eun and Wong, 1999), DIG-меченные зонды кРНК, (Hu and Wong, 1998), антисыворотка к рекомбинантным капсидным белкам (Lee and Chang, 2008), суперпарамагнитные шарики (Ooi et al., 2006), TD/RT-PCR (Seoh et al., 1998), бумага для быстрого иммунофильтрацинного анализа (Tanaka et al., 1997) и анализы магнитовосстановления с использованием антител без промывки (Yang et al., 2008).

Поскольку частицы CymMV обладают высокой иммуногенностью (Francki, 1970) и обильно и равномерно распределены в тканях хозяина (Lawson and Hearon, 1974; Leclercq-Le Quillec and Servé, 2001), серологические методы, такие как ELISA или DIBA, дешевые и надежные, хорошо подходят для рутинной диагностики вируса. Как и следовало ожидать, исходя из низкой аминокислотной дивергенции CP, моноклональные, а также поликлональные антитела выявляли широкий спектр изолятов (Lee and Chang, 2008; Vejaratpimol et al., 1998; Wisler et al., 1982). Однако, Рид (Read et al., 2007) сообщил о штамме (Thailand 306), который не реагировал с коммерческим моноклональным антителом. Этот штамм характеризовался аспарагиновой кислотой вместо аспарагина в позиции 123 CP, уникальной для этого изолята.

Более специфичное и чувствительное обнаружение вируса может быть достигнуто с использованием методов, основанных на нуклеиновых кислотах, и был разработан ряд пар праймеров и различных форматов для обнаружения CymMV с помощью ОТ-ПЦР (Barry et al., 1996; Bhat et al., 2006; Lim et al., 1993b; Martos, 2005; Ryu et al., 1995; Seoh et al., 1998; Yamane et al., 2008).

Эпидемиология

Заболеваемость CymMV на ванильных участках оценивалась в нескольких исследованиях, проведенных в различных агрономических условиях, Выявились очень разные ситуации, необъяснимые только систематической ошибкой выборки. На Коморских островах, например, весь посадочный материал кажется здоровым, поскольку недавнее расширенное обследование не обнаружило ни одной зараженной вирусом лианы (Grisoni and Abdoul-Karime, 2007). На Мадагаскаре ситуация была аналогичной в начале 2000-х годов, когда подавляющее большинство традиционных фермерских плантаций были свободны от CymMV. Однако, большая часть черенков новых сортов, размноженных в хранилище гермоплазмы в Амбохитсара (район Анталаха), были инфицированы (Grisoni et al., 1997; Leclercq-Le Quillec and Nany, 1999, 2000). На островах Реюньон и Общества относительно высокая заболеваемость CymMV была зарегистрирована после того, как в 1990-х годах были начаты интенсивные программы культивирования (Benezet et al., 2000; Grisoni et al., 2004; Leclercq Le Quillec et al., 2001), и эпидемиологический анализ мог проследить этот путь распространение вируса на ванильных участках.

Благодаря высокой стабильности вириона и его повышенной концентрации в тканях хозяина, CymMV легко передается механическим путём (Jensen and Gold, 1955). Поэтому он может эффективно распространяться на участках или в теплицах в отсутствие конкретных переносчиков, исключительно в результате попадания вируса из инфицированного сока через микротравмы в эпидермальные клетки. Это было специально продемонстрировано для ванили в теневых домах на острове Реюньон (Leclercq Le Quillec et al., 2001) и ФП (Grisoni et al., 2004). Мониторинг CymMV в этих теневых домах показал быстрое распространение в больших скоплениях, в основном вдоль рядов. Эти результаты подтверждают предположение, что CymMV заносится в теневые дома через инфицированные черенки, собранные на участке, а затем распространяется с растения на растение в основном в результате процессов возделывания (искусственное опыление, петлеобразование) и, возможно, корневым анастомозом между соседними лианами.

Для производителей ванили очень важно понимать, что отсутствие симптомов увеличивает вероятность как первичного, так и вторичного распространения этого вируса, и, следовательно, важность сертифицированного посадочного материала, свободного от вируса.

Контроль

В отсутствие лечебных средств или устойчивых коммерческих сортов, профилактика является единственным способом избежать потерь от CymMV в посадках ванили. Поскольку основным переносчиком вируса являются люди (путем посадки инфицированных черенков или в качестве источника механической передачи), то для предотвращения болезни достаточно простой стратегии, сочетающей фитосанитарную сертификацию растений и надлежащие методы ухода. Это было успешно реализовано в программах создания новых плантаций в начале 2000-х годов на острове Реюньон и во ФП (Benezet et al., 2000; Richard et al., 2009).

Основным требованием фитосанитарной сертификации является потребность в материале, свободном от вирусов, который должен быть размножен в соответствии с определенным протоколом. Здоровый исходный материал обычно можно найти в культивируемой популяции, но если требуется конкретный сорт, для которого доступна только инфицированная гермоплазма, растения необходимо излечить от вируса. Ваниль – клональная культура с высокой степенью гетерозиготности (см. главу 2), и хотя из семян вырастает ваниль, не содержащая вирусов (Jensen and Gold, 1955; Yuen et al., 1979), она не соответствуют типу. Элиминация вируса была достигнута для нескольких видов орхидей с помощью химиотерапии in vitro (Albouy et al., 1988; Lim et al., 1993a), и аналогичные стратегии должны быть перенесены на ваниль.

Генетическая сопротивляемость или толерантность особенно желательны, когда профилактика не обеспечивает достаточного контроля вирусного заболевания. V. planifolia не имеет естественной устойчивости, в отличие от описанной у V. pompona. Приобретенная патогенетическая устойчивость к CymMV возникла у некоторых видов орхидей (Chang et al., 2005; Liao et al., 2004; Lim et al., 1999), и хотя эта стратегия еще не разработана для ванили, это теоретически возможно, поскольку регенерация ванильных протопластов была недавно достигнута (Minoo et al., 2008).

Род Potyvirus представляет собой вторую по величине группу патогенных вирусов растений (около 25% всех известных видов вирусов растений), что делает потивирусы всемирной сельскохозяйственной проблемой (Fauquet et al., 2005). Потивирус, вызывающий деформацию листьев и мозаику на лианах V. tahitensis, был идентифицирован в 1986 году во ФП (Wisler et al., 1987). Серологически, а затем генетически, было показано, что этот вирус, названный вирусом мозаики ванили (VanMV), связан с вирусом мозаики таро (DsMV) (Farreyrol et al., 2006; Wang and Pearson, 1992; Wisler et al., 1987). В то же время еще один потивирус, вызывающий некроз у V. planifolia, был идентифицирован в 1986 году в Тонге и предварительно назван вирусом ванильного некроза (VNV), прежде чем его охарактеризовали как штамм вируса мозаики арбуза (WMV-Tonga) (Pearson and Pone, 1988; Pearson et al., 1990). Биологические свойства WMV-Tonga хорошо охарактеризованы, и определена полная последовательность гена его CP (Pearson et al., 1990; Wang et al., 1993). Вонг и Пирсон (Wang and Pearson, 1992) продемонстрировали, что WMV-Tonga и DsMV-Vanilla были разными вирусами. Впоследствии DsMV-Vanilla был обнаружен серологически у V. tahitensis на Островах Кука и у V. planifolia на Фиджи и Вануату (Pearson et al., 1993), а WMV был обнаружен у V. planifolia во ФП (Grisoni et al., 2004 г.). Сообщалось также о нескольких изолятах потивируса, которые не реагировали ни с WMV, ни с DsMV-антисыворотками (Grisoni et al., 2004; Pearson, 1997; Pearson et al., 1993), что позволяет предположить, что в посадках ванили присутствовали и другие потивирусы.

Вирусы

Род Potyvirus (семейство Potyviridae) включает 129 признанных видов плюс около 15 предполагаемых (Carstens and Ball, 2009; Fauquet et al., 2005). Потивирусы обнаружены во всем мире и инфицируют более 30 семейств растений, хотя отдельные вирусы часто имеют ограниченный круг хозяев. Изогнутые, непокрытые, стержнеобразные частицы (длина 680–900 нм, диаметр 12–15 нм), содержащие одноцепочечную положительно-смысловую молекулу РНК (Hull, 2002). Геном имеет размер около 10 т.п.н. и содержит одну открытую рамку считывания, которая кодирует полипротеин из 3000–3300 аминокислот. Полипротеин ко- и посттрансляционно расщепляется тремя кодируемыми вирусом протеиназами на 10 зрелых белков, большинство из которых являются многофункциональными (Adams et al., 2005a; Revers et al., 1999; Urcuqui-Inchima et al., 2001). Обширное исследование разнообразия генов в семействе Potyviridae (Adams et al., 2005b) пришло к выводу, что ген белка цитоплазматического включения (CI) лучше подходит для идентификации потивируса при использовании только части генома. Хотя ген CP менее информативен, чем CI, он тоже может эффективно разделять виды, критерий разграничения определяется этими авторами как 76–77% идентичности.

Анализ гена CP из 36 образцов ванили, собранных в регионах Индийского и Тихого океана в период с 1997 по 2005 год, добавил пять видов потивирусов к двум ранее описанным вирусам, инфицирующим ваниль, а именно: вирус мозаики ванили (BCMV), вирус мозаики переносимый люцерновой тлей (CABMV), вирус мозаики жилок глицинии (WVMV), вирус желтой мозаики бобовых (BYMV) и вирус мозаики птицемлечника (OrMV) (Grisoni et al., 2006).

Примечательно, что среди семи видов, инфицирующих ваниль, пять (BCMV, CABMV, DsMV, WMV и WVMV) принадлежат к подгруппе BCMV, преимущественно поражающих зернобобовые культуры и сорняки. Они были обнаружены на острове Реюньон (BCMV и CABMV), на Мадагаскаре (BCMV), на Маврикии (CABMV), во ФП (BCMV, DsMV и WMV), на Тонге (WMV) и на Самоа (WVMV). Два других вида, BYMV и OrMV, были обнаружены только на острове Реюньон. Потивирус, вызывающий мозаику, о котором сообщалось в Индии (Bhai et al., 2003; Bhat et al., 2004; Thomas et al., 2002), не был идентифицирован, но может быть связан с BYMV, что предполагается двумя образцами (GenBank, AY845011 и AY845012), происходящими из материал ванили, собранного в Карнатаке (Индия). О потивирусоподобных симптомах также сообщалось в Папуа-Новой Гвинее (Kokoa, 2000) и в Пуэрто-Рико (Childers and Cibes, 1948).

Штаммы DsMV, инфицирующие ваниль, сначала были условно обозначены как VanMV, потому что они показали только отдаленную серологическую связь со штаммами DsMV, инфицирующими таро, и из-за невозможности перекрестной инокуляции между штаммами, происходящими от двух хозяев. Впоследствии нуклеотидный анализ 3′-конца генома двух изолятов VanMV (с Островов Кука [CI] и ФП [FP]) подтвердил, что их следует классифицировать как штаммы DsMV, поскольку они имеют более 78% идентичностей, в частности в коре CP (Farreyrol et al., 2006). Интересно, что DsMV-ваниль [CI] и DsMV-ваниль [FP] так же расходились как друг с другом, так и с опубликованными штаммами DsMV-таро (Colocasia esculenta) (Farreyrol et al., 2006). Однако, недавно полученные последовательности для изолятов таро с Островов Кука и ФП были очень похожи на изоляты ванили из той же страны (M. Pearson et al., неопубликованные данные). Поскольку таро выращивали на этих островах намного дольше, чем ваниль, это предполагает, что «скачок вируса» с таро на ваниль мог произойти независимо на двух островах Тихого океана. Кроме того, DsMV-ваниль [FP] продемонстрировал необычные особенности, которые делают его особым вирусом среди потивирусов (Farreyrol et al., 2006): мотив передачи DVG от тли (вместо более распространенного мотива DAG) выше несвойственный участок аминокислотных повторов (GTN) типичный для нативно развернутых белков, и необычный сайт протеолитического расщепления NIb/CP (Q//V).

Симптомы и диагностика

У ванили потивирусы вызывают более или менее выраженную мозаику и деформацию листовых пластинок, иногда связанную с некротическими поражениями (рис. 7.2). Мозаика и некроз также могут быть видны на стебле. Эти симптомы особенно заметны на молодых листьях и значительно ослабевают на старых. На острове Реюньон симптомы потивируса были наиболее очевидны в прохладные месяцы с ремиссией симптомов, наблюдаемой в жаркое время года (Benezet et al., 2000; Leclercq Le Quillec et al., 2001). Воздействие вирусов на цветение и плодоношение ванильных лиан не было установлено, хотя о некотором замедлении роста можно судить по сильной мозаике и деформации, поражающей побеги. Полевые наблюдения показали, что вирусные частицы были неравномерно распределены в растении, а лианы с симптомами могут быть отрицательными в ELISA (Leclercq Le Quillec et al., 2001). Как следствие, визуальное наблюдение мозаики на листьях и тесты ELISA дополняют друг друга для оценки потивируса на ванильных участках, но использование методов в одиночку недостаточно надежно для диагностики.

РИСУНОК 7.2. Симптомы потивируса на листьях V. planifolia (a = BYMV-Réunion, b = BCMV-Madagascar, c = некротический штамм WMV-Tonga) и V. tahitensis (d = WMV-FP, e = DsMV-FP) и на стебле (f = WMV-FP).

Для диагностики потивирусной инфекции ванили на общем или специфическом уровне доступно несколько молекулярных методов. Универсальные моноклональные антитела к потивирусу (Jordan and Hammond, 1991), коммерциализированные Agdia (США), доказали свою эффективность в обнаружении всех видов потивируса, идентифицированных у ванили с помощью Indirect Simple Sandwich ELISA. Аналогичным образом, несколько мотивов, консервативных в геноме потивирусов, были использованы для создания ряда вырожденных праймеров для амплификации с помощью ОТ-ПЦР соответствующей последовательности в геноме потивирусов (Chen et al., 2001; Colinet et al., 1998; Gibbs and Mackenzie, 1997; Ha et al., 2008; Langeveld et al., 1991; Marie-Jeanne et al., 2000; Pappu et al., 1993). Оба метода могут использоваться для оценки потивирусного статуса материала, но не позволяют конкретно идентифицировать обнаруженные виды потивируса.

Для потивирусов специфическая идентификация с помощью серологии ненадежна из-за многочисленных перекрестных реакций между видами вирусов (Shukla et al., 1994). Чтобы преодолеть эту проблему, можно использовать простой однопробирный одностадийный анализ ОТ-ПЦР с использованием вырожденных праймеров с последующим прямым секвенированием короткого фрагмента (Grisoni et al., 2006). Поскольку технологии ОТ-ПЦР и секвенирования становятся все более простыми и дешевыми, этот метод можно использовать в эпидемиологических исследованиях, требующих высокой производительности. Технологии микрочипов, которые являются многообещающим способом получения широкого спектра, специфического и чувствительного инструмента обнаружения потивирусов, находятся в стадии разработки (Boonham et al., 2007; Wei et al., 2009).

Эпидемиология

Потивирусы несут ответственность за большие потери многих экономически важных культур, поскольку легко распространяются по полям. Некоторые из них передаются через семена, большинство – механически (хотя и неэффективно), но все они эффективно хотя и непостоянно передаются тлей (Brunt, 1992).

VanMV легко передавался от V. tahitensis к V. pompona персиковой тлёй Myzus persicae (Wisler et al., 1987). Экспериментальные тесты передачи WMV-Tonga от инфицированной Nicotiana clevelandii к здоровой с использованием Aphis gossypii были успешными, но тесты передачи с участием V. planifolia в качестве растения-донора с той же тлей не увенчались успехом (Pearson and Pone, 1988; Pearson et al., 1990; Wang и Пирсон, 1992; Ван и др., 1993, 1997). Однако, несколько полевых данных о потивирусных инфекциях подтверждают роль тли в распространении потивирусов на участках ванили (Richard et al., 2009). Успешные испытания передачи тлёй соответствовали непостоянному способу передачи. При непостоянной передаче нескольких секунд или минут достаточно для приобретения вируса или инокуляции питающих проб переносчиком. Поэтому неудивительно наблюдать тяжелую потивирусную инфекцию в отсутствие на ванили колоний установленной тли (за исключением Cerataphis orchidarum, для которой описаны только бескрылые формы и которая не считается эффективным переносчиком вируса).

Несколько потивирусов передаются с семенами, в частности CABMV у нескольких видов бобовых (Gillaspie, 2001), BCMV у некоторых сортов Phaseolus и Vigna и BYMV у нескольких видов стручковых (Aftab and Freeman, 2006). Кроме того, BCMV передается через пыльцу (Card et al., 2007). DsMV, WMMV и WVMV, как известно, не передаются с семенами, но было высказано предположение, что такая передача может быть более распространена, чем признано в настоящее время, особенно в подгруппе BCMV (Gibbs et al., 2008a).

Передача вирусов с семенами имеет эпидемиологические последствия при наличии дополнительных культур и сорняков. В полевых условиях первичный инокулят потивируса может поступать из инфицированных черенков ванили, окружающих растений, многолетних или однолетних сорняков, в семенах которых вирус может перезимовать. Из этого первичного инокулята потивирус распространяется по участку тлями. Молекулярное сходство между изолятами, поражающими ваниль и сорняки, способствует передаче вирусов от одного вида к другому. Например, на Мадагаскаре изоляты BCMV были идентифицированы в ванили и прилегающем сорняке Senna sp. (Leguminosae), которые были на 100% идентичны по последовательностям генов CP (Grisoni et al., 2006). На острове Реюньон быстрая вспышка CABMV на недавно посаженном участке ванили с использованием безвирусных черенков взаимосвязана с межрядной Vigna unguiculata, у которой CABMV передается с семенами. Напротив, использование Gliricidia sepium, бобового дерева, часто используемого в качестве опор для участков ванили и которое из-за частой обрезки сильно заражено тлей Aphis craccivora (эффективный переносчик вирусов подгруппы BCMV), похоже, не увеличивает количество новых случаев потивируса на участках ванили, по сравнению с использованием поддерживающих деревьев без тлей, таких как Leucena glauca (Grisoni et al., 2004). Однако, при наличии других источников вируса высокие популяции тли могут стать проблемой.

Контроль

Эпидемиологические данные показали, что серьезные вспышки потивируса происходят в основном в системе интенсивного выращивания ванили и могут происходить из-за разнообразия видов вирусов, включая разнообразие видов-хозяев, резервуаров вируса и, возможно, видов тлей.

Таким образом, помимо универсальной рекомендации высаживать безвирусный материал, стратегию борьбы необходимо адаптировать к каждой местной ситуации. Как следствие, рекомендуется оценивать риск потивируса до начала любой программы развития на новом участке или при изменении системы выращивания. Кроме того, молекулярные инструменты, которые позволяют быстро идентифицировать потивирусы, помогают понять подходящую стратегию контроля, которую можно использовать в случае неожиданных вспышек потивируса.

CMV – широко распространенный вирус, поражающий очень широкий круг растений. Он был обнаружен в ванили в начале 2000-х годов, что было связано с серьезными деформациями лиан во ФП (Farreyrol et al., 2001). Позднее вирус был обнаружен в ванили на острове Реюньон и в Индии (Madhubala et al., 2005).

Вирусы и генетическое разнообразие Virus and Genetic Diversity

CMV является типичным представителем рода Cucumovirus в семействе Bromoviridae. Он имеет трехкомпонентный геном с позитивно-смысловой РНК, кодирующий пять белков (два компонента полимеразы на РНК1 и РНК2, белок 2b, участвующий в нарушении защиты растений и перемещении вируса в растении на РНК2, а также 30 К белок и CP на РНК3). Каждая РНК инкапсулирована в отдельную полиэдрическую частицу (диаметром 28 нм), поэтому для заражения растения требуется инокуляция трех типов вирионов. Некоторые изоляты также инкапсулируют субгеномную РНК или сателлитную (сат)РНК. Биология и экология этого вируса подробно рассмотрены (Palukaitis et al., 1992 и Gallitelli, 2000).

Штаммы CMV делятся на две серологически разные подгруппы, различающиеся примерно по 25% нуклеотидов и также различающиеся по биологическим признакам. Термоустойчивые штаммы подгруппы 1 далее делятся на две клады (1A и 1B) на основе геномных последовательностей их РНК (Roossinck et al., 1999). Подгруппа 1A возникла из подгруппы 1B, и (до недавнего времени) штаммы 1A были обнаружены только в Азии. Термочувствительные штаммы подгруппы 2 ограничены зонами с прохладным климатом. Три механизма были связаны с эволюцией CMV: перегруппировка РНК между компонентами РНК, рекомбинация в некодирующих областях и мутации в кодирующих областях. Было показано, что несколько аминокислотных положений на CP положительно отобраны в отношении передачи вируса (Moury, 2004).

Насколько нам известно, 65 последовательностей CMV-CP были получены для изолятов ванили, происходящих из ФП (58), острова Реюньон (6) и Индии (1) (Farreyrol, 2005; Madhubala et al., 2005; Mongredien, 2002), 53 из которых депонированы в Genbank. Большинство последовательностей были наиболее тесно связаны с изолятами подгруппы 1B и сгруппированы в несколько клад (Farreyrol et al., 2009). Деревья, полученные из 3′-UTR последовательностей РНК3 (Farreyrol, 2005) и ORF2b последовательностей РНК2 (Mongredien, 2002), соответствовали CP-анализу. Интересно, что изолят, принадлежащий к группе 2 (NZ100, AY861389), был механически инокулирован в растения ванили, что вызывало мозаику и деформацию листьев (Farreyrol et al., 2009), что позволяет предположить, что широкий спектр изолятов CMV может инфицировать ваниль. Попытки обнаружить сат-РНК CMV, ассоциированную с ванильными изолятами CMV из ФП, методом ОТ-ПЦР с использованием вырожденных праймеров (Escriu et al., 2000; Varveri and Boutsika, 1999) не увенчались успехом (M. Grisoni, неопубликованные данные).

Филогенетический анализ изолятов CMV, собранных из ванили и нескольких связанных культур или сорняков, выявил кластеризацию в соответствии с географическим происхождением, а не с растением-хозяином. Например, на Подветренных островах (ФП) изоляты CMV с островов Райатеа и Хуахине находились в разных кластерах, в то время как между изолятами из ванили и из Commelina diffusa наблюдалось высокое сходство (Farreyrol et al., 2009). Эти данные подтверждают гипотезу передачи вируса от одного растения к другому, особенно от C. diffusa к V. tahitensis. Точно так же ген CP CMV из ванили, секвенированный в Керале (Индия), показал самую высокую идентичность (99%) с геном другого индийского изолята, заражающего черный перец в Карнатаке (Madhubala et al., 2005).

Симптомы и диагностика

С CMV связаны различные симптомы у его многочисленных хозяевах. Наиболее распространены мозаика и задержка роста, но симптомы могут быть столь же серьезными, как и полный системный некроз. Некоторые штаммы не имеют симптомов у определенных хозяев или при повышенной температуре (штаммы подгруппы 2). Выраженность симптомов также может изменяться из-за временной ремиссии вирусной инфекции или же с ослаблением или усугублением коинфекцией сат-РНК.

У ванили, описанные во ФП, изоляты CMV вызывали тяжелую деформацию листьев и побегов, а инфицированные растения часто бывают стерильными либо потому, что цветки не полностью развиваются, либо потому, что они сформированы ненормально и не содержат жизнеспособной пыльцы. На лианах V. tahitensis, механически инокулированных полевым изолятом CMV, первые симптомы проявились через два месяца после инокуляции, выпячиванием на молодых листьях, которые обычно имели тонкую и асимметричную (похожую на запятую) форму (рис. 7.3a). Впоследствии на лианах развился аномальный филлотаксис и неравномерный рост верхушек и цветков (рис. 7.3b и c), типичные для болезни. Подобные симптомы у листьев были описаны в Индии и на острове Реюньон для V. planifolia. В нескольких случаях наблюдались деформации побегов на инфицированных CMV лианах (Farreyrol, 2005), напоминающие аномальные трубчатые листья, описанные Якобом де Кордемуа (Jacob de Cordemoy,1899) (рис. 7.4), которые, возможно, являются историческим свидетельством давней инфекции CMV на острове Реюньон

РИСУНОК 7.3. Симптомы, вызванные CMV-инфекцией у V. tahitensis: (а) молодые листья с выпячиванием и деформацией (здоровый лист справа); (b) распространение на инфицированных молодых побегах; и (c) аномальный цветок (справа) на лиане, инфицированной CMV.

РИСУНОК 7.4. (Слева) Аномальный трубчатый лист a, обнаруженный у V. planifolia в 1899 г. М. Х. Якоб де Кордемуа (Jacob de Cordemoy, 1899); f – нормальный лист; p, хвостовой стебель. (Справа) Симптом трубчатого листа, наблюдаемый во время исследования во ФП в 2005 году.

Симптомы CMV на ванили очень заметны, довольно специфичны и могут быть хорошим индикатором вирусной инфекции. Однако, эти симптомы можно спутать на ранних стадиях с потивирусной инфекцией, а на более поздних стадиях – с физиологическими нарушениями. Кроме того, может наступить временная ремиссия симптомов. Следовательно, для диагностики заболевания или отбора черенков, свободных от вирусов, рекомендуются тесты, основанные на серологии (Devergne et al., 1981; Hu et al., 1995; Maeda and Inouye, 1991; Yu et al., 2005) или амплификации нуклеиновых кислот (Hu et al., 1995; Wylie et al., 1993; Yu et al., 2005).

Эпидемиология

CMV – растительный вирус, имеющий самый большой диапазон известных хозяев из более чем 1000 видов, принадлежащих более чем к 30 семействам (Douine et al., 1979). Вирус непостоянно передается более чем 80 видами тлей (Gallitelli, 2000). У некоторых хозяев CMV часто передается с семенами (Palukaitis et al., 1992). Несколько исследований указали на ключевую роль совместного присутствия резервуарных растений (в семенах которых перезимовал первичный инокулят) и тлей (которые обеспечивают вторичное распространение вируса) в эпидемиях CMV в разных культурах и странах (Hobbs et al., 2000; Kiranmai et al., 1998; Lavina et al., 1996; McKirdy, 1994; Rist and Lorbeer, 1991; Skoric et al., 2000).

На ванильных участках Островов Общества (ФП) высокая распространенность CMV была зарегистрирована в начале 2000-х годов, при этом каждый третий участок был инфицирован, а частота встречаемости часто превышала 25% лиан (Farreyrol et al., 2009). Гораздо меньшая распространенность вируса наблюдалась на острове Реюньон, где было всего 2 зараженных участка со спорадическим распространением вируса из 25 (Farreyrol, 2005), а также в Индии, где вирусы мозаики наблюдались на <5% лиан (Bhat et al., 2004; Madhubala et al., 2005). На Маркизах и Австралес (ФП), Коморском архипелаге и на Мадагаскаре CMV не был обнаружен у ванили, несмотря на интенсивные исследования (Grisoni, 2003; Grisoni, 2009; Grisoni, Abdoul-Karime, 2007; Leclercq-Lequillec and Nany, 2000).

Распространение CMV отслеживалось в нескольких теневых домах, засаженных безвирусными черенками, и проводилось в различных местах на Подветренных островах (Richard et al., 2009). Результаты показали, что при отсутствии защиты от насекомых и в благоприятных местах CMV может распространяться очень быстро. При этом 50% лиан были заражены всего через два года после посадки. Напротив, при использовании средств защиты от насекомых или в другом месте был зарегистрирован очень низкий уровень заболеваемости CMV. Эти результаты продемонстрировали роль тли в распространении болезни, а также важность окружающей среды, возможно, из-за наличия или отсутствия резервуара CMV среди сорняков.

Было показано, что Commelina diffusa (ма’апапе на таитянском или herbe d’eau на французском, рис. 7.5) играет доминирующую роль в эпидемиях CMV во ФП (Richard et al., 2009): (1) C. diffusa был единственным видом, который демонстрировал одновременно высокую частоту заражения CMV и пораженность тлей (A. gossypii), (2) появление CMV на ванильных лианах сильно коррелировало с близостью C. diffusa, (3) Заболеваемость CMV на обследованных участках достоверно коррелировала с встречаемостью инфицированных C. diffusa на участке, но не с другими видами, инфицированными CMV, и (4) способностью A. gossypii и A. craccivora передавать CMV от C. diffusa к молодым растениям V. tahitensis была продемонстрирована в лабораторных исследованиях. Все эти данные, наряду с высоким сходством последовательностей между изолятами CMV ванили и C. diffusa (Farreyrol et al., 2009), убедительно подтверждают мнение о том, что C. diffusa является основным активным резервуаром CMV и вносит большой вклад в распространение этого вируса на участках ванили. Этот эпидемиологический сценарий напоминает сценарий, описанный для CMV на банановых плантациях (Eiras et al., 2004; Lockard, 2000; Magnaye and Valmayor, 1995).

РИСУНОК 7.5. C. diffusa Burm. f., основной резервуар тлей и вирусов, участвующих в эпидемиях CMV во ФП: (а) растения, инфицированные вирусом; (b) цветок; и (c) инвазированный тлей лист.

Контроль

Ввиду очень серьезных симптомов, вызываемых на листьях и цветках и потенциально высокой заболеваемости в полевых условиях, CMV представляет собой серьезную угрозу для плантаций ванили и должен быть приоритетом для оценки и контроля рисков при внедрении систем интенсивного выращивания.

Во Французской Полинезии в 2003 г. была разработана эффективная стратегия борьбы, основанная на (1) поставке свободных от вирусов черенков, (2) покрытии теневых домов сеткой, защищающей от насекомых, (3) удалении больных растений, как только они обнаружены, (4) дезинфицированные инструменты и (5) уничтожение сорняков (особенно C. diffusa) внутри и в непосредственной близости от плантации. Обследование после внедрения в 2007 году показало, что вирусное воздействие (CMV и других вирусов) резко снизилось на новых плантациях, которые следовали рекомендациям (Richard et al., 2009).

Эпидемиологические данные показывают, что распространенность CMV может сильно варьировать от одного района к другому, особенно в связи с наличием резервуаров вируса. Следовательно, стратегии борьбы должны быть адаптированы к каждому конкретному контексту выращивания.

Помимо основных вирусов, уже подробно описаны другие вирусы, имеющие незначительное экономическое значение, как вирус кольцевой пятнистости одонтоглоссума (ORSV), или мало выраженные, как рабдоподобный вирус и клостероподобные вирусы (Bhat et al., 2004; Pearson et al., 1993), о которых также сообщалось у ванили.

Вирус кольцевой пятнистости одонтоглоссума (ORSV)

ORSV является представителем рода Tobamovirus, членом которого является вирус табачной мозаики (Jensen and Gold, 1951). Палочковидные частицы ORSV (300 × 18 нм) содержат одноцепочечную положительно-смысловую молекулу РНК размером примерно 6,6 т.п.н., кодирующую пять белков (Ryu et al., 1995). Диапазон естественных хозяев ORSV ограничен орхидеями, у которых он может вызывать серьезные симптомы, такие как мозаика, кольцевые пятна, некроз листьев и цветов (Albouy and Devergne, 1998; Gibbs et al., 2000). Как тобамовирус, ORSV обладает высокой стабильностью в соке (температурная инактивация 90°C и конечная точка разведения 10^-5-10^-6) и легко передается механическими средствами. Он часто встречается у культурных декоративных видов во всем мире (Freitas et al., 1999; Khentry et al., 2006; Zettler et al., 1990).

Однако, на ванили вирус имеет очень ограниченную заболеваемость и распространенность. Он был серологически обнаружен у нескольких лиан ванили на Тонге, Фиджи, островах Кука, Ниуэ, Французской Полинезии и на острове Реюньон (Farreyrol et al., 2001; Pearson and Pone, 1988; Pearson et al., 1993; Wisler et al., 1987), но никакие симптомы не были связаны с вирусом. Однако, во время карантина растений на острове Реюньон мы недавно наблюдали лиану V. pompona, происходящую из ботанического сада, с мозаикой на молодых листьях (рис. 7.6). Это растение давало положительный результат на ORSV и отрицательный на CymMV, потивирусы и CMV при помощи ELISA и RT-PCR.

РИСУНОК 7.6. Мозаика на листе V. pompona, инфицированного ORSV.

Поскольку ваниль встречается относительно нечасто, ORSV до сих пор не имел особого значения на производственных участках. Однако, из-за его возможной патогенности и отсутствия естественного переносчика стоит протестировать посадочный материал на этот вирус, чтобы избежать его размножения. Как и в случае с CymMV, был разработан ряд инновационных методов для обнаружения ORSV.

Неопознанный рабдо-подобный вирус

Во время обследования, проведенного на островах Тихого океана (Pearson et al., 1993), необычные симптомы на листьях, состоящие в виде некротических пятен, наблюдались на ванильных участках (рис. 7.7a) Вануату и Фиджи. Детальное препарирование симптоматических листьев выявили наличие оболочечных бацилловидных частиц, указывающих на возможный Rhabdovirus.

РИСУНОК 7.7. (a) Образования и некроз на листьях V. planifolia, инфицированных (b) оболочечными вирусоподобными частицами, видимыми под электронным микроскопом.

Семейство Rhabdoviridae (отряд Mononegavirales) содержит вирусы, поражающие животных и растения, которые передаются членистоногими и могут размножаться в переносчике (Fauquet et al., 2005). Рабдовирусы, инфицирующие растения, относятся к двум родам (Cytorhabdovirus и Nucleorhabdovirus), но номер до сих пор не присвоен, включая предполагаемый рабдовирус пятнистости орхидей (OFV), который стал более распространенным среди орхидей за последнее десятилетие (Kitajima et al., 2001; Kondo et al., 2006). OFV был предварительно отнесен к новому роду Dichorhabdovirus, поскольку его геном, хотя и демонстрирует сходство последовательностей с нуклеорабдовирусами, является двухниточным и частицы не покрыты оболочкой (Kondo et al., 2009). Эта последняя особенность контрастирует с предполагаемыми частицами рабдовируса, обнаруженными в ванили, которые явно покрыты оболочкой (рис. 7.7b). Кроме того, неоднократные попытки амплифицировать последовательности OFV из симптоматических листьев ванили с использованием специфических праймеров (Blanchefield et al., 2001) потерпели неудачу (Mongredien, 2002). После 1993 г. о дальнейшем повреждении ванили, которое напоминает этот еще не охарактеризованный предполагаемый рабдовирус не сообщалось, и этот вирус следует рассматривать как курьез для участков ванили.