Ваниль

Введение

Запутанная таксономия

Как показали недавние молекулярно-филогенетические исследования, Vanilla – древний род в семействе Orchidaceae, подсемействе Vanilloidae, трибе Vanilleae и подтрибе Vanillinae, (Bory et al., 2008c; Cameron, 2004, 2005; см. главу 1). Виды ванили естественным образом распространены по всей Америке, Африке и Азии и Океании между 27-й северной и южной параллелями. Портер описал 110 видов рода Vanilla (Portères, 1954), число которых сократилось до 90 (Cameron and Chase, 1999) и до 107 (Soto Arenas, 2003). Также добавились новые виды, такие как семь дополнительно предложенных американских видов (Soto Arenas, 1999, 2006, 2010) или V. shenzenica, недавно описанная в Китае (Liu et al., 2007). Всего же на сегодняшний день описано более 200 видов ванили, но остаются многочисленные синонимы (Bory et al., 2008c). Таксономическая классификация основана на морфологических вариациях (Portères, 1954), а такие вегетативные и цветочные признаки сильно зависят от окружающей среды. В частности, вегетативные признаки (листья, стебли) значительно варьируют на внутривидовом уровне, что затрудняет таксономическую идентификацию (рис. 2.1). Примером этого является отсутствие надежных сертификатов на гербарии и часто отсутствие цветов (см. главу 4). Поэтому, таксономия Vanilla значительно выиграет от развития молекулярной филогенетики, которая уже показала, что секции и подсекции, используемые в таксономическом описании видов Портером, не имеют филогенетической ценности (Bouetard, 2007; Soto Arenas, 2003). Так, на основе кладистического анализа морфологических и молекулярных данных, недавно была предложена новая внутриродовая классификация Vanilla для 106 изученных видов, разделившая род Vanilla на два подрода: Vanilla и Xanata (разделенный на секции Xanata и Tethya) (Soto Arenas and Cribb, 2010). Также предлагаются новые ключи для 15 мексиканских и центрально-американских видов (Soto Arenas and Dressler, 2010) и, в большей степени, для внутриродовой таксономической идентификации в рамках Vanilla. Эта недавняя работа представляет собой решающий и важный шаг на пути к полному таксономическому пересмотру рода.

РИСУНОК 2.1. Морфологические вегетативные признаки у видов ванили из коллекции CIRAD на острове Реюньон (см. главу 3): (а) типичный образец листа для некоторых видов; (b) анализ основных компонентов вегетативных признаков (лист и стебель), измеренных у разных видов, показывающий важность внутривидовых вариаций, ведущих к перекрытию видов.

Вегетативное и половое размножение

Для большинства видов Vanilla вегетативный рост, происходящий естественным образом из стеблевых черенков, является преобладающим репродуктивным способом и представляется эффективной стратегией, принятой растением для развития колоний (Portères, 1954) (рис. 2.2). Как сообщается – для видов V. bahiana Hoehne (Pignal, 1994) и V. chamissonis Klotzsch (Macedo Reis, 2000) в Бразилии, V. barbellata Reichenbach f., V. claviculata (W. Wright) Swartz и V. dilloniana Correll (Nielsen and Siegismund, 1999) в Пуэрто-Рико или V. madagascariensis Rolfe на Мадагаскаре (P. Besse, перс. комментарий) часто наблюдаются стебли, стелющиеся по земле, дающие новые корни и образующие новые растения, когда стебель обрезан. Что касается V. planifolia, в естественных условиях Мексики одна и та же особь может занимать до 0,2 га (Soto Arenas, 1999).

РИСУНОК 2.2. Типичная вегетативная поросль, наблюдаемая у видов Vanilla. Слева: V. madagascariensis на Мадагаскаре. Справа: V. pompona в Гваделупе. (С любезного разрешения П. Бессе.)

У видов Vanilla мембрана ростеллума разделяет женскую и мужскую части цветка, поэтому опыление зависит от вмешательства внешних опылителей. Заметным исключением является вид V. palmarum (Salzm. Ex Lindl.) Lindl., который самопроизвольно самоопыляется (Bory et al., 2008c; Soto Arenas, 2006). Следовательно, половое размножение редко наблюдается в естественных условиях из-за потребности в опылителях. Для V. planifolia сообщается о частоте от 1% до 1‰ (Bory et al., 2008c; Soto Arenas, 1999), при этом возможными естественными опылителями в Америке являются орхидные пчелы из рода Euglossa и, возможно, из рода Eulaema (Lubinsky et al., 2006; Soto Arenas, 2006). Показатели полового размножения, сообщаемые для вида V. chamissonis (6% аутогамии и 15% аллогамии) , также относительно низки (Macedo Reis, 2000).

Однако, даже редкие случаи полового размножения могут привести к существенному генетическому разнообразию, поскольку одно событие полового размножения способно создать множество генотипов, которые могут быстро размножиться вегетативным путем. Гетерозиготность, наблюдаемая у V. planifolia, составляла 0–0,078 при использовании изоферментов (Soto Arenas, 1999), 0,154 при использовании маркеров SSR (Bory et al., 2008b) и 0,293 при использовании AFLP (Bory et al., 2008d). Учитывая эти уровни гетерозиготности, даже самоопыление может обеспечить генетическое разнообразие, как было продемонстрировано в экспериментах по самоопылению вручную (Bory et al., 2008d), что привело к увеличению оценок разнообразия (D_max от 0,106 до 0,140) за счет новых комбинаций аллелей (рисунок 2.3). Это хорошо видно на примере V. planifolia в районах интродукции, где отсутствуют естественные опылители. В этих районах, например на острове Реюньон, традиционные методы выращивания включают размножение лиан черенками и ручное самоопыление для получения стручков. Это привело к появлению новых сортов ванили, наблюдаемых на острове Реюньон, таких как тип «Aiguille», которые, скорее всего, возникли в результате случайного прорастания семян из забытого стручка и последующего вегетативного размножения особи (Bory et al., 2008d) (Рисунок 2.3). Такой новый тип может быстро распространиться на плантациях, учитывая вегетативное размножение, используемое для размножения лиан. Подобное должно происходить и в дикой природе. Комбинация полового и вегетативного размножения, в которой одно создает разнообразие, а другое способствует расселению, уже была предложена для видов V. pompona Schiede и V. bahiana в тропической Америке на основе моделей AFLP (Bory et al., 2008d). Таким образом, половое размножение является ключевым эволюционным процессом для большинства видов этого рода, несмотря на его низкие темпы и преимущественно вегетативного размножение. Некоторые виды Vanilla, по-видимому, для размножения полагаются исключительно на половое размножение. Так обстоит дело с V. palmarum, которая полностью эпифитна на пальме с коротким жизненным циклом (Pignal, 1994), а также с V. mexicana Mill. (син. V. inodora Shiede), у которых даже искусственное вегетативное размножение не удается (P. Feldmann, личн. ком.) (рис. 2.4).

РИСУНОК 2.3. Факторный анализ маркеров AFLP различных видов американской ванили, иллюстрирующий повышенное разнообразие самоопыленных потомков V. planifolia.

РИСУНОК 2.4. Виды, размножающиеся исключительно половым путем. Слева: V. palmarum из коллекции CIRAD. Плоды были получены спонтанно в карантинной оранжерее, защищенной от насекомых. (Любезно предоставлено М. Гризони). Справа: V. mexicana в Гваделупе. (С любезного разрешения П. Бессе и П. Фельдманна).

Межвидовая гибридизация

Основными факторами, препятствующими межвидовой гибридизации в семействе Orchidaceae, являются механизмы предваряющие опыление, такие как специфичность опылителей, фенология цветения или механические барьеры в цветках (Dressler, 1981; Gill, 1989; Grant, 1994; Paulus and Gack, 1990; Van Der Pijl and Dodson, 1966). Напротив, генетическая несовместимость между близкородственными видами наблюдается редко (Dressler, 1993; Johansen, 1990; Sanford, 1964, 1967). То же самое и с Vanilla. Действительно, большинство межвидовых искусственных скрещиваний, предпринятых на сегодняшний день у Vanilla, оказались успешными, показывая отсутствие генетической несовместимости между вовлеченными видами. Межвидовые гибриды были успешно получены между близкородственными американскими видами (V. planifolia × V. tahitensis J.W. Moore – образец Hy0003 на рисунках 2.1 и 2.3, V. planifolia × V. pompona) в селекционных программах на Мадагаскаре (Bory et al., 2008c) и даже между отдаленно родственными видами, такими как индийская V. aphylla Blume и американская V. planifolia, в программах разведения в Индии (Minoo et al., 2006).

Появляется все больше свидетельств естественной межвидовой гибридизации у Vanilla. Исследование трех местных видов ванили, V. claviculata, V. barbellata и V. dilloniana в западной части острова Пуэрто-Рико, показало возможность межвидовой гибридизации между V. claviculata и V. barbellata в симпатрических областях (Nielsen, 2000; Nielsen and Siegismund, 1999). Это было продемонстрировано с помощью изоферментных маркеров, а морфологические наблюдения за цветками подтвердили гибридный статус симпатрических популяций. С другой стороны, V. dilloniana, демонстрируя другую фенологию, не гибридизировалась с двумя другими видами. Недавняя работа с использованием маркеров AFLP и SSR также позволила предположить возможность образования межвидовых гибридов в тропической Америке с участием таких видов, как V. bahiana, V. planifolia или V. pompona (Bory, 2007; Bory et al., 2008d) (рис. 2.5.). Вид V. tahitensis также недавно был показан, с использованием ядерных последовательностей ITS и cp ДНК, как результат преднамеренной или непреднамеренной гибридизации между видами V. planifolia и V. odorata C. Presl, которая могла произойти в поздний постклассический период (1350–1500 гг.) в Мезоамерике (Lubinsky et al., 2008b).

РИСУНОК 2.5. Цветки, плоды и листья образца CR0068 (a) из Коста-Рики, предположительно идентифицированные как гибридный вид, полученный от материнского вида-донора V. planifolia (b) на основе данных маркеров ДНК AFLP, SSR и cp. (С любезного разрешения М. Гризони).

Полиплоидизация

Мы недавно продемонстрировали наличие событий полиплоидизации на острове Реюньон (произошедших менее чем за 200 лет с момента интродукции V. planifolia в 1822 году) (Bory et al., 2008a). Соответствующие данные (маркеры AFLP, размер генома, количество хромосом и длина устьиц) показали формирование самостерильных аутотриплоидов (“Stérile”), а также аутотетраплоидов (“Grosse Vanille”) с размерами генома 2C = 7,5 и 10 пг соответственно, в отличие от 5 пг для традиционных сортов “Classique” (Bory et al., 2008a) (Таблица 2.1). Было высказано предположение, что наиболее вероятным образованием этих типов является ручное самоопыление, сопровождающееся образованием нередуцированных 2n гамет (Bretagnolle and Thompson, 1995), прорастанием семян из забытого стручка с последующим вегетативным размножением особей (Bory et al., 2008a) (рисунок 2.6). Полиплоидия была также зарегистрирована для культивируемого вида V. tahitensis в Полинезии с существованием диплоидных и тетраплоидных (т. е. “Хаапапе”) типов (Duval et al., 2006; см. главу 13), и этот вид мог быть результатом как полиплоидии, так и половой регенерации после его происхождения V. planifolia × V. odorata (Lubinsky et al., 2008b).

РИСУНОК 2.6. Схематическое представление возможного образования аутотриплоидных и аутотетраплоидных типов V. planifolia на острове Реюньон.

Следовательно, полиплоидизация может быть важным явлением в эволюции ванили. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели предварительное исследование вариаций размера генома у разных видов ванили. Тридцать восемь образцов были проанализированы методом проточной цитометрии в соответствии с подробно описанным протоколом (Bory et al., 2008a), с использованием пшеницы в качестве внутреннего стандарта: Triticum aestivum L. «Китайская Весна», 2C = 30,9 пг, 43,7% GC (Marie and Brown, 1993). Эти образцы принадлежат 17 различным видам ванили, а также включают 3 искусственных гибрида (V. planifolia × V. planifolia, V. planifolia × V. tahitensis, V. planifolia × V. phaeantha Rchb. F.). Все образцы листьев были собраны с лиан, содержащихся в коллекции генетических ресурсов Vanilla CIRAD на острове Реюньон (см. главу 3 и Grisoni et al., 2007). Подробная информация по каждому образцу (вид, предполагаемый континент происхождения, место отбора образца и размер генома) представлена ​​в таблице 2.1. Для каждого вида гистограммы флуоресценции выявили пять эндореплицированных пиков, а коэффициент маргинальной репликации все еще был нерегулярным (от 1,5 до 1,8 вместо 2), как это было у V. planifolia (Bory et al., 2008a).

Содержание ядерной ДНК 2С варьировало от 4,72 (± 0,05) пг (V. tahitensis) до 12,00 (± 0,11) пг (V. phalaenopsis Reichb. F. Ex Van Houtte) для 34 дикорастущих образцов. Один образец CR0067 (Vanilla sp.) имел экстремальное значение 22,31 пг (одна мера со стандартом для пшеницы) (таблица 2.1), что было подтверждено с использованием другого стандарта (горох, данные не показаны). Коэффициенты вариации внутри сообщества не превышали 5%.

В первых трех строках приведены результаты для V. planifolia согласно исследованию Bory et al. (2008a).

^a В соответствии с Portères (1954).

^b Из исследования Bory et al. (2008a).

Эти результаты показывают, что у Vanilla существуют вариации размера генома, что может свидетельствовать о наличии полиплоидных видов на основе данных, обнаруженных для V. planifolia (Bory et al., 2008a). В частности, африканские образцы имели больший размер генома, чем американские образцы, с содержанием ДНК 2С в диапазоне от 6,93 до 22,31 пг и от 4,72 до 9,23 пг, соответственно. Африканские виды, следовательно, могли подвергнуться более драматическим перестройкам генома и событиям полиплоидизации, чем их американские или азиатские аналоги. Наконец, как это наблюдалось у V. planifolia на острове Реюньон (Bory et al., 2008a), у некоторых видов были обнаружены внутривидовые вариации размера генома (V. imperialis Kraenzl., V. albida Blume), что может отражать различный уровень плоидности даже внутри вида. Эти результаты необходимо дополнительно изучить с помощью подсчета хромосом для каждого вида, но они уже убедительно свидетельствуют о том, что полиплоидия может быть основным явлением в эволюции Vanilla.

Выводы

Таким образом, появляется все больше свидетельств, демонстрирующих сложность процессов, вовлеченных в эволюцию и многообразие у Vanilla. Что касается многих видов, у которых преобладает вегетативное размножение, мы наблюдали фенотипическое разнообразие на внутривидовом уровне у V. planifolia, что не соответствовало наблюдаемому низкому генетическому разнообразию этой клональной культуры. Мы продемонстрировали, что это несоответствие частично связано с возникновением редких случаев полового размножения, а также с возникновением полиплоидизации у этого вида. Учитывая, что эти изменения произошли на острове Реюньон менее чем за 200 лет, нет сомнений в том, что такие внутривидовые вариации существуют у других видов этого рода, встречающихся в дикой природе, и могут быть причиной трудностей с правильной идентификацией видов исключительно на основе морфологических наблюдений. Это усугубляется возникновением межвидовых гибридизаций, что делает четкое таксономическое распознавание еще более затруднительным.

Следовательно, по мнению Энноса, Vanilla можно рассматривать как ТКГ, «таксономически комплексную группу» (Ennos et al., 2005). Действительно, она демонстрирует (1) режим однородительского размножения (вегетативное размножение), (2) межвидовую гибридизацию в симпатрических областях и (3) полиплоидию. Такие механизмы оказывают глубокое влияние на организацию биологического разнообразия и были описаны как ответственные за трудность определения дискретных, стабильных и когерентных таксонов в таких ТКГ (Ennos et al., 2005). ТКГ широко распространены у растений, и однородительское размножение может давать сложную смесь половых ауткроссингов и однородительских линий, находящихся на разных уровнях плоидности, а весь комплекс может быть вовлечен в ретикулярную эволюцию, создавая новые однородительские линии путем гибридизации (Ennos et al., 2005). Это имеет огромное значение для проведения природоохранных программ. Поскольку в таких ТКГ часто невозможно классифицировать биоразнообразие на отдельные и однозначные виды, традиционные программы сохранения видов не подходят. В соответствии с рекомендациями, сохранение in situ должно быть сосредоточено на эволюционных процессах, которые порождают таксономическое разнообразие, а не на плохо определенных таксонах, возникших в результате этой эволюции (Ennos et al., 2005). Внимание концентрируется на видах, которые могут быть широко распространены (и, следовательно, не связаны с классическими усилиями по охране), но ответственны за создание таксономического разнообразия (посредством гибридизации, интрогрессии или полиплоидизации).

Следовательно, механизмы, описанные в этой главе, обеспечивают не только лучшее понимание эволюции рода Vanilla, но также имеют большое значение для будущего управления генетическими ресурсами и их сохранности (Crandall et al., 2000; Moritz, 2002).

Данные механизмы также представляют большой интерес с точки зрения будущего улучшения V. planifolia. Межвидовая гибридизация V. planifolia с другими ароматическими видами уже оказалась успешной. На Мадагаскаре производство гибридного сорта “Manitra ampotony”, V. planifolia × V. tahitensis, привело к увеличению содержания ванилина (6,7% ванилина против 2,5% у V. planifolia), а “Tsy taitry”, (V. planifolia × V. pompona) × V. planifolia, проявляет повышенную устойчивость к различным заболеваниям (Dequaire, 1976; FOFIFA, 1990; Nany, 1996). В Индии были получены гибриды V. planifolia × V. aphylla для повышения устойчивости к фузариозу (Minoo et al., 2006). На внутривидовом уровне можно использовать самоопыление для увеличения разнообразия этой генетически однородной культуры (Bory et al., 2008d; Minoo et al., 2006). Кроме того, агрономическая характеристика (сила, устойчивость, выработка ванилина) аутотетраплоидных типов в настоящее время проводится на острове Реюньон в качестве первого шага для проверки потенциальных возможностей стратегии полиплоидного разведения у V. planifolia.

Разгадка эволюции и получение агрономически интересных характеристик не менее важны. Такие характеристики включают аромат плодов, которому, несмотря на значительный селекционный интерес, уделялось ограниченное внимание, особенно в отношении его эволюции. Виды с ароматными стручками ограничены исключительно Америкой (Soto Arenas, 2003), и этот признак мог развиться как способствующий распространению плодов летучими мышами (Soto Arenas, 1999) или липких семян пчелами, что показано у V. grandiflora (Lubinsky et al., 2006). Вопрос недавно был рассмотрен путем изучения вариаций длины интронов в семействе генов COMT (Besse et al., 2009), кодирующих ключевые ферменты фенилпропаноидного пути, предположительно участвующих в биосинтезе ванилина. Для понимания эволюции, механизмов и генетического детерминизма спонтанного самоопыления у представителей рода (V. palmarum) – очень желательного признака, который значительно снизил бы затраты на производство стручков – также необходима дальнейшая работа. Наконец, выяснение того, как безлистные виды этого рода эволюционировали и дифференцировались, может представлять большой интерес для нашего понимания адаптации к засушливым условиям, учитывая предсказанное будущее больших климатических изменений.