Ваниль

Введение

Vanilla planifolia G. Jackson (син. V. fragrans Andrews) – тропическая вьющаяся орхидея (рис. 5.1), известная своим популярным изысканным ароматом ванили (Purseglove et al., 1981), и вторая по цене пряность, после шафрана, продаваемая на мировом рынке (Ferrão, 1992). Основными странами-производителями ванили являются Мадагаскар, Индонезия, Уганда, Индия и Коморские острова, причем Мадагаскар занимает первое место. После открытия в 1492 году Нового Света Колумбом, самый ранний отчет о распространении ванили из Мексики принадлежит отцу Лабату, импортировавшему в 1697 году три лианы V. planifolia на Мартинику. Отсутствие естественных опылителей в районах интродукции препятствовало половому размножению и производству стручков до открытия искусственного опыления в первой половине девятнадцатого века (Bory et al., 2008d). Непрерывное вегетативное размножение, отсутствие естественного набора семян и недостаточные вариации в генофонде – все это препятствует программам улучшения данной культуры.

РИСУНОК 5.1. Лиана V. planifolia – в полном плодоношении.

За короткий промежуток времени биотехнология оказала значительное влияние на характер развития и качество жизни во всем мире (Bhatia, 1996). Во второй половине двадцатого века возникли новые отрасли промышленности, основанные на открытиях, сделанных в области биологических наук, а прогресс, достигнутый за последние годы в молекулярной биологии, генной инженерии и культуре тканей растений, открыл новое измерение в улучшении сельскохозяйственных культур.

Культура in vitro является одним из ключевых инструментов биотехнологии растений, в которой используется тотипотентная природа растительных клеток – концепция, предложенная Хаберландтом и впервые недвусмысленно продемонстрированная Фредериком Стюардом (Haberlandt, 1902; Steward et al., 1958). Ее можно использовать для производства здоровых клонов, массового клонирования выбранных генотипов, сохранения генофонда, отбора мутантов, выращивания гибридов нескрещиваемых таксонов, посредством соматической гибридизации, включения желаемых признаков с помощью генной инженерии и в производстве вторичных метаболитов в культивируемых клетках или тканях (Thorpe, 1990). Однако, реализация этих целей требует предварительной стандартизации и оптимизации процедур культивирования тканей.

Проблемы, на которые следует обратить внимание

Как товарная культура, ваниль играет важную роль в экономике Мадагаскара, Коморских Островов, Индонезии и Уганды. Непрерывное клональное размножение V. planifolia ведет к монокультуре, подвергая урожай серьезным потерям (Gopinath, 1994), поскольку ваниль поражается большим количеством вредителей и болезней (см. главы 7, 8, 9 и 20). Внедрение нового генетического материала в значительной степени сдерживается такими факторами как её бесполое размножение, преимущественным самоопылением цветов и опасностью, грозящей дикорастущим популяциям ванили из-за антропогенного давления (Lubinsky, 2003). Отсутствие достаточной изменчивости генофонда, угроза деструктивных заболеваний, уничтожающих плантации ванили, а также разрушение её естественной среды обитания, делают необходимым поиск альтернативных методов внесения изменчивости в генофонд. Бедный генофонд можно обогатить, используя межвидовую гибридизацию для объединения имеющегося первичного генофонда рода Vanilla со вторичным генофондом, то есть близкими родственниками V. planifolia, который является важным источником желательных признаков, таких как самоопыление, низкая зависимость стимуляции цветения от фотопериода, высокое завязывание плодов, нерастрескивание стручков и устойчивость к болезням (Lubinsky, 2003).

Различные виды ванили встречаются в разных географических регионах, и их сезоны цветения не синхронизированы, что создает трудности в перемещении пыльцы к видам-рецепторам для обеспечения опыления между видами. Именно в таких случаях становится важной разработка методов хранения жизнеспособной пыльцы в течение длительных периодов времени.

Переработчикам и потребителям ванили будет полезно улучшение качественных характеристик – повышенное содержание ванилина, более крупный размер стручков, улучшенный аромат и вкус и т. д. Чтобы улучшить прорастание незрелых зародышей в полноценное растение, можно использовать методы извлечения и регенерации зародышей из нежизнеспособных гибридных семян. Культура клеток или культура протопластов полезны возможностью создания соматических гибридов для переноса признаков из инородных источников. Протопласты могут использоваться в качестве органов-мишеней для преобразования, при условии их восстановления в полноценный саженец. Клональное размножение элитных линий, сохранение in vitro и международный обмен гермоплазмой возможны с использованием методов микроразмножения. Молекулярные маркеры – ДНК-маркеры [случайная амплифицированная полиморфная ДНК (RAPD), полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP), полиморфизм длины амплифицированного фрагмента (AFLP)] и биохимические маркеры (изофермент, белок) – могут применяться для описания свойств гермоплазмы и сомаклональных вариантов.

Генетическое разнообразие в Vanilla

V. planifolia – культура, мало отличающаяся от своих дикорастущих предков. Это можно объяснить недавним окультуриванием и ограниченным размножением (Bory et al., 2008c; Lubinsky et al., 2008a). В культивируемой ванили Мексики было обнаружено несколько типов, различающихся вегетативным внешним видом или способом воспроизводства (Soto Arenas, 2003). Анализ данных по изоферментам образцов с плантаций ванили на севере Веракруса, Оахаки и прочих мест в Мексике показал в целом незначительную генетическую изменчивость (Soto Arenas, 1999), хотя растения, происходящие из двух основных областей, можно было различить. Изменения нуклеотидной последовательности в интронах двух специфических генов, кодирующих белок, а именно кальмодулин и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, были обнаружены, но не смогли быть разграничены среди мексиканских типов ванили. За пределами страны происхождения, ваниль, вероятно, имеет клональное происхождение, и здесь можно ожидать очень незначительных вариаций. Плантации ванили на Реюньоне, Мадагаскаре, Маврикии и Сейшельских островах произошли от одного черенка (Lionnet, 1958), и, согласно имеющейся информации, наблюдается мало различий в типах культивируемой V. planifolia. Однако, недавние исследования показали, что самоплодотворение, а также случаи полиплоидизации привели к фенотипическому разнообразию ванили на Реюньоне (Bory et al., 2008a, 2008b, 2008c).

За последнее десятилетие, для изучения генетического разнообразия на уровне рода, были разработаны молекулярные маркеры – RAPD, AFLP и единичные повторы последовательности (SSR).

RAPD использовался для оценки уровня генетического разнообразия и взаимосвязей между различными клонами V. planifolia и родственными видами. Эти данные подтвердили очень ограниченную изменчивость сообщества V. planifolia, указывающую на его узкую генетическую базу и тесную связь с V. tahitensis J.W. Moore (Besse et al., 2004; Minoo et al., 2008; Schlüter et al., 2007). В исследовании, включающем как листовые, так и безлистные видоы, такие как V. planifolia, V. tahitensis, V. andamanica Rolfe, V. pilifera Holtt. и V. aphylla Blume (рис. 5.2), наблюдалась разумная вариабельность, свидетельствующая о возможности естественного самосева в дикой природе. Несмотря на внешнее морфологическое сходство, V. andamanica не имеет близкого родства с V. planifolia или V. tahitensis, а её образцы отличаются от всех других изученных видов, образуя отдельный уникальный кластер (Minoo et al., 2008). Между восемью различными образцами V. andamanica наблюдалась значительная изменчивость, подтверждающая вероятность того, что этот вид действительно произошел с Андаманских островов, где возможно семенное размножение (Minoo et al., 2008). Ранее сообщалось о появлении естественных семян у V. wightiana в Индии (Rao et al., 2000).

РИСУНОК 5.2. Цветки индийских видов ванили: (a) и (b) V. andamanica с разным цветом губы, (c) V. pilifera с указанием посещения насекомыми и d) V. aphylla.

Профили AFLP были разработаны для анализа видов Vanilla, межвидовых гибридов и самоопыленных потомков (Bory et al., 2008c; Lubinsky et al., 2008a; Minoo et al., 2006b). Все эти анализы сошлись на том, что большинство образцов V. planifolia, культивируемых за пределами Мезоамерики, демонстрируют очень низкий уровень генетического разнообразия, поскольку произошли от одного образца, возможно, мексиканского сорта «Манса» из Папантлы.

Также были изучены закономерности диверсификации у культурного вида и проведено сравнение с другим культурным (V. tahitensis) или дикорастущими видами (V. aphylla, V. bahiana, V. insignis, V. odorata и V. pompona). У этих родственных видов, межвидовых гибридов и самоопыленных потомков был обнаружен четкий полиморфизм.

Сообщалось о разработке SSR-маркеров (микросателлитов) (Bory et al., 2008b). Описаны выделение и характеристика 14 микросателлитных локусов V. planifolia. Как и ожидалось, внутри культурных образцов они были мономорфными, исходя из вероятного единственного клонального происхождения этой культуры и предыдущих генетических исследований. Эти маркеры были переносимыми для V. tahitensis, и 11 локусов оказались полиморфными между этими двумя близкородственными видами. Кроме того, некоторые из этих маркеров были переносимыми и полиморфными среди 15 других дикорастущих американских, африканских и азиатских видов и выявили устойчивые взаимосвязи между ними, а также четкую картину дифференциации видов Старого и Нового Света внутри рода. Кроме того, использование микросателлитов позволило провести первую молекулярную оценку уровней гетерозиготности у этого вида, что было невозможно при использовании доминирующих маркеров, таких как AFLP или RAPD.

Для реконструкции эволюционной истории ванилоидных орхидей, включая несколько видов Vanilla, использовалось секвенирование нейтральных генов (Cameron, 2000, 2004, 2009; Cameron and Molina, 2006; Cameron et al., 1999). Последовательности ядерной ДНК (внутренний транскрибируемый спейсер, ITS) и пластид (ген rbcL) использованы для выяснения происхождения таитянской ванили (Lubinsky et al., 2008b). Полиморфизм длины гена ненейтральной О-метилтрансферазы кофейной кислоты также недавно был использован для анализа 20 видов ванили и подтвердил сильную дифференциацию видов Старого и Нового Света в этом роде (Besse et al., 2009). На основе данных секвенирования ядерной и плазмидной ДНК Кэмерон (Cameron, 2005) предложил создать систему штрих-кода (Lahaye et al., 2008) для ванили с использованием области ITS и межгенного спейсера psbA-trnH. Эта система может позволить рутинную идентификацию образцов ванили до уровня вида и, возможно, даже до уровня образца.

Для построения надежной филогении рода Vanilla необходимо задействовать эталонные гербарные образцы. С этой целью следует рассмотреть возможность создания пластидных мононуклеотидных микросателлитов для ванили (особенно при использовании образцов деградированной ДНК, извлеченных из гербарного материала), которые уже успешно применялись для биогеографических исследований орхидей (Fay and Krauss, 2003; Micheneau, 2002).

Учитывая сложность использования классических фенотипических маркеров для многолетних культур, таких как ваниль, молекулярные маркеры являются мощным инструментом изучения изменчивости культивируемой ванили, выяснения взаимосвязей между видами, определения межвидовых гибридов и выявления важных генотипов (Minoo et al., 2006a). Поэтому они очень полезны для мониторинга и оценки достижений биотехнологий.

Размножение и методы разведения

Коммерческая ваниль всегда размножается стеблевыми черенками здоровых сильно-рослых растений и может быть срезана с любой части лианы. Длина черенка обычно определяется количеством доступного посадочного материала. Коротким черенкам длиной 20 см потребуется 3–4 года, чтобы зацвести и заплодоносить. Обычно предпочтительны черенки длиной 90–100 см, так как они имеют тенденцию к более раннему цветению. Когда они активны, со свободными концами свисающими с опор, то зацветут и заплодоносят через 1-2 года. Черенки обычно сразу высаживают на место, но при необходимости их первоначально подращивают на грядках. Из-за своей сочной природы черенки при необходимости можно хранить или транспортировать до двух недель.

Традиционно гермоплазму ванили хранят в биорепозиториях, принадлежащих ботаническим садам и научным учреждениям. Высокая стоимость традиционных систем ограничивает количество хранимых образцов. Для уменьшения потерь биоразнообразия и сохранения исчезающих видов, были предприняты попытки сохранять виды ванили in vitro (Jarret and Fernandez, 1984; Minoo et al., 2006b).

В селекционных целях ваниль можно выращивать из семян. Гибридизация и выращивание растений из семян проводились в Пуэрто-Рико и на Мадагаскаре. Семена необходимо продезинфицировать, промыть в стерильной дистиллированной воде и культивировать в питательной среде Кнудсона (Knudson, 1950). Прорастание семян ванили лучше, если культуры содержатся в темном инкубаторе при 32°C. Для прорастания семян межвидовых скрещиваний V. planifolia и V. pompona требуется более высокая температура в 34°C.

Проращивание семян in vitro

Ваниль дает множество мелких семян, которые не прорастают в естественных условиях. Для успешного проращивания семян можно использовать технику культивирования тканей. Протоколы для выращивания семян и зародышей ванили стандартизированы (Gu et al., 1987; Knudson, 1950; Minoo et al., 1997; Withner, 1955).

Посев семян на различных базальных средах показал, что семена ванили не имеют строгих требований к питанию для начала прорастания, в отличие от некоторых наземных орхидей умеренного климата (Minoo et al., 1997). Прорастание семян начинается в течение четырех недель после культивирования, и начальные стадии прорастания типичны для большинства орхидей, такие как набухание зародыша с последующим разрывом семенной оболочки и последующее появление протокорма (рис. 5.3). Семена прорастали непосредственно в проростки в среде, дополненной одним бензиладенином (БА) (0,5 мг/л), без какой-либо промежуточной фазы каллуса, и, таким образом, их можно было использовать для получения самоопыленных потомков/проростков. Добавление триптона имело стимулирующий рост эффект на размер и развитие протокорма, независимо от базовой среды, в которую он был добавлен. При обработке БА большинство протокормов оставались такими же, с чешуевидными примордиальными листьями и развивающимися в побеги, тогда как обработка добавками ауксина показала постепенную дезорганизацию протокорма в каллус. Среда Мурасиге и Скуга (МС), для культур ванили in vitro, давала лучший отклик, чем среда Кнудсона. Минимальная всхожесть (26%) наблюдалась в среде МС при половинной концентрации, а максимальная (85%) была зарегистрирована в среде МС полной концентрации с добавлением 2 г/л триптона (Minoo, 2002).

РИСУНОК 5.3. Прорастание семян in vitro.

Считается, что потребность в цитокинине для прорастания связана с использованием липидов, которые составляют основной запасной материал в большинстве семян орхидей, и было замечено, что, если запасной липид не используется, прорастание не продолжается (De Pauw et al., 1995).

Известно, что ваниль, культура с перекрестным опылением, имеет множество мейотических и постмейотических хромосомных аномалий (Ravindran, 1979). В результате можно получить различные цитотипы в семенном потомстве. Таким образом, выращивание из семян может дать множество генетически разнообразных типов. Исследования прорастания семян ванили и полученного в результате потомства in vitro показали морфологические и биохимические вариации. На самоплодных потомках V. planifolia были изучены профили изоферментов супероксиддисмутазы (SOD) и пероксидазы (PRX). Профили четко указывают на различия между потомками, выраженные наличием или отсутствием конкретных полос. Максимальное сходство, которое продемонстрировали эти потомки, составило 47,37%, что указывает на высокую сегрегацию и уровень гетерозиготности, существующие у V. planifolia (Minoo et al., 1997). Эта гетерозиготность была дополнительно подтверждена анализом AFLP (Bory et al., 2008c). Поэтому, культуру in vitro можно использовать для проращивания семян и отбора полезных генотипов из сегрегированных потомков, которые можно было бы массово размножать для получения свободного от болезней посадочного материала.

Микроразмножение

Размножение ванили in vitro необходимо для получения однородных, свободных от болезней ростков и сохранения генетических ресурсов. Размножение in vitro с использованием апикальной меристемы стандартизовано для крупномасштабного размножения здоровых и генетически стабильных растений (Cervera and Madrigal, 1981; George and Ravishankar, 1997; Kononowicz and Janick, 1984; Minoo, 2002; Minoo et al., 1997; Philip and Nainar, 1986; Rao et al., 1993b). Стандартизовано in vitro размножение V. tahitensis (Mathew et al., 2000) и исчезающих видов ванили, таких как V. wightiana, V. andamanica, V. aphylla и V. pilifera (Minoo et al., 2006b), чтобы защитить эти виды от исчезновения.

Сообщалось о методах клонального размножения для эффективного размножения V. planifolia путем индукции множественных побегов из эксплантатов пазушных зачатков (рис. 5.4) с использованием полутвердой среды МС с добавлением БА (2 мг/л) и α-нафталинуксусной кислоты (НУК, 1 мг/л) (George and Ravishankar, 1997). Множественные побеги переносили в перемешиваемую жидкую среду МС с БА в концентрации 1 мг/л и НУК в концентрации 0,5 мг/л в течение 2–3 недель, а затем культивировали на полутвердой среде. Используя этот метод, в среднем от одного эксплантата пазушной почки было получено 42 побега в течение 134 дней. Было обнаружено, что использование промежуточной жидкой среды способствует увеличению количества побегов.

РИСУНОК 5.4. Микроразмножение V. planifolia.

В другом исследовании (Minoo et al., 1997) оценивался перенос эксплантов на среду МС, содержащую различные уровни цитокинина (БА) и ауксина (индолмасляная кислота, ИМК), для пролиферации (таблица 5.1). Инициирование роста уже существующих почек in vitro может быть индуцировано в среде МС с низким содержанием цитокинина. Однако, комбинация цитокининов и ауксина способствовала образованию множественных побегов. Идеальной средой для размножения была МС с добавлением БА (1 мг/л) и ИМК (0,5 мг/л). В этой среде за 90 дней культивирования индуцировалось в среднем 15 множественных побегов (рис. 5.4). Узловые сегменты давали лучший ответ: в среднем 15 побегов на культуру по сравнению с кончиками побегов, которые давали в среднем семь побегов на культуру (Minoo, 2002). Питательные среды и условия, благоприятные для микроразмножения V. planifolia, подходили для других родственных видов, таких как V. andamanica, V. aphylla (рис. 5.5) и V. pilifera. Количество индуцированных побегов у разных видов варьировало (таблица 5.2). Примерно 12-15 побегов на культуру могут быть индуцированы у V. planifolia, и 8-10 побегов у V. aphylla. Среди изученных видов наименьшая скорость размножения наблюдалась у V. pilifera. Удлиненные побеги, из среды для пролиферации, укореняли на среде МС, содержащей 30 г/л сахарозы, без регулятора роста (рис. 5.6). Приживаемость проростков с хорошо развитыми корнями in vitro составила более 70%. Возникновение корней на микрочеренках начиналось между четырьмя и шестью днями после культивирования, достигая 100% культуры через две недели, что указывает на то, что оптимальные эндогенные уровни регуляторов роста растений, необходимых для укоренения, уже присутствовали в ткани/эксплантатах.

БА = бензиладенин, ИМК = индол-3-масляная кислота, Кин = кинетин, НУК = α-нафталинуксусная кислота.

БА = бензиладенин, ИМК = индол-3-масляная кислота, Кин = кинетин, НУК = α-нафталинуксусная кислота.

^a Ко всем регуляторам роста добавляли базальную среду МС в концентрации от 0,5 до 1,0 мг/л.

РИСУНОК 5.5. Возникновение множественных побегов in vitro у V. aphylla.

Разработаны простые и быстрые протоколы массового размножения V. planifolia (Janarthanam et al., 2005; Kalimuthu et al, 2006). Коммерчески жизнеспособный протокол массового размножения V. tahitensis, другого культивируемого вида ванили, был стандартизован с коэффициентом размножения 1:4,7 в течение периода культивирования 60–70 дней (Mathew et al., 2000). Рао (Rao et al., 2000) сообщил о случае микроразмножении V. wightiana Lindl., находящегося под угрозой исчезновения вида. Изучалось влияние других добавок, а именно, нитрата серебра, тидиазурона, зеатина, кокосового молока и т. д. на размножение побегов in vitro и образование корней у V. planifolia (Giridhar et al., 2001; Giridhar and Ravishankar, 2004).

Превращение кончиков корней в побеги наблюдали у V. planifolia и V. aphylla при культивировании на среде МС с добавлением БА (1,0 мг/л) и ИМК (0,5 мг/л). Эти побеги превратились в проростки, укрепились и укоренились в почве. Ранее сообщалось о превращении корневой меристемы в побеги в культурах ванили in vitro (Philip, Nainar, 1988). Предполагается, что эти меристематические преобразования без стадии каллуса сводят к минимуму вероятность индуцированных эпигенетических изменений. Более ранние исследования (Sreedhar et al., 2007) указали на отсутствие различий в паттернах AFLP-бэндов любого из микроразмножающихся образцов для конкретного праймера, что позволяет предположить отсутствие различий между микроразмножающимися растениями.

РИСУНОК 5.6. Укоренение in vitro в культурах V. planifolia.

Регенерация растений через каллусные культуры

Непрерывное вегетативное размножение и отсутствие достаточных изменений в генофонде препятствуют программам улучшения сельскохозяйственных культур. Введение сомаклональной изменчивости через каллусные культуры было предпринято для расширения узкой генетической базы. Система индукции каллуса и регенерации растений in vitro оптимизирована как для вегетативных, так и для репродуктивных тканей. Наилучшие результаты были получены при использовании вегетативных тканей, и более 80% каллусий было достигнуто в среде МС с добавлением 1 мг/л БА и 0,5 мг/л НУК. Каллус дифференцировался в побеги, которые можно было успешно размножить в соотношении 1:12 в комбинации 1 мг/л БА и 0,5 мг/л ИМК при добавлении среды МС (таблица 5.3). Укоренение in vitro индуцировали с эффективностью 100% в базальной среде МС, лишенной каких-либо регуляторов роста. Эта способность дедифференцированной ткани к регенерации является важной предпосылкой для экспериментов по генетической трансформации. Протокол был успешно распространен на находящиеся под угрозой исчезновения дикорастущий вид V. aphylla, предлагая возможность применения протокола для массового размножения, а также индукции вариаций у видов Vanilla за ограниченное время.

БА = бензиладенин, ИМК = индол-3-масляная кислота, Кин = кинетин, НУК = α-нафталинуксусная кислота.

Сообщений об изменчивости каллус-регенерированных растений ванили немного. Они касаются успешной регенерации растений из каллусов, полученных из листьев и семян (Davidonis and Knorr, 1991; Davidonis et al., 1996; Janarthanam and Seshadri, 2008; Xju et al., 1987), и исследований среди местных коллекций ванили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) (Rao et al., 1993a). Исследование, включающее случайным образом отобранные каллус-регенерированные потомства, показало изменчивость морфологии и профилей RAPD (рис. 5.7) среди регенерированных из каллусов растений, по сравнению с контрольным растением V. planifolia (Minoo, 2002). Показано, что с помощью этого протокола может быть получена значительная вариабельность, которая может быть использована в программах улучшения ванили для создания вариантов с желаемыми агрономическими характеристиками.

РИСУНОК 5.7. Профили RAPD потомков ванили, регенерированных из каллуса, с использованием праймера OPERON OPA10. 1 – лестница 1 kb, 2–23: растения, регенерированные из каллусов, 24 – контроль (V. planifolia).

Культуры каллуса из листовых эксплантатов V. planifolia показали лучшее инициирование каллуса, чем культуры из узловых эксплантатов с максимальной продукцией биомассы каллуса при культивировании на базальной среде МС, содержащей 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и БА. Каллус, перенесенный в базальную среду МС с добавлением 3 мг/л БА и 2,5 мг/л μМ НУК, показал лучший ростовой ответ. Производство каллуса V. planifolia, экстракция ванилина и использование феруловой кислоты для увеличения содержания ванилина запатентовано (Davidonis et al. 1996).

Сообщалось о наследственных сомаклональных вариациях в отношении различных признаков устойчивости, а именно: устойчивости к метионинсульфоксиму (Carlson, 1973) и Pseudomonas syringae (Thanutong et al., 1983) у табака, устойчивости к Fusarium oxysporum у томатов (Evans et al., 1984), а также устойчивости к Helminthosporium sativum (Chawla, Wenzel, 1987) у пшеницы. В будущих попытках генетически трансформировать ваниль, способность трансформированной ткани к регенерации является решающим условием. Оптимизированный протокол регенерации (Minoo, 2002) может сократить продолжительность экспериментов по генетической трансформации, вызывая высокую частоту регенерации.

Выращивание рассады ex vitro

Большинство видов растений, выращиваемых in vitro, требуют постепенной акклиматизации и закаливания для выживания и роста в естественной среде. Выживание растений in vitro зависит от их способности противостоять потере воды и осуществлять фотосинтез. Однако, у ванили выживаемость перенесенных растений в процессе закаливания в настоящее время составляет более 80% (Minoo, 2002). Проростки необходимо извлечь из культуральных сосудов (рис. 5.8), промыть, обработать фунгицидом, перенести в полиэтиленовые пакеты, содержащие почвенную смесь (песок, почву и вермикулит), и закалить в течение 30 дней в контролируемых условиях (26–28°C, 80–90% относительной влажности). Инициирование нового роста происходит за счет развития пазушной ветви. Эти растения успешно переносятся в почву после трехнедельного периода закаливания (рис. 5.9). Позже они высаживаются на участок с подходящей тенью и опорой.

РИСУНОК 5.8. Закалка проростков, выращенных in vitro.

РИСУНОК 5.9. Растения из культуры ткани, выращиваемые в горшках.

Межвидовая гибридизация

Межвидовая гибридизация – это давний механизм, с помощью которого полезные гены диких предков и видов могут быть перенесены в культивируемые виды. Культурные типы многих видов сельскохозяйственных культур были улучшены за счет межвидовой гибридизации и обратного скрещивания. Межвидовая гибридизация очень распространена у орхидей для получения новых разновидностей цветущих растений.

Нильсен и Сигзмунд (Nielsen and Siegsmund, 1999) сообщали о естественном возникновении межвидовых гибридов ванили между V. claviculata и V. barbellata в Пуэрто-Рико, в местах сосуществования. Было обнаружено потомство, имеющее промежуточные морфологические признаки между двумя родителями.

Культурные вид V. planifolia был скрещен с другими американскими видами, включая V. pompona и V. phaeantha, устойчивым к Fusarium (Purseglove et al., 1981). На Яве также была проведена межвидовая гибридизация культурной и дикорастущей ванили с целью создания линий, устойчивых к стеблевой гнили, вызываемой Fusarium oxysporum (Mariska et al., 1997).

В Индии V. aphylla и V. pilifera цветут синхронно, но V. aphylla естественным образом встречается в Южной Индии, а V. pilifera – в Ассаме, Северо-Восточная Индия. При культивировании в Керале цветки обоих видов раскрывались последовательно и держались один день у V. pilifera, тогда как у V. aphylla – два дня. В первом случае признаки завязывания плодов наблюдались даже без ручного опыления, тогда как цветки V. aphylla не завязывали плоды. Поскольку ростеллум присутствует у обоих видов, естественное опыление без посторонней помощи исключено. Можно предположить, что аромат цветов V. pilifera привлекает насекомых (которые, как было установлено, часто посещают цветы), чтобы посетить их и произвести эффективное опыления (Д. Миноо, неопубликованные данные). Самостоятельную и межвидовую гибридизацию между двумя видами проводили вручную и наблюдали завязывание плодов.

Были предприняты успешные попытки увеличить спектр изменчивости V. planifolia путем межвидовой гибридизации с V. aphylla, устойчивой к Fusarium (Minoo, 2002). Морфологические признаки и молекулярные профили выявили истинную гибридность у межвидовых потомков. Выращенное потомство V. planifolia и межвидовые гибриды, полученные от скрещивания V. planifolia (мать) и V. aphylla (отец), оценивались с использованием ряда локусов AFLP и RAPD в качестве маркеров. Профили показали сходство между родителями, потомками от самоопыления и межвидовыми гибридами, а все протестированные потомки были разными по сравнению друг с другом, что можно использовать для улучшения культуры ванили (Minoo et al., 2006a).

Таким образом, эти успешные внедрения мужских и женских признаков в гибриды (Minoo et al., 2006a) посредством межвидовой гибридизации, подтвержденные молекулярными профилями, обещают помочь преодолеть основные узкие места в селекции ванили.

Хранение in vitro

Стандартизированы эффективные процедуры хранения in vitro путем медленного роста отдельных видов ванили (Minoo et al., 2006b). Добавление маннита (10-15 г/л) и снижение сахарозы до более низких уровней (15-10 г/л) вызывало медленный рост, и более 80-90% культур можно было поддерживать в течение периода 360 дней, когда культуральные сосуды были закрыты алюминиевой фольгой. Добавление маннита и сахарозы в равных пропорциях в количестве 10 или 15 г/л может помочь поддерживать культуры в течение одного года, а с ежегодным субкультивированием in vitro более семи лет. Проростки, содержащиеся в этой среде, показали пониженную скорость роста и максимальную выживаемость. Консервированный материал переносили в среду МС, обогащенную 30 г/л сахарозы и дополненную 1 мг/л БА и 0,5 мг/л ИМК для получения нормальных побегов и их размножения. Проростки небольшого размера, которые хранились в среде для консервации более одного года, показали хороший рост и превратились в растения нормального размера с хорошей степенью размножения (1:5). Эти саженцы были перенесены в почву (садовая почва:песок:перлит в равных пропорциях) и легко укоренились с успехом 80% во влажной камере в течение 20–30 дней после пересадки. Они превратились в нормальные растения без каких-либо деформаций и симптомов дефицита и проявляли очевидное морфологическое сходство с материнскими растениями. После более чем семи лет хранения с медленным ростом, включающего более пяти циклов субкультивирования, генотипическая стабильность нескольких видов была оценена с помощью молекулярных маркеров. Никаких изменений в дактилоскопии ДНК по сравнению с неконсервированными контролями в лаборатории авторов не наблюдалось.

Джаррет и Фернандес (Jarret and Fernandez, 1984) сообщили о хранении верхушек побегов V. planifolia в качестве тканевых культур в течение 10 месяцев, а Филип (Philip, 1989) обсудил возможность использования корневых культур для сохранения гермоплазмы ванили для гарантированной генетической стабильности. Сообщалось о сохранении in vitro V. planifolia (Jarret and Fernandez, 1984) и V. walkeriae с использованием метода медленного роста (Agrawal et al., 1964), и было изучено влияние полиаминов на сохранность in vitro V. planifolia (Thyagi et al., 2001).

Обычные и in vitro генные банки дополняют друг друга, как активная и базовая коллекции генетических ресурсов. Хотя сохранение in vitro нельзя рассматривать как метод замены сохранения in situ, были продемонстрированы преимущества сохранения in vitro как компонента, который может быть включен в общую стратегию долгосрочного сохранения ванили для безопасного и экономичного хранения гермоплазмы.

Криоконсервация

Протоколы сохранения генофондов были разработаны для медленного роста, а также криоконсервации образцов ванили в виде инкапсулированных кончиков побегов, пыльцы и ДНК (Minoo, 2002). Объединение доступного генофонда поможет расширить генетическую базу и внедрить в культивируемую ваниль полезные гены из дикорастущих видов. Межвидовая гибридизация требует синхронного цветения между видами и наличия жизнеспособной пыльцы. Пыльцу двух асинхронно цветущих видов ванили, а именно культурной V. planifolia и её дикорастущего родственника V. aphylla, подвергали криоконсервации после высушивания. Предварительно обрабатывали криопротектором диметилсульфоксидом (5%) и криоконсервировали при -196°C в жидком азоте. Эта криоконсервированная пыльца была позже разморожена и протестирована на её жизнеспособность как in vitro, так и in vivo. Процент прорастания пыльцы V. planifolia и V. aphylla составил 82,1% и 75,4% соответственно, что указывает на её жизнеспособность. Эта криоконсервированная пыльца V. planifolia была успешно использована для опыления цветков V. aphylla, что привело к завязыванию плодов. Полученные таким образом семена были успешно культивированы для развития гибридных всходов (Minoo, 2002). Таким образом, оценка жизнеспособности и фертильности криоконсервированной пыльцы (рис. 5.10) видов ванили показала, что можно использовать криогенные методы для сохранения гаплоидного генофонда этого вида и управления им. Это имеет большое значение для облегчения скрещиваний в программах селекции, для распространения и обмена гермоплазмой, а также для сохранения ядерных генов гермоплазмы.

РИСУНОК 5.10. Прорастание криоконсервированной пыльцы.

Процедура хранения гермоплазмы ванили путем криоконсервации кончиков побегов с использованием метода инкапсуляции/дегидратации была стандартизирована (рис. 5.11). Кончики побегов, выращенных in vitro, инкапсулировали в 4% альгинате натрия. Инкапсулированные шарики подвергали предварительной обработке путем постепенного увеличения концентрации сахарозы от 0,1 до 1,0 М с последующей дегидратацией в течение 8 часов до содержания влаги 22%. Затем последовало быстрое замораживание путем погружения в жидкий азот. Криоконсервированные кончики побегов размораживали через 12 часов, выдерживая их на водяной бане при 40°C в течение 3 минут. Оттаявшим пропагулам давали возможность восстановиться на МС с 3% сахарозой, 1 мг/л БА и 0,5 мг/л ИМК в темноте в течение одной недели, а затем переносили на свет для повторного роста и размножения. Семьдесят процентов пропагул были восстановлены, выращены и размножены в полноценные растения (Ravindran et al., 2004).

РИСУНОК 5.11. Прорастание криоконсервированных побегов.

После полного внедрения, криоконсервация обеспечит быстрое и дешевое средство для дублирования базовой коллекции из соображений безопасности, а также для распространения наборов гермоплазмы в другие страны/континенты.

Производство синтетических семян

Технология синтетических семян была стандартизирована путем инкапсуляции на 3–5 мм регенерированных in vitro почек побегов и протокормов в 4%-ном альгинате натрия для получения жестких шариков хорошего качества, идеально подходящих для выдерживания низких температур и криоконсервации. Более высокие концентрации альгината не подходили, поскольку они давали очень твердую матрицу, которая препятствовала появлению почек побегов и тем самым влияла на скорость прорастания и восстановления, тогда как при более низких концентрациях альгината с гранулами было трудно обращаться во время криоконсервации и извлечения. Синтетические семена хранили при 5°C, 15°C и 22°C для изучения влияния температуры на их хранение и жизнеспособность. Низкие температуры (5°C и 15°C) не подходят для синтетических семян. Побеговые почки размером 0,4–0,5 см подходили для инкапсуляции, поскольку более мелкие почки не выдерживали хранения и теряли жизнеспособность в течение месяца. Однако, при температуре 22±2°C синтетические семена можно хранить в течение 10 месяцев (рис. 5.12). Растения, полученные из этих инкапсулированных почек, были явно здоровыми и превратились в нормальные растения.

РИСУНОК 5.12. Синтетические семена.

Клональное размножение V. planifolia с использованием инкапсулированных почек побегов было описано George et al. (1995). Синтетические семена идеальны для сохранения и обмена гермоплазмы, особенно у ванили, где нет естественного набора семян.

Выделение и слияние протопластов

Методы выделения и слияния протопластов важны из-за далеко идущих последствий в исследованиях улучшения растений путем модификации клеток и соматической гибридизации. была изучена Возможность протопластных систем у пряных культур, таких как кардамон, имбирь и ваниль (Triggs et al, 1995; Geetha et al., 2000).

Протопласты были успешно выделены из V. planifolia и V. andamanica при инкубации в растворе фермента, содержащем мацерозим R10 (0,5%) и онозука целлюлазу R10 (2%), в течение 8 часов при 30°C в темноте (таблица 5.4). Перед ферментативным раскрытием, листья in vitro подвергали плазмолизу в растворе, содержащем промывочные соли протопластов клеток с 9% маннитом. Поскольку у ванили было трудно отшелушивать нижний эпидермис, плазмолизированную ткань листа механически мацерировали, соскребая нижнюю поверхность листа острым лезвием и инкубируя с различными концентрациями и комбинациями растворов ферментов. Периодические микроскопические наблюдения показали высвобождение кластеров клеток и отдельных клеток после 2 ч инкубации в растворе фермента.

Было обнаружено, что для высвобождения и поддержания жизнеспособных протопластов, необходим изолирующий раствор, содержащий 9% маннитола. Выделенные протопласты имели округлую форму и были заполнены хлоропластами. Протопласты V. planifolia были больше по размеру (0,031 мм), чем у V. andamanica (0,022 мм), и их можно было отличить по расположению хлоропластов – периферических у V. planifolia и центрально разбросанных V. andamanica. Визуально различимая природа протопласта может быть использована для идентификации генетической трансформации у этих видов. Когда они подвергаются слиянию, опосредованному полиэтиленгликолем (PEG), то протопласты сливаются, образуя гетерокарион. Продукт слияния культивировали на жидкой среде МС с 0,5 м/л БА, 0,5 мг/л ИМК с добавлением 3% сахарозы и 7% маннитола в течение 20 дней. Развитие клеточной стенки вокруг продукта слияния наблюдали через 36 часов (Minoo et al., 2008). Технология слияния протопластов может быть очень полезной для переноса генов полезных признаков, наблюдаемых у V. andamanica, в V. planifolia, особенно естественного образования семян и устойчивости к болезням.

Будущее улучшения ванили

Ориентиры, достигнутые в виде различных технологий, могут быть эффективно использованы для создания спектра генетических вариаций ванили, тем самым преодолевая основное узкое место в программах селекции и улучшения культуры. Разработанная технология выделения и слияния протопластов может быть использована для передачи полезных признаков посредством получения соматических гибридов, тем самым уступая место генетическим манипуляциям с ванилью. Характеристика видов ванили, образцов, сеянцев, сомаклонов и межвидовых гибридов доказала существование и степень генетических вариаций, которые доступны и вносятся с помощью биотехнологических инструментов. Методы сохранения in vitro с использованием синтетических семян, медленного роста и криоконсервации станут неотъемлемой и важной частью общей стратегии сохранения в управлении генетическими ресурсами гермоплазмы ванили. Кроме того, технология синтетических семян представляет собой идеальное средство для обмена незараженным посадочным материалом.